Iontové zdroje I. Iontový zdroj. Data. Vzorek. Hmotnostní analyzátor. Zdroj vakua. Ionizace, vlastnosti iontových zdrojů, iontová optika

MC230P43 Hmotnostní detekce v separačních metodách, 2015

Iontové zdroje I. Ionizace, vlastnosti iontových zdrojů, iontová optika API zdroje: Iontové zdroje pracující za atm. tlaku Elektrosprej Nanoelektrosprej Chemická ionizace za atmosférického tlaku Fotoionizace za atmosférického tlaku Thermosprej Kombinované zdroje


Iontový zdroj

Vzorek

Iontový zdroj

Data

Hmotnostní analyzátor

Detektor

Zdroj vakua


Ionizace Ionizace: převedení neutrálních molekul, případně iontů v roztoku na ionty v plynné fázi Příklady ionizací: M + e- -> M+• + 2e- (tvorba radikál kationtu v EI) M + e- -> M2+ +3e- (vznik vícenásobně nabitých iontů v EI) M + h -> M+• + e- (tvorba radikál kationtu v APPI) M + [BH]+ -> [M+H]+ + B (přenos protonu, CI, ESI, APCI) M + B -> [M-H]- + [BH]+ (vznik negativně nabitých iontů v CI, ESI, APCI) M + X+ -> [M+X]+ (elektrofilní adice, kationizace, ESI, MALDI)

molekulární ion (M+•) vs. molekulární adukt ([M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+)


Ionizace, iontový zdroj, interface Neexistuje univerzální ionizační technika pro všechny molekuly, pro různé typy sloučenin jsou vhodné různé ionizace, které vedou k molekulárním iontům nebo aduktům.

ionizace

měkká tvrdá

Rozdělení podle energie “tvrdé” ionizační techniky – vysoce energetická ionizace, molekuly se rozpadají na fragmenty (EI, PB) “měkké” ionizační techniky – málo energetické, vznikají hlavně molekulární adukty, minimální fragmentace (API techniky, MALDI)

ionizace

za sníženého tlaku za atmosférického tlaku

Rozdělení podle tlaku v iontovém zdroji: ionizace může probíhat za sníženého tlaku (EI, MALDI) nebo za atmosférického tlaku – tzv. API techniky, MALDI


Ionizační techniky APCI: chemická ionizace za atmosférického tlaku APPI: fotoionizace za atmosférického tlaku EI: elektronová ionizace ESI: ionizace elektrosprejem MALDI: ionzace za spoluúčasti matrice TSI: ionizace termosprejem


Ionizační techniky

http://masspec.scripps.edu


Ideální iontový zdroj pro GC, HPLC, CE  Musí být kompatibilní s mobilními fázemi a jejich průtoky běžně používanými v separačních metodách. Vysoké průtoky mobilní fáze nesmí ovlivnit vakuum v hmotnostním spektrometru.  Nesmí výrazně přispívat k rozšiřování chromatografických zón.  Musí zajistit vysokou účinnost ionizace a transportu vzniklých iontů do MS (citlivost).  Ionizace co největšího množství látek (struktura, polarita, hmotnost).  Spektra musí být reprodukovatelná a interpretovatelná.  Signál musí být koncentračně závislý (umožňovat kvantifikaci).  Zařízení musí být spolehlivé, robustní, jednoduché na obsluhu, cenově dostupné.


API zdroje: Iontové zdroje pracující za atmosférického tlaku ESI, nanoESI, APCI, APPI


Sprejování mobilní fáze Společným prvkem technik ionizace za atmosférického tlaku je tvorba spreje. elektrickým polem (elektrosprej)

sprejování

pneumatické, za pomocí plynu vyhříváním kapiláry

Vzájemné uspořádání sprejeru a vstupu do hmotnostního spektrometru (kóna, kapilára) ovlivňuje citlivost, velikost matričních efektů i robustnost systému.


