KARAKTERISTIK ANTI BAKTERI ISOLAT Lactobacillus DARI TEMPOYAK. (Skripsi) Oleh : Pratika Viogenta

KARAKTERISTIK ANTI BAKTERI ISOLAT Lactobacillus DARI TEMPOYAK (Skripsi)

Oleh : Pratika Viogenta

JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2010

ABSTRAK KARAKTERISTIK ANTIBAKTERI ISOLAT Lactobacillus DARI TEMPOYAK Oleh PRATIKA VIOGENTA

Antimikroba merupakan senyawa yang dikeluarkan oleh mikroorganisrne dan dapat menghambat atau membunuh mikroorganisme lain. Lactobacillus merupakan salah satu genus bakteri yang mampu menghasilkan senyawa antibakteri seperti asam organik, hidrogen peroksida (H2O2), karbon dioksida (CO2), diacetyl dan bakteriosin. Terdapat empat jenis isolat Lactobacillus dari tempoyak yaitu L1, L2, L3 dan L4. Keempat isolat Lactobacillus tersebut mampu menghambat pertumbuhan Escherichia coli. Namun, karakteristik antibakteri yang dihasilkan oleh ketiga isolat belum diketahui.

Tujuan dari penelitian ini adalah mendeteksi senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4 dengan cara mengukur total asam dan berat molekul bakteriosin isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4.

Penelitian ini akan dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Biomolekuler FMIPA Unila. Penentuan karakterisasi jenis antibakteri dilakukan dua tahapan yaitu penentuan asam organik dan protein sebagai senyawa antibakteri. Asam organik ditetapkan dengan mengukur pH media kultur dan total asam melalui titrasi menggunakan 0,1 N NaOH. Karakterisasi protein antibakteri dilakukan secara observasi. Karakterisasi protein antibakteri ditentukan dengan menetralkan supernatant kemudian diuji dengan metode difusi sumuran terhadap bakteri uji yaitu Esherchia.coli, Salmonella paratyphii ,

Bacillus substilis dan Staphilococcus aureus. Terbentuknya zona jernih menunjukkan zat antibakteri berupa protein, dilanjutkan dengan menetukan berat molekul protein yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji dengan menggunakan teknik Sodium Dodecyl Sulfat Polyakrilamide Gel Elektoforesis (SDS-PAGE).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa antibakteri yang dihasilkan dari isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4 berupa senyawa asam organik. Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 menghasilkan asam organik maksimum berturut-turut yaitu sebesar 37,15 untuk Lactobacillus L1, 36,13 untuk Lactobacillus L2, 29,94 untuk Lactobacillus L3, dan 7,89 untuk Lactobacillus L4. Selama fermentasi berlangsung, total asam organik yang diproduksi oleh keempat isolat Lactobacillus meningkat hingga hari ke 5 waktu produksi. Dari hasil SDS-Page diperoleh pada isolat L1, L2 dan L3 tidak terdapat pita protein yang terbentuk, sedangkan isolat Lactobacillus L4 menghasilkan protein dengan berat molekul 15 kDa, 24 kDa, 53 kDa dan 169 kDa akan tetapi bukan sebagai antibakteri

Key Word : Lactobacillus, Asam organik, Bakteriosin,Total Asam, SDS-PAGE

KARAKTERISTIK ANTI BAKTERI ISOLAT Lactobacillus DARI TEMPOYAK

Oleh

Pratika Viogenta Skripsi Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar SARJANA SAINS Pada Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2010

Judul Skripsi

: KARAKTERISTIK ANTI BAKTERI ISOLAT Lactobacillus DARI TEMPOYAK

Nama Mahasiswa

:

Nomor Pokok Mahasiswa

: 0617021058

Jurusan

: Biologi

Fakultas

: Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Pratika Viogenta

MENYETUJUI

1. Komisi Pembimbing

Dr. Sumardi, M.Si NIP 196503251991031003

Dra. Christina.N Ekowati, M.Si NIP. 195808181985032001

2. Ketua Jurusan Biologi

Dra. Nuning Nurcahyani, M. Sc NIP. 196603051991032001

MENGESAHKAN

1. Tim Penguji

Ketua

: Dr. Sumardi, M. Si

...............

Sekretaris

: Dra. Christina N. Ekowati, M. Si

...............

Penguji Bukan Pembimbing : Kusuma Handayani, M. Si

2. Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Dr. Sutyarso, M. Biomed. NIP. 195704241987031001

Tanggal Lulus Ujian Skripsi : 18 November 2010

...............

DAFTAR RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Kota Bandar Lampung pada tanggal 24 Maret 1989, dari pasangan Sanyoto dan Inah Lestari, S.Pd, sebagai anak kedua dari dua bersaudara. Penulis menyelesaikan pendidikan Taman Kanak-kanak di TK Al-Azahar Perumnas Way Halim pada tahun 1994, pendidikan dasar diselesaikan pada tahun 2000 di Sekolah Dasar AlAzahar Perumnas Way Halim, Sekolah Lanjutan Tingkat Pertama diselesaikan di SLTP Negeri 19 Bandar Lampung pada tahun 2003, dan Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri 2 Bandar Lampung pada tahun 2006. Penulis tercatat sebagai mahasiswa di Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung melalui jalur SPMB ( Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru) pada tahun 2006.

Selama menjadi mahasiswa, penulis berkesempatan mengikuti berbagai kegiatan keorganisasian di UKM. Rohani Islam tahun 2007-2009 sebagai anggota Biro Akademik, di HIMBIO sebagai anggota Bidang Hubungan Masayarakat pada tahun 2007-2008 dan sebagai seketaris Bidang Keilmuan pada tahun 2008-2009, dan di BEM FMIPA sebagai seketaris Dinas Lingkungan Hidup pada tahun 2009. Penulis juga pernah menjadi asisten dosen pada mata kuliah Fisiologi Tumbuhan, Genetika, Mikrobiologi Pangan dan Industri, Mikrobiologi Umum, Mikrobiologi Lingkungan, Fisiologi Mikrobiologi jurusan biologi FMIPA, Mikrobiologi STIKES UMITRA, Mikrobiologi Umum guru-guru SMP tahun 2010, dan

Pengenalan SAINS kepada guru-guru SD tahun 2010. Pada tahun 2009 penulis melaksanakan kerja praktek di Loka Penelitian dan Pengembangan Pengendalian Penyakit Bersumber Binatang (Litbang P2B2) Banjarnegara, Jawa Tengah.

“Jika niat sudah tertuju karena Allah, tidak akan ada halangan yang bisa menghentikan seseorang melakukan sesuatu. Niat karena Allah ialah motivator yang utama dan seharusnya menjadi satu-satunya motivator kita.” “Allah SWT memerintahkan kita untuk mau berpikir tentang penciptaan-Nya yang begitu menakjubkan, rumit, dan kompleks. Namun semua itu telah Allah SWT tundukan untuk kita. Ini sebagai tanda bahwa manusia memiliki kemampuan (dari Allah) untuk menundukan apa yang ada di langit dan di bumi.” “Allah SWT, tidak akan pernah menjanjikan hari-hari kita berlalu tanpa sakit, berhias tawa tanpa kesedihan, senang tanpa kesulitan, tapi Allah SWT menjajikan kekuatan kepada kita untuk dapat melewatinya”

Dengan Menyebut Nama Allah yang Maha Pengasih Dan Maha Penyayang

Dengan segala Cinta dan Kasih sayang kupersembahkan karya sederhana ini teruntuk orangorang yang akan selalu berharga dalam hidupku : Ibu dan Bapak tercinta dan dicintai Allah SWT Masku : Septian D.C Almamater yang ku banggakan

SANWACANA

Puji syukur penulis panjatkan kehadiran Allah SWT, yang telah melimpahkan rahmat, taufik serta hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelelesaikan skripsi yang berjudul “KARAKTERISTIK ANTIBAKTERI ISOLAT Lactobacillus DARI TEMPOYAK” dengan tepat waktu. Penelitian ini merupakan rangkaian dari penelitian “ISOLASI DAN KARAKTERISASI Lactobacillus DARI TEMPOYAK YANG BERPOTENSI SEBAGAI PENGAWET HAYATI BAHAN PANGAN” yang didanai oleh Dirjen Dikti Kementrian Pendidikan Nasional melalui Hibah Penguasaan Teknologi (Strategis Unila). Shalawat serta salam semoga selalu tercurah kepada suri taudalan terbaik umat manusia Nabi Muhamammad SAW.

Penyelesaian ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak baik berupa bantuan pemikiran ataupun bantuan moril sehingga pada kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih dengan setulus hati kepada. 1. Bapak Dr. Sumardi, M.Si., selaku pembimbing satu atas ide, saran-saran, motivasi, kesabarannya, waktunya serta bimbingannya kepada penulis dalam penyelesaian hasil penelitian ini. 2. Ibu Dra. Christina. N. Ekowati, M.Si., selaku pembimbing kedua atas kesabarannya dalam membimbing, mengkoreksi, kasih sayangnya, dan selalu memotivasi penulis.

3. Ibu Kusuma Handayani, M. Si selaku penguji yang telah memberikan saransaran, kritik serta koreksinya kepada penulis. 4. Bapak dan Ibu tercinta yang senantiasa memanjatkan doa, memberikan dukungan moril dan materil pada penulis. Semoga Allah SWT, senantiasa memberikan kemuliaan di dunia dan akhirat. 5. Ibu Dra. Rumyati, M.Si., selaku dosen pembimbing akademik atas bimbingannya selama penulis menjadi mahasiswa di Jurusan Biologi FMIPA Unila. 6. Bapak Dr. Sutyarso, M.Biomed., selaku Dekan FMIPA Unila. 7. Ibu Dra. Nuning Nurcahyani, M.Sc., selaku Ketua Jurusan Biologi FMIPA yang telah memberikan kemudahan pada penulis. 8. Seluruh dosen dan staf karyawan FMIPA khususnya jurusan Biologi 9. Kakakku yang telah memberikan perhatian serta kasih sayang yang mengalir tiada hentinya selama ini. 10. Teman seperjuanganku Kak Robi yang selalu membantu meski sudah lulus terlebih dahulu. 11. Penghuni lab mikrobiologi (mbak wiwin, mbak nur, kak asep, deby, ros, ria, mahendra) terima kasih atas bantuannya, perhatiannya, nasehatnya dan canda tawa sehingga penulis tidak merasa jenuh. 12. Teman-temanku Dora, Nensi, Gina, Rima dan semua teman-teman angkatan 2006 yang tidak bisa disebutkan satu persatu atas kebersamaan, bantuannya dan semua kenangan yang telah kita lalui bersama. 13. Adik-adikku penerus generasi mikrobiologi Ratna, Zahra, Dwi, Diah dan Wiwik jangan mudah menyerah dan selalu semangat.

