Interní grantová agentura AF MENDELU Závěrečná zpráva o řešení interního grantového projektu AF MENDELU za rok 2012 Individuální projekty ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA 1. Název projektu: Studium komplexů živočišných kov-vazných proteinů s platinovými cytostatiky 2. Řešitel (příjmení, jméno, tituly): Zítka, Ondřej, Mgr. 3. Pracoviště řešitele (ústav, telefon, e-mail): Ústav chemie a biochemie, telefon: 3350, e-mail:
[email protected] 4. Garant doktorského projektu (příjmení, jméno, ústav): Kizek, René, Prof. Ing. PhD., Ústav chemie a biochemie 5. Závěrečná zpráva a) Anotace projektu Problematika interakcí těžkých kovů s biologicky aktivními molekulami u živočichů je dosud ne zcela uspokojivě prozkoumána. Ať už jde o těžké kovy jako je kadmium, olovo nebo rtuť, které jsou významnými polutanty životního prostředí nebo o kovy jako je platina nebo arsen, které jsou používány při léčbě onkologických onemocnění, mají všechny společnou vlastnost. V živočišném organismu se tyto prvky nepohybují volně, ale jsou vázány na jiné molekuly. Těmi jsou dnes známé některé transportní proteiny, které přenáší kovy v buňkách, krevním řečišti anebo bílkovinné přenašeče, které zprostředkovávají pohyb těchto kovů přes cytoplasmatickou membránu. Těžké kovy mohou být ale také vázány menšími molekulami než jsou samotné proteiny. Nejčastěji jsou to peptidy obsahující ve své struktuře aminokyselinu cystein, která obsahuje thiolovou skupinu. Těžký kov, který je vázán na některou z těchto látek, představuje výrazně nižší nebezpečí pro organismus, než kdyby se vyskytoval volně. Vyvázání kovu výrazně zamezí tvorbu reaktivních kyslíkových radikálů (ROS) které mohou poškozovat biomolekuly. V případě Cis-platiny a ostatních léčiv je naopak žádoucí aby se cytostatikum navázalo do struktury DNA a bylo tak zamezeno další replikaci DNA nádorové buňky. Z dosavadních poznatků vyplývá, že malý, na cystein bohatý protein metalothionein (MT) je velmi důležitým kov vazným proteinem pro většinu živočichů od savců po ryby. Kov vazné schopnosti proteinů jako je MT se však mohou měnit v závislosti na primární struktuře proteinu. Tyto znalosti jsou velmi důležité pro vývoj nových protinádorových léčiv na bázi kovů, jako jsou dnes již známé Cis-Pt, Carbo-Pt a Oxali Pt. Tento projekt je zaměřen na studium komplexů uměle nasyntetizovaných peptidových fragmentů proteinu MT s výše zmíněnými platinovými cytostatiky. Získané fragmenty pocházejí z různých živočišných organismů a liší se sekvencí aminokyselin při zachování konzervativních pozic s aminokyselinou cystein. Vzhledem k výrazné elektroaktivitě aminokyseliny cysteinu bude pro účely studia optimalizována metoda průtokové injekční analýzy s elektrochemickou detekcí (FIA-ED). Podmínky pro tvorbu komplexů in vitro budou velmi podrobně optimalizovány. Výstupem projektu byly data, která za účelem snazší a srozumitelné interpretace projdou bioinformatickým zpracováním. Tato data pak pomohou objasnit problematiku vlivu sekvence primární struktury proteinu na tvorbu komplexu s léčivem. Tato námi vyvíjená metoda by v budoucnu mohla pomoci při řešení problémů s rezistencí nádorových buněk vůči nově vyvíjeným léčivům, jelikož jedním z mechanismů resistence je i syntéza proteinu MT samotnými nádorovými buňkami.
