Karakteristik Bakteri Heterotrofik Penghasil Enzim Amilolitik Diperairan Situ Cibuntu, Cibinong Bogor

Karakteristik Bakteri Heterotrofik Penghasil Enzim Amilolitik Diperairan Situ Cibuntu, Cibinong Bogor (Heterotroph Bacteria Identification Which Produced Amylolytic in Situ Cibuntu Freshwaters, Cibinong, Bogor) Rismawati1, Tri Saptari Haryani1, S. Y. Srie Rahayu 2 Program Studi Biologi, FMIPA-Universitas Pakuan Bogor

1)

Abstrak: Air memegang peranan penting dalam kehidupan manusia dan juga makhluk hidup lainnya, antara lain air dapat digunakan untuk minum, memasak, mencuci, dan mandi. Pencemaran air dapat disebabkan oleh berbagai hal, salah satunya adalah akibat adanya limbah organik. Bakteri heterotrofik merupakan bakteri yang dapat memanfaatkan dan mendegradasi senyawa organik kompleks menjadi senyawa sederhana yang digunakan sebagai sumber energi bakteri itu sendiri. Amilase adalah enzim yang memiliki kemampuan untuk menghidrolisis amilum menjadi molekul yang lebih sederhana. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakterisasi fenotipik dan mengidentifikasi isolat bakteri heterotrofik penghasil enzim amilolitik dari perairan Situ Cibuntu, Cibinong. Metode pengujian dilakukan secara makroskopis secara mikroskopis meliputi uji Gram, uji kapsul dan uji spora, sedangkan morfologi bakteri di lakukan dengan pengamatan secara makroskopis meliputi warna koloni, elevasi dan permukaan koloni. Pengujian secara molekuler dilakukan menggunakan alat PCR. Identifikasi bakteri heterotrofik yang diuji berjumlah 11 isolat, bakteri dengan kode isolat TSi5 merupakan isolat bakteri tidak pathogen dengan hasil uji gram (+), uji kapsul (-) dan uji spora (-). Kata kunci: Karakteristik Bakteri Heterotrofik, Bakteri Heterotrofik, Enzim Amilolitik. PENDAHULUAN Air memegang peranan penting dalam kehidupan manusia dan juga makhluk lainnya, antara lain air dapat digunakan untuk minum, memasak, mencuci, dan mandi. (Effendi, 2003). Telah diketahui beberapa bakteri digunakan untuk mendeteksi tingkat pencemaran di perairan. Pemantauan kualitas air secara periodik dan perbaikan pemanfaatan lahan di wilayah perairan sangat diperlukan guna memelihara kesehatan masyarakat yang berada di sekitar

lingkungan perairan. Terdapat kelompok bakteri heterotrofik yang berperan penting dalam sistem perairan karena kemampuan aktivitas metabolismenya, baik pada lingkungan aerob ataupun anaerob (Sigee, 2005). Bakteri heterotrofik merupakan golongan bakteri yang mampu memanfaatkan dan mendegradasi senyawa organik kompleks baik yang mengandung unsur C, H, dan N (Parwanayoni, 2008). Sutiknowati dan Ruyitno (2008) menyatakan bahwa bakteri heterotrofikdapat digunakan

sebagai salah satu indikator kualitas kesuburan suatu perairan, karena kemampuan menguraikan senyawa organik. Jika kelimpahan bakteri heterotrofik dalam suatu perairan tinggi dapat indikasi bahwa dalam suatu perairan terdapat cemaran bahan organik. BAHAN DAN METODE Peralatan yang digunakan pada penelitian ini antara lain: cawan petri, autoclave, tabung reaksi, botol schott, timbangan analitik, tabung eppendorf, pipet volumetriks, vorteks, kulkas,oven dan perangkat PCR. Bahan yang digunakan adalah isolat bakteri heterotrofik dari perairan Situ Cibuntu sebanyak 11 isolat; bahan media untuk pertumbuhan bakteri heterotrofik: tripton, glucose, yeast, agar, dan aquades, seperangkat reagen untuk identifikasi jenis bakteri heterotrofik secara makroskopis, mikroskopis, maupun reagen untuk reaksi molekular isolat bakteri. 

