Tananyag címe: Transzaminázok vizsgálata
Szerző: Dr. Mótyán János András, egyetemi tanársegéd Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet Általános Orvostudományi Kar Debreceni Egyetem
Készült: 2014.12.01-2015.01.31.
A tananyag elkészítését "Az élettudományi- klinikai felsőoktatás gyakorlatorientált és hallgatóbarát korszerűsítése a vidéki képzőhelyek nemzetközi versenyképességének erősítésére" TÁMOP 4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 számú projekt támogatta. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósult meg.
Jegyzőkönyv
1
JEGYZŐKÖNYV A transzamináz-reakció megfordíthatóságának vizsgálata
Írja le a kísérlet célját: ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... Írja le a szérum GOT és GPT mérésének klinikai jelentőségét! ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... Írja le a röviden a kísérlet kivitelezésének lépéseit! 1. ................................................................................................................................................... 2. ................................................................................................................................................... 3. ................................................................................................................................................... 4. .................................................................................................................................................. 5. ................................................................................................................................................... Rajzolja le a glutamát-piruvát transzamináz (GPT) által katalizált reakciót képletekkel!
2
Írja le a kísérlet során felhasznált anyagok szerepét! Enzimpreparátum: ............................................................................................................................................................ .................................................................................................................................................. -Ketoglutarát: ............................................................................................................................................................ .................................................................................................................................................. Na-piruvát: ............................................................................................................................................................ .................................................................................................................................................. Na-glutamát: ............................................................................................................................................................ .................................................................................................................................................. Alanin: ............................................................................................................................................................ .................................................................................................................................................. Eredmények: - Rajzolja le a kísérlet eredményét berajzolva a startvonal helyét, a minták felviteli sorrendjét és helyét, a vándorlás irányát és az aminosavakat! - Az aminosavak futási sorrendje a felcseppentési ponttól: Glu, Ala.
3
Értékelés: - Azonosítsa be a megjelenő aminosav foltokat a standard aminosav keverék segítségével! - Válaszolja meg a következő kérdéseket: - Melyik minta volt a vak minta? Hogyan készítette el? Miért használható vak mintaként? - Elemezze a kapott eredményeket és értékelje, hogy mennyiben sikerült bizonyítani a megfordíthatóságot? Válaszát indokolja meg! - Mely, a GPT által katalizált reakcióban szereplő szubsztrátok és/vagy termékek látszanak a kromatogramon és miért? ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................
4
JEGYZŐKÖNYV Szérum GOT és GPT aktivitásának meghatározása optikai teszttel A kísérlet célja: ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... Írja le a Warburg-féle optikai teszt elméleti hátterét! ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... Rajzolja le GPT és a GOT méréshez használt segédenzimek által katalizált reakciókat képletekkel (kivéve NAD és NADH)!
Írja le a röviden a kísérlet kivitelezésének lépéseit! 1. ................................................................................................................................................... 2. ................................................................................................................................................... 3. ................................................................................................................................................... 4. .................................................................................................................................................. 5. ...................................................................................................................................................
5
Eredmények és számítások: Töltse ki a táblázatot a mért értékekkel, számítsa ki a percenkénti abszorbancia-változást! Szérum GOT idő (perc)
A366
Szérum GPT
ΔA366 / perc
ΔA366 / perc
A366
-
0
-
1 2 3
Számítsa ki a percentkénti abszorbancia-változás átlagát: Szérum GOT
Szérum GPT
Átlag ΔA366 / perc
Számítsa ki a szérum GOT és GPT aktivitás értékeket az alábbi egyenlet alapján:
V 109 ΔA/min Ɛ d 60 v
V * 109 * (ΔA366 / perc) Ɛ * d * 60 * v
= nkat / l
V * 109 Ɛ * d * 60 * v
= 30303
- reakcióelegy végtérfogata (1,5 ml) - a literre és a nmol-ra történő átszámítás faktora - az 1 perc alatt mért extinkcióváltozás - a NADH moláris extinkciós koefficiense (366 nm-nél 3300 mol-1.L.cm-1) - a fényút hossza a küvettában (1 cm) - a percről másodpercre történő átszámítás faktora - a vizsgálandó minta bemért térfogata (0,25 ml)
A vizsgált minták térfogataktivitása (nkat/l) = 30303 * Átlag ΔA366 / perc (1 U = 1/60 μkatal = 16,67 nkatal) GOT: ................................................... nkat/l
= ................................................... U/L
GPT: ................................................... nkat/l
= ................................................... U/L
6
Értékelés: - Hasonlítsa a kapott eredményeket a megadott normál értékekhez! - Ha eltérés van milyen diagnózis állítható fel? - Válaszolja meg az alábbi kérdéseket: - Mik azok az intracelluláris enzimek? - Hogyan kerülhetnek ezek az enzimek a szérumba? - Van klinikai jelentősége a szérumból történő aktivitásmérésüknek? ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................
7
JEGYZŐKÖNYV Szérum és vizelet aminosav-tartalmának vizsgálata vékonyrétegű ioncserélő kromatográfiával
A kísérlet célja: ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... Írja le a fenilketonúria kialakulásának lehetséges okait és tüneteit! ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... Írja le a kísérlet során felhasznált anyagok szerepét! Szérum, vizelet: ............................................................................................................................................................ .................................................................................................................................................. TCA: ............................................................................................................................................................ .................................................................................................................................................. aminosav standard: ............................................................................................................................................................ .................................................................................................................................................. ninhidrin: ............................................................................................................................................................ ..................................................................................................................................................
8
Írja le a röviden a kísérlet kivitelezésének lépéseit! 1. ................................................................................................................................................... 2. ................................................................................................................................................... 3. ................................................................................................................................................... 4. .................................................................................................................................................. 5. ................................................................................................................................................... 6. ................................................................................................................................................... 7. ................................................................................................................................................... 8. ................................................................................................................................................... 9. ................................................................................................................................................... 10. .................................................................................................................................................
Eredmények: - Rajzolja le a kísérlet eredményét berajzolva a startvonal helyét, a minták felviteli sorrendjét és helyét, a vándorlás irányát és az aminosavakat! - Az aminosavak futási sorrendje a felcseppentési ponttól (a standardban): Arg, His, Lys, Phe, Tyr, Leu, Val, Gly.
9
Értékelés: - Azonosítsa be a megjelenő aminosav foltokat a standard aminosav keverék segítségével! - Keresse meg a Tyr és Phe aminosavakat! Figyelje meg melyik szérumban és vizeletben szaporodott fel (normál vagy patológiás)! - Értékelje a látottakat a szövegesen! ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................
10
