Immunológiai módszerek

Immunológiai módszerek

poliklonális ellenanyagok

monoklonális ellenanyagok

specificitás

heterogén

homogén

affinitás

heterogén

homogén

izotípus

heterogén

homogén

keresztreakciók

gyakori

nincs

előállítás

olcsó, egyszerű

drága, speciális felszerelést igényel

immunizálás

tisztított antigénnel

szennyeződés nem zavar

mennyisége

korlátozott

korlátlan

jellemzés

specificitás/keresztreagáló képesség – izotípus összetétel – átlag affinitás

finom specificitás – izotípus – affinitás

ajánlott módszerek

precipitáció – agglutináció – komplement aktiválás – ELISA

FACS / MACS – blot ELISA/RIA

A monoklonális ellenanyag előállítás menete

George Köhler és Cesar Milstein, 1984 tisztítás jelölés

antigén

mielómasejtek

lépsejtek

ellenanyag termelés

PEG

sejtek

aszcitesz

HAT ellenanyag szelekció klónozás

klónok felnövesztése

fagyasztás

Antigén-ellenanyag kötődés kimutatása 1. Másodlagos (szerológiai) reakciókon alapuló módszerek

Gél közegben végzett precipitációs módszerek Kétdimenziós egyszerű immundiffúzió

Kétdimenziós kettős immundiffúzió

Másodlagos (szerológiai) reakciókon alapuló módszerek: 1. precipitáció - folyadékfázisban - gél közegben 2. agglutináció 3. komplement függő lízis

antigén antigén

agarba kevert

ellenanyag

ag

antigén

ea

ellenanyag

antigén

ellenanyag

ellenanyag

Ouchterlonz/m=dsyer Ouchterlony módszer

Machini-módszer

Agar gél

Agaróz gél

Ea 1/128

1/64

Ag 1/2

Ag

1/32

1/128

1/4

1/8 1/16

1/64

1/2

Ea

1/32

1/4

1/8 1/16


Agglutináció direkt indirekt

passzív

 Rh vércsoport antigének (Coombs teszt)  AB0 vércsoport

autoantitestek vagy vírus antigének kimutatása

Komplement függő sejtlízis HLA tipizálás szerológiai módszere


allél-specifikus antisavók PBMC szeparálás alvadásgátolt vér komplement forrás (friss nyúlsavó)

festék élő / pusztult sejtarány

jelzéses technikák

precipitációs módszerek

agglutinációk

módszer

érzékenység (g/ml )

ELISA

< 0,001

RIA

< 0,0001

immunfluoreszcencia

< 1,0

kettős immundiffúzió

1,0 – 10,0

ellenelektroforézis

0,1 – 1,0

immunelektroforézis

5,0 – 50,0

radiális immundiffúzió

1,0 – 10,0

rakéta elektroforézis

0,1 – 1,0

indirekt - direkt

0,01 – 1,00

passzív

0,005 – 0,1

agglutináció gátlás

0,001 – 0,01

komplement kötés

0,01 – 0,1

Antigén-ellenanyag kötődés kimutatása

2. Jelzéses technikák

Jelölés módja:

- Enzimmel (HRPO, alkalikus foszfatáz)  ELISA, ELISPOT, hisztokémia - Fluoreszcens festékkel (FITC, TRIC, Texasred, Rodamin, PE, CyChrom, Alexa)  FACS, fluorescens mikroszkópia

- Fémkolloidokkal (vas, arany)  MACS, elektron mikroszkópia

- Radioaktív izotópokkal  RIA (radio immuno assay)

ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay)

1. direkt ELISA 2

1

3

-- Enzimmel konjugált ellenanyag -- Ag + szubsztrát + kromogén % direkt

5

1

0,2

EA [c] mg/ml

25

5

1

Ag [c] mg/ml

%

direkt

ellenanyag

antigén determinánsok jelzés (enzim, pl. HRPO; radioaktív izotóp;fluorokróm)