Prosedur Penelitian Proses ini dilakukan untuk menghindari adanya mikroorganisme dari peralatan yang akan digunakan. Proses sterilisasi dilakukan secara basah menggunakan autoclave dengan suhu 1210C, tekanan 1 atm selama 15 menit untuk pembuatan media, dan sterilisasi secara kering menggunakan oven dengan suhu 800C selama 2 jam untuk mensterilkan peralatan yang terbuat dari gelas dan baja (Hadioetomo, 1985).



Peremajaan Isolat Bakteri Heterotofik Proses ini dilakukan untuk meremajakan kembali bakteri heterotrofik yang akan digunakan dalam pengujian. Peremajaan bakteri menggunakan media NA. Diambil sedikit biakan bakteri heterotrofik kemudian digoreskan pada media NA miring dan diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Setelah diinkubasi selama 24 jam, biakan siap digunakan untuk pengujian karakteristik fenotipik bakteri. 

Pengujian Karakteristik Fenotipik Isolat Bakteri Heterotrofik Pengujian karakterisasi fenotipik bakteri heterotrofik dilakukan dengan beberapa pengujian diantaranya pengamatan morfologi atau makroskopis koloni bakteri berupa warna, bentuk, elevasi, permukaan, tepi, ukuran dan karakteristik optik; dan karakter mikroskopis koloni bakteri berupa bentuk sel, reaksi Gram, reaksi endospora dan uji kapsul. Pengujian karakterisasi fisiologis meliputi: UjiIndole, MR-VP, katalase, Uji motilitas dan uji oksidase. Isolat bakteri yang sudah diketahui karakternya kemudian dicocokkan dengan buku panduan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 9th Edition (Holt, et al., 2000). 

Amplifikasi PCR Reaksi PCR menggunakan alat PCR (Eppendorf German) dengan predenaturasi pertama pada suhu 94C selama 90 detik, dilanjutkan dengan 30

siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 95C selama 30 detik, penempelan primer pada suhu 50C selama 30 detik dan ekstensi pada suhu 72C selama 90 detik. Setelah 30 siklus selesai, diikuti fase pemanjangan pada suhu 72C selama 5 menit dan pendinginan pada suhu 4C selama 20 menit (Promega 2012). Hasil amplifikasi PCR (produk pcr) dielektroforesis menggunakan agarose gel 0,8%, dengan volume produk PCR per lane: 1 uL, voltase elektroforesis 100 V, waktu elektroforesis 25 menit dan volume 1Kb DNA ladder per lane: 1 uL. Gel hasil elektroforesis direndam dalam larutan ethidium bromida selama 30 menit. Gel didokumentasi menggunakan gel documentation system. Hasil amplifikasi PCR daerah sekuen 16S ribosomal DNA bakteri menghasilkan pita DNA tunggal dengan ukuran 1500 bp (Promega, 2012). Selanjutnya dipurifikasi dan di cycle seqencing dengan primer 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3') dan 1492R (5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT3'). Analisis sekuensing dilakukan di laboratorium First Base (Malaysia). Data hasil sekuensing selanjutnya di trimming dan di assembling dengan program BioEdit dan selanjutnya dikonversi dalam bentuk FASTA format. Hasil sekuensing DNA dalam bentuk FASTA format selanjutnya di BLAST untuk mencari homologi secara on line di pusat database DNA di NCBI.

