Tananyag címe: Transzaminázok vizsgálata
Szerző: Dr. Mótyán János András egyetemi tanársegéd Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet Általános Orvostudományi Kar Debreceni Egyetem
Készült: 2014.12.01-2015.01.31. Módosítva: 2016. július
A tananyag elkészítését "Az élettudományi- klinikai felsőoktatás gyakorlatorientált és hallgatóbarát korszerűsítése a vidéki képzőhelyek nemzetközi versenyképességének erősítésére" TÁMOP 4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 számú projekt támogatta. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósult meg.
1
1. feladat A transzamináz-reakció megfordíthatóságának vizsgálata Eszközök - Eppendorf csövek - mikropipetta - 37 C-os vízfürdő - 95 °C-os blokktermosztát - kromatográfiás kád fedővel - 6,5 cm 5,5 cm-es Whatman 3 MM kromatográfiás papír Anyagok - kész enzimpreparátum (Készült: A hideg foszfát-pufferrel homogenizált sertésmájat centrifugálást követően 10 percig 50C-on inkubáltuk, majd ismételt centrifugálást követően a tiszta felülúszót foszfát-pufferrel duplájára hígítottuk.) - 0,10 M foszfát-puffer (pH 7,4) - 0,50 M alanin foszfát-pufferben - 0,25 M -ketoglutarát NaOH-dal neutralizálva - 0,50 M Na-L-glutamát foszfát-pufferben - 0,25 M Na-piruvát-oldat - 10 % ZnSO4-oldat - 0,5 M NaOH-oldat - kromatográfiás oldószerelegy (77 ml 96% etanol és 23 ml cc. NH4OH elegye) - ninhidrin spray (1 % ninhidrin acetonban)
Gyakorlat kivitelezése: 1. Állítsa össze az alábbi reakcióelegyeket Eppendorf csövekbe: 1.
2. Vak
3.
4. Vak
Foszfát-puffer (μl)
150
150
150
150
Alanin-oldat (μl)
125
125
-
-
-Ketoglutarát-oldat (μl)
75
75
-
-
Glutamát-oldat (μl)
-
-
125
125
Piruvát-oldat (μl)
-
-
75
75
100
-
100
-
Enzimpreparátum (μl)
Inkubálja a mintákat 60 percig 37 C-os vízfürdőben, majd adja hozzá az alábbi oldatokat a reakcióelegyekhez ZnSO4-oldat (μl)
75
75
75
75
NaOH-oldat (μl)
75
75
75
75
-
100
-
100
Enzimpreparátum (μl)
2
2. Az Eppendorf csöveket helyezze 95 °C-os blokktermosztátba és inkubálja a mintákat 3 percig. 3. Centrifugálja a mintákat 10 percig 5000 rpm fordulatszámon. Centrifugálás után óvatosan kezelje a mintákat, hogy elkerülje a pellet felkeveredését. 4. A kromatográfiás papír előkészítése - puha grafitceruzával húzzon „start-vonalat” a 6,5 cm 5,5 cm Whatman 3 MM kromatográfiás papír alsó szélétől kb. 1 cm távolságra - jelölje ki a négy minta felcseppentési pontjait a start-vonalon - a kijelölt pontokra mikropipettával cseppentsen fel 5-5 µl-t a tiszta felülúszókból - a papírt hajszárítóval szárítsa meg minden egyes felcseppentést követően 5. Kromatografálás - a kromatográfiás kádak kb. 1 cm magasságig meg vannak töltve pufferrel - állítsa bele a kádba a papírt úgy, hogy a felcseppentett minták ne érjenek bele a pufferbe - a puffert a papír tetejétől számított 1 cm-ig hagyja felfutni 6. Az aminosavak előhívása - hajszárítóval szárítsa meg a kádból kiemelt papírt - permetezze be egyenletesen ninhidrinnel - szárítsa meg a papírt hajszárítóval - a megjelenő aminosav-foltokat a standard aminosavkeverékkel és egymással összehasonlítva értékelje
3
