123
KÍSÉRLETES KÖZLEMÉNYEK Magyar Sebészet 56, 123–127, 2003.
Semmelweis Egyetem II. sz. Sebészeti Klinika (igazgató: Ondrejka Pál egyetemi tanár) és *Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika (igazgató: Tulassay Zsolt egyetemi tanár)
Az oxidált epe vastagbél-nyálkahártya károsító hatása és az antioxidáns védõ mechanizmus Sipos Péter *Hagymási Krisztina *Blázovics Anna
The damaging effect of oxidized bile on colonic mucosa and the antioxidative protective mechanism
Populációs felmérések igazolták, hogy a táplálkozási zsírok nem emelik közvetlenül a vastagbél daganatok kialakulását, bár fogyasztásuk mellett számos elváltozás alakulhat ki. Sebészeti modellt fejlesztettünk ki az oxidált epe vastagbél nyálkahártya károsító hatásának tanulmányozására zsírdús diétában és természetes hatóanyagú Raphachol granulátum használatát követõen. 150–200 grammos Wistar patkányokat zsírdús diétán tartottunk (2% koleszterin, 20% napraforgó olaj, 0,5% kólsav) és/vagy Raphachol granulátumot juttattunk az ivóvizükbe (2 gr/tskg) 10 napig. A ductus choledochust megkanüláltuk, majd a gyûjtött epét kontroll és kezelt állatok vastagbelének proximalis és distalis szakaszára fecskendeztük. A redox paramétereket biokémiai módszerekkel határoztuk meg, és az elektronmikroszkópos eredményekkel hasonlítottuk össze. A vastagbél nyálkahártya szabad SH csoport koncentrációja (0,1132±0,034/0,096±0,0065 mmol/l) és a redukáló képessége (1169,49±97/871,25±157,61 nmolAS) szignifikánsan csökkent zsírdús diéta mellett. A zsírdús diétán tartott állatok epéje, kontroll epéhez képest a vastagbél szabad SH csoport koncentrációját (0,1757±0,0228/ 0,1932±0,0398 mmol/l) és proton donor aktivitását (0,2669±0,0431/0,3333±0,013 %) csökkentette. A Raphachol kezelés hatására a nyálkahártya károsodás kisebb mértékû volt, mind a zsírdús, mind az epekezelt csoportokban. Vizsgálataink az enteralisan alkalmazott antioxidáns kezelés védõ hatását igazolták zsírdús diétával és ennek következtében kialakuló oxidált epével szemben. Kulcsszavak: epe, szabadgyök, colon mucosa, Raphachol Population based studies suggest that dietary fat is not associated directly with an increased risk of colon cancer, although lot of alterations can occur in the gastrointestinal system. A surgical model was developed to study the effect of oxidative modified bile on colonic mucosa in hyperlipidemic rats as well as the effectiveness of natural product “Raphacol” bile granule. 150-200 g Wistar rats were treated with lipid rich diet (2% cholesterol, 20% sunflower oil, 0.5% cholic acid supplementation) and/or Raphacol (2g/bwkg) in drinking water for 10 days. Ductus choledochus was cannulated and bile was collected, than bile was injected into the lumen of proximal and distal parts of colon for 30 minutes. Redox parameters were measured and electronmicroscopical study was carried out. Free SH-group (0.1132±0.034/0.096±0.0065 mmol/l) and reducing power (1169.49±97/871.25±157.61 nmolAS) of colonic mucosa were significantly decreased in hyperlipidemy. When bile from hyperlipidaemic rats was injected on the bowel, the free SH group (0.1757±0.0228/0.1932±0.0398 mmol/l) and the proton donor activity (0.2669±0.0431/0.3333±0.013 %) decreased comparing to the effect on colonic mucosa of bile from control animals. When the animals were treated with Raphacol, the damage of mucosal membrane was moderate in both (hyperlipidemic and bile treated) experiments. Our results show that enteral antioxidant treatment can protect against destructive mechanism of dietary fat and oxidative modified bile in hyperlipidemy. Keywords: bile, free radical, colon mucosa, Raphachol Közlésre érkezett/Received: 2003. július 2. Cím/Corresponding author: Dr. Sipos Péter, Semmelweis Egyetem II. sz. Sebészeti Klinika. H-1125 Budapest, Kútvölgyi út 4. Tel.: 355 1122, fax: 375 4291. E-mail:
[email protected]
124 Az epe, a felszívódásban játszott szerepe mellett, hatással van az immunrendszerre és enterohepaticus körforgása révén befolyásolja az egész szervezetet. Kóros öszszetétele és rendellenes áramlása révén – duodenogastricus, oesophagogastricus regurgitatio során – károsíthatja a gasztrointesztinális traktust. A vastagbélben anaerob baktériumok hatására szekunder epesavak keletkeznek, melyek tovább hatnak a nyálkahártyára. Az epe tartós károsító hatása polypok képzõdéséhez vezethet, hám proliferációt, daganatot okozhat. Familaris adenomatosus polyposisban polypok alakulhatnak ki nemcsak a vastagbélben, de a gyomorban is, melynek hátterében szintén feltételezhetõ az epe szerepe [1]. Az epének szerepe lehet a vastagbél adenocarcinomák kialakulásában és tartós refluxot követõen a nyelõcsõben epithelialis mitokondrialis károsodást okozó hatása révén. Az epe kiválasztódására ható májreszekciók, az elfolyásra ható choledochus és epehólyag mûtétek és az enterohepaticus körforgást érintõ bélmûtétek mind befolyásolhatják az epe összetételét és mennyiségét. Mûtétek, mint a cholecystectomia vagy a vastag- és vékonybél reszekciók az enterohepaticus epekörforgás megváltoztatása során befolyásolhatják az epe összetételét és mennyiségét, ami visszahat a bélnyálkahártyára. Kísérleteink célja az állatkísérletes modell felállítása mellett az epében és a gasztrointesztinális rendszerben lejátszódó szabadgyök-reakciók tanulmányozása volt. A modellhez kidolgozott biokémiai vizsgáló módszerekkel próbáltuk elemezni a táplálkozási faktorok, mint a hyperlipidaemia és a fekete retek kivonatából készített antioxidáns (Raphachol) adagolása mellett az epe bélnyálkahártya károsító hatását.
Anyag és módszer Vizsgálatainkat 6–8 hetes, 150–200 g-os hím Wistar patkányokon végeztük. Az állatokat randomisaltan osztottuk csoportokba a kezelések szerint. Minden csoportba legalább 5 állatot osztottunk. Alimentáris eredetû lipidanyagcsere zavart „short term” (10 napos) kísérletben hoztunk létre az állatok tápjához kevert 20% napraforgó olaj, 0,5% kólsav, 2% koleszterin adagolásával [2]. A passzázsból kirekesztett, keringését megtartott bélszakaszok nyálkahártyájának károsítására különbözõ kezelésben részesült patkányok ductus choledochusának kanülálásával nyertünk epét [3]. A Raphacholt 1,5 g/ttkg koncentrációban itatóvizükben feloldva 10 napos kezelés alatt az alimentáris hyperlipidaemia modellben alkalmaztuk. A kezelést követõen az állatokat 1 g/ttkg dózisú intraperitoneálisan adott Nembutallal mély narcosisban megoperáltuk. A choledochust kanüláltuk és az 1–3 órán keresztül gyûjtött epét a passzázsból kirekesztett, de keringését megõrzött vastagbélbe fecskendeztük. A kezeléseket követõen a bélszakaszokat a bélsártól megtisztítottuk, KCl pufferes átöblítés után a bél mukózát eltávolítottuk. Potter készülékkel homogenizáltuk, majd fehérje tartalmát 10 mg/ml-esre állítottuk be izotóniás KCl oldattal, és a feldolgozásig –20 °C-on tároltuk. A fehérjetartalmat a szérum, plazma, bélnyálkahártya kaparék és epemintákban Lowry és munkatársai módszere szerint, szarvasmarha albumin standardsor felhasználásával, a folin-fenol módszerrel határoztuk meg [4]. A bélnyálkahártya kaparékban a szabad SH csoport koncentrációt Sedlak módszere szerint határoztuk meg Ellmann reakció alapján. Az 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoesavat (Ellmann reagens) a szabad SH-cso-