PARAMETER YANG DIAMATI  Perbedaan karakter secara morfologi dan fisiologi dari 11 isolat bakteri heterotrofik dengan melihat morfologi bakteri yang disesuaikan dengan buku Bergey’s Manual of Determinative Microbiology. Identifikasi dilakukan dengan cara melihat bentuk koloni dan morfologi sel bakteri, sedang pengujian secara mikroskopis meliputi uji morfologi sel dan uji fisiologi sel bakteri  Identifikasi isolat bakteri heterotrofik dilakukan di mikrobiologi LIPI dengan metode coloni PCR dilakukan secara molekuler berdasarkan analisis genetik secara parsial. (Pitcher et al., 1990; Modified), ANALISIS DATA Data yang telah diperoleh dari berbagai pengujian yang telah dilaksanakan kemudian dilakukan analisis data secara deskriptif untuk mengetahui karakterisasi bakteri heterotrofik hingga tingkat genera dan berpedoman pada buku panduan Bergey’s Manual Of Determinative Bacteriology 9th Edition (Holt, et al., 2000). HASIL DAN PEMBAHASAN  Karakteristik Morfologi Bakteri Heterotrofik Dari hasil identifikasi 11 isolat bakteri heterotrofik secara morfologi diperoleh dua kelompok bakteri yaitu basilus dan kokus yang tumbuh pada media Nutrient Agar. Identifikasi

dilakukan secara morfologi meliputi bentuk dan elevasi koloni, bentuk sel, uji Gram, uji spora dan uji kapsul. Hasil selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 3 dan Tabel 4. Dari Tabel 3 tampak bahwa warna koloni secara umum berwarna putih, kecuali isolat TSi5 berwarna kuning bening dan TSi2 berwarna transparan. Bentuk koloni tumpul, elevasi koloni cekung, bentuk sel didominasi bentuk basil (batang). Hal ini sesuai dengan pendapat Hatim, W. (2013), bahwa Situ Cibuntu didominasi oleh kelompok bakteri berbentuk batang dikarenakan pH air berkisar antara 5,5 - 5,8 dan merupakan pH optimum untuk pertumbuhan bakteri heterotrofik. Dari hasil pengujian secara mikroskopis diperoleh hasil seperti pada Tabel 4, dimana isolat dengan kode isolat TSi5 memberikan hasil Pewarnaan Gram (+), Pewarnaan Spora (-) dan Pewarnaan Kapsul (-), berarti isolat TSi5 merupakan isolat yang bersifat tidak pathogen, mendominasi diperairan Situ Cibuntu, dan mampu menghasilkan enzim amylase yang dapat mengkatalisis proses hidrolisis pati menjadi senyawa sederhana yang dimanfaatkan untuk proses metabolisme bakteri itu sendiri. Hal ini sesuai dengan pendapat Inggit, dkk (2013) dan Hatim, W (2013) bahwa isolat TSi5 mampu membentuk zona hambat sebesar 5cm dan menghasilkan enzim amilase.



Hasil Identifikasi Sekuen DNA Sampel Bakteri Heteroprofik Isolat kode TSi5 teridentifikasi sebagai Micrococcus luteus. Sekuen isolat kode TSi5 dianalisis menggunakan BLAST di NCBI menunjukkan homologi dengan max identity 100 % terhadap Micrococcus luteus.



Karakteristik Molekuler Bakteri Heterotrofik Dari hasil pengujian karakteristik morfologi diperoleh isolat TSi5 merupakan isolat yang paling efektif menghasilkan enzim amilase, oleh karena itu isolat TSi5 yang di uji secara molekuler untuk menentukan jenis bakterinya menggunakan alat PCR yang dilakukan di laboratorium Mikrobiologi LIPI Cibinong, Bogor.

