ISOLASI, KARAKTERISASI, ANALISA KIMIA DAN DETEKSI BAPPT BAKTERI TANAH PERAKARAN PADI DARI RAMBUT SIWI, BALI

Isolasi, Krakterisasi, Analisa Kimia.…

ISOLASI, KARAKTERISASI, ANALISA KIMIA DAN DETEKSI BAPPT BAKTERI TANAH PERAKARAN PADI DARI RAMBUT SIWI, BALI Sri Widawati1, Suliasih2 Bidang mikrobiologi-Puslit Biologi-LIPI Cibinong Science Center Jl. Raya Bogor Jakarta Km. 46 Cibinong 1 [email protected]; 2 [email protected] ABTRACT Rhizosphere of rice plant is rich in organic compounds in the form of energy. Bacteria, especially “Plant growth promoting rhizobacteria (PGPR)” group liked rich habitat with energy resources to grow and compete. This study aims to determine the population, characterization and detection of bacteria as PGPR from rice rhizosphere that can be use as one of the tool to environmental rehabilitation of degraded land. The study used a selective media (Yema, Caceres, Mannitol Ashby, Pikovskaya) for isolation and population bacteria. Chemical analysis (IAA hormone, PMEase enzyme, ACC Deaminase) methods follow Mehboob, Tabatabai and Bremner, Penrose and Glick methods, whereas characterization (identifying) used molecular methods (analysis sequencing) with amplification of the 16S rRNA gene. Identification results found 10 species of bacteria namely Bacillus weihenstephanensis, lipoferum Azospirillum, Azotobacter crococcum, Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus megaterium, Bacillus megaterium, Rhizobium sp., Rhizobium sp. were detected as PGPR. The highest population (41 CFU / g soil) of bacteria in rice rhizosphere is Azospirillum lipoferum RSB17. The bacteria also has the highest value on the production of IAA (5.596), saline resistant on 30g / L NaCl, and potential as a producer of ACC deaminase (grown a lot in the media DF + ACC). Bacillus megaterium RSB3 and RSB 9, Bacillus weihenstephanensis RSB18, and Azospirillum lipoferum RSB17 has the highest value of dissolved P and PMEase enzyme. Kata kunci: PGPR, saline, IAA, ACC Deaminase, available P, PME-ase enzyme

PENDAHULUAN Populasi bakteri tersebar luas diberbagai macam lingkungan. Seperti lingkungan tanah basa, asam, marginal, subur, dan salin. Bakteri penambat nitrogen simbiotik (BPNS), Bakteri penambat nitrogen non simniotik (BPNNS), dan bakteri pelarut fosfat (BPF) merupakan bakteri fungsional kelompok PGPR penyuka habitat yang kaya dengan sumber energi seperti lingkungan rizosfir. Lingkungan tersebut kaya dengan senyawa organik yang merupakan eksudat akar tanaman. Beberapa bakteri fungsional bersifat gram negatif dan mengkolonisasi di rizosfer. Genus bakteri tersebut antara lain: Rhizobium (BPNS), Azotobacter dan Azospirillum (BPNNS), Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Acetobacter dan Burkholderia (BPF) dan aktivitasnya sangat menguntungkan bagi pertumbuhan tanaman serta dapat memperbaharui rantai makanan dan membantu kesuburan dalam tanah. Secara langsung aktivitasnya akan memberi fasilitas pada akar tanaman untuk lebih mudah menyerap berbagai unsur hara ensensial seperti unsur P dan N yang ada dalam tanah dan udara. Aktivitas bakteri juga akan mensintesis dan mengubah aneka fitohormon yang dapat memacu pertumbuhan tanaman dan membantu menyerap unsur hara yang terikat. Secara tidak langsung aktivitas bakteri akan menghasilkan aneka senyawa atau metabolit (antibiotik dan siderophore) yang dapat menekan pertumbuhan bakteri patogen yang merugikan pertumbuhan tanaman sehingga bakteri tersebut dikenal sebagai bakteri agen antagonis (Huang et al.). Produksi sintesa metabolit sekunder berupa l-aminocyklopropane l-carboxylate (ACC) deaminase oleh bakteri

Prosiding Seminar Nasional Biologi 2016_ ISBN: 978‐602‐0951‐11‐9

BAPPT/PGPR yang secara in vitro dapat menghambat bakteri patogen yang merugikan tanaman (Diby, 2004). Pembentukan (sintesis) ACC dipacu oleh hormon Indol Acetic Acid (IAA), dan ACC yang terbentuk akan diubah menjadi hormon etilen dan produksi etilen yang berlebih akan merusak tanaman termasuk menghambat pemanjangan/perkembangan akar baru (Mullins, 1972). Bakteri penghasil ACC deaminase sering digunakan sebagai biofertilizer, karena diharapkan akan menurunkan kerusakan pada tanaman. Penurunan senyawa ACC oleh Enzim aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) deaminase yang diproduksi oleh bakteri akan mengurangi pembentukan ACC yang merupakan bahan dasar pembentukan hormon etilen dan juga dapat meningkatkan rasio serapan K+/Na+ melalui mekanisme binding Na di sekitar rizosfer tanaman (Zahir et al. 2008). Hormon lain yang dihasilkan bakteri tersebut adalah phosphatase / monoesterace (PMEase) yang berguna dalam proses pelarutan unsur P terikat menjadi tersedia dan siap diserap oleh tanaman. Bakteri penambat nitrogen dan pelarut fosfat penghasil hormon indol acetic acid (IAA), enzim aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) deaminase, enzim phospomonoesterase (PMEase), dan dapat melarutkan unsur P terikat merupakan ciri bakteri yang masuk dalam kelompok “Bakteri akar pemacu pertumbuhan tanaman (BAPPT)” atau “Plant growth promoting rhizobakteri (PGPR)”. Hasil beberapa penelitian terdahulu menyatakana bahwa tidak semua bakteri yang hidup di rizosfer tanaman mampu berperan sebagai BAPPT atau PGPR (Husen et al. 2008). Kelompok BAPPT/PGPR merupakan kelompok bakteri