port redukálta, és így a 2-nitro-5-merkapto-benzoesav 440 nm-en spektrofotometriásan mértük [5]. A bélnyálkahártya minták hidrogén donor kapacitását 1,1-difenil-2pikrilhidrazil gyök jelenlétében vizsgáltuk. A DPPH stabil gyök, metanolos oldata 517 nm-en abszorbancia maximumot mutat. H-donor molekula jelenlétében az abszorbancia csökken [6]. Redukálóképesség mérésénél Oyaizu módszerével a Fe3+-Fe2+ átalakulást vizsgáltuk a bélnyálkahártya homogenizátumban. A spektrofotometrált oldat elõkészítése során 1 ml minta, 2,5 ml foszfát puffer (pH 6,6), 2,5 ml 1%-os K3Fe(CN)6 oldat elegyét 50 oC-on 20 percig inkubáltuk. 2,5 ml 10%-os TCA hozzáadása után 10 percig 3000g fordulatszámon lecentrifugáltuk. A felülúszóból FeCl3-dal adott színreakcióját 700 nm-en spektrofotometráltuk [7]. Az epe zsírsavösszetételét a lipidfrakciót 2:1 arányú kloroform/metanol eleggyel izoláltuk. A kloroformos fázis 1 cm3-ét dehidrálás és észterifikálás után használtuk fel. Az elszappanosítás 5% NaOH-dal történt 50%-os metanolos oldatban. Az észterifikálást 10%-os bórtrifluorid metanolos oldatban végeztük. Az elválasztást Alexander és munkatársai szerint végeztük Hewlett-Packard 5890 gázkromatográffal és a detektálás láng-ionizációs detektorral történt [8]. A vastag- és vékonybelekbõl elektronmikroszkópos feldolgozást 3%-os paraformaldehid és 0,5%-os glutáraldehides fixálás után 1%-os OsO4 utófixálással végeztük. Félvékony metszeteket, majd a kívánt területrõl ultravékony metszeteket készítettünk. Uranyl acetáttal és ólom citrát kontrasztozás után elektronmikroszkóppal értékeltük a nyálkahártya finom szerkezetét és az esetleges elváltozásokat. Az adatok statisztikai feldolgozása Statistica 5 (Stat. Soft) és Microsoft Excel programmok segítségével, a Student’s t teszt felhasználásával történt. A null hipotézist elvetettük, ha p < 0,05.
Eredmények Az elektronmikroszkópos vizsgálatok a colon mucosa változását mutatták, a mucopolysaccharidot tartalmazó glycocalix felületi réteg eltûnt mind a zsírdús diétán tartott, mind az epe kezelt állatokban (1. ábra). A sejtek mikrovillusainak száma lecsökkent és némelyiknél el is tûnt. Epével történõ kezelést követõen a sejtmembránok széttöredeztek, a citoplazmába epe került. A zsírdús diétán tartott állatokból nyert epével történõ kezelést követõen a felszíni hám lelökõdött, a kehelysejtek száma szignifikánsan csökkent és gyulladásos sejtek tûntek fel a tunica mucosában, összehasonlítva a kontroll és zsírdús diétán tartott állatok vastagbél nyálkahártyájának elektronmikroszkópos képével (2. ábra). A kezelések hatására létrejövõ elváltozások kvantitatív meghatározása miatt a mukóza sejtjeit megszámoltuk. Az enterocyták és kehelysejtek száma csökkent a zsírdús diéta mellett és a polymorphonuclearis sejtek számának megszaporodását a Raphachol kezelés kissé csökkentette (I. táblázat). Az epével történõ inkubálás morfológiai eltérést okozó hatásait a Raphachol elõkezelés nagyban javította. A redox paraméterek közül a zsírdús étrendet követõen a bélnyálkahártya szabad SH csoport tartalma szignifikánsan csökkent a kontrollhoz képest (3/a ábra). A protondonor aktivitásban csökkenés volt megfigyelhetõ zsírdús etetést követõen, és szignifikáns különbség adódott a két epekezelt csoport között is (3/b ábra). A redukálóképesség szignifikánsan alacsonyabb volt a zsírdús diétán tartott csoportban és mind a két epekezelt csoportban öszszehasonlítva a kontrollokkal (3/c ábra).