14. Pak Sungadi, Pak Tris, Pak Imron, Bu Endang dan seluruh saudaraku biologi angkatan (’05-’09) serta semua pihak yang tidak bisa disebutkan satu persatu terima kasih atas bantuan selama ini dan persahabatannya.

Semoga Allah SWT membalas segala bantuan yang telah diberikan kepada penulis dan semoga penulisan skripsi ini dapat bermanfaat bagi yang membacanya

Bandar Lampung, November 2010 Pratika Viogenta

DAFTAR ISI

Halaman DAFTAR TABEL .......................................................................................... i DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... ii I.

PENDAHULUAN ................................................................................... 1 A. B. C. D. E.

Latar Belakang .................................................................................... 1 Tujuan Penelitian ................................................................................ 3 Kerangka Pemikiran ............................................................................ 3 Hipotesis ............................................................................................. 4 Manfaat Penelitian .............................................................................. 5

II. TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................... 6 A. B. C. D. E. F.

Lactobacillus ....................................................................................... 6 Antibakteri .......................................................................................... 7 Asam Organik ..................................................................................... 8 Hidrogen Peroksida ............................................................................. 11 Karbon Dioksida ................................................................................. 12 Bakteriosin .......................................................................................... 13 2.6.1. Karakteristik Bakteriosin .......................................................... 13 2.6.2. Penggolongan Bakteriosin ........................................................ 14 2.6.3. Mekanisme Kerja Bakteriosin ................................................... 18 2.6.4. Imunitas Bakteri Penghasil Bakteriosin .................................... 20

III. METODE PENELITIAN ....................................................................... 22 A. B. C. D.

Tempat dan Waktu Penelitian ............................................................. 22 Alat dan Bahan .................................................................................... 22 Metode Penelitian ............................................................................... 23 Prosedur Kerja .................................................................................... 24 1. Peremajaan Bakteri ....................................................................... 24 2. Produksi Senyawa Antibakteri ...................................................... 24 3. Karakterisasi Antibakteri Berupa Asam Organik ......................... 25 4. Uji Daya Antibakteri ..................................................................... 25

5. Sodium Dodecyl Sulfat-Polyakrilamide Gel Elektoforesis (SDS-PAGE) dan Identifikasi Aktivitas Pita Protein ................... 27 6. Diagram Alir ................................................................................. 30

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................... 31 A. Karakterisasi Antibakteri Senyawa Asam Organik ............................ 31 B. Karakterisasi Antibakteri Senyawa Protein ........................................ 37

V. KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................... 42 A. Kesimpulan ......................................................................................... 42 B. Saran ................................................................................................... 43

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 44 LAMPIRAN

DAFTAR TABEL

Tabel

Halaman

1.

Klasifikasi Bakteriosin .............................................................................. 16

2.

Penggolongan Bakteriosin Berdasarkan Kandungan Sistein .................... 17

3.

Komposisi Gel Pemisah dan Gel Penahan ................................................ 27

4.

Analisis Ragam Total Asam yang Dihasilkan Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 Dan L4 Terhadap Waktu Produksi (Hari) ..................................... 33

5.

Zona Hambat dari Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sebelum dan Sesudah Dinetralkan Terhadap Bakteri Uji ........ 38

6.

Hasil Pengukuran pH Media Kultur Isolat Lactobacillus ......................... 48

7.

Hasil Pengukuran Total Asam Media Kultur Isolat Lactobacillus ........... 48

8.

Penetuan Kurva Logaritma Berat Molekul Protein Standart Terhadap Mobilitas Relatif (rf) ................................................................................. 54

9.

Penetuan Berat Molekul Protein Terhadap Mobilitas Relatif (Rf) Pada Isolat Lactobacillus L4

DAFTAR GAMBAR

Gambar

Halaman

10. Model Pembentukan Pori pada Membran, Barrel-Stave dan Carpet Model ....................................................................................................... 20 11. Model Mekanisme Kerja Protein Imunitas ............................................... 21 12. Bentuk Sumur Dilihat dari Bagian Bawah Cawan Petri ........................... 27 13. Pola Perubahan pH Media Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 yang Diamati Tiap Hari Sampai Hari Ke 5........................................................ 31 14. Total Asam Organik Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 yang Diamati Tiap Hari Sampai Hari Ke 5........................................................ 32 15. Uji Polinomial Orthogonal Isolat Lactobacillus L1.................................. 34 16. Uji Polinomial Orthogonal Isolat Lactobacillus L2.................................. 34 17. Uji Polinomial Orthogonal Isolat Lactobacillus L3.................................. 35 18. Uji Polinomial Orthogonal Isolat Lactobacillus L4.................................. 35 19. SDS-PAGE Isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4 ........................................................................... 40 20. Gel SDS-PAGE Ektrak Antibakteri L4 yang Diuji Terhadap St.Aureus .. 40 21. Isolat Lactobacillus L1 ............................................................................. 46 22. Isolat Lactobacillus L2 ............................................................................. 46 23. Isolat Lactobacillus L3 ............................................................................. 47 24. Isolat Lactobacillus L4 ............................................................................. 47

25. Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Staphylococcus aureus ............... 48 26. Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Staphylococcus aureus ................ 48 27. Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Bacillus substilis ......................... 48 28. Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Bacillus substilis.......................... 49 29. Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Escherchia coli ........................... 49 30. Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Escherchia coli ............................ 49 31. Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Salmonella paratyphii ................ 50 32. Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Salmonella paratyphii ................. 50 33. Grafik Logaritma Berat Molekul Protein Standart Terhadap Mobilitas Relatif ....................................................................................................... 52

I.

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Lactobacillus merupakan salah satu mikroorganisme yang aman jika ditambahkan dalam bahan pangan karena sifatnya tidak tosik dan tidak menghasilkan toksik. Bahkan, Lactobacillus bermanfaat bagi kesehatan dan meningkatkan keamanan bahan pangan melalui penghambatan secara alami terhadap pertumbuhan mikroorganisme berbahaya yang menyebabkan pembusukan pada makanan maupun menyebabkan penyakit. Lactobacillus berfungsi sebagai pengawet makanan karena mampu memproduksi senyawa antibakteri seperti asam organik, hidrogen peroksida (H2O2), karbon dioksida (CO2), diacetyl dan bakteriosin (Kusmiati dan Malik, 2002).

Lactobacillus ditemukan pada produk-produk makanan fermantasi seperti thongcai, lemma, tempoyak, ikan fermentasi, tauco, rebung asin dan sawi asin (Wulandari, 2005). Tempoyak merupakan salah satu jenis makanan tradisional yang melibatkan bakteri Lactobacillus dalam prosesnya. Tempoyak berasal dari daging buah durian yang diolah dengan cara fermentasi secara spontan dengan menambahkan garam 6-16 % dalam wadah tertutup. Tempoyak dikenal di Indonesia, terutama di Sumatera dan Kalimatan serta Malaysia (Yuliana dan Garcia, 2010). Isolat yang ditemukan

di dalam tempoyak antara lain Lactobacillus plantarum, L. brevis, L. mali, L. fermentum L.casei, dan L. corynebacterium. Jenis bakteri asam laktat lain yang juga ditemukan pada tempoyak yaitu Leuconostoc mesenteroides, Pediacoccus acidilactici dan Weisella mesenteroides ( Yuliana dan Garcia, 2009).

Ekowati (2000) melaporkan bahwa dua jenis isolat Lactobacillus yang diperoleh dari tempoyak mampu menghambat pertumbuhan Escherchia coli dan Streptococcus haemoliticus. Konsentrasi filtrat kedua isolat Lactobacillus tersebut mulai dari 40 % (v/v) efektif menurunkan jumlah sel bakteri E. coli dan S. haemoliticus. Berdasarkan hasil analisis asam organik, isolat Lactobacillus memproduksi asam laktat 0,4257 % (v/v), asam asetat 0,0717 % (v/v), asam propionat 0,0502 % (v/v), dan asam butirat 0,01 % (v/v).

Ekowati (2009) memperoleh tiga jenis isolat Lactobacillus dari tempoyak yaitu L1, L2 dan L3. Ketiga isolat Lactobacillus tersebut mampu menghambat pertumbuhan Escherichia coli. Daya hambat zat antibakteri dari ketiga isolat terhadap pertumbuhan Escherichia coli relatif sama, yang terlihat dari diameter zona hambat berkisar 1,65 cm-2,2 cm. Hal ini menunjukkan bahwa ketiga isolat tersebut menghasilkan suatu senyawa antibakteri tertentu. Menurut Ogunbawo et all (2003), Lactobacillus plantarum ST194BZ menghasilkan senyawa antibakteri dalam bentuk asam organik dan protein. Jenis senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh ketiga isolat belum diketahui. Berdasarkan permasalahan tersebut maka perlu

dilakukan penelitian mengenai karakteristik antibakteri yang dihasilkan oleh isolat Lactobacillus dari tempoyak.

B. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat Lactobacillus dari tempoyak.

C. Kerangka Pemikiran

Lactobacillus dapat diisolasi dari makanan yang telah mengalami fermentasi seperti tempoyak. Pada proses terbentuknya tempoyak, penambahan garam dapur sebesar 3-7 % pada daging buah durian akan menyebabkan Lactobacillus tumbuh dengan baik. Hasil metabolit Lactobacillus pada tempoyak terbentuk asam-asam organik dari karbohidrat yang berasal dari daging buah durian. Beberapa asam organik dapat bersifat toksik terhadap mikroorganisme patogen ataupun mikroorganisme pembusuk pada makanan. Isolat Lactobacillus yang diperoleh dari tempoyak berpotensi menghasilkan senyawa antibakteri yang mampu menghambat pertumbuhan Escherichia coli. Daya hambat zat antibakteri dari ketiga isolat terhadap pertumbuhan Escherichia coli relatif sama, yang terlihat dari diameter zona hambat berkisar 1,65 cm – 2,2 cm.