b) Způsob metody řešení, průběh řešení 5.1 Úvod Problematika rezistence nádorových buněk na nádorová léčiva je velkým problémem v léčbě (Boehm, a kol., 1997) a není dodnes uspokojivě vysvětlena (Sakai, a kol., 2008). Její podstatou je mimo jiné i interakce cytostatik s biomolekulami syntetizovanými nádorovými buňkami (Higgins, 2007). Vyvíjení stále nových typů léčiv, je podmíněno dosažením vyšší selektivity a nižší nežádoucí toxicity (Sawyers, 2004). Příkladem vývojové řady jsou platinová cytostatika (Wang a Lippard, 2005). Ta jsou zároveň nejdéle a nejvíce rozšířená pro systémovou terapii mnoha nádorových onemocnění, ale špatná odpověď na tuto léčbu může být způsobena interakcí s proteiny anebo komplexy proteinů s DNA (Ohndorf, a kol., 1999). Jeden z obecně uznávaných mechanismů rezistence je overexprese proteinu metalothioneinu (MT) v nádorových buňkách (Eckschlager, a kol., 2009). Ze strukturního hlediska je metalothionein nízkomolekulární protein o velikosti (6-7 kDa) který je velmi bohatý na aminokyselinu cystein, která jej předurčuje pro jeho kov vazné vlastnosti. Dodnes bylo popsáno celkem 250 jeho různých strukturních forem. Terciární struktura je rozdělena na dvě domény, tvořící cysteinové clustery, kde do domény alfa se mohou vázat až 4 ionty dvojmocných kovů a do domény beta tři ionty dvojmocných kovů (Bell a Vallee, 2009), (Coyle, a kol., 2002).Vzhledem k četnému rozmístění cysteinů ve struktuře MT lze označit hned několik úseků řetězce, které významně přispívají k interakci s kovem. Pro účely studia interakcí in vitro jsme na základě vyhodnocení z databáze Expasy vybrali fragment proteinu metalothioneinu. Metalothionein již byl v minulosti studován pomocí elektrochemických metod, které jsou použitelné zejména díky vysokému obsahu cysteinu v jeho struktuře. Z hlediska tvorby komplexů na úrovni aminokyselin je vhodné studovat pouze fragment tohoto proteinu metalothioneinu (Mendieta, a kol., 1995). V rámci sledování vlivu histidinu, který není příliš častý, na redoxní změny v sekvenci MT, byly podobně jako v naší práci studovány možnosti zvýšení koordinace kovů. Zde však autoři použili jiného metodického základu (NMR a ICP) (Blindauer, a kol., 2007), kde NMR podává strukturní informaci a ICP-MS podává informaci o kvantitě daných složek. Oproti tomuto multi instrumentálnímu postupu naše použitá metoda kombinuje strukturní i kvantitativní informaci. Vhodnost elektrochemické metody pro studium tvorby komplexu MT s kovem byla prokázána metodami katodické rozpouštěcí voltametrie (Sestakova a Mader, 2000), square wave voltametrie (Nieto a Rodriguez, 1996) nebo cyklické voltametrie (Harlyk, a kol., 1997, Marshall, a kol., 2009). Metoda FIA-ED byla zvolena právě díky zkušenosti z předchozího studia interakcí mezi thiolovou skupinou peptidu a cisplatiny (Zitka, a kol., 2007). V této studii je velmi detailně ukázáno, že záměnou jednotlivých aminokyselin v peptidovém řetězci proteinu dochází ke změnám v interakci s cisplatinou. 5.2 Materiál a metody využívané při řešení projektu 5.2.1 Bioinformatické zpracování dat Zdrojem dat byla internetová proteomická databáze Expasy (www.expasy.org). Pro zpracování dat byl použit program Matlab 7.9.0 (2009b). Zarovnání bylo provedeno podle konzervativních úseků pomocí globálního mnohočetného zarovnání sekvencí s využitím substituční matice BLOSUM50. Při konstrukci dendrogramu, byla použita metoda Jukes-Cantora pro výpočet vzájemné distance sekvencí, BIONJ (Bio Neighbor - Joining) (Gascuel, 1997). Pro lepší posouzení podobnosti sekvencí bylo rozložení váhováno na počet "znaků". 5.2.2 Chemikálie Uměle nasyntetizované peptidy FMT byly zakoupeny od firmy Clonestar (Česká Republika). Veškeré chemikálie potřebné pro provedení analýz byly zakoupeny u firmy Sigma-Aldrich (USA). Dále byl zakoupen argon pro provoz HPLC od firmy Siad (Česká Republika) a také spotřební materiál pro HPLC od firmy Labicom (Česká Republika). 5.2.3 Interakční podmínky
Komplexy fragmentu metalothioneinu s cisplatinou byly připraveny v molárních poměrech Cis-Pt 100 µM:FMT 50, 100 a 150 µM v prostředí fosfátového pufru pH 7,5 (20 mM). Inkubace komplexů byla prováděna v celkovém objemu 400 µl směsi, která byla během inkubace neustále vortexována na termobloku při 400 rpm. 5.2.4 Průtoková injekční analýza s elektrochemickou detekcí FIA-ED systém byl složen z jedné chromatografické pumpy Model 582 ESA (ESA Inc., Chelmsford, MA) -1 (pracovní rozsah 0,001-9,999 ml.min ) reakční smyčky (1 m) napojené na elektrochemický detektor Coulochem III (ESA, USA) s amperometrickou průtokovou detekční celou (Model 5040, ESA, USA). Průtočná cela obsahuje planární elektrodu ze skelného uhlíku, hydrogen-paládiovou jako referenční a uhlíkovou jako pomocnou elektrodu. Vzorek (20 µl) byl injektován automaticky pomocí autosampleru (Model 542, ESA, USA), který má v sobě zabudován i termostatovaný prostor pro kolonu. Vzorky byly během analýzy uchovány v karuselu při teplotě 8 °C.