Gambar. 1. Isolat Bakteri Heterotrofik 

Amplifikasi PCR Hasil amplifikasi PCR daerah sekuen 16S ribosomal DNA bakteri divisualisasi menggunakan gel documentation system sebagai berikut :

di NCBI menunjukkan homologi dengn max identity 100 % terhadap Micrococcus luteus. Klasifikasi isolat bakteri tersebut sebagai berikut (Chen et al., 2009; Wieser, et al., 2009): Kingdom : Bacteria Filum : Actinobacteria Class : Actinobacteria Subclass : Actinobateridae Ordo : Actinomycetatles Famili : Micrococcaceae Genus : Micrococcus Spesies : Micrococcus luteus. Micrococcus luteus merupakan bakteri Gram positif, koloni berbentuk bulat dan berwarna kuning terang pada medium Nutrient Agar dan bersifat aerobe obligat. Micrococcus luteus ditemukan di tanah, air, udara dan sebagian merupakan flora normal kulit mamalia. Micrococcus luteus bersifat koagulase negative, sensitif pada basitrasin dan secara taksonomi berkerabat dekat dengan Micrococcus endophyticus (Chen et al.,2009; Wieser, et al., 2009). 

Dengan adanya hasil dokumentasi agarose, maka dapat diketahui bahwa DNA Micrococcus teramaplifikasi dengan sempurna dan menunjukkan berat bakteri tersebut sebesar 1500 bp . Dari hasil tersebut DNA yg teramplifikasi dapat diartikan DNA tersebut sesuai dengan praimer spesifik yg digunakan, sehingga bakteri dapat teridentifikasi sebangai bakteri Micrococcus luteus spesifik yaitu dari praimer. 

Hasil Identifikasi Sekuen DNA Sampel Bakteri Heteroprofik Isolat kode TSi5 teridentifikasi sebagai Micrococcus luteus. Sekuen isolat kode TSi5 dianalisis menggunakan BLAST

Karakteristik Morfologi Bakteri Heterotrofik Dari hasil identifikasi 11 isolat bakteri heterotrofik secara morfologi diperoleh dua kelompok bakteri yaitu basilus dan kokus yang tumbuh pada media Nutrient Agar. Identifikasi dilakukan secara morfologi meliputi bentuk dan elevasi koloni, bentuk sel, uji Gram, uji spora dan uji kapsul. Hasil selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 3 dan Tabel 4. Dari Tabel 3 tampak bahwa warna koloni secara umum berwarna putih, kecuali isolat TSi5 berwarna kuning bening dan TSi2 berwarna transparan. Bentuk koloni tumpul, Gambar. elevasi 3.koloni cekung, bentuk sel didominasi bentuk basil (batang). Hal ini sesuai dengan pendapat Hatim, W. (2013), bahwa Situ Cibuntu didominasi oleh kelompok bakteri berbentuk batang dikarenakan pH air berkisar antara 5,5 - 5,8 dan merupakan

pH optimum untuk pertumbuhan bakteri heterotrofik. Dari hasil pengujian secara mikroskopis diperoleh hasil seperti pada Tabel 4, dimana isolat dengan kode isolat TSi5 memberikan hasil Pewarnaan Gram (+), Pewarnaan Spora (-) dan Pewarnaan Kapsul (-), berarti isolat TSi5 merupakan isolat yang bersifat tidak pathogen, mendominasi diperairan Situ Cibuntu, dan mampu menghasilkan enzim amylase yang dapat mengkatalisis proses hidrolisis pati menjadi senyawa sederhana yang dimanfaatkan untuk proses metabolisme bakteri itu sendiri. Hal ini sesuai dengan pendapat Inggit, dkk (2013) dan Hatim, W (2013) bahwa isolat TSi5 mampu membentuk zona hambat sebesar 5cm dan menghasilkan enzim amilase. KESIMPULAN DAN SARAN  Dari hasil penelitian, karakteristik morfologi bakteri heterotrofik didominasi oleh kelompok bakteri berbentuk basil (batang), elevasi dari isolat makroskopis diperoleh elevasi isolat bakteri koloni cekung. Bakteri dengan kode isolat TSi5 merupakan isolat bakteri tidak pathogen dengan hasil uji Gram termasuk (+), uji Spora (-) dan uji Kapsul (-).  Hasil identifikasi bakteri isolat dengan kode isolat TSi5 teridentifikasi sebagai Micrococcus luteus, yang dianalisis menggunakan BLAST di NCBI menunjukkan homologi terhadap Micrococcus luteus. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai isolasi enzim amilolitik dari isolat TSi5 dan isolat-isolat lainnya.