Lactobacillus yang berasal dari tempoyak mampu memproduksi jenis asamasam organik, yaitu asam laktat 0,4257 % (v/v), asam asetat 0,0717 % (v/v), asam propionat 0,0502 % (v/v), dan asam butirat 0,01 % (v/v). Senyawasenyawa tersebut dapat menghambat pertumbuhan dari bakteri patogen dan

bakteri pembusuk makanan sehingga dapat digunakan sebagai zat antibakteri. Pada umumnya tidak hanya asam organik yang dihasilkan Lactobacillus mampu menghambat mikroorganisme lain tetapi terdapat senyawa lain yang ikut berperan di dalam penghambatan pertumbuhan bakteri pembusuk dan patogen seperti H2O2, diasetil, CO2, dan bakteriosin. Dalam metabolisme Lactobacillus, ada kemungkinan Lactobacillus yang berasal dari tempoyak mengubah asam-asam organik menjadi asam amino. Asam – asam amino tersebut dapat digunakan oleh Lactobacillus untuk menyusun bakteriosin atau protein penghambat. Bakteriosin merupakan substansi protein yang dikode oleh plasmid, umumnya mempunyai berat molekul kecil serta memiliki aktivitas menghambat pertumbuhan bakteri lain (bakterisidal), terutama yang memiliki kekerabatan erat secara filogenik.

Bakteriosin dihasilkan oleh bakteri Lactobacillus antara fase logaritmik dan awal fase stasioner. Faktor lingkungan sangat mempengaruhi pertumbuhan bakteri Lactobacillus maupun hasil metabolitnya. Penambahan substrat seperti ekstrak yeast (3%), NaCl (1.0-2.0%), glukosa (1.0%) dan Tween 80 (0.5%) menghasilkan bakteriosin dalam jumlah optimal. Substrat-substrat tersebut digunakan Lactobacillus sebagai prekursor senyawa antibakteri. Aktivitas maksimal bakteriosin dicapai pada awal pH 5.5 dan diinkubasi antara 48 jam hingga 60 jam pada suhu 30 – 37 oC.

D. Hipotesis

Hipotesis yang diajukan yaitu isolat Lactobacillus dari tempoyak dapat menghasilkan antibakteri berupa senyawa asam organik dan protein.

E. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai jenis senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh isolat Lactobacillus dari tempoyak dalam menghambat pertumbuhan bakteri lain. Selanjutnya informasi ini diharapkan dapat bermanfaat sebagai biopreservatif terhadap bahan pangan.

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Lactobacillus

Lactobacillus merupakan bakteri gram positif, tidak berspora, berbentuk batang atau coccosbacilli. Pada umumnya mengandung guanin-citosin di dalam DNA kurang dari 50 mol%. Lactobacillus dapat melakukan fermentasi, bersifat aero-toleran atau anaerobik, aciduric atau acidophilic dan memerlukan asupan nutrisi yang kompleks seperti karbohidrat, asam amino, peptida, ester asam lemak, garam, derivat asam nukleat dan vitamin. Lactobacillus tidak mensintesis porphyrinoids begitu juga dengan aktivitas yang terkait dengan porphyrinoids. Namun, terdapat beberapa strain dari Lactobacillus dapat menggunakan porphorinoid dari lingkungan dan memperlihatkan aktivitas katalase, reduksi nitrit bahkan sitrokrom. Strain Lb. mali mampu membentuk pseudocatalase (Wood dan Holzapfel, 1995).

Lactobacillus mampu merombak senyawa kompleks menjadi senyawa yang lebih sederhana dengan hasil akhirnya yaitu asam laktat (Rostini, 2007). Glukosa sebagai sumber karbon dimetabolisme membentuk 85 % asam laktat oleh Lactobacillus yang bersifat homofermentatif atau menghasilkan asam laktat, CO2, etanol oleh Lactobacillus yang bersifat heterofermentatif (Nur, 2005).

Apabila jumlah oksigen atau senyawa oksidan lain meningkat, sejumlah asam asetat akan terbentuk dari asam laktat atau etanol melalui reaksi asetat kinase. Demikian variasi metabolisme Lactobacillus membentuk metabolit. Berbagai hasil metabolit seperti sitrat, malat, tartar, quinolat, nitrat, dan nitrit dapat juga di metabolisme kembali dan digunakan sebagai sumber energi atau penerima elektron terakhir (Wood dan Holzapfel, 1995)..

B. Antibakteri

Antibakteri adalah senyawa yang dihasilkan oleh mikroorganisme hidup yang mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain terutama bakteri, bahkan dapat membunuhnya (Irianto, 2007). Suatu antibakteri yang ideal memiliki toksisitas selektif, berarti obat antibakteri tersebut hanya berbahaya bagi bakteri, tetapi relatif tidak membahayakan bagi hospes. Berdasarkan sifat toksisitas selektif. Ada bakteri yang bersifat menghambat pertumbuhan bakteri (bakteriostatik) dan ada yang bersifat membunuh bakteri (bakterisida). Berdasarkan mekanisme kerjanya, antibakteri dibagi menjadi 5 kelompok, yaitu: 1) Merusak dinding sel yaitu dengan menghambat pembentukan dan mengubahnya setelah selesai terbentuk. 2) Mengganggu permeabilitas sel yaitu dengan merusak membran sel. Fungsi membran sel adalah mempertahankan bahan-bahan dalam sel serta mengatur aliran keluar masuknya bahan lain. Adanya kerusakan pada membran ini mengakibatkan terhambatnya pertumbuhan sel atau matinya.

3) Merubah molekul protein dan asam nukleat yaitu dengan mendenaturasikan protein dan asam nukleat sehingga kerusakan sel tidak dapat diperbaiki lagi karena hidup suatu sel tergantung pada molekul protein dan asam nukleat dalam keadaan alamiah. 4) Menghambat kerja enzim dengan mengganggu reaksi biokimiawi. Penghambatan ini dengan mengakibatkan terganggunya metabolisme sel. 5) Menghambat sintesis asam nukleat dan protein. Gangguan pada pembentukan atau fungsi-fungsi DNA, RNA dan protein dapat mengakibatkan kerusakan total pada sel, karena zat-zat tersebut memegang peranan penting dalam proses kehidupan normal sel (Mulyanti, 2009).

Bakteri Lactobacillus berpotensi menghasilkan antibakteri yang mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme berbahaya yang menyebabkan pembusukan pada makanan maupun menyebabkan penyakit melalui produk metabolik seperti asam organik, hidrogen peroksida (H2O2), karbon dioksida (CO2), diacetyl dan bakteriosin (Ogunbanwo et all, 2003).

C. Asam Organik

Ketika proses fermentasi glukosa, Lactobacillus mampu memproduksi asam laktat secara homofermentasi atau sebanding dengan jumlah asam laktat, asam asetat, etanol dan karbondioksida secara heterofermentatif. Apabila proses tersebut diamati selama seminggu, asam organik yang dihasilkan Lactobacillus memiliki suatu aktivitas antimikroba yang lebih besar pada pH

rendah dibandingakan dengan pH netral. Mengenai kedua asam yang terbentuk, asam asetat memiliki aktivitas penghambat yang paling kuat dan mempunyai suatu cakupan lebih luas dalam hal aktivitas menghambat pertumbuhan khamir, kapang dan bakteri sedangkan asam propionat memiliki efek antimikroba yang kuat khususnya untuk khamir dan kapang (Salminen et all, 2004).

Aktivitas antimikroba asam asetat dan asam propionat lebih kuat dibandingkan dengan aktivitas antimikroba dari asam laktat. Hal ini dapat dijelaskan dari tingginya nilai pKa asam asetat ( pKa = 4,87) dan asam propionat (pKa = 4, 75) dibandingkan dengan nilai pKa asam laktat (pKa = 3,08). Sebagai contoh, pada pH 4, hanya 11 % dari asam laktat yang tidak terdisosiasi sedangkan 85 % asam asetat dan 92 % asam propionat tidak terdisosiasi. Namun, ketika terbentuk campuran asam-asam organik, terjadi kerja sama dalam meningkatkan aktivitas menghambat. Sebagian besar asam laktat menyebabkan pH menurun disaat asam asetat dan asam propionat yang tidak terdisosiasi menjadi agen antimikroba. Gabungan dari asam laktat dan asam asetat mampu mengurangi laju pertumbuhan Salmonella enetric ser var Typhimurium lebih baik daripada aktivitas masing-masing dari asam laktat atau asam asetat sendiri (Salminen et all, 2004).

Asam laktat selain menurunkan pH juga dapat menggangu permeabilitas membran, dengan demikian dapat meningkatkan aktivitas dari substansi antimikroba lainnya. Mekanisme antimikroba asam laktat berdasarkan teori "chemiosmotic" dan pH homeostasis. Ketika asam laktat yang diproduksi

disekresikan ke lingkungan, beberapa molekul terdisosiasi menjadi H+ dan anion, sementara yang lain tidak terdisosiasi. Salah satu faktor yang berperanan terhadap terdisosiasi atau tidaknya suatu molekul adalah pH lingkungan dan pK (tetapan keseimbangan). Hal ini menyebabkan peningkatan proton transmembran yang pada akhirnya menyebabkan gradient proton. Perbedaan ini menyebabkan proton lebih cepat masuk ke dalam sel sehingga meningkatkan kebutuhan energi untuk mempertahankan pH alkali dalam sel. (Lunggani, 2007). Banyak orang mengasumsikan bahwa molekul asam lemah yang tidak terdisosiasi menjadi racun, walaupun asam yang terdisosiasi telah banyak yang mengamati juga mampu menghambat pertumbuhan mikroba. Hal ini dapat dijelaskan bahwa asam organik yang tidak terdisosiasi (netral) dapat berdifusi melewati membran sel karena asam organik yang tidak terdisosiasi larut dalam lipid. Setelah memasuki sel, asam akan terdisosiasi pada pH sitoplasma yang biasanya mendekati netral (Salminen et all, 2004).

Banyak peneliti menyatakan bahwa pelepasan proton ke dalam sitoplasma berperan penting di dalam proses pengasaman dan menghilangnya perbedaan pH yang berlebih pada membran sehingga menyebabkan pertumbuhan mikroba terhambat. Namun, beberapa peneliti lainnya menyatakan bahwa hipotesis ini harus ditinjau kembali karena melihat bahwa proton tidak dapat ditranslokasi. Menurut mereka, akumulasi anion yang menjadi faktor utama menyebabkan pertumbuhan mikroba terhambat jika dilihat dari jumlah anion berkurang pada sintesis makromolekul dan anion mempengaruhi sistem

transport pada membran sel. Seperti bakteri lainnya, bakteri asam laktat memberikan efek penetralan dari akumulasi anion dengan cara mengurangi pH sitoplasma mikroba patogen dan mikroba pembusuk (Salminen et all, 2004).