2. feladat Szérum és vizelet aminosav-tartalmának vizsgálata vékonyrétegű ioncserélő kromatográfiával Eszközök - Polygram vékonyréteg-kormatográfiás lemez (erős kationcserélő réteggel) (NEM PAPÍR!) - kromatográfiás kád fedővel (laborasztalon) - mikropipetta - hajszárító - centrifuga - Eppendorf csövek Anyagok - szérum- és vizeletminták (I. és II. számú) - 10 %-os triklórecetsav (TCA) - éter (adagolóban a fülke alatt) (Használatához kérje az asszisztens segítségét!) - Futtatóelegy: nátrium citrát-puffer, pH 5,28 (24.5 g citromsav, 14 g NaOH és 6.5 ml cc. HCl 1000 ml-re oldva) - aminosav-standard keverék: (0,2 mM mindegyik aminosavból: Arg, His, Lys, Phe, Tyr, Leu, Val és Gly, 9 ml desztillált víz és 1 ml izopropanol elegyében oldva) - ninhidrin (1 % ninhidrin acetonban oldva)
Gyakorlat kivitelezése: 1A. Végezze el az alábbi kísérletet az I. és II. szérum és vizeletmintákkal is: - Eppendorf csőbe mérjen 250 μl oldatot - adjon hozzá 500 μl 10 %-os triklórecetsavat - alaposan rázza össze az elegyet - csapadék képződése esetén centrifugálja le az oldatot (5000 rpm, 10 perc) - mérje át a tiszta felülúszót egy tiszta Eppendorf csőbe - adjon 500 μl étert a tiszta felülúszóhoz (a TCA eltávolítása érdekében) - rázza össze a mintát (vortexelés) - a fázisok szétválása után távolítsa el a felső (éteres) fázist 2. A kromatográfiás lemez előkészítése - puha grafitceruzával húzzon „start-vonalat” a kromatográfiás lemez alsó szélétől kb. 1 cm távolságra - jelölje ki a minták felcseppentési pontját a start-vonalon 1. vizelet I. minta 2. vizelet II. minta 3. aminosav referenciaelegy 4. szérum I. minta 5. szérum II. minta - a kijelölt pontokra mikropipettával cseppentsen fel 5-5 µl mintát - a lemezt hajszárítóval szárítsa meg minden egyes felcseppentést követően 4
3. Kromatográfia - a kromatográfiás kádak kb. 1 cm magasságig meg vannak töltve pufferrel - állítsa bele a kádba a lemezt úgy, hogy a felcseppentett minták ne érjenek bele a pufferbe - a puffert a lemez tetejétől számított 1 cm-ig hagyja felfutni 4. Az aminosavak előhívása - hajszárítóval szárítsa meg a kádból kiemelt lemezt - permetezze be egyenletesen ninhidrinnel - szárítsa meg a lemezt hajszárítóval - a megjelenő aminosav-foltokat a standard aminosavkeverékkel és egymással összehasonlítva értékelje
5
3. feladat Szérum GOT és GPT aktivitásának meghatározása optikai teszttel Eszközök - fotométer - küvetták - mikropipetták Anyagok - GOT szubsztrát-oldat: 250 mM aszpartát, 25 mM -ketoglutarát, 0,2 mM NADH és 1,2 U/ml malát-dehidrogenáz, 100 mM foszfát pufferben (pH 7,4) - GPT szubsztrát-oldat: 800 mM alanin, 80 mM -ketoglutarát, 0,2 mM NADH és 1,2 U/ml laktát-dehidrogenáz, 100 mM foszfát pufferben (pH 7,4) - szérum minta Végezze el az alábbi kísérletet GOT és GPT szubsztrát alkalmazásával is! 1. Állítsa a fotométert 366 nm-es hullámhossz értéket. 2. Nullázza a fotométert desztillált vízre. 3. Küvettába mérjen 1,25 ml (GOT vagy GPT) szubsztrát-oldatot. 4. Adjon hozzá 0,25 ml szérumot. 5. Parafilmmel fedje le a küvettát és rázza össze az elegyet majd rögtön helyezze a küvettát a fotométerbe. 6. Közvetlenül ezután olvassa le az abszorbancia értéket (0. perc), majd ezt követően 3 percig, percenként olvassuk le az abszorbanciát (1., 2. és 3. perc). 7. Végezze el a számításokat!
6
