INTERAKSI 4R06-NATIVE DENGAN ISOFORM GAMMA DARI RESEPTOR PEROXISOME PROLIFERATOR-ACTIVATED MENGGUNAKAN PyRx

THE 5TH URECOL PROCEEDING

18 February 2017

UAD, Yogyakarta

INTERAKSI 4R06-NATIVE DENGAN ISOFORM GAMMA DARI RESEPTOR PEROXISOME PROLIFERATOR-ACTIVATED MENGGUNAKAN PyRx Fatimah Nur Aini1)danBroto Santoso2) Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta 1 email: [email protected] Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta 2 email: [email protected]

Abstrak Reseptor Peroxisome Proliferator-Activatedisoform gamma (PPAR-γ) merupakan protein yang bertanggung jawab terhadap proses sensitisasi insulin dalam jaringan adiposa. Kekuatan interaksi ligan terhadap PPAR-γ berakibat efek antidiabetes. Metode yang digunakan adalah in silico dengan cara molecular dockingmenggunakan aplikasi PyRx-Autodock-Vina. Penelitian telah dilakukan terhadap senyawa native protein 4R06 dengan 2 kelompok ligan pembanding menggunakan PyRx dan interaksi yang terjadi ditampakkan melalui program PyMOL dan PLIP. Semua senyawa kelompok pembanding memperlihatkan hasil afinitas ikatan yang tidak lebih baik dibandingkan dengan ligan native. Hal ini menunjukkan bahwa tidak ada ligan uji yang aktif terhadap protein 4R06. Keywords: PPAR isoform gamma, PyRx, antidiabetes, afinitas ikatan Pioglitazon dan Rosiglitazon meningkatkan sensitivitas insulin dengan mekanisme aksi sebagai agonis PPARγ dan telah dipatenkan untuk terapi hiperglikemia pada DM Tipe 2 (Chiarelli dan Marzio, 2008). Peroxisome Proliferator-Activation Receptor Gamma (PPARγ) adalah suatu reseptor inti teraktivasi ligan yang banyak terdapat pada jaringan adiposa, makrofag, dan sel pembuluh darah (Puhl, 2012; Gorniak, 2014) berperan pada adipogenesis dan homeostasis glukosa dan lipid (Auwerx, 1999; Lehrke dan Lazar, 2005; Puhl, 2012). Struktur tiga dimensi PPARγ terdiri dari domain ikatan DNA (DBD) dan domain ikatan ligan (LBD) (Gorniak, 2014). Aktivasi reseptor ini akan meregulasi ekspresi gen target dengan berikatan dengan Peroxisome Proliferator HormoneResponse Elements (PPRE) spesifik pada sisi aktif gen teregulasi. Tiap reseptor berikatan dengan PPRE sebagai heterodimer dengan RetinoidX Receptor (RXR) (Berger dan Moller, 2002). PPRE ditemukan pada promoter

1. PENDAHULUAN Diabetes melitus (DM) termasuk problem kesehatan global yang besar. Menurut Federasi Diabetes Internasional (2008), dengan penderita DM beberapa tahun belakangan ini terus meningkat, diperkirakan 380 juta orang akan terkena DM pada 2025, dengan kematian satu orang tiap 10 detik. 90% penderita diabetes terkena DM Tipe 2. DM merupakan suatu gangguan metabolisme yang mengakibatkan glukosa terakumulasi dalam jumlah yang besar di dalam tubuh. Mengacu pada data WHO, diperkirakan diabetes melitus akan menempati peringkat tujuh penyebab kematian pada 2030. Prevalensi DM Tipe 2 telah mencapai hingga >5% populasi. Dua hal dasar penyebab DM Tipe 2 adalah resistensi insulin dan kerusakan fungsi sel-β (Saltiel, 2001). Salah satu pengobatan DM Tipe 2 menggunakan obat golongan Thiazolidin (TZD) dengan jalan meningkatkan sensitivitas insulin.