D. Hidrogen Peroksida

Dalam kondisi adanya oksigen, bakteri asam laktat menghasilkan hydrogen peroksida melalui oksidasi molekul yang mengandung flavoprotein, oksidasi NADH, dan superoxide dismutase. Bakteri asam laktat tidak menghasilkan katalase yang berfungsi mungurai hydrogen peroksida. Pada sistem lainnya bahwa penguraian hydrogen peroksida tidak seaktif dibandingkan dengan produksi hydrogen peroksida itu sendiri sehingga terjadi akumulasi hydrogen peroksida. Hydrogen peroksida tidak akan terakumulasi sebab hydrogen proksida diuraikan oleh peroksidase, flavoprotein, dan pseudcatalase. Pengaruh bakterisidal dari hydrogen peroksida dihubungkan dengan efek oksidasi yang kuat di dalam sel bakteri seperti kelompok sulfidril dari protein sel dan lipid membran dapat dioksidasi. Untuk menghasilkan hidrogen peroksida dibutuhkan oksigen sehingga menyebabkan lingkungan menjadi anerobik. Hal ini tidak baik untuk organisme yang bersifat aerobik (Salminen et all, 2004).

Di dalam kondisi normal, pengaruh antimikroba dari hidrogen proksida kemungkinan ditingkatkan karena adanya lactoperoksidase dan thiocyanate (SCN-). SCN- +H2O2

lactoperoxidase

OSCN- + H2O

OSCN- menyebabkan kerusakan struktural dan perubahan pada membran sel bakteri. Namun yang menjadi faktor utama hidrogen peroksida menjadi senyawa antimikroba yaitu menghambat proses glikolisis. Hidrogen peroksida menghambat pengangkutan glukosa, aktivitas heksokinase, dan aktivitas glyceraldehyde-3-phosphat dehidrogenase dengan cara mengoksidasi sulfhydryl yang terdapat didalam enzim tersebut (Salminen et all, 2004).

E. Karbon Dioksida

Karbon dioksida dihasilkan selama proses fermentasi glukosa dan respirasi berlangsung. Karbon dioksida memiliki pengaruh antimikroba ganda. Karbon dioksida dapat menyebabkan lingkungan menjadi anaerob dan karbon dioksida itu sendiri bersifat antimikroba. Mekanisme penghambatan dari karbon dioksida belum banyak diketahui tetapi karbon dioksida mampu menghambat aktivitas enzim dehidrogenase dan terjadinya akumulasi karbon dioksida di dalam lipid bilayer menyebabkan tidak berfungsinya permeabilitas membran. Pada konsentrasi karbon dioksida dalam keadaan rendah dapat merangsang pertumbuhan beberapa organisme sedangkan pada konsentrasi yang lebih tinggi dapat menghambat pertumbuhan (Salminen et all, 2004).

F. Bakteriosin 2.6.1 Karakteristik Bakteriosin

Bakteriosin merupakan antimikrobia yang berupa protein dan disintesis secara ribosomal (Suparjo, 2008). Bakteriosin memiliki pengaruh bakterisidal dan bakteriostatik terhadap bakteri yang mempunyai hubungan dekat dengan bakteri penghasilnya (Kusmiati dan Malik, 2002). Bakteri target memiliki sifat pengikatan spesifik (specific binding site) (Usmiati,2009).

Bakteriosin biasanya tahan terhadap panas, dan aktivitasnya masih tetap ada dalam lingkungan asam misalnya pada suhu 100˚C atau 121˚C selama 15 menit (Ogunbawo et all, 2003), demikian pula suhu yang sangat rendah dalam penyimpanan tidak mempengaruhi aktivitas bakteriosin. Umumnya, bakteriosin memiliki sifat mudah didegradasi enzim proteolitik seperti protease (Usmiati,2009).

Bakteriosin dihasilkan baik oleh bakteri gram positif maupun bakteri gram negatif. Bakteriosin gram positif mengandung 30 sampai 60 asam amino dengan aktifitas yang bervariasi dari spektrum sempit sampai luas delam melawan bakteri gram positif lainnya (Suparjo,2009).

Bakteriosin disintesis selama fase eksponensial pertumbuhan sel mengikuti pola sintesis protein. Sistem ini diatur oleh plasmid DNA. Pada umumnya, bakteriosin non lantibiotik disintesis melalui jalur

ribosomal, sedangkan kelompok lantibiotik disintesis secara ribosomal sebagai prepeptida kemudian mengalami modifikasi. Sekresi prepeptida dilakukan pada fase eksponensial dan diproduksi secara maksimal pada fase stasioner. Prinsip regulasi sintesis bakteriosin diatur oleh adanya gen pengkode produksi dan pengkode immunitas.

Aktivitas produksi bakteriosin oleh bakteri asam laktat dipengaruhi oleh faktor pH, suhu, sumber karbon, serta fase pertumbuhan. Jenis sumber karbon maupun sumber nitrogen yang digunakan dalam medium produksi mempengaruhi laju pertumbuhan sel bakteri asam laktat, selanjutnya berpengaruh terhadap metabolisme produksi bakteriosin. Selain itu, tingkat salinitas medium produksi seperti kandungan garam dari media turut mempengaruhi metabolisme produksi bakteriosin. Secara umum kondisi optimum produksi bakteriosin selain dipengaruhi oleh fase pertumbuhan, pH media, suhu inkubasi, jenis sumber karbon dan sumber nitrogen juga konsentrasi NaCl (Kim, 1990).

2.6.2 Penggolongan Bakteriosin

Bakteriosin berdasarkan sifat kimia, struktur dan fungsinya dibagi menjadi 4 kelas yaitu a. Kelas I : Lantibiotik, peptida molekul kecil dengan berat molekul kurang 5 kDa mengandung lanthionine (Lan), β-metyl lanthionine (MeLan), dehydroalanine dan dehydrobutyrine serta mengandung 19 sampai 50 asam amino. Kelas ini dibagi lagi menjadi menjadi 2 tipe berdasarkan struktur kimia dan aktifitas antimikroba, yaitu tipe

A dan tipe B. Tipe A memiliki bentuk ulir, bermuatan positif, aktifitasnya berhubungan dengan pembentukan pori pada membran sel. Tipe B memiliki bentuk globular bermuatan negatif atau netral, aktifitas mikrobanya terkait dengan penghambatan enzim spesifik. b. Kelas II : peptida yang stabil terhadap panas, berat molekul lebih kecil dari 10 kDa, tidak memiliki asam amino lantionine dan tidak terjadi perubahan asam amino. Kelas ini dibagi menjadi tiga subkelas, yaitu bakterosin yang mempunyai efek antilisterial (IIa), bakteriosin dengan dua peptida (IIb), dan bakteriosin yang disekresikan melalui sec-dependent (IIc). Namun menurut van Belkum dan Stiles dalam Supajo (2009) membagi kelas bakteriosin ini menjadi enam subkelas antara lain IIa : cystibiotics dengan dua ikatan disulfida yang dihasilkan dari empat asam amino sistein. Contoh pediosin PA-1, pediosin AcH, Enterocin A dan Divercin V41. IIb : Cyntibiotics dengan satu ikatan disulfida dari dua residu sistein pada N-section peptida, contoh pada leucocin A. IIc : cyntibiotics dengan satu ikatan disulfida pada N- dan C-section peptida, contoh pada carnobacteriocin A dan enterocin B. IId : peptida yang mengandung satu (thiolbiotics) atau tanpa sisten, contoh pada lactococcin A dan B. IIe : bakteriosin yang memiliki dua peptida, contoh pada thermophilin 13, lactacin F, plantaracin S, plantaracin A, plantaracin EF, plantarain JK, lactococcin G dan lactococcin M. Iif : bakteriosin khas, contoh entrocin 4.

c. Kelas III : protein labil terhadap panas dengan molekul lebih besar dari 30 kDa d. Kelas IV : suatu kelompok bacteriocin kompleks. Protein ini mengandung lipid atau karbohidrat (glikoprotein dan lipoprotein), Bakteriosin yang bersifat hidrofobik dan stabil terhadap panas. (Alpay et

all, 2003 ; Suparjo, 2008).

Tabel 1. Klasifikasi Bakteriosin Kelompok I

A

B

II

a

Karakteristik Molekul kecil (2-5 kDa), mengandung asam amino lanthionine dan βmethyllanthionine, bermuatan positif, berbentuk ulir

Molekul kecil (< 2 kDa), bermuatan negatif atau netral, berbentuk globular

Peptida anti-listerial

Contoh Bakteriosin

Bakteri Penghasil

Nisin

Lactococcus lactis

Pep 5

Stapylococcus epidermidis

Epidermin

Stapylococcus epidermidis

Lactoccin S

Lactobacillus sake

Gallidermin

Stapylococcus gallinarum

Lacticin 481

Lactococcus lactis

Marsacidin

Bacillus subtilis

Actagardin

Actinoplasnes sp

Cinnamycin

Streptomyces cinnamoneus

Pediosin PA-1/AcH

Pediococcus acidilactici H / PAC1.0

Sakacin A

Lactobacillus sake LB706

Sakacin P

Lactobacillus sake LTH 674

Leucocin AUAK187

Leuconostoc gelidium UAL187

Carnobacteriocin B2

Carnobacterium piscicola LV17B

Mesentrecin Y105

Leuconostoc mesenteroides

B

C

III

IV

Bakteriosin 2-peptida

Bakteriosin yang disekresikan melalui secdependent

Molekul besar (> 30 kDa) sensitif terhadap panas Mengandung protein dan lipid

Lactococcin MMFII

Lactococcus lactis

Lactococcin G

Lactococcus lactis

Lactococcin M

Lactococcus lactis

Lactacin F

Lactobacillus johnsonii

Plantacirin A

Lactobacillus plantarum

Plantacirin EF


Plantacirin JK


Acidin B

Lactobacillus acidophilus

Carnobacteriocin A

Carnobacterium piscicola LV17A

Divergicin A

Arnobacterium divergens LV13

Enterocin P

Enterococcus faecum

Enterocin B

Enterococcus faecum T136

Lactococcin A

Lactococcus lactis LMG2130

Lactococcin B

Lactococcus lactis WMA4

Acidocin B

Lactobacillus acidophilus M46

Cerein 7 / 8

Bacillus cereus Bc7

Helveticins J

Lactobacillus helveticus

Helveticins V-1829

Lactobacillus helveticus

Lactococcin 27 Lacstrecins

(Suparjo,2008)

Bakteriosin berdasarkan kandungan sistein atau ikatan disulfida dikelompokkan menjadi 3 kelompok yaitu 1. Cystibiotic; mengandung dua atau lebih asam amino sistein untuk ikatan disulfida 2. Thiobiotic ; mengandung satu sistein 3. Tanpa sistein

Tabel 2. Penggolongan Bakteriosin Berdasarkan Kandungan Sistein Bakterosin

Berat Molekul (kDa)