Iontová optika iontových zdrojů - maximalizace transportu iontů do analyzátoru / omezení vstupu neutrálních částic - účinná desolvatace / deklasterizace Účinnost přenosu iontů z iontového zdroje do MS zásadním způsobem ovlivňuje citlivost a dynamický rozsah spektrometru Skimmer: kónická elektroda s otvorem, která odděluje oblasti s různým tlakem; vzorkování iontů ve spreji nebo v expanzním prostoru za štěrbinou

Vyhřívaná vstupní kapilára: vyhřívanáná trubice, která odděluje oblasti s různým tlakem Ztráty při převodu iontů z vyššího tlaku do nižšího v oblasti skimmeru – (u ESI může být detekovaný iontový proud až o 3 řády nižší než generovaný).


Iontová optika iontových zdrojů Šestiotvorová vstupní kapilára Vstupní kapiláry/štěrbiny – průměr typicky 0,2 – 1,0 mm ESI: maximální tvorba iontů v oblasti 3-5 mm od středu spreje (Agilent AJS) Vyšší průměry nevedou ke významnému zvýšení signálu (ztráty kvůli změně laminárního proudění na turbulentní), vyšší nároky na čerpadla. → vstupní element tvořený soustavou 6 kapilár (zvýšení transmise, vyšší nároky na čerpání)

Firemní materiály Agilent


Iontová optika iontových zdrojů Iontová nálevka (ion funnel) – soustava prstencových elektrod s otvory, jejichž vnitřní průměr se postupně snižuje. Na elektrody se vkládá stejnosměrné a střídavé napětí – ionty jsou kolizně ochlazeny, zaostřeny do úzkého svazku a účinně přeneseny dále do MS. Zvýšení citlivosti oproti skimmerům: 10x – 30x

Shaffer et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 1997, 11, 1813–1817; Firemní materiály Agilent, Bruker


Iontová optika iontových zdrojů StepWave™- soustava prstencových elektrod tvořících dva oddělené kanály. Ionty a neutrální částice ze zdroje vstupují do spodní trubice; potenciálový rozdíl mezi trubicemi směruje ionty do horní trubice, neutrální částice jsou odstraněny vakuovým systémem. Ionty jsou dále vedeny pomocí kombinace RF a DC (T-wave technologie)

Firemní materiály Waters


Elektrosprej (ESI)

Eluát prochází kapilárou, na niž je vloženo vysoké napětí. Intenzivní pole na konci kapiláry tvoří kónický meniskus (Taylorův kužel), ze kterého se uvolňuje sprej vysoce nabitých kapiček. Následným postupným odpařením rozpouštědla vznikají ionty. Pokud je více ionizačních míst v molekule mohou vznikat vícenásobně nabité ionty. ESI – převod iontů, které již existují v kapalné fázi do fáze plynné.


Elektrosprej (ESI)

Rayleighův limit - stav, kdy jsou repulsní síly stejné jako povrchové napětí, které drží kapku pohromadě

q  8 ( 0  R 3 )1 / 2

q – náboj, 0 – permitivita vakua,  - povrchové napětí, R – poloměr kapky


Elektrosprej (ESI)

 jednoduchý, s velmi širokou oblastí použití, díky tvorbě vícenásobně nabitých iontů umožňuje analyzovat velmi velké molekuly (proteiny apod.)  omezená použitelnost pro nepolární MF a nepolární analyty Elektrosprej je vhodný pro:

Měkká ionizační technika, tvorba [M+H]+, [M+Na]+, [M-H]- iontů, fragmentace jen v některých případech.

polární i iontové látky, peptidy, proteiny, sacharidy, nukleové kyseliny, organometalické i anorganické komplexy průtoky 5 µl/min - 1 ml/min (při >50 µl/min je nutné použít nebulizační/pomocný plyn)

Elektrosprej je nejčastěji používaný iontový zdroj v LC/MS.