c) Dosažené výsledky a jejich porovnání s předpokládanými cíli obsaženými v grantové přihlášce. Cíle řešení: 1. Výběr fragmentů kov vazného proteinu metalothioneinu – statistické zpracování sekvencí 2. Elektrochemická charakterizace vybraných uměle nasyntetizovaných fragmentů 3. Vyvinutí elektrochemické metody vhodné pro studium interakce mezi cisplatinou a vybranými fragmenty proteinu metalothioneinu 4. Provedení experimentů in-vitro 5. Vyhodnocení získaných výsledků a jejich interpretace 1. Výběr fragmentů kov vazného proteinu metalothioneinu – statistické zpracování sekvencí Matematické porovnání různých metalothioneinů pocházejících z obratlovců o délce sekvence 60 respektive 61 aminokyselin bylo provedeno podle aminokyselinové sekvence jejich primární struktury. Kompletní aminokyselinové sekvence celkem 145 metalothioneinů byly nejprve zarovnány podle konzervativních úseků. Ze zarovnaných sekvencí bylo vytvořeno sekvenční logo [1] reprezentující konzervativnost jednotlivých pozic v sekvencích (Obr. 1). Následně byl určen deseti (jedenácti) aminokyselinový klastr (na pozici 31-40) s nejvyšším obsahem cysteinu na počet aminokyselin v rámci dekapeptidu a přitom s vysokou mírou konzervativnosti která byla vztažena k peptidu FMT 2, který byl nejvíce konzervativní, tedy součet všech hodnot výskytu jednotlivých aminokyselin v procentech byl nejvyšší. C-terminal possition 1 - K (98,62 %), 2 - free (93,79 %), 3 - S (97,93 %), 4 - C (100 %), 5 - C (99,31 %), 6 - S (63,45 %), 7 - C (100 %), 8 - C (99,31 %), 9 - P (100 %), 10 - S (51,72), 11 - G (93,79). Variabilita pozic 2 a 10 méně vzdálených od zbytků cysteinu a více vzdálené pozice 11 byla < 94 %. V rámci takto stanoveného fragmentu jsme vybrali ze všech sekvencí ty, které se lišily nejméně anebo právě o jednu aminokyselinu. Ze 145 v přírodě nacházejících se fragmentů MT této podmínce vyhovovalo 23. Pro každou z těchto 23 sekvencí byl vybrán krátký fragment v rozmezí 31 – 40 (41) aminokyselin. Pro těchto 23 fragmentů byla stanovená procentuální konzervovanost sekvence. Pj je procentuální konzervovanost sekvence j udávající míru podobnosti sekvencí, vyjádřenou v závislosti na konzervaci genetické informace jednotlivých sekvenčních pozic. Stanoví se jako:
Pj
1 k f ij 100, j 1 ... n k i 1 n
Kde k je délka sekvence, i je ukazatel pozice v řetězci sekvence, j je ukazatel sekvence a n je počet sekvencí. Parametr fij je četnost znaku sij na i-té pozici v zarovnaných sekvencích, tedy kolikrát se znak ležící v j-té sekvenci na i-té pozici vyskytuje na té samé pozici ve všech sekvencích. Př. Sekvence č.2 (P52722) první pozice je symbol ‘K’. i = 1; j = 2; f12 = 22; n = 23; k = 11
- doména
- doména Fragment (dekapeptid)
Obr. 1: Struktura proteinu metalothioneinu, - doména metalothioneinu obsahující čtyři atomy kadmia (zeleně), - doména metalothioneinu obsahující dva atomy zinku (oranžově) a jeden atom kadmia. Růžově je vyznačen fragment metalothioneinu, který byl nasyntetizován pro následné in vitro studium interakce (Zdroj: www.expasy.org). 2. Elektrochemická charakterizace vybraných uměle nasyntetizovaných fragmentů Pomocí FIA-ED systému byly nejprve analyzovány závislosti proudové odezvy na aplikovaném signálu – hydrodynamické voltamogramy (HDV). Ty charakterizují redoxní profil každé studované látky (Obr. 2). -- 700 mV -- 800 mV -- 900 mV -- 1000 mV -- 1100 mV -- 1200 mV
B 60 50
Výška píku (µA)
Výška píku10 0(nA)
A -- 100 mV -- 200 mV -- 300 mV -- 400 mV -- 500 mV -- 600 mV
40 30 20 10 0
Doba analýzy 10 (sec)
0
500
1000
Aplikovaný potenciál (mV)
Obr. 2: (A) Hydrodynamický voltamogram fragmentu FMT 21 jako proložení jednotlivých záznamů z FIAED analýz. (B) Křivka hydrodynamického voltamogramu FMT 21
Provedli jsme tedy analýzu všech 23 fragmentů metalothioneinu i samotných platinových cytostatik cisplatiny, oxaliplatiny a karboplatiny (Obr. 3). Z obrázků je patrné, že elektrochemické profily se pro jednotlivé FMT i platinová cytostatika poměrně liší. To vyplývá z odlišného chemického složení aminokyselin (v rámci FMT) a odlišné struktury cytostatika. Vzhledem k vysokému množství dat, která byla při studiu získána jsme se s ohledem na detaily zaměřili pouze na studium tvorby komplexu mezi všemi 23 FMT a cisplatinou při variantních podmínkách které byly dále hodnoceny. 800 700 600