Asam Amino

Bakteri Penghasil

4,6

44 37 37 41 43 57 53 43 48 56

Pediococcus acidilactic H/PAC1.0 Leuconostoc gelidium UAL 187 Leuconostoc mesenteroides Y 105 Lactobacillus sake LB706 Lactobacillus sake LTH 674 Lactobacillus acidophilus 11088 Carnobacterium piscicola LV 17A Carnobacterium piscicola LV17B Carnobacterium piscicola LV17B Bacillus cereus Bc7

5,3

47

Lactococcus lactis subsp cremoris 9B4

Lactococcin A

5,8

54

Lactococcin M Lactococcin N Lactococcin Gα Lactococcin Gβ

4,3 4,4 4,3 4,1

48 47 39 65

Lactococcus lactis subsp cremoris 9B4, Lac. lactis subsp cremoris LMG 2130 Lac. lactis subsp lactis bv diacetylactic WM4 Lac. lactis subsp cremoris 9 B4 Lac. lactis subsp cremoris 9 44 Lac. lactis subsp lactis LMG 2081 Lac. lactis subsp lactis LMG 2081

Cystibiotics Pediosin AcH/PA1 Leucocin A/UAL 187 Mesentericin Y 105 Sakacin A Sakacin P Lactacin F Carnobacteriocin A Carnobacteriocin BM1 Carnobacteriocin B2 Cerein 7/8

3,9 3,8 4,3 4,4 5,6 6,1 4,5 4,9 4,9

Thiolbiotics Lactococcin B Non Sistein

(Suparjo,2008)

2.6.3 Mekanisme Kerja Bakteriosin

Usmiati (2009) menyebutkan bahwa target utama bakteriosin adalah membran sitoplasma sel bakteri karena reaksi awal bakteriosin adalah merusak permeabilitas membran dengan membentuk pori pada membrane sel dan menghilangkan gaya gerak proton (proton motive force (PMF)). Gaya gerak proton merupakan gradien elektrokimia membran sitoplasma yang mengatur sintesis dan penimbunan ATP. Kegagalan gaya gerak proton menyebabkan kematian sel melalui penghentian semua reaksi yang membutuhkan energi, biosintsesis protein atau asam nukleat (Suparjo, 2008).

Pembentukan pori pada membran sel menyebabkan destabilitas membran sehingga dapat mengganggu kesetimbangan ADP/ATP intraseluler akibat kebocoran pospat anorganik, mengurangi daya gerak proton dan jumlah kation bivalensi ( Mg2+ atau Ca2+ ) yang menyebabkan penetralan muatan negatif fosfolipid dan memungkinkan perembesan ion ( K+ dan Mg2+ ), asam amino dan ATP (Suparjo, 2008).

Aktivitas penghambatan bakteriosin membutuhkan reseptor spesifik permukaan sel. Lipid membran sitoplasma yang bermuatan negatif merupakan reseptor utama bakteriosin dalam proses pembentukan pori. Interaksi elektrostatik bakteriosin yang bermuatan positif yang bersifat hidrofobik dengan gugus fosfat bermuatan negatif pada membran sel target merupakan tahap awal pengikatan bakteriosin dengan membran target. Bagian hidrofobik bakteriosin masuk ke dalam membran

membentuk pori. Konduktivitas dan stabilitas pori pada bakteriosin lantibiotik ditingkatkan melaui pengikatan molekul (molecule docking) sedangkan pada bakteriosi kelas II, reseptor membran target bekerja terhadap spesifikasi tertentu (Suparjo, 2008).

Proses pembentukan pori pada membran fosfolipid oleh peptida membran aktif umumnya terjadi melalui dua mekanisme yaitu metode tong kayu (barrel-stave model) dan model baji atau karpet (wedge model or carpet model) (Gambar 1). Pada model tong, peptida menghadap hampir tegak lurus terhadap membran, kemudian masuk dan membuat saluran ion sepanjang membran diikuti dengan pengikatan monomer tambahan membentuk pori. Pada model karpet, peptida berikatan dengan permukaan membran, jika konsentrasi ambang batas monomer peptida tercapai, membran ditembus dan pori sementara terbentuk (Zhao,2003).

Gambar 1. Model Pembentukan Pori pada Membran, Barrel-Stave dan Carpet Model (Zhao, 2003).

2.6.4 Imunitas Bakteri Penghasil Bakteriosin

Salah satu perbedaan bakteriosin dengan antibiotik adalah adanya mekanisme perlindungan bakteri penghasil terhadap kerja bakteriosinnya. Perlindungan pada bekteriosin lantibiotic dapat dimediasi melalui protein imunitas, LanI dan lanFEG. Terdapat dua sistem yang bekerja secara sinergis untuk melindungi sel penghasil dari bakteriosinnya sendiri. LanI, yang sebagian besar berikatan pada sisi luar membran sitoplasma, memberikan imunitas dengan mencegah pembentukan pori oleh bakteriosin. LanFEG bekerja melalui pengangkutan molekul bakteriosin yang telah masuk ke dalam membran kembali ke medium sekeliling dan menjaga konsentrasi dalam membran di bawah tingkat kritis (Suparjo, 2008).

Protein imunitas bakteriosin non-lantibiotics disandikan oleh suatu gen yang terdapat pada bagian hilir gen bakteriosin, kecuali gen imunitas bakteriosin kelas IIc. Sistem imunitas bakteriosin sejauh ini belum berhasil dijabarkan semuanya kecuali LciA, protein imunitas Lactococcin A (Gambar 2). LciA dapat mencegah aksi Lactococcin A dengan mengikat kemudian menetralisir bakteriosin atau dengan berinteraksi dan merintangi reseptor bakteriosin. Melalui interaksi Lactococcin A- reseptor dalam LciA menjangkau kedalam membran sitoplasma. Ujung C protein imunitas berada di luar sel sedangkan ujung N berada didalam sitoplasma. Dengan mengikat reseptor, LciA

mencegah lactococcin A masuk ke dalam membran tetapi ikatan lactococcin A pada reseptor tetap terjadi (Suparjo, 2008).

Gambar 2. Model Mekanisme Kerja Protein Imunitas (Suparjo, 2008)

III. METODE PENELITIAN

A. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Molekuler Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung. Penelitian dilakukan pada bulan Januari 2010 hingga Juli 2010.

B. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain tabung reaksi, cawan petri dengan diameter 15 cm dan 30 cm, erlenmeyer ukuran 500 mL, 250 mL, 100 mL dan 50 mL, gelas ukur, ose, spatula, bunsen, vortex mixer, neraca analitik, kompor listrik, autoklaf, laminar air flow, inkubator dengan suhu 37oC, inkubator shaker, piranti elektroforesis protein (Mini Protean Tetra Cell Biorad, USA), mikrotube, tip, mikropipet, pH meter, syringe, pipet tetes, sarung tangan dan peralatan lainnya.

Bahan-bahan yang digunakan adalah isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, dan Lactobacillus L3 yang diperoleh dari penelitian sebelumnya serta isolat Lactobacillus L4 yang diperoleh dari hasil isolasi terbaru dari tempoyak dengan ciri-ciri bentuk batang, gram positif, katalase negatif dan motil, biakan Escherchia coli, Staphylococcus aures, Bacillus substilis, dan

Salmonella paratyphii yang diperoleh dari koleksi biakan Laboratorium Mikrobiologi FMIPA Unila, media deMan Rogosa and Sharpe (MRS) Broth, media Nutrient Broth (NB), bacteriological agar, akuades, akubides, alumunium foil, kasa dan kapas.

C. Metode Penelitian

Penentuan karakterisasi jenis antibakteri dilakukan dua tahapan yaitu penentuan asam organik dan protein sebagai senyawa antibakteri. Untuk mengkarakterisasi senyawa asam organik yaitu dengan mengukur pH media kultur sampai hari kelima fermentasi. Terjadinya penurunan pH menunjukkan terbentuknya asam, maka akan dilanjutkan dengan menghitung total asam yang dihasilkan oleh isolat Lactobacillus melalui titrasi dengan 0,1 N NaOH. Perlakuan disusun dalam faktorial dengan rancangan acak kelompok lengkap (RAKL) dengan 2 kali pengulangan. Faktor pertama adalah jenis isolat bakteri Lactobacillus, yakni L1, L2, L3 dan L4. Faktor kedua adalah lama produksi senyawa antibakteri dari isolat Lactobacillus, yakni hari ke-1, ke-2, ke-3, ke-4 dan ke-5. Variabel yang diamati yaitu perubahan pH dan total asam yang dihasilkan oleh keempat isolat Lactobacillus. Data yang diperoleh diuji dengan analisis ragam. Adanya perbedaan nyata (p<0.01), maka dilanjutkan dengan uji Polynomial Ortogonal.

Karakterisasi protein antibakteri dilakukan secara observasi. Karakterisasi protein antibakteri ditentukan dengan menetralkan supernatant kemudian diuji dengan metode difusi sumuran terhadap bakteri uji yaitu E.coli, Sa.

paratyphii, B. substilis dan St aureus. Jika terbentuk zona jernih diduga zat antibakteri dapat berupa protein, maka dilanjutkan dengan menetukan berat molekul protein yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji dengan menggunakan teknik Sodium Dodecyl Sulfat Polyakrilamide Gel Elektoforesis (SDS-PAGE). .

D. Prosedur Kerja

1. Peremajaan Bakteri

Isolat bakteri Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4 dibiakkan dengan cara digores pada media MRS agar miring, sedangkan untuk bakteri uji dibiakkan dengan cara digores pada media NA miring.

2. Produksi Senyawa Antibakteri

Media produksi antibakteri disiapkan dengan komposisi MRS cair ditambah 3 % glukosa (pH 6,2 ± 0,2). Masing-masing isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4 diinokulasikan ke dalam lima erlenmeyer yang berisi 20 mL media produksi. Setiap erlemeyer diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 37o C sesuai dengan lama produksi yaitu 1 hari, 2 hari, 3 hari, 4 hari dan 5 hari. Setiap hari kultur dideteksi karakteristik senyawa antibakteri hingga hari ke-5 fermentasi.

3. Karakterisasi Antibakteri Berupa Asam Organik

Asam organik dapat dideteksi melalui penurunan pH media kultur dan dilanjutkan dengan mengukur total asam yang dihasilkan Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4. Media kultur diambil sebanyak 5 mL secara aseptis dan diukur pH media dengan menggunakan pH meter. Kemudian 5 mL kultur tersebut ditambahkan sebanyak 10 mL aquades netral dan dititrasi dengan 0,1 N NaOH hingga larutan menjadi netral. Total asam dapat dihitung dengan menggunakan persamaan berikut :

Jumlah NaOH x Normalitas NaOH x BM asam laktat Total Asam = Jumlah Bahan

Keterangan : Jumlah NaOH

= volume NaOH yang dibutuhkan untuk menetralkan media.