237


yang aktivitasnya sangat menguntungkan bagi pertumbuhan tanaman. Berdasarkan hal tersebut, maka penelitian ini bertujuan untuk mencari beberapa bakteri penambat nitrogen dan pelarut fosfat yang dapat memproduksi hormone IAA, enzim fosfatase dan ACC Deaminase serta dapat melarutkan P sehingga bakteri tersebut dapat dimasukan ke dalam kelompok BAPPT/PGPR. METODE Bahan penelitian untuk dianalisa berupa tanah sawah yang diambil di daerah rizosfer tanaman padi yang tergenang sebanyak 20 titik (Pantai Rambut Siwi, desa Yehembang, Jembrana, Bali). Sampel dibawa dengan polybag hitam dan dimasukan dalam box es, kemudian dibawa ke laboratorium Mikrobiologi, P2B, LIPI. Sampel dikering anginkan sampai kering lalu ditumbuk, diayak dan diisolasi. Isolasi, Populasi, Purifikasi, dan Identifikasi Isolasi dikerjakan ditempat steril. Sebanyak 10 gram tanah dimasukkan kedalam Erlenmeyer berisi 90 ml akuades seteril (10-1), kemudian dikocok selama 60 menit dengan kecepatan 120 rpm. Diambil 1 mL ekstrak tanah dari tabung Erlenmeyer dan dimasukan ke dalam tabung yang berisi 9 mL akuades steril (10-2), kemudian di kocok pada forteks hingga homogen. Selanjutnya diambil 1 mL dari tabung tersebut dan dimasukkan ke dalam tabung berikutnya (10-3) dan diforteks. Dilakukan hal seperti itu hingga ke tabung 10-7. Pada tabung 10-3, 10-5, dan 10-7 masing-masing diambil 0,2 mL dan ditransfer ke cawan petri steril yang berisi media selektif yaitu media yeast extract manitol agar + Kongo merah (YEMA= 10g manitol; 0,5g K2HPO4; 0,2g MgSO4.7H2O; 0,1g NaCl; 1,0g yeast; 20g agar; 1L akuades + Kongo merah 2,5 mL/L dalam 1% larutan) untuk menangkap bakteri Rhizobium (Rao, 1994), media Mannitol Ashby (20g manitol; 0,2g K2HPO4; 0,2g MgSO4. 0,2g 7H2O; 0,1g NaCl; K2SO4; 5g CaCO3; 20g agar; 1L akuades) untuk menangkap bakteri Azotobacter (Rao, 1994), medium setengah padat Caceres (0,5g K2HPO4; 0,2g MgSO4.7H2O; 0,1g NaCl; 0,5g Yeast ekstrak; 0,02g CaCl2; 0,01g FeCl3.6H2O; 5,09g D-L Malic Acid; 4,8g KOH; 20g Agar; 0,25% Kongo merah 15 ml (disteril terpisah dan ditambahkan sebelum media digunakan); Akuades 1L) untuk menangkap Azospirillum (Caceres et al., 1982), dan media Pikovskaya (10g glukosa; 5g Ca3PO4; 0,5g (NH4)2SO4; 0,2g KCl; 0,1g MgSO4.7H2O; 0,01g MnSO4.H2O; 0,5g yeast ekstrak dan 0,01g FeCl3.6H2O; 1L akuades) untuk menangkap pertumbuhan bakteri pelarut fosfat (Gaur 1981) Semua media dibuat pH 7. Inkubasi dalam suhu ruang selama 7 hari. Dihitung total populasi bakteri yang tumbuh pada media natrium agar (NA yaitu 3gr ekstrak sapi, 5gr pepton, 20gr agar, 1L akuades) dengan menggunakan metode plate count (Vincent, 1992). Sel atau koloni tunggal ditransfer kembali pada media yang sama untuk purifikasi dan diinkubasi 5-7. Purifikasi diulang hingga didapatkan pertumbuhan koloni tunggal. Kemudian koloni tunggal ditransfer ke media yang sama untuk masing-masing bakteri pada agar