DAFTAR PUSTAKA Achmad, R. 2004. Kimia Lingkungan. Penerbit Andi. Yogyakarta. Chen,H., G.Zhao, D.Park,3 Y.Zhang,L. Xu, J.Lee, C. Kim and W.Li . 2009. Micrococcus endophyticus sp. nov.,

isolated from surface-sterilized Aquilaria sinensis roots. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 59: 1070-1075. Ditjen POM. 1995. Farmakope Indonesia. Jilid IV. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta. Effendi, Hefni. 2003. Telaah Kualitas Air Bagi Pengelolaan Sumber Daya dan Lingkungan Perairan. Kanisuis, Yogyakarta. Fatmawati, R. Aniek. M. Dan M. Solichin. 2012. Kajian Identifikasi Daya Tampung Beban Pencemaran Kali Ngorowo Dengan Menggunakan Paket Program QUAL2Kw. Universitas Brawijaya. Malang. Jurnal : Teknik Perairan. Vol. 3. No. 2. Hindarko. 2003. Mengelola air limbah agar tidak mencemari orang lain. ESHA. Jakarta. Hadioetomo, R. S. 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek teknik dan Prosedur Dasar laboratorium. PT. Gramedia. Jakarta. Inggit.W, Tri. S. H , dan Tri R. N . 2013. Pemanfaatan Enzim Amilolitik Bakteri Heterotrofik Dalam Menurunkan Tingkat Pencemaran Perairan Tawar. Universitas Terbuka. Tangerang Janda, J. M. and S. L. Abbott. 2007. 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial ldentification in the Diagnostic Laboratory: Pluses, Perils, and Pitfalls. Minireview. Journal of Clinical Microbiology 45(9): 2761-2764. Jawetz E., J. L Melnick, E. A. Adelberg, G. F. Brooks, J. S. Butel, L. N. Ornston. 1995. Mikrobiologi Kedokteran, ed. 20, Universiti of California, San Fransisco. Kristanto, P. 2004. Ekologi Industri. Penerbit Andi, Yogyakarta. Lee, T.D. 1978. Handbook of Variables of Environmental Impact As Sesment

Arbor: An Arbor Science publishor inc. Parwanayoni, S. 2008. Pergantian Populasi Bakteri Heterotrofik, Alga, dan Protozoa di Lagoon BTDC Penanganan Limbah Nusa Dua Bali. Jurnal BumiLestari. Rahadi, B. Dan N. Lusiana. 2012. Penentuan Kualitas Air Tanah Dangkal dan Arahan Penelolaan (Studi Kasus Kabupaten Sumenep). Universitas Brawijaya. Malang. Jurnal: Teknologi Pertanian. Vol. 13. No. 2. Tannock, G.W. 1999. ldentification of Lactobacilli and Bifidobacteria. Current lssues Molecular Biology 1 (1): 53-64. Waluyo, L. 2009. Mikrobiologi Lingkungan. UMM press. Malang. Wieser M., E.B. M. Denner, P.Kampfer,P. Schumann, B. Tindall, U. Steiner, D. Vybiral, W. Lubitz, A. M. Maszenan, B. K. C. Patel, R.J. Seviour, C. Radax and H.J.Busse. 2002. Emended descriptions of the genus Micrococcus, Micrococcus luteus (Cohn 1872) and Micrococcus lylae (Kloos et al. 1974). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 52: 629–637. Wardhana, W.A. 2004. Dampak Pencemaran Lingkungan. Penerbit Andi, Yogyakarta