Normalitas NaOH = 0,1 N Jumlah Bahan

= 5 mL

BM asam laktat

= 90

4. Uji Daya Antibakteri

Setelah Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4 diinkubasi selama lima hari pada media kultur, media tersebut diambil sebanyak 2 mL. Untuk memisahkan zat antibakteri

dengan sel penghasil maka kultur disentrifuge dengan kecepatan 11.000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak antibakteri yang diduga mengandung asam organik dan protein penghambat. Untuk menghilangkan pengaruh aktivitas asam organik di dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji maka supernatan dinetralkan dengan menggunakan 1 N NaOH. Larutan tersebut digunakan untuk uji daya hambat terhadap bakteri uji. Bakteri uji yang digunakan, yakni E.coli, Sa.paratyphii, B. substilis, dan St. aureus.

Bakteri uji diinokulasi sebanyak 1 ose ke dalam tabung reaksi yang berisi 5 mL aquades steril sampai diperoleh kekeruhan yang sama dengan Standar Mac Farlan ( 3 x 108 CFU/mL ). Kemudian sebanyak 1 mL bakteri uji dimasukkan ke dalam cawan petri steril dan ditambahkan 25 mL media NA steril. Supaya bakteri menyebar rata pada media maka cawan petri diputar sesuai angka 8 sebelum media NA memadat. Setelah media memadat, di dalam media dibuat lubang membentuk sumur dengan diameter 1 cm. Sebelum larutan antibakteri dimasukkan ke sumur, bagian bawah cawan petri dibuat 3 garis yang saling bersilangan dan pusat sumur sebagai titik persilangan tiga garis tersebut ( gambar 3). Setelah itu, larutan antibakteri dimasukkan ke dalam sumur sebanyak 100 µL. Kultur diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Kemudian diukur diameter zona bening yang dihasilkan sesuai dengan garis yang telah dibuat.

Gambar 3. Bentuk sumur dilihat dari bagian bawah cawan petri

5. Sodium Dodecyl Sulfat-Polyakrilamide Gel Elektoforesis (SDS-PAGE) dan Identifikasi Aktivitas Pita Protein

Masing-masing supernatan antibakteri yang akan diindentifikasi dicampur dengan 5 x buffer sampel (lampiran) di dalam mikrotube. Supaya tercampur dengan rata, campuran tersebut disentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 detik. Elektroforesis protein menggunakan gel pemisah ( 8 % polyakrilamide) dan gel penahan (4 % polyakrilamide) (tabel 3). Setelah gel dipasang pada perangkat elektroforesis, 500 mL 5 x buffer elektroforesis pH 8,3 dituangkan ke dalam chamber. Sebanyak 20 µL campuran sampel tersebut dimasukkan ke dalam gel penahan, dan untuk standar sebanyak 2 µL ke dalam sumur gel penahan.

Tabel 3 . Komposisi Gel Pemisah dan Gel Penahan Komposisi 8 % Gel Pemisah (mL)

4 % Gel Penahan (mL)

Akuades

4,80

1,54

1,5 M buffer tris-HCl pH 8,8 +SDS 0,5 M buffer tris-HCL pH 6,8

2,55

-

-

0,65

30 % akrilamide

2,66

0,67

10 % APS

0,10

0,05

TEMED

0,01

0,01

Elektroforesis dijalankan pada tegangan konstan 100 volt 50 mA selama 12 jam hingga migrasi bromo fenol biru berada dibagian bawah gel pemisah. Gel elektroforesis dilepas dari cetakan dan jarak migrasi bromo fenol biru diukur dari batas atas gel pemisah. Gel untuk mengetahui berat molekul protein diwarnai dengan pewarnaan perak nitrat (AgNO3). Dalam pewarnaan perak nitrat, mula-mula gel direndam dalam larutan fiksasi selama 1 jam hingga semalam dengan diinkubasi bergoyang kecepatan 3.000 rpm. Kemudian gel tetap dalam keadaan bergoyang di rendam 50 % etanol selama 20 menit. Setelah itu, gel tersebut direndam sebanyak dua kali di larutan 30 % etanol (masing-masing selama 20 menit). Selanjutnya gel direndam dalam larutan enhancer selama 1 menit. Kemudian gel tersebut dicuci tiga kali dalam akuabides masing-masing 20 detik. Setelah dicuci, gel direndam dalam larutan perak nitrat selama 30 menit. Untuk memunculkan pita protein, gel direndam dengan larutan natrium karbonat selama 3-5 menit sampai muncul pita protein. Untuk menghentikan munculnya pita protein tersebut, gel direndam dengan larutan fiksasi. Agar gel tidak menyusut ketika dalam penyimpanan, maka gel direndam pada akuades selama semalam. Setelah itu, pita protein yang muncul diukur jarak migrasinya. Berat molekul protein diukur dengan menggunakan standar berat molekul rendah, yaitu fosforilase b (otot kelinci) 94 kDa, albumin (serum bovin) 67 kDa, ovalbumin (putih telur) 45 kDa, karbonat anhidrase (eritrosin bovin) 30

kDa, tripsin inhibitor (kedelai) 20,1 kDa, dan α-laktal-bumin (susu bovin) 14,4 kDa.

Gel untuk identifikasi pita protein penghambat kemudian direnaturasi untuk menghilangkan SDS sesuai dengan Osmanagaoglu et all (1998). Mula-mula gel direndam dalam larutan 20 % isopropanol selama 1 jam dan dilanjutkan pada larutan 10 % asam asetat. Kemudian gel direndam akuabides selama semalam dalam shaker dengan kecepatan 3.000 rpm untuk menghilangkan pengaruh dari isopropanol dan asam asetat. Untuk mengetahui daya hambat masing-masing protein penghambat, gel diletakkan di atas media NA yang telah mengandung bakteri uji yang paling sensitif terhadap protein penghambat (disesuaikan dari hasil uji supernatan antibakteri yang dinetralkan). Media tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC. Di sekitar pita protein penghambat akan bebas dari bakteri uji.

E. Diagram Alir

Produksi senyawa antibakteri dari isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 dengan lama produksi, yakni hari ke-1, ke-2, ke-3, ke-4 dan ke-5

Mengukur pH media lam supernatan di kultur

Mentitrasi 5 mL media kultur dengan 0,1 N NaOH

Menghitung total asam yang dihasilkan isolat Lactobacillus L1, L2, L3, dan L4

Memisahkan senyawa antibakteri dari sel bakteri dengan cara disentrifuge 11.000 rpm selama 5 menit

Supernatan dinetralkan dengan 1 N NaOH.

Protein penghambat yang terdapat di supernatant di deteksi berat molekulnya dengan teknik SDS-PAGE

Larutan tersebut diujikan terhadap bakteri E.coli, Sa.paratyphii, B. substilis, dan St. aureus dengan metode difusi sumur

Pewarnaan perak nitrat

Menghitung berat molekul protein

Uji daya hambat pita protein

Menghitung berat molekul protein

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Karakterisasi Antibakteri Senyawa Asam Organik

Selama penyimpanan 5 hari, pola perubahan pH pada keempat isolat Lactobacillus dari tempoyak disajikan pada Gambar 4, sedangkan data pengukuran pH dan total asam dapat dilihat pada Tabel 6.

6.00 5.00

pH

4.00 L1

3.00

L2 2.00

L3 L4

1.00 0.00 0

1

2

3

4

5

6

Waktu Produksi (1 x 24 jam)

Gambar 4. Pola perubahan pH media isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 yang diamati tiap hari sampai hari ke 5

Nilai pH media produksi pada awal fermentasi adalah 6,2 untuk keempat isolat. Gambar 4 menunjukkan terjadi penurunan pH hingga hari ke 5 waktu produksi pada isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2 dan Lactobacillus L3 sedangkan Lactobacillus L4 hanya mengalami penurunan pH hingga hari ke 3 waktu produksi. Pada 4 hari dan 5 hari waktu produksi, pH media kultur

isolat Lactobacillus L4 mengalami kenaikan. pH terendah dari masingmasing isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4 yaitu 3,50, 3,47, 3,54 dan 4,67. Penurunan pH yang terbentuk berkisar 5,40 pada isolat Lactobacillus L4 dengan waktu produksi 1 hari hingga 3,47 untuk isolat Lactobacillus L2 dengan waktu produksi 5 hari.

Terjadinya penurunan pH media menunjukkan bahwa keempat isolat Lactobacillus dari tempoyak menghasilkan asam-asam organik yang dapat digunakan oleh isolat tersebut untuk menghambat pertumbuhan bakteri lain.

Grafik perubahan total asam yang dihasilkan oleh isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4 dalam membentuk asam organik pada media MRS disajikan pada Gambar 5. Data yang diperoleh dianalisis dengan analisis ragam yang dapat dilihat pada Tabel 4.

40.00 35.00 Total Asam (%)

30.00 25.00 L1

20.00

L2

15.00

L3

10.00

L4

5.00 0.00 0

1

2

3

4

5

6


. Gambar 5. Total asam organik isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 yang diamati tiap hari sampai hari ke 5

Tabel 4. Analisis ragam total asam yang dihasilkan isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 terhadap waktu produksi (hari). Sumber Keragaman Perlakuan isolat waktu iso x wak Galat Total

db 19 3 4 12 20 39

jk

kt

253,08 4.808,45 3.256,64 1.085,55 1.255,72 313,93 296,08 24,67 289,86 14,49 5.098,30

F

Sign

17,46 74,90 21,66 1,70

Sign * Sign * Sign * tn

Ftb 1%

Ftb 5%

2,97 4,94 4,43 3,23

2,14 3,10 2,87 2,28

Keterangan : * = berbeda nyata pada taraf 1% dan 5% tn = tidak berbeda nyata

Hasil analisis ragam data total asam menunjukkan hubungan antara setiap jenis isolat Lactobacillus yaitu berbeda nyata. Hal ini menjelaskan bahwa setiap isolat Lactobacillus yang ditemukan dari tempoyak memiliki kemampuan yang berbeda dalam hal menghasilkan asam-asam organik. Perbedaan kadar asam organik tidak terlepas dari karakter dari masingmasing isolat Lactobacillus. Setiap isolat memiliki kondisi optimum yang berbeda dalam pertumbuhannya, antara lain pH, suhu dan kebutuhan nutrisi. Tidak semua isolat Lactobacillus pertumbuhannya optimum berada pada pH 6,2 sehingga akan mempengaruhi fase pertumbuhan. Isolat Lactobacillus L1 mampu menghasilkan total asam sebesar 37,15 dan isolat Lactobacillus L2 sebesar 36,13 kemungkinan memiliki pH optimum pada pH 6,2 sehingga lebih mudah untuk beradapatasi dan mencapai fase logaritmik secara optimal dibandingkan dengan isolat Lactobacillus L3 sebesar 29,94 dan isolat Lactobacillus L4 sebesar 7,98. Pada fase logaritmik, metabolit primer yang diantaranya yaitu asam-asam organik banyak dihasilkan pada fase ini.