1200

THE 5TH URECOL PROCEEDING

18 February 2017

gen responsif PPAR, seperti asam lemak-terikat protein (aP2) (Willson et al., 2000). Selama berikatan dengan agonisnya, PPARγ berlokasi pada nukleus (Gorniak, 2014) dan konformasi PPARγ berubah menjadi stabil, lalu membentuk binding cleft yang melibatkan coaktivator transkripsi. Hasil dari proses ini adalah peningkatan transkripsi gen (Berger dan Moller, 2002) PPARγ berhubungan dengan beberapa gen yang berpengaruh terhadap aksi insulin. Pada penelitian sebelumnya oleh Ribon et al. (1998), aktivasi PPARγ telah menunjukkan peningkatan ekspresi cCBL, protein yang banyak terdapat pada jaringan adiposit. Protein ini memiliki peranan positif dalam jalur signalling insulin (Baumann, 2000). Golongan Thiazolidin seperti Rosiglitazon, merupakan agonis penuh PPARγ (Marrewijk, 2015). Meski dinilai efektif dalam menaikkan sensitivitas insulin, penggunaannya dibatasi oleh karena efek sampingnya (Puhl et al, 2012). Larsen et al. (2003) menuliskan adanya hubungan penggunaan Thiazolidin dengan kenaikan massa lemak. Penelitian oleh Mudaliar et al. (2003) yang dikemukakan kembali oleh Nissen dan Wolski (2007) menyebutkan retensi cairan renal dan banyak kasus kardiovaskuler berat adalah efek samping dari obat golongan ini. Pengembangan agen peningkat sensitivitas insulin kini lebih mengarah pada agonis parsial PPARγ, karena dinilai lebih menjanjikan sebagai agen terapetik untuk DM Tipe 2 berdasarkan pada lebih minimnya efek samping dan peningkatan indeks terapi pada manusia dibandingkan dengan agonis penuh PPARγ. Novel SR2067 merupakan senyawa agonis parsial PPARγ dengan struktur co-kristal yang diperoleh pada resolusi 2,2 Ǻ. Senyawa ini berinteraksi dengan sisi β melalui interaksi hidrofobik melalui gugus naftalen dan berikatan pada reseptor dengan afinitas

UAD, Yogyakarta

yang tinggi (Marrewijk et al., 2015). Penelitian ini adalah dasar dari studi molecular docking senyawa C28H24N2O3S dan senyawa obat Rosiglitazondengan 4R06 sebagai protein target yang potensial sebagai agonis PPARγ. Pada dasarnya, penelitian dan pengembangan obat memiliki tujuan untuk mengembangkan agen terapi baru. Molecular docking merupakan metode pengembangan obat yang sering dipakai dalam Structure-Based Drug Design (SBDD) karena dinilai akurat dan mampu memprediksi konformasi molekul kecil ligan dengan binding-site target (Meng, 2011). Metode ini merupakan metode desain obat secara in silico(komputasi)berbasis software yang mempercepat proses rancangan obat dalam menemukan konformasi ikatan antara ligan dan makromolekul protein target yang strukturnya telah diketahui. Selain prosesnya yang cepat, metode in silico ini juga lebih murah biayanya dibandingkan dengan metode in vivo maupun in vitro yang memakan waktu lama dan biaya yang relatif besar. 2. METODE PENELITIAN Alat: satu set laptop dengan spesifikasi ACER RAM 4 GB Processor 1,7 GHz VGA 2G yang menggunakan software, antara lainMarvinBean Suite, PyMOL, PyRx, Chimera, JChem for Excel, dan PLIP. Bahan: protein target 4R06, 12 senyawa aktif yang ada di pasaran, 750 decoy, dan obat Rosiglitazon merupakan permodelan 3D yang didapatkan dari alamat situs www.pdb.org. Preparasi: Protein dan ligan terlebih dahulu dipreparasi untuk mempersiapkan sebelum digunakan untuk docking. Protein dengan kode 4R06 yang digunakan dalam proses docking merupakan protein hasil dari XRay dan diambil dari data bank senyawa obat dengan alamat http://pdb.org. Protein ini memiliki 2 rantai yaitu rantai

1201

THE 5TH URECOL PROCEEDING

18 February 2017

A dan rantai B. Proses preparasi dilakukan dengan memotong salah satu dari rantai tersebut dan menghasilkan protein tanpa ligan (Gambar 1) dan ligan. Pada proses docking ini menggunakan rantai A dari protein 4R06. Molecular docking: protein 4R06 dan ligan yang telah dipreparasi diproses dengan aplikasi PyRx-Autodock-Vina menggunakan format file .pdb. Gridbox yang merupakan koordinat lokasi reseptor protein ditempatkan sesuai dengan nilai X, Y, dan Z yang didapatkan dari center of mass (com). Proses docking ligan aktif, decoys, serta obat menggunakan langkah yang sama, dengan terlebih dahulu menyesuaikan format filenya menjadi .pdbqt. setelah dilakukan proses docking, dilakukan analisis berdasarkan pada besaran nilai energi ikatan (binding affinity). Visualisasi hasil docking: setelah melalui proses docking, dipilih senyawa dengan binding affinity terbaik. Untuk visualisasi hasil senyawa, dapat dilihat melalui aplikasi PyMOL. Kemudian, untuk melihat jenis interaksi yang terlibat dalam ikatan protein-ligan dapat menggunakan aplikasi Protein-Ligand Interaction Profiler (PLIP).