Výška píku (µA)
500
FMT_1
FMT_2
FMT_3
FMT_4
FMT_5
FMT_6
FMT_7
FMT_8
FMT_9
FMT_10
FMT_11
FMT_12
FMT_14
FMT_13
FMT_15
FMT_16
FMT_17
FMT_18
FMT_19
FMT_20
FMT_21
FMT_22
FMT_23
400 300 200 100 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200
Aplikovaný potenciál (mV)
Obr. 3: Hydrodynamické voltamogramy fragmentů FMT 1-23. 3. Vyvinutí elektrochemické metody vhodné pro studium interakce mezi cisplatinou a vybranými fragmenty proteinu metalothioneinu. Pro následnou analýzu komplexů byla vyvinuta unikátní metodika, která ale vyžadovala analyzovat vysoké množství vzorků. Proto jsme se rozhodli plně automatizovat formu FIA-ED analýzy. Metodika byla založena na analýze HDV samotných složek komplexů a následně byla provedena analýza směsi při různých faktorech (teplota, čas, koncentrace). Ze získaných HDV byla určena rovnice regrese křivky jak testovaných směsí (S mix) tak variant samotné cisplatiny (SPt) a samotných jednotlivých fragmentů (SFMT). Jednotlivé závislosti byly odečteny a byla získána hodnota směrnice, která prezentuje pouze výslednou změnu průběhu signálu díky vzniku interakce (SInt) (vzorec 1). Vzorec 1: SInt= (Smix - SFMT) - SPt Pro posouzení vlivu všech faktorů na interakce (a 1 - 5, 10 - 45 °C; b 1 – 8, 1 – 8 hodin; c 1 - 3, 50 - 200 µM) pro každý fragment bylo provedeno grafické vyhodnocení jako X = S(a) versus Y = ΣS(a1+a2+a3…) , kde Sa =ΣS/nparametr (Obr. 4). Pro selekci pouze takových podmínek, při nichž bylo zaznamenáno prokazatelné zvýšení interakce, byl pro graf sestaven mediánový interval s poloměrem, který byl získán vztahem Σmax*0,3= 1,17 ve smyslu osy Y. Na ose X byla hodnota průměru mediánového intervalu S(a)=0,16. Body nacházející se uvnitř tohoto mediánového intervalu byly vyloučeny jako nedostatečně průkazné (2x RSD, spolehlivost pod 90). Naopak hodnoty vně mediánového intervalu již s významnými interakcemi spojenými s rozdílností struktury peptidu (Obr. 4).
5 4
Bod ležící mimo interval
Bod ležící uvnitř intervalu
ΣS(a1+a2+a3…)
3 2 1
Mediánový interval
0
-0.2
0.3 -1
0.8 S(a)
Obr. 4: Návrh grafického vyhodnocení s využitím mediánového intervalu Hodnoty odchylek směrnic ve smyslu osy x od okraje mediánu byly dále sečteny na sumu, která byla interpretována jako celkový vliv teploty, koncentrace a doby interakce a dává tedy interakční konstantu ICFMT (vzorec 2). Vzorec 2: ICFMT= (Sa+Sb+Sc) 4. Provedení experimentů in-vitro Komplexy fragmentu metalothioneinu s cisplatinou byly připraveny v molárních poměrech Cis-Pt 100 µM:FMT 50,100 a 150 µM v prostředí fosfátového pufru pH 7,5 (20 mM). Pro studium interakce byly takto připravené komplexy inkubovány při různých teplotách a časech. Tyto parametry byly zvoleny jako faktory, které nejvíce ovlivní interakci FMT a Cis-Pt in-vitro. Inkubace komplexů byla prováděna v celkovém objemu 400 µl směsi, která byla během inkubace neustále vortexována na termobloku při 400 rpm. Pro každou z kombinací byl získán hydrodynamický voltamogram (HDV) v rozsahu potenciálu 100 - 1200 mV (n = 3) (RSD < 15 %). Nejprve byl studován vliv teploty 10, 15, 25, 35 a 45 °C. Vzorky byly inkubovány 1 hodinu při koncentraci FMT 100 µM a Cis-Pt 100 µM. Ihned po inkubaci proběhla analýza pomocí FIA-ED. Zjistili jsme, že nejvhodnější teplota byla 45 °C pro všechny studované FMT. Následně jsme testovali koncentraci přídavku Cis-Pt (50, 100 and 200 µM) k FMT (100 µM). Inkubace vzorků proběhla 1 hodinu při 45 °C. Po analýze všech variant jsme zjistili, že se jako nejvhodnější ukázal ekvimolární poměr čili koncentrace Cis-Pt 100 µM. Poslední testovaný parametr byla doba interakce. Zde jsme na základě zkušeností z předchozí práce testovali delší časové rozmezí tedy 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 a 8 hodin při nejvhodnějších výše zmíněných podmínkách. Zjistili jsme, že jednohodinová inkubace je plně dostačující, a že při vyšších časech se již hodnoty směrnic nemění. Po analýze všech variant byl tedy nejvhodnější ekvimolární poměr FMT 100 µM a Cis-Pt 100 µM (1 h při 45 °C). U všech fragmentů byla (dle vyhodnocení uvedeného v kapitole 3) zjištěna vyšší míra interakce mimo mediánový interval kromě FMT 1. U všech 22 FMT byla zaznamenána kladná IC (Obr. 5).