miring. Sebagai indikasi secara fisiologi bakteri Rhizobium berwarna putih berkilau (ada yang putih susu dan ada yang transparan), lengket, bulat, menonjol dengan tepi utuh, bakteri Azotobakter berwarna putih bening, bulat, dan tepinya rata, Azotobacter berwarna merah muda, dan bakteri pelarut fosfat selnya akan dikelilingi daerah bening. Isolat yang sudah murni di subculture pada masing-masing media yang sama seperti media untuk isolasi, diinkubasi 1 hari untuk isolat yang bersifat fast growing dan 3 hari untuk isolat yang bersifat slow growing, kemudian di PCR dan diidentifikasi menggunakan metode molekuler (analisis sequencing) dengan amplifikasi gen 16S rDNA (Weisburg et al. 1991; Woo 2008). Urutan data 16S rDNA dibandingkan dengan urutan di National Pusat data bank Biotechnology Information menggunakan program BLAST (Altschul et al. 1997). Analisa Kualitatif Ketahanan Bakteri pada Media Yema, Manitol Ashby, Caceres, dan Pikovskaya Salin Bakteri hasil identifikasi, kemudian diuji ketahanannya terhadap salinitas. Masing-masing media Yema, Manitol Ashby, Caceres, dan Pikovskaya ditambahkan NaCl 0%, 1%, 2% 3%, dan 4% yang setara dengan 0g, 10g/L, 20g/L, 30g/L, dan 40g/L. Inkubasi pada suhu kamar dan ketahanannya diamati setiap hari selama 7 hari. Analisa Kualitatif Kemampuan Setiap Bakteri Memproduksi IAA Analisa kualitatif kemampuan bakteri memproduksi IAA digunakan media TSB 50% (Tryptic Soy Broth = 10g Peptone; 2,5g NaCl; 20g Agar; 1000 mL Akuades) mengikuti metode Gravel et al. (2007). Kemudian setelah media steril kedalamnya ditambahkan precursor L-Tryptophan 200 ppm mengikuti metode Mehboob et al. (2010). Media dituangkan ke dalam beberapa cawan petri steril. Seteleh media beku dan padat, tumbuhkan 1 ose dari masing-masing bakteri yang teridentifikasi kedalamnya. Setelah diinkubasi pada suhu ruang selama 3-5 hari (bakteri tumbuh), selanjutnya larutan Salkowski [1 ml 0,5 M FeCl3 (melarutkan 1,35gr dalam 10ml akuades) dalam 50ml HClO4 50% v/v (campuran 25 ml HClO4 dan 25ml akuades)] diteteskan ke dalam cawan petri tersebut (di atas pertumbuhan koloni bakteri dan medianya). Petri yang ditanami bakteri diinkubasi selama 3 jam pada suhu ruang selama 1-3 jam. Indikator bakteri potensial dapat menghasilkan IAA ditandai dengan adanya gradasi warna merah hingga merah muda pada koloni dan media tersebut. Analisa Kualitatif Kemampuan Bakteri Untuk Menghasilkan ACC Deaminase Aktifitas bakteri dalam menghasilkan ACC Deaminase diuji dengan metoda Glick (2005). Isolat yang teridentifikasi ditumbuhkan di media 5 mL TSB (10g Peptone; 2,5g NaCl; 20g Agar; 1000 mL Akuades), dishaker 24 jam dengan kecepatan 150 rpm, selanjutnya diambil 5 µl kultur cair, dimasukan ke eppendorf, dan disentrifugasi pada kecepatan 1000 rpm selama 5 menit.

238


Natan diambil dengan membuang supernatan dan membilas natan dengan akuades steril, divorteks dan dibilas kembali dengan akuades steril (2 kali pencucian). Satu öse kultur (5 µl) diinokulasi ke media padat Dworkin-Foster Salt/DF (makroelemen = 4gr KH2PO4; 0,2g Na2HPO4; 6gr MgSO4.7H2O; 2gr Glukosa; 2gr Gluconic Acid; 2gr Citric Acid; 1L Akuades) dari metode Dworkin and Foster (1958) + 3 mM prekusor ACC deaminase (1-Aminocyclopropane 1-Carboxylic Acid). Di inokulasikan juga pada media DF salt (tanpa ACC) sebagai kontrol negatif untuk mengetahui kemampuan isolat menambat N2 bebas dari udara (kelompok bakteri diazotrof) dan pada media DF salt + (NH4)2SO4 (sumber N) sebagai kontrol kontrol positif. Indikasi bakteri positif penghasil ACC Deaminase adalah adanya pertumbuhan koloni bakteri pada media DF+ACC setelah inkubasi 2x24 jam atau sampai 72 jam. Kontrol negatif dalam analisis kualitatif produksi ACC Deaminase juga digunakan isolat Eschericia coli yang diinokulasikan ke dalam media DF+ACC.

Tabel 1. Isolasi, Populasi, dan Hasil Identifikasi

No.

Kode sampel

1

RSB1

Populasi bakteri (106) (cfu/g tanah)

Nilai absorbansi (ʎ = 436 nm)

Isolat teridentifikasi

Uji Kemampuan Bakteri Melarutkan P dalam Media Pikovskaya Padat Bakteri yang teridentifikasi diuji kemampuannya secara kwalitatif melarutkan P terikat pada Ca3(PO4)2 dalam media Pikovskaya padat (Ca3(PO4)2 5 gr, (NH4)2SO4 0,5 gr; NaCl 0,2 gr; MgSO4. 7H2O 0,1 gr; KCl 0,2 gr; Glukosa 10 gr; ekstrak ragi 0,5 gr; agar 20 gr; MnSO4 dan FeSO4 sedikit, akuades 1L (Gaur, 1981). Indikasi kemampuan bakteri dalam melarutkan fosfat dapat dilihat ada tidaknya pembentukan zona bening disekitar koloni bakteri.

Stenotrophomonas maltophilia 2 RSB2 1 a 1,6255 a TT 3 RSB3 1,5554 a Bacillus 5 abc megaterium 4 RSB4 4 abc 1,0840 a TT 5 RSB5 1 a 1,5154 a TT 6 RSB6 1 a 0,9968 a TT 7 RSB7 2 ab 1,3313 a TT 8 RSB8 5 abc 1,5189 a TT 9 RSB9 1,8306 a Bacillus 7 bcd megaterium 10 RSB10 8 bcde 1,8962 a Rhizobium sp. 11 RSB11 1 a 2,1140 a TT 12 RSB12 2,3123 a Azotobacter 13 e aerogenes 13 RSB13 2,3113 a Azotobacter 32 f crococcum 14 RSB14 1 a 1,9496 a TT 15 RSB15 1 a 1,6255 a TT 16 RSB16 2,2601 a Azospirillum 30 f lipoferum 17 RSB17 2,4662 a Azospirillum 41 g lipoferum 18 RSB18 2,2058 a Bacillus 27 f weihenstephanensis 19 RSB19 11 de 2,2799 a Rhizobium sp. 20 RSB20 1 a 1,1287 a TT Keterangan: Angka diikuti huruf yang sama pada baris atau kolom yang sama tidak berbeda nyata menurut uji Duncan (p<0,05)TT= tidak teridentifikasi.