Isolat Lactobacillus L1 memiliki kemampuan terbesar untuk menghasilkan asam organik, sedangkan isolat Lactobacillus L2 dan Lactobacillus L3 memiliki kemampuan menghasilkan asam organik lebih rendah dari isolat Lactobacillus L1 serta isolat Lactobacillus yang memiliki kemampuan menghasilkan asam organik terkecil yaitu isolat Lactobacillus L4.

40.00

Tptal Asam (%)

35.00 30.00 25.00

y = -1.004x2 + 10.71x + 7.852 R² = 0.975

20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 0

1

2

3

4

5

Waktu Produksi ( 1 x 24 jam)

Gambar 6. Uji polinomial orthogonal isolat Lactobacillus L1

40.00

Total Asam (%)

35.00 30.00 y = -1.177x2 + 11.62x + 6.214 R² = 0.935

25.00 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 0

1

2

3

4

5

Waktu Produksi (1x 24 jam)


35.00 30.00 Total Asam (%)

25.00 20.00

y = 0.075x2 + 4.859x + 3.276 R² = 0.992

15.00 10.00 5.00 0.00 0

1

2 3 Waktu Produksi (1x 24 jam)

4

5


9.00 8.00 Total Asam (%)

7.00 6.00

y = -0.25x2 + 2.32x + 2.408 R² = 0.930

5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 0

1

2

3

4

5



Keragaman waktu produksi juga menunjukkan adanya perbedaan yang nyata terhadap kadar asam organik yang diproduksi oleh keempat isolat Lactobacillus. Selama fermentasi berlangsung, total asam organik yang diproduksi oleh keempat isolat Lactobacillus meningkat hingga hari ke 5 waktu produksi. Waktu fermentasi menunjukkan beda nyata dengan

membentuk garis lengkung (kuadratik) dengan persamaan regresi y = -1,004x2 + 10,71x + 7,852, R² = 0,975 untuk isolat Lactobacillus L1, y = -1,177x2 + 11,62x + 6,214,R² = 0,935 untuk isolat Lactobacillus L2 dan y = -0,25x2 + 2,32x + 2,408, R² = 0,930 untuk isolat Lactobacillus L4. Hal ini berarti bahwa dengan semakin lama waktu fermentasi, total asam organik memiliki kecendrungan untuk meningkat dan menurun pada hari tertentu. Penurunan total asam disebabkan karena asam organik yang dihasilkan keempat isolat Lactobacillus ada yang bersifat volatil. Menurut Ekowati (2000), hasil analisis asam organik isolat Lactobacillus dari tempoyak terdapat asam-asam organik antara lain asam laktat, asam asetat, asam propionat dan asam butirat. Asam butirat merupakan asam organik yang bersifat volatil sehingga tidak terjadi akumulasi asam butirat. Selain itu, asam organik yang tidak volatil kemungkinan juga dimanfaatkan oleh bakteri untuk metabolisme selanjutnya (Mayasari, 2007).

Berdasarkan persamaan regresi, isolat Lactobacillus L1 menghasilkan asam organik maksimum pada hari ke 5 waktu produksi yaitu sebesar 37,15. Begitu juga dengan isolat Lactobacillus L2 dan Lactobacillus L4 menghasilkan asam organik maksimum pada hari ke 5 waktu produksi yaitu 36,13 untuk Lactobacillus L2 dan 7,89 untuk Lactobacillus L4.

Peningkatan produksi asam organik terbesar pada hari ke-5 waktu produksi menunjukkan bahwa aktivitas ketiga isolat bakteri Lactobacillus mencapai fase pertumbuhan logaritmik. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Kartika

(2000) bahwa fase logaritmik isolat Lactobacillus yang berasal dari tempoyak mulai pada hari ke-0 sampai hari ke-7.

Total asam yang dihasilkan isolat Lactobacillus L3 terhadap waktu produksi (hari) menunjukkan pola linier dengan persamaan regresi y = 0,075x2 + 4,859x + 3,276, R² = 0,992. Hal ini berarti produksi asam organik oleh isolat Lactobacillus L3 selama 5 hari fermentasi mengalami peningkatan.

Interaksi antara isolat dengan waktu produksi tidak berbeda nyata. Hal ini berarti bahwa interaksi setiap isolat dengan keragaman waktu adalah sama. Data total asam terbesar dihasilkan oleh isolat Lactobacillus L1 pada hari kelima sedangkan total asam terkecil dihasilkan oleh isolat Lactobacillus L4 pada hari pertama.

B. Karakterisasi Antibakteri Senyawa Protein

Ekstrak antibakteri isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4 sebelum dinetralkan mampu menghambat pertumbuhan dari bakteri Stapylococcus aureus, Bacillus substilis, Escherchia coli, dan Salmonella paratyphii dengan terbentuknya zona hambat disekitar sumur. Namun, ketika ekstrak antibakteri keempat isolat tersebut dinetralkan dengan NaOH hanya ekstrak antibakteri isolat Lactobacillus L4 terhadap St. aureus yang masih membentuk zona hambat sedangkan yang lainnya kemampuan ekstrak antibakteri isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2 dan Lactobacillus L3 terhadap St aureus, B. substilis, E. coli dan Sa. paratyphii dan ektrak antibakteri L4 terhadap B. substilis, E. coli dan

Sa. paratyphii hilang atau tidak menghasilkan zona hambat ( Tabel 5 ). Fungsi penetralan bertujuan untuk menghilangkan pengaruh dari asam organik yang digunakan oleh keempat isolat Lactobacillus untuk menghambat pertumbuhan bakteri-bakteri uji.

Tabel 5. Zona hambat dari ekstrak antibakteri isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 sebelum dan sesudah dinetralkan terhadap bakteri uji

Bakteri Uji

Ekstrak antibakteri sebelum dinetralkan

Ekstrak antibakteri sesudah dinetralkan

L1

L2

L3

L4

L1

L2

L3

L4

Staphylococcus aureus

+

+

+

+

-

-

-

+

Bacillus substilis

+

+

+

+

-

-

-

-

Escherchia coli

+

+

+

+

-

-

-

-

Salmonella paratyphii

+

+

+

+

-

-

-

-

Keterangan : + = terbentuk zona hambat ( ekstrak antibakteri menghambat pertumbuhan bakteri uji) , - = tidak terbentuk zona hambat (ekstrak antibakteri tidak menghambat pertumbuhan bakteri uji)

Hasil dari elektroforesis gel polyakrilamid, SDS PAGE, dapat dilihat bahwa pada isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2 dan Lactobacillus L3 tidak terdapat pita protein yang terbentuk, sedangkan isolat Lactobacillus L4 terdapat empat pita protein dengan berat molekul 15 kDa, 24 kDa, 53 kDa dan 169 kDa akan tetapi protein tersebut tidak mampu menghambat pertumbuhan St. aureus ( Gambar 6 dan 7). Tidak terbentuknya zona hambat pada pita protein Lactobacillus L4 kemungkinan disebabkan karena kadar protein yang terlalu sedikit untuk menghambat pertumbuhan St. aureus yang tumbuh pada gel.

Keempat isolat Lactobacillus yang ditemukan pada tempoyak tidak memiliki protein penghambat yang dapat menghambat pertumbuhan St. aureus, B. substilis, E. coli dan Sa. paratyphii.. Menurut Kusmiati dan Malik (2002), protein penghambat memiliki pengaruh bakterisidal dan bakteriostatik terhadap bakteri yang mempunyai hubungan dekat dengan bakteri penghasilnya karena bakteri target memiliki sifat pengikatan spesifik (specific binding site) sehingga kemungkinan isolat Lactobacillus L4 memiliki protein penghambat yang menghambat pertumbuhan bakteri selain bakteri St aureus, B. substilis, E. coli dan Sa. paratyphii.

Ekstrak antibakteri Lactobacillus L4 yang telah dinetralkan membentuk zona hambat disebabkan karena ada senyawa lain selain protein dan asam organik yang berperan dalam menghambat pertumbuhan Sa aureus pada isolat Lactobacillus L4, seperti hydrogen peroksida, etanol, diasetyl dan karbon dioksida.

169 kDa 53 kDa 24 kDa 15 kDa

M

a

b

c

d

Gambar 6. SDS-PAGE isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Keterangan : M = protein standart a = protein dari isolat Lactobacillus L1 b = protein dari isolat Lactobacillus L2 c = protein dari isolat Lactobacillus L3 d = protein dari isolat Lactobacillus L4

Gambar 7. Gel SDS-PAGE ektrak antibakteri L4 yang diuji terhadap St.aureus.

Jenis – jenis Lactobacillus yang mampu menghasilkan protein penghambat dalam bentuk bakteriosin antara lain L. plantarum ST194BZ menghasilkan 2 bakteriosin dengan berat molekul 3,3 kDa dan 14 kDa (Todorov dan Dick, 2005), L. amylovorus LMPGP-13139 menghasilkan bakteriosin dengan berat molekul 4,5 dan 6 kDa (Contreras et all, 1996) , L. sake menghasilkan sakacin B dengan berat molekul 6,3 kDa (Samelis et all, 1994), L. acidophilus menghasilkan acidophilin 801 dengan berat molekul 6,5 kDa (Zamfir et all, 2001), L. bavaricus M1401 menghasilkan bavaricin A dengan berat molekul 3,5-4 kDa (Larsen et all, 1993), L. gaseri KT7 menghasilkan gassericin KT7 dengan berat molekul 4,5-5 kDa (Zhu et all, 2000). Namun, ada juga jenis Lactobacillus yang tidak menghasilkan protein penghambat berupa bakteriosin seperti L. fermentum, L. delbrueckii dan L. reuteri (Sanni et all,1999)

Bakteriosin disintesis mengikuti pola sintesis protein. Sistem ini diatur oleh plasmid DNA. Pada umumnya, bakteriosin non lantibiotik disintesis melalui jalur ribosomal, sedangkan kelompok lantibiotik disintesis secara ribosomal sebagai prepeptida kemudian mengalami modifikasi. Sekresi prepeptida dilakukan pada fase eksponensial dan diproduksi secara maksimal pada fase stasioner. Prinsip regulasi sintesis bakteriosin diatur oleh adanya gen pengkode produksi dan pengkode immunitas (Kim, 1990).