UAD, Yogyakarta

Gambar 1. Hasil preparasi 3D protein 4R06 menggunakan Chimera Docking dengan autodock vina akan menghasilkan suatu nilai energi ikatan yang merupakan parameter baiktidaknya suatu ligan berikatan dengan reseptornya. Makin baik suatu interaksi ikatan nilai energi ikatan akan semakin kecil. Hasil docking (Tabel 1) menunjukkan bahwa interaksi ikatan terbaik dimiliki oleh ligan native dan ligan C28H24N203S yang ditandai dengan nilai energi ikatan sebesar -11,3 kkal/mol. Nilai yang sama ini menunjukkan kemungkinan C28H24N2O3S memiliki potensi aktivitas yang tidak lebih baik dibandingkan dengan ligan native, yang berarti tidak menunjukkan respon yang positif terhadap 4R06 sebagai protein target. Hal yang menarik disini adalah interaksi ikatan rosiglitazon memberikan hasil nilai energi ikatan dengan protein target yang jauh lebih besar dibandingkan ligan native yaitu sebesar -8,8 kkal/mol. Seperti yang diketahui, agonis PPARγ bekerja dengan mekanisme ikatan pada Ligand Binding Domain (LBD) dan kemudian mengaktivasi reseptor untuk memacu gen transkripsi memproduksi adiponektin untuk meningkatkan aksi insulin dengan menaikkan sensitivitas insulin. Selain itu aktivasi PPARγ menghambat produksi resistin yang berpengaruh terhadap resistensi insulin (Chiarelli dan Marzio, 2008).

3. HASIL DAN PEMBAHASAN Proses preparasi oleh chimera menghasilkan protein tanpa ligan (Gambar 1) dan ligan native. Protein 4R06 tanpa ligan akan menjadi protein target proses docking menggunakan autodock vina untuk membandingkan afinitas ikatannya dengan ligan native, 12 ligan aktif, 750 decoys, dan senyawa obat golongan Thiazolidin, Rosiglitazon. Ligan native merupakan ligan uji yang akan diuji dan dibandingkan interaksi ikatannya. Ligan aktif adalah ligan pembanding yang memiliki aktivitas biologis, sedangkan decoys merupakan senyawa yang memiliki interaksi ikatan yang tinggi, namun tidak memiliki aktivitas biologis.

1202

THE 5TH URECOL PROCEEDING

Senyawa

Ligan native C28H24N2O3S (ligan aktif) C25H24FN3O2S2 (decoys) Rosiglitazon

18 February 2017

Energi ikatan (kkal/mol) -11,3

Interaksi Hidrofobik ILE-326

-11,3

ILE-326

-11,2

ILE-281, ILE-341

-8,8

UAD, Yogyakarta

Ikatan Hidrogen

SER-289, TYR-327, LEU-340 SER-289, TYR-327

Interaksi π

HIS-449

TYR-327, HIS-449 ARG-288, SER-289, GLU-295, TYR-327

ARG-288

Tabel 1. Perbandingan energi ikatan dan interaksi residu asam amino dengan ligan Dengan aplikasi Protein Ligand pengikatan di area ini. Interaksi yang Interaction Profiler (PLIP) didapatkan terjadi pada binding site protein 4R06 prediksi interaksi antara ligan dan terbentuk dari ikatan hidrogen, interaksi protein (Gambar 2). Interaksi ini hidrofobik, dan interaksi π. Semakin melibatkan binding site, area pengikatan banyak kemiripan residu asam amino ion-ion maupun ligan dengan antara ligan nativedengan suatu proteinnya yang akan mempengaruhi senyawa, maka tingkat kemiripan konformasi maupun kinerja dari protein sifatnya akan semakin tinggi. tersebut. Residu-residu asam amino mempunyai peran penting pada