Analisa Pembentukan Enzim Fosfatase (PME-ase) Enzim fosfatase yang dihasilkan oleh aktivitas bakteri yang teridentifikasi mengikuti metode Tabatabai dan Bremner (1969). Enzim fosfatase diukur dengan menggunakan p-nitrophenyl phosphate disodium (pNPP 0.115 M) sebagai substrat. Sebanyak 0,48 mL buffer asetat pH 6,5 dan 0,12 mL substrat ditambahkan pada 0,15 mL supernatan bakteri dan diinkubasikan selama 2 jam pada suhu ruang (25oC). Kemudian setelah inkubasi kedalamnya ditambahkan 0,12 mL CaCl2 0,5 M dan 0,48 mL NaOH lalu dikocok. Larutan tersebut disentrifus pada 8000 rpm selama 5 menit. Media akan berwarna kuning dan P-nitrophenol (PNP) yang terbentuk diukur absorbannya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm. Kontrol dibuat dengan prosedur yang sama, tetapi penambahan larutan substrat dilakukan setelah penambahan CaCl2 0,5 M dan NaOH.0,5 M. Standar menggunakan larutan p-nitrofenol dengan konsentrasi 1-10 ppm, sedangkan untuk blanko menggunakan air destilasi.

Populasi bakteri berkisar antara 1- 41 CFU/gr tanah. Nilai populasi bakteri tertinggi pada rizosfer padi didapatkan pada RSB17 (41x106 CFU/gr tanah) dan dari rizosfer tersebut teridentifikasi satu isolat bakteri “Azospirillum lipoferum”. Berturut-turut populasi bakteri dengan jumlah diatas rata-rata teridentifikasi sebagai bakteri Bacillus weihenstephanensis strain RSB18 (27x 106 CFU/gr tanah), Azospirillum lipoferum strain RSB16 (30x106 CFU/gr tanah), dan Azotobacter crococcum strain RSB13 (32x106 CFU/gr tanah). Populasi terenedah (1x106 CFU/gr tanah) yaitu strain RSB2, RSB5, RSB6, RSB11, RSB14, RSB15, dan RSB20 tidak teridentifikasi. Populasi bakteri dengan kisaran yang sama, teridentifikasi sebagai Stenotrophomonas maltophilia (RSB1), Bacillus megaterium (RSB5), Bacillus megaterium (RSB9), Rhizobium sp. (RSB10), Rhizobium sp. (RSB11). Semua isolat baik yang teridentifikasi dan tidak teridentifikasi mempunyai nilai asorbansi tidak berbeda nyata pada pemeriksaan spektrofotometer dengan ʎ = 436 nm (Tabel 1).

9 cde

2,3948 a

HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil isolasi tanah dari rizosfer didapatkan 20 isolat murni dan hanya dapat teridentifikasi 10 isolat (Tabel 1).


239


Tabel 2. Ketahanan bakteri pada media Yema, Manitol Ashby, Caceres, Pikovskaya salin (0gr, 10gr/L, 20g/L, 30gr/L, dan 40gr/L NaCl). Kode RSB 1

Jenis Bakteri 0g/L +

Media Natrium Agar + NaCl 10g/L 20g/L 30g/L 40g/L + + -

Stenotropho monas maltophilia RSB Bacillus + + + 3 megaterium RSB Bacillus + + + 9 megaterium RSB Rhizobium + + + 10 sp. RSB Azotobacter + + + 12 aerogenes RSB Azotobacter + + + 13 crococcum RSB Azospirillum + + + 16 lipoferum RSB Azospirillum + + + 17 lipoferum RSB Bacillus + + + 18 weihensteph anensis RSB Rhizobium ++ + 19 sp. Keterangan: Tahan salin (+) dan tidak tahan salin (-)

+

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

+

-

-

-

-

-

Hasil uji ketahanan bakteri pada salinitas dapat dibaca pada Tabel 2. Semua bakteri yang diuji tahan terhadap salinitas sampai dosis NaCl 20gr/L. Bakteri Bacillus megaterium strain RSB3, Azotobacter crococcum strain RSB13, Azospirillum lipoferum strain RSB17, Azospirillum lipoferum strain RSB18 mampu bertahan hidup pada media yang mengandung 30g/L NaCl (3%). Pengujian 10 isolat teridentifikasi yang diinokulasikan pada media DF, DF+ACC dan DF+Amonium Sulfat menujukkan bahwa hanya bakteri Bacillus megaterium, Rhizobium sp. dan Azotobacter aerogenes yang dapat tumbuh dengan jumlah koloni banyak (+++). Bakteri Stenotrophomonas maltophilia strain RSB1 dan Azospirillum lipoferum strain RSB17 dapat tumbuh banyak (+++) pada media Media DF + (NH4)2 SO4 dan Media DF + ACC. Bakteri Rhizobium sp.strain RSB19 tumbuh agak banyak (++) pada media DF + ACC. Bacillus megaterium strain RSB9 dan Azotobacter crococcum tumbuhnya sedikit (+) pada media DF + ACC. Sedangkan jenis bakteri Azospirillum lipoferum strain RSB17 dan Bacillus weihenstephanensis strain RSB18 hanya tumbuh pada media DF (+++ dan +) dan DF+Amonium Sulfat (++ dan +++) dan tidak tumbuh (-) pada media DF+ACC (Gambar 1, Tabel 3). Secara statistik produksi hormon IAA tertinggi dihasilkan oleh bakteri Azospirillum lipoferum strain RSB17 (5,596 ppm) dan terendah oleh kontrol serta pada 9 bakteri lainnya tidak ada perbedaan yang signifikan.


Gambar 1. Uji pertumbuhan 10 bakteri teridentifikasi pada media DF (Dworkin Foster) + ACC, hanya 8 bakteri teridentifikasi yang dapat tumbuh (1.Stenotrophomonas maltophilia,3. Bacillus megaterium, 9. Bacillus megaterium, 10. Rhizobium sp., 12. Azotobacter aerogenes, 13. Azotobacter crococcum, 16. AzospirilluM lipoferum, 17. Azospirillum lipoferum, 19. Rhizobium sp.).