125
1. ábra. Elektronmikroszkópos kép a colon mucosáról zsírdús diétát követõen. Az enterocyták mikrovillusainak száma lecsökkent. A sejtek szerkezete fellazult
2. ábra. Elektronmikroszkópos kép a colon mucosáról zsírdús diétát és epekezelést követõen. A sejtmembránok széttöredeztek, a kehelysejtek citoplazmájába epe és baktériumok kerültek
I. táblázat A vastagbél nyálkahártyában észlelt különbözõ sejtek száma/1000mm2 Raphacol kezelés hatására Sejtszám
kontroll csoport
zsírdús csoport
Raphachol kezelt
zsírdús + Raphachol
Enterocyta Kehely sejt Polymorphonuclearis sejt
28±4,2b 32±5,4b 4±2,2b
12±3,2a,c,d 18±4,8a,c,d 16±2,5a,c
26±3,5b 29±4,6b 6±2,6b,d
24±3,9b 26±4,8b 12±3,2c,b
a b c d
szignifikáns különbség kontroll csoporttal szemben szignifikáns különbség zsírdús csoporttal szemben szignifikáns különbség Raphachollal kezelt csoporttal szemben szignifikáns különbség zsírdús diéta mellett Raphachollal kezelt csoporttal szemben II. táblázat Az epe zsírsav összetétele kontroll és zsírdús diétán tartott állatokban
Zsírsavak
normál diéta (%±SEM)
zsírdús diéta (%±SEM)
C12:0 (lauril) C14:0 (mirisztin) C15:0 C16:0 (palmitin) C16:1 (palmitolein) C18:0 (sztearin) C18:1 (olajsav) C18:2 (linolsav) C18:3,C19:0 C20:0 (arachidin) C20:2 (arachidion) C20:3
1.45 ±0.55 2.14±0.29 0.88±0.75 21.09±2.06 0.70±0.63 21.53±4.17 34.96±3.26 10.52±2.36 1.99±0.34 0.54±0.18 1.70±0.87 0.63±0.00
0.26±0.04 3.34±2.91 1.47±0.65 19.58±0.44 4.02±3.35 8.10±3.48 23.29±8.71 17.54±3.33 1.87±0.69 6.22±0.68 3.01±0.17 2.04±0.85
A zsírsavösszetétel a hyperlipidaemiás kezelést követõen szintén megváltozott, és a többszörösen telítetlen zsírsavak menynyisége szignifikánsan magasabb lett (II. táblázat). Tíz napos Raphachol kezelés a kontroll állatok vastagbél nyálkahártyáján nem okozott lényeges elváltozást, azonban a zsírdús diéta hatására létrejövõ nyálkahártya károsodást szignifikánsan javította (III. táblázat). Az elõkísérletekben a vékonybélen mind a morfológiai, mind a redox paraméter változások sokkal kisebb mértékben jelentkeztek.
126 III. táblázat Biokémiai paraméterek változása Raphachol kezelés hatására Biokémiai paraméterek Redukálóképesség (nmolAS) Szabad SH koncentráció (mmol/l) a k
kontroll csoport
zsírdús csoport
Raphachol kezelt
zsírdús + Raphachol
1169,4±97 0,1132±0,034a
871,2±157 0,096±0,0065k
1160,1±53 0,1097±0,042
1172,7±103 0,1052±0,057
szignifikáns különbség zsírdús csoporttal szemben. szignifikáns különbség kontroll csoporttal szemben
Eredményeink alátámasztják, hogy az oxidált epe lehet az egyik faktora a cholecystectomiák után kialakuló, populációs felmérésekkel kimutatott emelkedett számú ampullaris [11] és proximális vastagbél daganat kialakulásának [12]. Ezért fontos a mûtét elõtt megfelelõ antioxidáns status elérése, melyet megfelelõ táplálkozással és antioxidáns tartalmú vegyületekkel, gyógyszerekkel javítani lehet. A munka a Semmelweis Egyetem Doktori Iskola 7-es PhD programjának keretén belül készült, az F 029252 ifjúsági OTKA kutatási támogatásának segítségével.