a. b. Gambar. 2 visualisasi 3D interaksi residu-residu asam amino dengan a) ligan native, b) senyawa C28H24N2O3S menggunakan PLIP Interaksi residu (Tabel 1) pada ligan native mirip dengan senyawa C28H24N2O3S yakni pada SER-289 dan TYR-327 dengan jenis ikatan hidrogen. Selain itu, kesamaan lain terdapat pada ILE-326 yang berinteraksi melalui ikatan hidrofobik. Perbedaannya hanya pada ikatan π pada residu HIS-449 yang dimiliki oleh senyawa C28H24N2O3S dan ikatan hidrogen pada residu LEU-340 yang dimiliki oleh ligan native. Residu TYR-327 dengan ikatan hidrogen juga dimiliki oleh senyawa decoys, C25H24FN3O2S2 dan senyawa obat, Rosiglitazon. Serta ikatan hidrogen pada residu SER-289 dimiliki juga oleh Rosiglitazon. Sehingga, interaksi

residu SER-289 dan TYR-327 merupakan yang paling dominan terjadi pada keempat senyawa. 4. KESIMPULAN Meski terdapat beberapa kesamaan ikatan residu, dilihat dari nilai afinitas ikatannya, tidak ada ligan uji yang aktif terhadap protein target 4R06

5. DAFTAR PUSTAKA Auwerx J. 1999. PPARgamma, the ultimate thrifty gene. Diabetologia 42:1033 1049

1203

THE 5TH URECOL PROCEEDING

18 February 2017

Baumann CA, Chokshi N, Saltiel AR, Ribon V. 2000. Cloning and characterization of a functional peroxisome proliferator activator receptor-gamma-responsive element in the promoter of the CAP gene. J. Biol. Chem. 275:9131–35 Berger J, Moller D. 2002. The Mechanisms Of Action Of PPARs. Annu. Rev. Med. 53:409–35 Chiarelli, Francesco, and Di Marzio, Daniele. 2008. REVIEW: Peroxisome proliferator-activated receptor-γ agonists and diabetes: Current evidence and future perspectives. Vascular Health and Risk Management. Dove Medical Press Limited :4(2) 297–304 Gorniak, Grygiel. 2014. Peroxisome proliferator-activated receptors and their ligands: nutritional and clinical implicationsa. Review. Nutrition Journal 13:17 IDF. International diabetes federation. 2008. Implementation of the United Nations Resolution on Diabetes (61/225) in Africa, Diakses Januari 2017 Larsen TM, Toubro S, and Astrup A. 2003. PPARgamma agonists in the treatment of type II diabetes: is increased fatness commensurate with long-term efficacy? IntJ Obes Relat Metab Disord 27:147–161 Lehrke M and Lazar MA. 2005. The many faces of PPARgamma. Cell 123:993– 999 Marrewijck, Laura M,Steven W. Polyak,Marcel Hijnen,Dana Kuruvilla, Mi Ra Chang, Youseung Shin, Theodore M. Kamenecka, Patrick R. Griffin, and John B. Bruning. 2015. SR2067 Reveals a Unique Kinetic and Structural Signature for PPARγ Partial

UAD, Yogyakarta

Agonism. ACS Chem. Biol 11: 273−283 Meng, X.Y.; Zhang, H.X.; Mezei, M.; Cui, M. 2011. Molecular docking: A powerful approach for structurebased drug discovery. Curr. Comput. Aided Drug Des 7: 146–157. Mudaliar S, Chang AR, and Henry RR. 2003. Thiazolidinediones, peripheral edema, and type 2 diabetes: incidence, pathophysiology, and clinical implications. EndocrPract 9:406–416 Nissen SE and Wolski K. 2007. Effect of rosiglitazone on the risk of myocardial infarction and death from cardiovascular causes. N Engl J Med 356:2457–2471 Puhl, C Ana, Amanda Bernardes, Rodrigo L. Silveira, Jing Yuan, Jessica L. O. Campos, Daniel M. Saidemberg, Mario S. Palma, Aleksandra Cvoro, Stephen D. Ayers, Paul Webb, Peter S. Reinach, Munir S. Skaf, and Igor Polikarpov. 2012. Mode of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ Activation by Luteolin. Mol Pharmacology 81:788–799 Saltiel AR. 2001. New perspectives into the molecular pathogenesis and treatment of type 2 diabetes. Cell 104:517–529 WHO. World Health Organization diabetes fact sheet. http://www.who.int/ mediacentre/factsheets/fs312/en 2016. Diakses Januari 2017 Willson TM, Brown PJ, Sternbach DD, Henke BR. 2000. The PPARs: from orphan receptors to drug discovery. J Med Chem, 43:527–550

1204