Elektrosprej

ESI zdroj (Waters)

ESI zdroj (Thermo)


Elektrosprej N CH3 N

Příklad: Analýza léčiv – antiepileptikum Midazolam

N F Cl

N

N

OH

N F Cl

Tvorba molekulárních aduktů [M+H]+, žádná fragmentace. Muchohi et al., J. Chromatogr. B, 821, 2005, 1


Elektrosprej Příklad: Analýza peptidů bradykinin

bradykinin

Tvorba molekulárních aduktů [M+H]+, [M+Na]+. Většinou velmi intenzivní signály. Toll et al., J.Chromatogr. A, 1079, 2005, 274.


Elektrosprej Příklad: Analýza proteinů myoglobin

myoglobin 16951 Da , 153 AA

Tvorba vícenásobně nabitých molekulárních aduktů [M+H]+, [M+2H]2+, [M+3H]3+, [M+4H]4+, atd. Distribuce nábojových stavů závisí na pH mobilní fáze.


Elektrosprej Příklad: Analýza oligonukleotidů

Tvorba vícenásobně negativně nabitých molekulárních aduktů [MH]-, [M-2H]2-, [M-3H]3-, [M-4H]4-, atd. Mohou se vyskytnout výměny protonu za alkalický kov (Na, K).


Nanoelektrosprej (nanosprej) Taylorův kužel

Wilm, M. S.; Mann, M. Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 1994, 136, 167.

 velmi malá spotřeba vzorku, sprejování z vody bez přítomnosti organických rozpouštědel, vyšší tolerance k solím, možnost spojení s kapilární HPLC  experimentální náročnost

Nanoelektrosprej - obdoba ESI pracující s průtoky nl/min. Sprejuje se z kapilár o velmi malém průměru (několik m), vkládá se nižší napětí než u ESI (0,5 – 1,5 kV). Tvoří se menší kapky, které snáze desolvatují. Zvyšuje se účinnost ionizace. Práce s nanoelektrosprejem je experimentálně náročnější, polohu sprejeru je nutno pečlivě optimalizovat.

Nanoelektrosprej je vhodný: pro obdobné látky jako ESI, hlavní využití v analýze proteinů a peptidů průtoky 20-500 nl/min 0,5-5 l/min = microESI

Nanoelektrosprej je používaný pro kapilární a nano-HPLC/MS a CE/MS.


Nanoelektrosprej (nanosprej)

sprejovací kapiláry

nanoelektrosprej Waters

nanoelektrosprej Proxeon


Nanoelektrosprej (nanosprej) Integrace sprejeru, kolony a termostatu do snadno vyměnitelného dílu

Zdroj: Thermo



Čip = mikrofabrikovaná chromatografická kolona pro UHPLC, spojovací kapilára a nanoelektrosprejer (keramický materiál) Zdroj: Waters

Čip = mikrofabrikovaná chromatografická kolona, spojovací kapilára a nanoelektrosprejer (polyimid); sendvičová struktura, čipy na zakázku

Zdroj: Agilent



Čip = křemíková destička s mikrofabrrikovanými sprejery a integrovanou SD kartou. Automatická změna sprejeru při zablokování. Zdroj: Advion


Nanoelektrosprej (nanosprej) Vliv napětí na sprejovací kapiláře na kvalitu spreje:

Sprejování 5% kyseliny octové v 30% MeOH , průtok 200 nl/min, 5mm od vstupní kóny 900 V – žádný sprej 1000 V – oscilace mezi Taylorovým kuželem/kapkami, více kapek než spreje 1100 V - oscilace mezi Taylorovým kuželem/kapkami, 50% sprej 1200 V – sprej s kapkami na jeho okraji 1300 V – stabilní sprej 1400 V – nestabilní sprej 1550 V – vícenásobný sprej, pokles signálu


Nanoelektrosprej (nanosprej) Příklad: Analýza inzulínu – srovnání ESI a nanoESI v přítomnosti solí

ESI

nanoESI

V přítomnosti sodných kationtů se v případě elektrospreje tvoří vedle [M+4H]4+ ještě sodné adukty. NanoESI je méně citlivý na přítomnost solí, proto se adukty s Na+ netvoří. Schmidt et al., J Am Soc Mass Spectrom. 2003 14(5):492.