Gambar 2. Kontrol Negatif Isolat Eschericia coli pada media DF (Dworkin Foster) + ACC. Hasil uji pelarutan fosfat pada media padat dan cair dengan sumber P: Ca3H2(PO4)2, menunujukkan, bahwa semua bakteri yang diuji dapat melarutkan P (Tabel 4). Hasil pelarutan pada media padat yang ditandai dengan zona bening terbesar (≥ 2,00 cm) disekeliling koloni adalah bakteri Bacillus megaterium RSB3 (2,7 cm), Bacillus megaterium RSB9 (2,4 cm), Bacillus weihenstephanensis RSB18 (2,3 cm), Stenotrophomonas maltophilia RSB1 (2,3 cm), dan Azospirillum lipoferum RSB17 (2,0 cm). Nilai produksi enzim fosfatase (PMEase) asam (0,257; 0,341; 0,270; 0,272; 0,247) dan basa (0,195; 0,288; 0,228; 0,141; 0,194 µg unit/g/jam) serta diikuti oleh nilai P tersedia tertinggi 4,316; 4,583; 4,583; 4,204; 4,283 ppm dan nilai pH yang menurun dari pH 7,0 ke pH 4,5 dijumpai pada hasil aktivitas bakteri: Bacillus megaterium RSB3, Bacillus megaterium RSB9, Bacillus weihenstephanensis RSB18, Stenotrophomonas maltophilia RSB1 (bakteri pelarut fosfat), dan Azospirillum lipoferum RSB17 (bakteri penambat nitrogen non simbiotik).

240


Tabel 3. Analisa Kemampuan Bakteri Memproduksi IAA dan Potensial Memproduksi ACC Deaminase Kode

RSB1 RSB3 RSB9 RSB10 RSB12 RSB13 RSB16 RSB17 RSB18

RSB19

Jenis Bakteri

IAA (ppm)

Stenotrophomonas maltophilia Bacillus megaterium Bacillus megaterium Rhizobium sp.

1,838 ab 1,908 ab 3,544 ab 2,499 ab 3,387 ab 4,162 ab 2,153 ab

Azotobacter aerogenes Azotobacter crococcum Azospirillum lipoferum Azospirillum lipoferum Bacillus weihenstephanensi s Rhizobium sp.

5,596 b 3,311 ab 2,812 ab

ACC Deaminase Media Media Media DF DF + DF + (NH4)2 ACC SO4 ++ +++ +++ +

++

+

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+

++

+

+

++

-

++

+++

+++

+++

++

-

++

+++

++

RSBK

Kontrol (tanpa bakteri) 0,000 a Keterangan: Angka diikuti huruf yang sama pada baris atau kolom yang sama tidak berbeda nyata menurut uji Duncan (p<0,05), tidak tumbuh (-),tumbuh sedikit (+ = 105), tumbuh agak banyak (++ = 105), tumbuh banyak (+++ = 107).

Tabel 4. Hasil analisa Pelarutan P oleh bakteri pada media padat (zona bening), cair (P tersedia) dan enzim fosfatase (PMEase).

Φ Zona bening (cm)

pH

PMEase asam (µg unit/g/ja m

2,3 g

4,5 a

0,257 d

0,195 e

4,316 e

4,5 a

0,341 e

0,288 f

4,583 e

2,4 g

4,5 a

0,270 d

0,228 e

4,583 e

1,1 b

5,0 ab

0,087 b

1,8 e

5,0 ab

0,066 b

1,5 d

5,5 b

0,149 c

1,3 c

5,5 b

0,114 bc

0,045 ab 0,115 cd 0,076 bc 0,033 ab

2,0 f

4,5 a

0,272 d

0,141 d

4,204 e

2,3 g

4,5 a

0,247 d

0,194 e

4,283 e

Rhizobium sp,

1,0 b

5,0 ab

0,066 b

kontrol

0,0 a

7,0 c

0,000 a

Jenis Bakteri

Stenotrophomon as maltophilia Bacillus megaterium Bacillus megaterium Rhizobium sp, Azotobacter aerogenes Azotobacter crococcum Azospirillum lipoferum Azospirillum lipoferum Bacillus weihenstephanen sis

2,7 h

PMEase basa (µg unit/g/ja m

P tersedia (ppm)

0,077 bc 0,000 a

0,538 b 1,220 c 1,325 cd 0,660 b

0,497 ab 0,000 a

Keterangan : Angka diikuti huruf yang sama pada baris atau kolom yang sama tidak berbeda nyata menurut uji Duncan (p<0,05)

Rizosfir tanaman padi sudah banyak diisolasi, tetapi seberapa banyak bakteri yang didapat dan