IRODALOM
Megbeszélés A vastagbélbe kerülõ epesavak, a tápanyagból képzõdõ termékek, mint a butirát és a zsírsavak különbözõ módokon befolyásolják a colon epithelsejtjeit. A vastagbélbe jutó zsírsavak baktériumok hatására hidroxi-zsírsavakká alakulnak, melyek toxikusak. Az epe mennyiségének és összetételének megváltozása befolyásolhatja a colon mucin termelést és ezáltal az enterocyták védelmét [9]. Kimutatták, hogy a másodlagos epesavak hyperproliferatiót indukálnak in vitro [10]. A konjugálatlan epesavak a vastagbélben prosztaglandin E2 felszabadulást és nitrogénoxid-szintetázt indukálhatnak.
1. Wallace, M. H., Phillips, R. K. S.: Upper gastrointestinal disease in patients with familial adenomatosus polyposis. Brit. J. Surg. 85, 742–750 (1998). 2. Blázovics, A., Fehér, E., Fehér, J.: Role of free radical reactions in experimental hyperlipidemia in the pathomechanism of fatty liver. Free Radicals and the Liver. Fehér, J., Csomós, G., (ed.), Springer Verlag. 98–126 (1992). 3. Sipos, P., Hagymási, K., Lugasi, A., Fehér, E., Örsi, F., Blázovics, A.: Direct effect of bile on colonic mucosa in alimentary induced hyperlipidemy in rats. Acta Alimentaria 30, 25–35 (2001). 4. Lowry, O. H., Rosenbrough, N. J., Farr, A. L., Randall, B. J.: Protein measurement with the Folin-phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265–275 (1951). 5. Sedlak, J., Lindsay, R. H.: Estimation of total, protein bound and non protein bound sulfhydril groups in tissues with Ellmann's reagent. J. Biochem. 25, 192–205 (1968). 6. Hatano, T., Kagawa, H., Yasuhara, T., Okuda, T.: Two new flavonoids and other constituents in cicore root: their relative astringency and radical scavenging effects. Chem. Pharm. Bull. 36, 2090–2097 (1998). 7. Oyaizu, M.: Studies on products of browning reaction prepared from glucosamine. Jpn J. Nutr. 44, 307–315 (1986). 8. Blázovics, A., Örsi, F., Sipos, P., Fehér, J.: Free radical reactions in the bile: Experimental and human studies. Current Topics in Biophysics 22(Suppl), 21–26 (1998). 9. Shekels, L. L., Lyftogt, C. T., Ho, S. B.: Bile acid-induced alteration of mucin production in differentiated human colon cancer cell lines. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 28(2), 193–201 (1996). 10. Velazquez, O. C., Seto, R. W., Bain, A. M., Fisher, J., Rombeau, J. L.: Deoxycholate inhibits in vivo butyrate-mediated BrDU labeling of the colonic crypt. J. Surg. Res. 69(2), 344–348 (1997).
127 11. Urbach, D. R., Swasntrom, L. L., Khajanchee, Y. S., Hansen, P. D.: Incidence of cancer of the pancreas, extrahepatic bile duct and ampulla of Vater in the United States , before and after the introduction of laparoscopic cholecystectomy. Am. J. Surg. 181, 526–528 (2001). 12. Lagergran, J., Ye, W., Ekbom, A.: Intestinal cancer after cholecystectomy: Is bile involved in carcinogenesis? Gastroenterology 121, 542–547 (2001).