Nanoelektrosprej (nanosprej) chromatogram

Příklad: Analýza tryptického digestu cytochromu c

MS spektrum

MS/MS spektrum

Nejčastější využití nanoESI analýza proteinů po jejich enzymatickém štěpení na peptidy.


ESI při nízkých tlacích: subatmosférický tlak ESI ve vakuu?

atmosférický tlak

vakuum (10−5–10−6 Torr)

Atmosférický tlak snižuje rychlost kapiček, zvyšuje hustotu náboje a způsobuje rozšiřování spreje → sprejování za nižších tlaků umožňuje účinnější transmisi iontů do analyzátoru → příliš nízký tlak způsobuje velmi rychlé odpařování rozpouštědel, zamrzání, nestabilitu spreje; výhodnější je nepříliš nízký (subatmosférický) tlak. Komerčně (zatím) nedostupné. Další aplikace: sprejování iontových kapalin (zanedbatelně těkavé, vysoká el. vodivost) ve vysokém vakuu jako ESI zdroj pro SIMS J. Fluid Mech. 2008, 604, 339; Anal. Chem. 2008, 80, 1800; Anal. Chem. 2010, 82, 9344


Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI Horning, E.C., Carroll, D.I., Dzidic, I., Haegele, K.D., Horning, M.G., Stillwell, R.N., J. Chromatogr. 99, 13, 1974.

Eluát je rozprašován do vyhřívané komůrky (~400-500 °C). Koronový výboj je zdrojem elektronů, které ionizují plyny ve zdroji (zmlžovací plyn N2, vzduch). Vzniklé ionty kolidují s molekulami rozpouštědla za tvorby sekundárních reakčních iontů (např. (H2O)nH+). Tyto ionty ionizují molekuly analytu (záleží na jejich protonové afinitě).


Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI Mechanismus tvorby iontů v APCI:

kladně nabité ionty: přenos protonu, výměna náboje

záporně nabité ionty: ztráta protonu, záchyt elektronu


Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI  jednoduchá, se širokou oblastí použití, snadné použití s konvenční HPLC (kompatibilita průtoků), vhodná i pro méně polární analyty  nevhodná pro termálně nestálé sloučeniny

Měkká ionizační technika, tvorba [M+H]+, [M-H]- iontů, adukty se solventem, fragmentace je běžná, ale většinou v malém rozsahu.

APCI je vhodná pro: polární i málo polární analyty < 2000 u, průtoky 0,5 – 2,0 ml/min

APCI je druhý nejčastěji používaný iontový zdroj v LC/MS.


Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI

APCI zdroj Thermo APCI zdroj Varian


Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI Příklad: Analýza oxkarbazepinu a jeho metabolitů ve vlasech (forenzní toxikologie)

[M+H]+

Ve spektrech je molekulární adukt [M+H]+ a fragmenty.

frg.

Kłys et al., J. Chromatogr. B, 825, 38, 2005


Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI Příklad: analýza triacylglycerolů v tukovém tělese čmeláků

150 mm + 300 mm NovaPak C18

J.Cvačka, O. Hovorka, P.Jiroš, J. Kindl, K. Stránský, I. Valterová: J. Chromatogr.A, 1101, 226-237, 2006 E.Kofroňová, J.Cvačka, P.Jiroš, D.Sýkora, I.Valterová: J. Lipid Sci. Technol., 2009,


Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI Příklad: analýza triacylglycerolů v tukovém tělese čmeláků [M+NH4]+ 876.4

Triacylglycerol OOP

577.4

603.4

[M+H]+ 282; FA 18:1

859.5

256; FA 16:0


GC/APCI-MS

McEwan and McCay, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 16, 1730–1738 (2005).