efektivitasnya sebagai bakteri akar pemacu pertumbuhan tanaman masih terus diteliti. Isolasi tersebut menghasilkan 20 isolat, tetapi hanya10 isolat yang teridentifikasi. Isolasi tersebut hasilnya lebih banyak dari pada hasil penelitian Messungen et al. (2009) yang mengisolasi bakteri dari rizosfer tanaman Gynura pseudochina (L.) DC dan dihasilkan 3 isolat (PDMCd0501, PDMZnCd2003, dan PDMCd2007). Kemudian teridentifikasi sebagai Serratia marcescens, Serratia marcescens, dan Pseudomonas aeruginosa (Nakbanpote, 2013). Populasi bakteri teridentifikasi rata-rata 107 cfu/gr tanah, sedangkan yang tidak teridentifikasi populasinya di bawah 107 cfu/g tanah. Jumlah populasi kurang dari 107 cfu/gr tanah, merupakan fenomena yang mencirikian tanah tersebut tergolong kurang subur (Obaton, 1977). Hal ini menujukkan bahwa peluang teridentifikasinya suatu bakteri mungkin berkaitan dengan jumlah populasi bakteri di rizosfer dan jumlah populasi bergantung pada kesuburan rizosfir, dimana kesuburan tersebut berasal dari senyawa organik yang merupakan eksudat akar tanaman, yaitu padi. Setiap akar tanaman mengeluarkan eksudat senyawa organik berbeda-beda dan dimanfaatkan oleh bakteri untuk berkembang dan bersaing. Perbedaan eksudat akar tanaman berfungsi sebagai penyeleksi jenis bakteri di rizosfer, sehingga terjadi fenomena peningkatan bakteri tertentu tetapi bakteri lainnya terhambat perkembangannya (Husen et al. (2008). Pendapat tersebut memperkuat hasil penelitian, karena dari 20 isolat hanya teridentifikasi 10 isolat dan hanya ditemukan 7 jenis bakteri gram negative. Program BLAST yang digunakan pada isolat RSB1, RSB2 dan RSB9, RSB10 dan RSB19, RSB12, RSB13, RSB16 dan RSB17, RSB18 menunjukkan identitas 99% sebagai bakteri Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus megaterium, Rhizobium sp., Azotobacter aerogenes, Azotobacter crococcum, Azospirillum lipoferum, Bacillus weihenstephanensis. Bakteri Azospirillum lipoferum merupakan bakteri dengan populasi tertinggi dibandigkan bakteri lainnya di rizosfer tanaman padi. Menurut Alexander (1977) populasi bakteri dalam tanah dipengaruhi oleh pemupukan dan jenis tanaman yang tumbuh diatasnya. Azospirillum lipoferum terisolasi dari tanaman padi yang tergolong sebagai tanaman rumput dan menurut Jolly et al. (2010) genus Azospirillum hidup tersebar luas pada daerah rizosfir dibeberapa tanaman rumput tropis dan dapat hidup di pesisir pantai (Widawati dan Muharam, 2012). Sepuluh bakteri teridentifikasi yang diisolasi dari rizosfir tanaman padi di lahan persawahan pesisir pantai Rambut Siwi-Bali, ternyata hanya Bacillus megaterium strain RSB3, Azotobacter crococcum strain RSB13, Azospirillum lipoferum strain RSB17, Azospirillum lipoferum strain RSB18 yang mampu bertahan hidup pada media yang mengandung 30g/L NaCl. Hal ini mungkin karena bakteri diisolasi dari tanah sawah pesisir pantai atau kemungkinan bakteri tersebut merupakan kelompok halofilik dan halotoleran. Menurut Kaushik dan sethi (2005) bakteri Gram negatif kelompok halofilik dan halotoleran dapat hidup subur pada lingkungan salin

241


dan sangat salin (EC 5, 10. 15 dS/m) atau konsentrasi NaCl sebanyak 5-20 % untuk bakteri halofilik sedang, dan 20-30 % untuk bakteri halofilik ekstrem (Irshad, 2014). Bakteri yang masuk dalam kelompok halofilik dan halotoleran adalah bakteri yang dapat merubah bahan nitrogen organik dalam air (Prosser, 2007). Kematian bakteri yang lain pada lingkungan salinitas tinggi terjadi karena adanya tekanan osmotik yang tinggi dan berpengaruh pada aktivitas pertumbuhan mikroba di rizosfer (Ofek et al., 2006) dan kandungan natrium klorida mempengaruhi struktur komunitas mikroba di rhizosfer melalui kuantitas dan /atau kualitas eksudat akar (Nelson dan Mele, 2007). Hasil tersebut diatas meskipun lebih rendah dari hasil penelitian Zao et al. (2011) pada isolat YCWA 18 yang tahan hidup pada konsentrasi NaCl hingga 20% dan dapat melarutkan fosfor dari Ca3H2(PO4)2, tetapi secara global salinitas tidak masalah bagi kehidupan bakteri Bacillus, Azotobacter dan Azospirillum, khususnya dalam melarutkan P (Soni et al.,2013). Hal yang sama terjadi pada penelitian ini, semua bakteri yang diuji dapat membentuk zona bening disekeliling koloni pada media Pikovskaya padat. Hasil serupa juga diperoleh pada hasil penelitian Rachmiati (1995), yang selanjutnya dijelaskan, bahwa luas daerah bening yang terbentuk secara kualitatif menunjukkan besar kecilnya kemampuan bakteri melarutkan P. Proses pelarutan P oleh bakteri akan diikuti penurunan pH substrat (pH asal 7 menjadi 4,5-5). Hal ini terjadi karena adanya proses pembebasan BPF oleh sejumlah asamasam organik seperti asam sitrat, glutamat, suksinat, laktat, oksalat, glikooksalat, malat, fumarat, tartarat, dan asam alpha ketobutirat yang berakibat pada terjadinya pelarutan Ca-fosfat (Rao, 1991). Fosfat terlarut di media cair berhubungan dengan aktivitas enzim PMEase. Tinggi rendahnya aktvitas enzim fosfatase tergantung pada tinggi rendahnya aktivitas bakteri. Jadi jelas bahwa enzim fosfomonoesterase (PMEase) mempunyai peranan penting terhadap mineralisasi dari P organik menjadi P anorganik (Linu et al., 2009) dan peningkatan P tersedia selama inkubasi pada media Pikovskaya cair disebabkan oleh bakteri pelarut fosfat yang mensekresikan asam-asam organik membentuk senyawa kompleks yang sukar larut sehingga fiksasi P akan menurun sebaliknya P-tersedia meningkat (Whitelaw 1999). Semua bakteri yang diuji dapat melarutkan P, memproduksi PMEase, dan memproduksi hormon IAA, tetapi hanya bakteri Bacillus megaterium, Stenotrophomonas maltophilia, Rhizobium sp., Azotobacter aerogenes, Azotobacter crococcum, dan Azospirillum lipoferum yang dapat menghasilkan ACC deaminase dan tahan saline sampai 20g/L NaCL. Fenomena ini terjadi karena efektivitas enzim ACC deaminase yang dihasilkan bakteri dapat menurunkan kadar ACC yang meningkat karena stres salinitas, sehingga produksi etilen dapat ditekan (Glick, 1995). Sedangkan produksi IAA oleh bakteri dipengaruhi prekursor L-triptofan 200 ppm yang ditungkan dalam media TSB. L-triptofan 200ppm berperan sebagai prekursor biosinstesis IAA (indole-3-asetic-acid), indol-