V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan, maka didapatkan kesimpulan sebagai berikut : 1. Senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh keempat isolat Lactobacillus yaitu berupa asam organik. 2. Isolat Lactobacillus L1 paling berpotensi menghasilkan asam organik sebesar 37,15 dibandingkan dengan isolat Lactobacillus L2 sebesar 36,13, isolat Lactobacillus L3 sebesar 29,94 dan isolat Lactobacillus L4 sebesar 7,98. 3. Waktu dalam mencapai total asam maksimum isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4 pada hari ke-5 waktu produksi. 4. Isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2 dan Lactobacillus L3 tidak menghasilkan protein sedangkan isolat Lactobacillus L4 menghasilkan protein dengan berat molekul 15 kDa, 24 kDa, 53 kDa dan 169 kDa akan tetapi bukan sebagai antibakteri.

B. Saran

Perlu diadakan penelitian lanjutan untuk mengetahui kadar potein penghambat dan nilai optimum dari asam organik yang dihasilkan isolat Lactobacillus dari tempoyak dengan memperbanyak waktu produksi dan mengetahui kondisi optimum pertumbuhan dari keempat isolat Lactobacillus seperti suhu dan pH.

Tabel 6. Hasil Pengukuran pH Media Kultur Isolat Lactobacillus Lactobacillus Hari 1 2 3 4 5

L1 4,03 3,63 3,55 3,53 3,50

L2 3,99 3,65 3,53 3,50 3,47

L3 4,84 4,24 3,83 3,80 3,54

L4 5,40 4,80 4,67 4,71 4,77

Tabel 7 . Hasil Pengukuran Total Asam Media Kultur Isolat Lactobacillus Ulangan Perlakuan X X X2 1 2 L1H1 33,93 575,82 16,97 16,65 17,28 L1H2 52,47 1.392,62 26,24 29,07 23,40 L1H3 63,25 2.003,74 31,63 32,94 30,31 L1H4 65,59 2.154,03 32,80 34,02 31,57 L1H5 74,30 2.760,30 37,15 37,31 36,99 L2H1 30,78 482,27 15,39 17,46 13,32 L2H2 54,63 1.521,48 27,32 31,14 23,49 L2H3 60,80 1.856,16 30,40 32,38 28,42 L2H4 62,82 1.977,86 31,41 32,94 29,88 L2H5 72,25 2.610,03 36,13 36,16 36,09 L3H1 15,98 134,67 7,99 9,86 6,12 L3H2 27,00 383,23 13,50 16,56 10,44 L3H3 38,52 754,60 19,26 21,78 16,74 L3H4 45,52 1.096,54 22,76 28,26 17,26 L3H5 59,87 1.904,86 29,94 37,44 22,43 L4H1 8,46 35,79 4,23 4,25 4,21 L4H2 13,14 87,12 6,57 5,94 7,20 L4H3 14,08 102,40 7,04 5,76 8,32 L4H4 14,53 106,29 7,27 6,66 7,87 L4H5 15,95 127,55 7,98 7,56 8,39 Total 823,87 22.067,35 411,94

Gambar 9. Isolat Lactobacillus L1




L1

L2

L3

L4

Gambar 13. Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Staphylococcus aureus

L1

L3

L2

L4

Gambar 14. Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Staphylococcus aureus

L1

L3

L2

L4

Gambar 15. Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Bacillus substilis

L1

L2

L3

L4

Gambar 16. Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Bacillus substilis

L1

L2

L3

L4

Gambar 17. Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Escherchia coli

L1

L2

L3

L4

Gambar 18. Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Escherchia coli

L1

L2

L3

L4

Gambar 19. Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Salmonella paratyphii

L1

L3

L2

L4

Gambar 20. Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Salmonella paratyphii

Tabel 8. Penetuan kurva logaritma berat molekul protein standart terhadap mobilitas relatif (rf) Standart α-lactal-bumin Trypsin inhibitor Carbonic an-hydrase Ovalbumin Albumin Fosforilase b

Berat Molekul (Da) (Y) 14.400 20.100 30.000 45.000 66.000 97.000

Log (Y) 4,16 4,30 4,48 4,65 4,82 4,99

Mobilitas Relatif (rf) (X) 0,956 0,911 0,856 0,822 0,778 0,722

Keterangan : 1. Jarak migrasi bromofenol biru untuk standart protein diukur dari batas atas gel pemisah yaitu 4,5 cm 2.

a. Jarak dari batas atas gel pemisah ke Fosforilase b yaitu 3,25 cm b. Jarak dari batas atas gel pemisah ke Albumin yaitu 3,5 cm c. Jarak dari batas atas gel pemisah ke Ovalbumin yaitu 3,7 cm d. Jarak dari batas atas gel pemisah ke Carbonic an-hydrase yaitu 3,85 cm e. Jarak dari batas atas gel pemisah ke Trypsin inhibitor yaitu 4,1 cm f. Jarak dari batas atas gel pemisah ke α-lactal-bumin yaitu 4,3 cm

Mobilitas Relatif (rf) Log Berat Molekul (Da)

5.00

y = -3.652x + 7.636 R² = 0.995

4.50 4.00

Mobilitas Relatif (rf)

3.50 Linear (Mobilitas Relatif (rf))

3.00 2.50 2.00 0.600

0.700

0.800

0.900

1.000

Mobilitas Relatif (rf)

Gambar 8. Grafik Logaritma Berat Molekul Protein Standart Terhadap Mobilitas Relatif Perhitungan Berat Molekul Protein

Untuk mengetahui berat molekul protein, mobilitas relative dimasukkan kedalam persamaan y = -3,652x + 7,636

Tabel 9. Penetuan Berat Molekul Protein Terhadap Mobilitas Relatif (Rf) Pada Isolat Lactobacillus L4 Mobilitas Relatif Berat Molekul Log (y) (x) (Da) (y) 0,947 0,894 0,798 0,660

4,178 4,373 4,722 5,227

15.066,07 23.604,78 52.722,98 168.655,30

Keterangan : 1. Jarak migrasi bromofenol biru untuk sampel L4 diukur dari batas atas gel pemisah yaitu 4,7 cm. 2. Jarak dari batas atas gel pemisah ke protein pada sampel L4 adalah 3,1 cm, 3,75 cm, 4,2 cm, dan 4,45 cm

Reagent yang digunakan

1. Larutan Standar Mac Farlan Larutan 1 % asam sulfat (H2SO4) sebanyak 9,9 mL dicampur dengan 1 % barium klorida (BaCl2.2H2O) sebanyak 0,1 mL. Kocok terlebih dahulu sebelum digunakan.

2. 0,1 N NaOH Sebanyak 40 g NaOH dilarutkan dalam1000 mL akuades. Larutan disimpan dalam suhu ruang.

3. 1 % phenophetylen Sebanyak 1 gram phenophetylen dilarutkan dalam 50 mL alkohol 96 % . Setelah larut ditambahkan 50 mL akuades. Larutan disimpan dalam suhu ruang.

4. 5 x buffer sampel Larutan ini terdiri dari 0,12 mL 1 M buffer tris-HCl pH 6,8 (konsentrasi akhir 60 mM), 1 mL 50 % gliserol (konsentrasi akhir 25 %), 0,4 mL 10 % SDS (2%), 0,1 mL β-merkaptoetanol (14,4 mM), 0,2 mL 1 % bromofenol biru (0,1%) dan 0,18 mL akuabides. Sampel protein diencerkan dengan perbadingan 1:4 dengan 5x larutan stok. Larutan disimpan pada suhu 4oC.

5. 5 x buffer elektroforesis pH 8,3 Larutan terdiri atas 9 g tris basa, 43,2 g glisin, 3 g SDS yang dilarutkan hingga 600 mL akuades. Untuk membuat 300 mL larutan, 60 mL 5 x larutan stok diencerkan dengan akuades sebanyak 240 mL. Larutan disimpan pada suhu 4oC.

6. Elektroforesis gel polyakrilamide 30 % ( 29% : 1 % ) Sebanyak 29,2 g akrilamida dicampur dengan 0,8 g N’N’-bis-akrilamida dan dilarutkan dengan akuades hingga 100 mL. Campuran disaring dengan kertas saring, dan disimpan dalam botol gelap pada suhu 4oC. Sebelum digunakan campuran tersebut divakum selama 15 menit pada suhu kamar.

7. 1,5 M buffer tris-HCl pH 8,8 Ke dalam 50 mL akuades dimasukkan 18,15 g tris (hidroksimetil) aminometan (tris basa), pH diatur 8,8 dengan 1 N HCl. Akuades ditambah hingga 100 mL. Larutan disimpan pada suhu 4oC.

8. 0,5 M buffer tris-HCl pH 6,8 Ke dalam 60 mL akuades dimasukkan 6 g tris basa, pH diatur 8,8 dengan 1 N HCl. Akuades ditambah hingga 100 mL. Larutan disimpan pada suhu 4oC.

9. 10 % SDS Sebanyak 0,1 g SDS dilarutkan dalam 1 mL akuades. Larutan disimpan pada suhu 4oC dan dibuat segar setiap minggu.

10. 10 % Amonium Persulfat (APS) Satu mL akuades mengandung 1 g APS. Larutan ini tersedia harus dalam keadaan segar.

11. Larutan fiksasi Larutan ini terdiri atas 25 % metanol, 12 % asam asetat, dan 63 % akuades. Larutan ini disimpan dalam botol gelap pada suhu kamar.

12. Larutan enhancer Sebanyak 0,02 g Na2S2O3.5H2O dilarutkan dalam 100 mL akuabides. Larutan ini disimpan dalam botol gelap pada suhu kamar.

13. Larutan perak nitrat Larutan ini terdiri atas 0,2 g AgNO3, 35 µL formaldehida, dan dilarutkan dalam 100 mL akuabides. Larutan ini disimpan dalam botol gelap pada suhu kamar.

14. Larutan natrium karbonat Larutan ini terdiri dari 6 g NaCO3 dan 48 µL formaldehida dalam 100 mL akuabides. Larutan ini tersedia dalam keadaan segar.

KARAKTERISTIK ANTI BAKTERI ISOLAT Lactobacillus DARI TEMPOYAK. (Skripsi) Oleh : Pratika Viogenta

Recommend Documents