1 0.9 0.8
Interakční konstanta (ICFMT)
0.7 0.6
Vyšší intenzita interakce
0.5 0.4
0.3
Nižší intenzita interakce
0.2 0.1 0
Obr. 5: Hodnoty IC všech 23 studovaných fragmentů metalothioneinu vycházející z výpočtu vzhledem k testovaným parametrům (teplota, molární koncentrace, doba interakce). Hodnota ICFMT 2 (0,43) je červeně zvýrazněna. 5. Vyhodnocení získaných výsledků a jejich interpretace U studovaných 23 fragmentů metalothioneinu byly zjištěny různé hodnoty IC. Vzhledem k nejvyšší konzervativnosti FMT 2 byly všechny změny interakcí komentované níže vztaženy v procentech k tomuto konzervativnímu fragmentu (Obr. 6). Nejvyšší hodnoty IC byly zaznamenány u FMT 18 a 20, kde je zároveň patrná změna v aminokyselinách nesousedících přímo s cysteiny. U FMT 18 se jednalo o výskyt P na pozici č 10 a u FMT 20 byla pozice 10 obsazena V a navíc velmi silně konzervativní pozice 1 obsahovala T místo K. Hodnoty IC pro oba FMT byly tak o více než 100 % zvýšené. Na druhou stranu u fragmentů FMT 2, 4, 16 byla schopnost interakce nižší i přes to, že vedle cysteinů byly stále konzervativní aminokyseliny S, S, P. Pouze v případě FMT 4 byly konzervativní cysteinové clustery obklopeny P místo S ale současně byly konec peptidu výrazně odlišován záměnou N-terminálního D za G, což mělo za následek celkové zvýšení IC o 14 %. Dále bylo zaznamenáno zvýšení IC u FMT 16 a to o 6 %, které bylo způsobeno pouze záměnou M za S na pozici 10. Celkově nejméně konzervativní peptid FMT 21 ze všech testovaných peptidů vykazoval nejnižší podobnost. Ta byla způsobena nahrazením konzervativního S za N vedle prvního cysteinového klastru na pozici 3, dále záměnou C za Y uvnitř druhého cysteinového clusteru na pozici 8 a nakonec záměnou V za S na pozici 10, která byla také avizována u FMT 20, měla za následek celkové snížení 10 %. Další zaznamenané snížené hodnoty IC v řádu 25 – 38 % bylo pozorovány u FMT 7, 8, 22 a 23. U FMT 7 a 8 byla struktura identická s konzervativním FMT 2 kromě záměny na pozici 6, která sousedí s oběma cysteinovými clustery. V porovnání konzervativní sekvence FMT 2 měla záměna S za T na pozici 6 v případě FMT 8 za následek snížení IC o celých 26 % a záměna S za A na pozici 6 v případě FMT 7 způsobila pokles IC o více než 37 %. U FMT 22 byly aminokyseliny obklopující cysteinové clustery na pozicích 3, 6 a 9 S, P a P což způsobilo snížení IC o 26 %. FMT 23 vykazoval nejméně
Code (MT) P52722 P67983 P52727 Q93083 O18842 P02800 P80294 O13269 P51902 Q6S4N8 P80593 O42152 Q1HEB5 Q499L1 P04731 P07438 Q6XUW5 P68503 Q86YX3 P68502 A0RZE1 A6NER9 C0H770
31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41
konzervativní uspořádání (69,92 %). V rámci pozice 2 byla záměna free za A dále pak na pozici 5 W za C a 6 S za D což nakonec vyústilo ve snížení IC skoro o 26 %. Nejvýraznější snížení hodnoty IC v řádu 50 – 100 % bylo pozorováno všech ostatních studovaných FMT 17, 14, 3, 10, 13, 6, 5, 11, 19, 9, 12, 15 a 1, které se majoritně nacházeli uvnitř mediánového intervalu. U FMT 17, 6, 9 a 1 byla změna na pozici 6 na D, E, D a zároveň P na pozici 2, a nakonec P. Kombinace umístění P vůbec nejvíc snížilo IC a to až o 90 – 100 %. U FMT 14, 3, 13, 11, 19, 12, 15 byla záměna na pozici 10 za V, A, M, V, A, G, L. Přitom navíc u FMT 14 byl C na pozici 3, a u FMT 13 byl navíc M na pozici 10. Vložení těchto sirných aminokyselin na tyto pozice mělo za následek snížení IC o 51 – 58 %. U FMT 19 byla navíc změna na pozici 2 na T, což mělo za následek pokles IC o 78 %. Ve srovnání s podobným FMT 20, kde před T byl ještě K a na pozici 10 V místo A to byl jeden z nejvíc pozorovaných vlivů charakterizovaný celkovým rozdílem 197 %. Nejvyšší vliv charakterizovaný celkovým rozdílem 201% však byla inverzní záměna P na pozicích 6 a 10 u FMT 18 a 1. U FMT 10 a 5 byla záměna na pozici 11 za T a E což mělo za následek snížení IC o 57 – 68 %.