APCI lze použít jako iontový zdroj pro GC.  lze použít vyšší průtoky nosného plynu, rychlé přepínání polarit  méně univerzální než EI (nelze ionizovat např. uhlovodíky), méně fragmentace, spektra nejsou vhodná pro srovnávání s EI knihovnami Stejně jako u LC/APCI vznikají molekulární adukty [M+H]+.


Fotoionizace za atmosférického tlaku - APPI

Eluát je rozprašován do vyhřívané komůrky. VUV lampa je zdrojem fotonů (energie ~10 eV), které jsou absorbovány molekulami analytu. Analyt ztrácí elektron a vznikají molekulární ionty M•+. Do zdroje se může přivádět dopant s nízkou ionizační energií (toluen, aceton) ke zvýšení koncentrace ionizovaných molekul a tím i ke zvýšení účinnosti ionizace analytu.


Fotoionizace za atmosférického tlaku - APPI detekce látek s velmi nízkou polaritou, velký lineární dynamický rozsah APPI je vhodná pro: látky, které se obtížně ionizují v ESI a APCI (APPI není závislá na acidobazických reakcích v plynné fázi). průtoky 0,5 – 2,0 ml/min Energie fotonů je volena tak, aby byla dostatečná pro ionizaci analytů, ale zároveň dostatečně nízká, se neionizoval vzduch a rozpouštědla (voda, MeOH, MeCN). Dochází k přímé ionizaci analytů.

API metoda, měkká ionizace. Tvorba M•+, M•-, [M+H]+, [M-H]iontů, aduktů se solventem.


Fotoionizace za atmosférického tlaku - APPI


Fotoionizace za atmosférického tlaku - APPI Příklad: Analýza polycyklických aromatických uhlovodíků

Benzo[a]pyren dává v ESI minimální odezvu [M+H]+, v APCI část iontů fragmentuje. Maximální odezvu poskytuje APPI. Hanold et al., Anal.Chem.76, 2842, 2004


Thermosprejová ionizace - TSI C. R. Blakley, J. J. Carmody, and M. L. Vestal: J. Am. Chem. Soc. 1980; 102(18), 5931

Pro průtoky 0,5-2,0 ml/min

Eluát prochází kapilárou, jejíž konec je vyhřívaný. Na konci kapiláry se tvoří sprej, mobilní fáze obsahující těkavý pufr (např. 0,1 M octan amonný) je rychle zplyněna. Analyty přitom tvoří adukty s přítomnými ionty. Ionty jsou extrahovány do vstupní štěrbiny analyzátoru. Nízká účinnost ionizace, nízká citlivost. Dnes téměř nepoužívaný zdroj. Není pravý API zdroj, v prostoru zdroje je tlak jen několik Pa.


Thermosprejová ionizace - TSI Příklad: Identifikace saponinů v sóji luštinaté (Glycine max)

* fragmenty

Tvorba aduktů se složkami mobilní fáze, rozsáhlá fragmentace.

N.Fuzzati, R.Pace, G.Papeo, F.Peterlongo, J. Chromatogr. A, 777, 1997, 233


Kombinované (duální) iontové zdroje: ESI + APCI

- současná detekce v módu ESI a APCI bez nutnosti přepínání zdroje - pro ionizace látek, které mají výrazně jiné citlivosti v ESI a APCI

Př. Analýza vitamínů

Zdroj: Agilent, Shimadzu


Kombinované (duální) iontové zdroje: APCI + APPI Př. Polycyklické látky

- současná ionizace v módu APCI a APPI může zvyšovat celkovou odezvu detektoru

Zdroj: Thermo

Iontové zdroje I. Iontový zdroj. Data. Vzorek. Hmotnostní analyzátor. Zdroj vakua. Ionizace, vlastnosti iontových zdrojů, iontová optika

Recommend Documents