3-asetamida, triptamin, dan indol-asam piruvat (Thenius et al. 2004). Menurut Ahmad et al. (2005) pemberian triptofan secara eksogen pada media TSB akan mempengaruhi bakteri kinerja dalam meningkatkan IAA karena triptofan juga merupakan sumber nitrogen yang mudah diserap mikroorganisme. Selain itu, triptofan juga merupakan sumber karbon dan energi yang akan diurai dalam beberapa jalur metabolisme karbohidrat (Moat dan John 1995). Semua analisa yang dilakukan pada 10 jenis bakteri tersebut dapat disimpulkan, bahwa sepuluh bakteri tersebut sudah terdeteksi sebagai bakteri akar pemacu pertumbuhan tanaman (BAPPT) atau Plant growth promoting rhizobacteria (PGPR). Kelompok PGPR dapat menyediakan unsur hara P dan N yang merupakan unsur esensial bagi tanaman serta dapat memproduksi hormon pemacu pertumbuhan tanaman seperti IAA ("indole-3-acetic acid") (Patten dan Glick 2002), dapat memproduksi senyawa antibiotik dan siderophor yang berguna untuk menekan aktivitas pathogen (Glick, 1995) serta menghasilkan enzim 1aminocyclopropane-1-karboksilat (ACC) deaminase untuk mengurangi tingkat pengembangan etilena di akar tanaman sehingga meningkatkan panjang akar dan pertumbuhan (Penrose dan Glick, 2001). Jadi harapannya kedepan adalah dengan keberadaan isolat bakteri indigenus pelarut P, penghasil hormone IAA dan penghasil ACC deaminase pada rhizosfer tanaman padi di lahan sawah pantai Rambut Siwi, Bali, diharapkan dapat berkontribusi pada lahan salin/kondisi salin. SIMPULAN Teridentifikasi 10 spesies bakteri yaitu Bacillus weihenstephanensis, lipoferum Azospirillum, Azotobacter crococcum, Stenotrophomonas maltophilia, B. megaterium, B. megaterium, Rhizobium sp., Rhizobium sp yang terdeteksi sebagai BAPPT/PGPR. Terdektesi tiga bakteri spesies “Azospirillum lipoferum RSB 17, B. megaterium RSB3, B. weihenstephanensis RSB18” terbaik sebagai BAPPT/PGPR dengan populasi dan produksi IAA tertinggi, tahan salin, serta berpotensi sebagai producer ACC Deaminase. Daftar Pustaka Ahmad F, Ahmad I dan Khan MS. 2005. Indole Acetic Acid Production by the Indigenous Isolates of Azotobacter and Fluorescent Pseudomonas in the Presence and Absence of Tryptophan. Turk J Biol., 29: 29-34. Alexander M. 1977. Introduction to Soil Mycrobiology.2nd Edition.John Wiley and Sons. New York Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. 1997. Gapped BLAST and PSIBLAST a new generation of protein database search programs. Nucleic acids Res, 25:3389–3402. doi:10.1093/nar/25.17.3389 Caceres, Enrique A, dan Rodriguez. 1982. Improved Medium for Isolation of Azospirillum spp.

242


Applied and Environmental Microbiology, 44: 990-991. Dworken, M. adan Foster J. 1958. Experiments With Some Microorganisms Which Utilize Ethane and Hydrogen. J. Bacteriol., 75: 592-601. Gaur, AC. 1981. Phospho-Microorganism and Varians Transformation in Compost Technology, Project Field Document No. 13 FAO. Glick, BR. 1995. The Enhancement of Plant Growth by Free-living Bacteria. Can. J. Microbiol., 41: 109-17. Glick, BR. 2005. Modulation of Plant Ethylene Levels by the Bacterial Enzyme ACC Deaminase. FEMS Microbiology Letters, 251: 1-7. Gravel V, Antoun H, Tweddell RJ. 2007. Growth Stimulation and Fruit Yield Improvement of Greenhouse Tomato Plants by Inoculation With Pseudomonas Putida or Trichoderma atroviride: Possible Role of Indole Acetic Acid (IAA). Soil Biology Biochemistry, 39: 1968-1977 Huang H, Huang M, Fan G, Liu X, Wang J, Duan Q dan Zhang Q. 2013. Isolation Characterization of 1Aminocyclopropane-1-Carboxylate (ACC) Deaminase-containing Plant Growth-promoting Rhizobacteria From Carnation Soil and Roots. African Journal of Microbiology Research, 7 (50) : 5664-5668. Husen E, Saraswati R dan Hastuti RD. 2008. Pupuk Hayati Pupuk Organik. Balai Tanah Litbang Pertanian. Bogor. Irshad A, Ahmad I, dan Kim SB. 2014. Culturable Diversity of Halophilic Bacteria in Foreshore soils. Braz J Microbiol., 45(2): 563–571 Jolly SN, Shanta NA, dan Khan ZUM. 2010. Quantification of Heterotrophic Bacteria and Azospirillum from The Rhizosphere of Taro (Colocasia esculenta L. Schott) and the Nitrogen Fixing Potential of Isolated Azospirillum. Intern. J. Botany, 6 : 117-121. Kaushik A and Sethi. 2005. Salinity Effects on Nitrifying and Free Diszotrophic Bacteria Populations in The Rhizosphere of Rice. Bulletin of the National Institute of Ecology, 15: 139 – 144. Linu MS, Stephen J dan Jisha MS. 2009. Phosphate Solubilizing Gluconacetobacter sp., Burkholderia sp. And Their Potential Interaction eith Cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp.). International Journal of Agriculture Research, 4(2): 79-87. Meesungnoen O, Nakbanpote W, Thiwthong R, Thuamnu K. 2009. Plant Growth Promoting Properties of Heavy Metal Tolerant Bacteria Isolated From Gynura pseudochina (L.) DC.’s