K - S C C S C C P S G K - S C C S C C P V G K - S C C S C C P A G K - S C C S C C P M G K - S C C S C C P P G K - S C C S C C P G G K - S C C S C C P L G
K - S C C P C C P S G K - S C C E C C P S G K - S C C A C C P S G K - S C C T C C P S G K - S C C S C C P S E K - S C C S C C P S T K - S C C P C C P P G
K - S C C S C C P M S K - C C C S C C P V G K T S C C S C C P A G K A S C C D C C P S G T - S C C S C C P V G K - S C C P C C P S D K P S C C D C C P S G K - N C C S C Y P V G K A S C W D C C P S G
Conservation Peptide [%] No. 87,681 85,145 84,420 84,420 84,420 84,058 84,058 83,696 82,971 82,971 82,971 81,159 81,159 80,435 77,899 77,899 77,899 77,536 77,536 77,174 77,174 70,290 69,928
2 11 3 16 18 12 15 1 6 7 8 5 10 22 13 14 19 17 20 4 9 21 23
conservation
0%
100 %
Obr. 6: Přehledná tabulka, kde je zobrazen: Kód původního MT, aminokyselinové sekvence FMT, procentuální podobnost, která udává konzervativnost v rámci skupiny a pořadové číslo peptidu. Aminokyseliny podstatně ovlivňující míru interakce jsou zvýrazněny modře. Z dosažených výsledků vyplývá, že největší vliv na interakci FMT s Cis-Pt mají změny aminokyselin na pozici 1 a 10, které jsou vzdálené o více než jednu pozici od cysteinových clusterů, kde v rámci FMT 20 a 18 poměrně výrazně ovlivňuje celkovou interakci umístění aminokyselin P, T a V. V porovnání s těmito aminokyselinami pak s velkým odstupem ovlivňovali interakci změny aminokyselin P a D na pozicích 6 a 11 u FMT 4 a následované záměnou M na pozici 10 u FMT 16.
Literatura: BELL, S. G.; VALLEE, B. L. The Metallothionein/Thionein System: An Oxidoreductive Metabolic Zinc Link. Chembiochem, 2009, roč. 10. č. 1, s. 55-62. ISS 1439-4227.
BLINDAUER, C. A.; RAZI, M. T.; CAMPOPIANO, D. J.; SADLER, P. J. Histidine ligands in bacterial metallothionein enhance cluster stability. Journal of Biological Inorganic Chemistry, 2007, roč. 12. č. 3, s. 393-405. ISS 0949-8257. BOEHM, T.; FOLKMAN, J.; BROWDER, T.; OREILLY, M. S. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance. Nature, 1997, roč. 390. č. 6658, s. 404-407. ISS 0028-0836. COYLE, P.; PHILCOX, J. C.; CAREY, L. C.; ROFE, A. M. Metallothionein: The multipurpose protein. Cellular and Molecular Life Sciences, 2002, roč. 59. č. 4, s. 627-647. ISS 1420-682X. ECKSCHLAGER, T.; ADAM, V.; HRABETA, J.; FIGOVA, K.; KIZEK, R. Metallothioneins and cancer. Curr. Protein Pept. Sci., 2009, roč. 10. č. 4, s. 360-375. ISS 1389-2037. clanek IF 3.854 GASCUEL, O. BIONJ: An improved version of the NJ algorithm based on a simple model of sequence data. Molecular Biology and Evolution, 1997, roč. 14. č. 7, s. 685-695. ISS 0737-4038. HARLYK, C.; BORDIN, G.; NIETO, O.; RODRIGUEZ, A. R. Cyclic voltammetry study of the peptide LysCys-Thr-Cys-Cys-Ala [56-61] MT I in the presence of cadmium. Electroanalysis, 1997, roč. 9. č. 8, s. 608-613. ISS 1040-0397. HIGGINS, C. F. Multiple molecular mechanisms for multidrug resistance transporters. Nature, 2007, roč. 446. č. 7137, s. 749-757. ISS 0028-0836. MARSHALL, N. M.; GARNER, D. K.; WILSON, T. D.; GAO, Y. G.; ROBINSON, H.; NILGES, M. J.; LU, Y. Rationally tuning the reduction potential of a single cupredoxin beyond the natural range. Nature, 2009, roč. 462. č. 7269, s. 113-U127. ISS 0028-0836. MENDIETA, J.; CHIVOT, J.; MUNOZ, A.; RODRIQUEZ, A. R. Electrochemical-Behavior of Metallothioneins and Related Molecules .1. Lys-Cys-Thr-Cys-Cys-Ala Thionein Fragment [5661] Mt-I. Electroanalysis, 1995, roč. 7. č. 7, s. 663-669. ISS 1040-0397. NIETO, O.; RODRIGUEZ, A. R. Complexation properties of the metallothionein fragment Lys-Cys-ThrCys-Cys-Ala [56-61] MT I with zinc using square wave voltammetry. Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 1996, roč. 40. č. 2, s. 215-222. ISS 0302-4598. OHNDORF, U. M.; ROULD, M. A.; HE, Q.; PABO, C. O.; LIPPARD, S. J. Basis for recognition of cisplatin-modified DNA by high-mobility-group proteins. Nature, 1999, roč. 399. č. 6737, s. 708712. ISS 0028-0836. SAKAI, W.; SWISHER, E. M.; KARLAN, B. Y.; AGARWAL, M. K.; HIGGINS, J.; FRIEDMAN, C.; VILLEGAS, E.; JACQUEMONT, C.; FARRUGIA, D. J.; COUCH, F. J.; URBAN, N.; TANIGUCHI, T. Secondary mutations as a mechanism of cisplatin resistance in BRCA2-mutated cancers. Nature, 2008, roč. 451. č. 7182, s. 1116-U9. ISS 0028-0836. SAWYERS, C. Targeted cancer therapy. Nature, 2004, roč. 432. č. 7015, s. 294-297. ISS 0028-0836. SESTAKOVA, I.; MADER, P. Voltammetry on mercury and carbon electrodes as a tool for studies of metallothionein interactions with metal ions. Cellular and Molecular Biology, 2000, roč. 46. č. 2, s. 257-267. ISS 0145-5680. WANG, D.; LIPPARD, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery, 2005, roč. 4. č. 4, s. 307-320. ISS 1474-1776. ZITKA, O.; HUSKA, D.; KRIZKOVA, S.; ADAM, V.; CHAVIS, G. J.; TRNKOVA, L.; HORNA, A.; HUBALEK, J.; KIZEK, R. An investigation of glutathione-platinum(II) interactions by means of the flow injection analysis using glassy carbon electrode. Sensors, 2007, roč. 7. č. 7, s. 12561270. ISS 1424-8220. 1. Výstupy (publikace, programy, projekty, normy, metodiky apod.) Výsledky získané v průběhu řešení projektu se staly podkladem pro přípravu dvou publikací, které byly odeslány do ISI indexovaných časopisů Scientific Reports a International Journal of electrochemical science: Zitka, O., Kominkova, M., Skalickova, S., Skutkova, H., Provaznik, I., Eckschlager, T., Stiborova, M., Trnkova, L., Adam, V., Kizek, R.: Change of Single Amino Acid in Metal-Binding Cluster of Metallothionein Significantly Influences an Interaction with Cisplatin, Scientific Reports, (odesláno 2012) Zitka, O., Kominkova, M., Skalickova, S., Skutkova, H., Provaznik, I., Eckschlager, T., Stiborova, M.,
Adam, V., Trnkova, L., Kizek, R.: Hydrodynamic electrochemical voltammograms profiling of metallothionein fragment. International Journal of electrochemical science, (odesláno 2012) 2. Informace o přínosu řešení k dané odborné problematice, u individuálních doktorských projektů vyjádření o přínosu pro zpracování doktorské disertace) Práce uskutečněná v rámci tohoto projektu přináší zásadní fyzikálně - chemické poznatky o interakcích kovů a proteinů. Aplikace na reálný model peptidu, který je složením obsažen v jednom z nejdůležitějších kov vázajících proteinech metalothioneinů s platinovým cytostatikem cisplatinou významně přispívá k objasnění podstaty rezistence nádorových buněk k cytostatikům obsahujících kovy z hlediska evoluce. Doktorand Ondřej Zítka se ve své doktorské práci věnuje elektrochemickému studiu interakcí mezi platinovými cytostatiky a peptidy pocházejícími z živočišného proteinu. Tento projekt jasně ukazuje, že tyto elektrochemické metody jsou využitelné i v praktické oblasti a také využitelné k biochemickým analýzám pro oblast medicíny. Výsledky získané při zpracování tohoto projektu jsou jednoznačně platnou součástí jeho doktorské práce. 3. Informace o zapojení spolupracovníků a studentů a jejich podílu na řešení projektu, příp. informace o spolupráci s dalšími subjekty Kromě řešitele se z mateřské univerzity do projektu zapojila Ing. Pavlína Šobrová, která se podílela na pracích spojených s přípravou manuskriptu. Jako akademičtí pracovníci se na tvorbě publikace za MENDELU podíleli Prof. Ing. René Kizek, Ph.D. a Doc. RNDr. Vojtěch Adam, Ph.D. Dále se na řešení podíleli i pregraduální studenti Bc. Sylvie Skaličková, která se podílela na pracích spojených s vyvíjením metody analýzy a Bc. Markéta Komínková, která se podílela na přípravě vzorků pro stanovení pomocí HPLC-ED. Na bioinformatickém zpracování dat se podílela Ing. Helena Škutková (VUT Brno). Na spolupráci se dále podíleli Prof. RNDr. Marie Stiborová, DrSc. (UK Praha), Prof. MUDr. Tomáš Eckschlager, Ph.D. (UK Praha a FN Motol Praha), Doc. RNDr. Libuše Trnková, CSc. (MU Brno) a Prof. Ing. Ivo Provazník, Ph.D. (VUT Brno). Všichni jmenovaní se aktivně zapojili do řešení dané problematiky. 4. Perspektiva řešené problematiky, příp. sdělení o podání přihlášek k externím grantovým agenturám, předpoklady využití výsledků řešení V rámci tohoto projektu byly splněny všechny předem vytyčené výzkumné cíle. Řešení tohoto projektu významně přispívá do oblasti vědeckého směru Metalomiky, která je relativně nově se vyvíjející vědní disciplínou. Elektrochemické metody jsou pro tato studia velmi přínosné avšak často je k interpretaci výsledků třeba použít vyspělých bioinformatických postupů. Výsledky tohoto projektu budou využity k řešení projektu CEITEC a budou tvořit základ pro podání dalších grantových přihlášek. Výsledky získané v tomto projektu dále významně přispělo k řešení disertační práce Mgr. Ondřeje Zítky. 5. Informace o účasti na konferencích a zahraničních cestách realizovaných v rámci řešení projektu, anotace cestovních zpráv, separáty příspěvků z konferencí Výsledky získané v průběhu řešení projektu byly prezentovány na konferenci Setkání fyzikálních chemiků a elektrochemiků 2012. Zde byly výsledky prezentovány formou posterového sdělení. Konference se konala ve dnech 30-31. Května. Dále byly výsledky prezentovány na mezinárodní konferenci MendelNet 2012: Zitka, O., Kominkova, M., Skalickova, S., Adam, V., Eckschlager, T., Stiborova, M., Trnkova, L., Kizek, R.: Electrochemical study of interaction of 23 fragments of metallothionein with cisplatin – high throughput method. Setkání fyzikálních chemiků a elektrochemiků 2012. ISBN 978‐80‐7375‐618‐5 Zitka, O., Kominkova, M., Skalickova, S., Skutkova, H., Adam, V., Kizek, R.: Studium komplexů
živočišných kov-vazných proteinů s platinovými cytostatiky . MendelNet 2012. Mendel University in Brno, Brno, Czech Republic. 6. Shrnutí účelnosti využití finančních prostředků grantu (podrobný popis ve formuláři Výkaz o hospodaření s grantovými prostředky IGA AF MENDELU) 7. Přílohy k Závěrečné zprávě 8. Výkaz hospodaření s grantovými prostředky (vypsat + předložit podepsaný výpis ze SAPu) 9. Separáty příspěvků z konferencí (ofotit, doložit sborníky, potvrzení o přijetí)
Podpis řešitele: Ondřej Zítka
Datum: 27.7.2012
Podpis garanta doktorského projektu: René Kizek
Datum: 27.7.2012
Interní grantová agentura AF MENDELU Závěrečná zpráva o řešení interního grantového projektu AF MENDELU za rok 2010 Individuální projekty PŘÍLOHA - VÝKAZ HOSPODAŘENÍ Z GRANTOVÝMI PROSTŘEDKY Název projektu: Studium komplexů živočišných kov-vazných proteinů s platinovými cytostatiky Řešitel (příjmení, jméno, tituly): Zítka, Ondřej, Mgr. Jednotlivé položky rozpočtu Stipendium řešitele Stipendium spolupracovníků Ostatní osobní náklady (DPP)
Přidělené prostředky
Čerpané prostředky
12 6
12 6
0
0
Služby Cestovné Ostatní náklady CELKEM
102 120
102 120
Z peněz na ostatní náklady bylo nakoupeno: Spotřební materiál: Byl zakoupen purifikovaný peptid od firmy Clonestar v hodnotě 8 280 Kč, který byl využit při FIA-ED analýzách. Dále byly zakoupeny chemikálie vysoké čistoty (ammonium sulfate, sodium acetate, amonium acetate, sodium dodecyl sulfate, dodecyl sulfate, sodium phosphate, acetic acid) od firmy Sigma Aldrich celkem za 28 540,4 Kč, které byly nezbytné pro přípravu pufrů a pracovních roztoků pro analýzu. Od firmy Labicom byly zakoupeny kyty a náplně pro cartridge HPLC celkem za 52 089,30 Kč, pro zajištění údržby a funkce přístroje HPLC. Pro realizaci in vitro experimentu bylo zakoupeno laboratorní sklo od firmy Anton Paar v hodnotě 4 349,30 Kč a laboratorní váženky a špachtle od firmy VWR v celkové hodnotě 8741 Kč. Stipendia byla vyplacena: V tomto roce se na řešení projektu podíleli Mgr. Ondřej Zítka a Ing. Pavlína Šobrová. Návrh na vyplacení stipendií byl podán v měsíci srpnu a následně vyplaceny: Mgr. Ondřeji Zítkovi 12 000 Kč a Ing. Pavlíně Šobrové 6 000 Kč. Celkem bylo tedy formou stipendií vyplaceno 18 000 Kč. Sumarizace za finance: Z projektových prostředků bylo celkem hrazeno 102 000 Kč na kapitolu ostatní náklady, které pokrývaly většinu laboratorního provozu, který byl spojen s činností na projektu. Dále bylo hrazeno celkem 18 000 Kč jako mzdové prostředky pro řešitele a spoluředitele projektu. V kapitolách Ostatní osobní náklady, Služby a Cestovné nebyly čerpány žádné prostředky.
__________________________________________________________________________ Podpis řešitele:
Ondřej Zítka
Datum: 27.7.2012