rhizosphere, Proceeding of International Conference on Green and Sustainable Innovation (ICGSI); 2009 Dec 2–4; Thailand: Chiang Rai. p. 618–624 Mehboob A, Stal LJ, dan Hasnain S. 2010. Production of Indole-3-Acetic Acid by the Cyanobacterium Arthrospira platensis Strain MMG-9. J. Microbiology Biotechnol., 20 (9): 1259–1265 Moat AG dan John WF (1995). Microbial Physiology. Third Ed. New York, John Wiley & Sons p, 305-306, 452-453. Mullins MG. 1972. Auxin and ethylene in adventitious root Plant Growth Substances. pp 526-533 in DJ. Carr (Ed.) Springer-Verlag, New York. Nakbanpote W, Panitlurtumpai N, Sangdee A, Sakulpone N, Sirisom P dan Pimthong A. 2014. Salttolerant and Plant Growth-Promoting Bacteria Isolated from Zn/Cd Contaminated Soil: Identification and Effect on Rice Under Saline Conditions. Journal of Plant Interactions, 9 (1): 379–387. Nelson DR dan Mele PM. 2007. Subtle Changes in The Rhizosphere Microbial Community Structure Inresponse to Increased Boron and Sodium Chloride Concentrations. Soil Biology and Biochemistry, 39, 340–351 Obaton M. 1977. In Biological Nitrogen Fixation in Farming System of the Tropics. Ayanaba and Dart, Eds. Willey. London. Ofek M, Ruppel S, dan Waisel Y. 2006. Effects of Salinity on Rhizosphere Bacterial Communities Associated with Different Root Types of Vicia faba L. pp 1–21 in Biosaline Agriculture and Salinity Tolerance in Plants. Ozturk M, Waisel Y, Khan A, dan Gork G (eds), Birkhauser, Basel. Patten CL dan Glick BR. 2002. Role of Pseudomonas Putida Indoleacetic Acid in Development of The Host Plant Root System.Appl. Environ. Microbiol., 68: 3795–3801. Penrose DM, Moffatt BA and Glick BR. 2001. Determination of 1-Aminocyclopropane-1Carboxylic Acid (ACC) to Assess The Effects of ACC Deaminase-containing Bacteria on Roots of Canola Seedlings. Can. J. Microbiol., 47: 77– 80. Rachmiati Y. 1995. Bakteri Pelarut Fosfat dari Rizozfer Tanaman dan Kemampuannya Dalam Melarutkan Fosfat. Prosiding Kongres Nasional VI HITI, Jakarta, 12-15 Desember 1995. Ravikumar S, Kathiresan K, Ignatiammal TM, Baba MS dan Shanthy S. 2004. Nitrogen Fixing Azotobacters From Mangrove Habitat and Their Utility as Marine Biofertilizes. Journal of

243


Experimental Marine Biology and Ecology, 31 (2): 5-17. Rao S. 1994. Mikroorganisme Tanah dan Pertumbuhan Tanaman. Jakarta. Penerbit Universitas Indonesia. Soni AA, Rokad S, Sharma P. 2013. Screening of efficient Halotolerant Phosphate Solubilizing Bacteria and Their Effect on Seed Germination Under Saline Conditions. Journal of Scientific and Innovative Research, 2 (5): 932-937. Tabatabai MA dan Bremner JM 1969. Use of pnitrophenyl Phosphate Assay of Soil Phosphatase Activity. Soil. Biol. Biochem., 1: 301-307. Thenius M.H, Kobayashi Broughton WJ dan Prinsen E. (2004). Flavonoids, NodD1, NodD2, and NodBox NB15 Modulate Expression of The y4wEFG Locus That is Required for Indole-3Acetic Acid Synthesis in Rhizobium sp. Strain NGR234. Mol. Plant-Microbe Interactions, 17 (10): 1153-1161 Vincent JM. 1982. Nitrogen Fixation in Legume. Academic Press, London. Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ. 1991. 16S Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic Study. J Bacteriol, 173: 697–703. Whitelaw MA, Harden TJ, Helyar KR.1999. Phosphate Solubilisation in Solution Culture by The Soil Fungus Penicillium Radicum. Soil Biol Biochem, 31:655–665 Widawati S dan Muharam A. 2012. Uji laboratorium Azospirillum sp. yang Diisolasi dari Beberapa Ekosistem. J. Hort. 22 (3): 258-267.http: //www. researchgate. net /publication /277312967. Zahir ZA, Munir A, Asghar HN, Arshad M, Shaharoona B. 2008. Effectiveness of Rhizobacteria Containing ACC-Deaminase For Growth Promotion of Peas (Pisum sativum) Under Drought Conditions. J. Microbiol. Biotechnol, 18 (5), 958–963 Zhao XR dan Lin QM. 2001. A Review of Phosphate Dissolving Microorganisms. Soil Fertilizer. 3 : 7–11.


244

ISOLASI, KARAKTERISASI, ANALISA KIMIA DAN DETEKSI BAPPT BAKTERI TANAH PERAKARAN PADI DARI RAMBUT SIWI, BALI

Recommend Documents