OD

2. indirekt ELISA

indirekt

10x

ellenanyag

1000x

EA hígítás

antigén determinánsok

második ellenanyag (anti-egér immunoglobulin)

monoklonális reagens

100x

jelzés (enzim, pl. HRPO; radioaktív izotóp;fluorokróm) + szubsztrát

+ kromogén poliklonális reagens

Szendvics ELISA

1. „Coat” készítés – elsődleges ellenanyag szilárd fázishoz kötődik 2. antigén (ismeretlen konc.) (fehérjék, nukleinsavak, poliszacharidok, vírusok, baktériumok, sejtek) Standard: ismert koncentrációjú antigén higításai – kvantitatív meghatározáshoz szükséges 3. Antigén secifikus második allanyag – jelzett (-HRPO) formában (biotin-sztreptavidin=erősíti a színreakciót, ld. ábra) 4. Szubsztrát (H2O2) + kromogén (pl. TMB) A redukált (színtelen) TMB kromogén oxidálódik – színváltozás (kék) 5. Reakció leállítása (H2SO4) – színváltozás (sárga) 6. Spektrofotometriás mérés Az első réteg után blokkolás (szabad kötőhelyek fedése), a további lépések között mosás (nem kötődött molekulák eltávolítása)

ELISA kivitelezése:

ELISA kit különféle antigének mennyiségi meghatározására

Antigén-ellenanyag elsődleges kapcsolódásának kimutatásán alapuló: jelzéses módszerek

1. ELISA

2. Fénykibocsátás detektálásán alapuló módszerek  Fluoreszcencia, lumineszcencia (Sejtanalitikai módszerek: FACS, CLM)

Fluoreszcencia • Egy gerjesztett molekula elektronátmeneteit (relaxáció) kísérő foton kibocsátás (emittáció) • Egy foton elnyelése, az ABSZORBCIÓ (1) váltja ki • Egy gerjesztett elektronállapot (S1’) jön létre, mely először a legalacsonyabb S1 vibrációs szintre relaxál (2), majd • Fluoreszcencia kibocsátás vagy egyéb relaxációs folyamatok (3) során visszatér az alapállapotba: a kibocsátott fluoreszcencia mindig hosszabb hullámhoszú, mint az elnyelt hullámhossz

Fluorofórok lényeges paraméterei • Emissziós (kibocsátási) spektrum • Gerjesztési (elnyelési, excitációs) spektrum

Miért jó fluoreszcens technikákat használni?  pmol/l érzékenységű → a radioaktív jelölés lenne hasonlóan érzékeny, de az veszélyes  térbeli és időbeli feloldást is lehetővé tesz (határ: 1-100 ns, ami a fluoreszcencia életideje)  spekrofluorimetria  multiparaméteres fluoreszcens mikroplate reader  áramlási citofluorimetria (FACS)  fluoreszcens mikroszkópia

Fluorofórok • • •

A flurofórok olyan molekulák, melyek képesek az elnyelt fényt jó hatásfokkal fluoreszcencia formájában kibocsátani Természetes fluorofórok: Trp, Tyr, koenzimek, szteroidok, DNS/RNS Gyakori szintetikus és szemi szintetikus fluorofórok: Fluoreszcein, Rhodamin, Etídium bromid, Propídium jodid, fikobiliproteinek (RPE, APC)

Áramlási citofluorimetria (FACS) Alapelvek •

Sejtszuszpenzió áramoltatása zárt keringési rendszerben

•

Hidrodinamikai fókuszálás kis keresztmetszetű kapilláris fejbe

•

Egyszerre 1 sejt megvilágítása lézerrel

•

Sejtről érkező fluoreszcencia és fényszórás detektálása

•

Adatok digitálsi feldolgozása és tárolása

Áramlási citofluorimetria

Mit detektálunk? fluoreszcens jeleket • Fényszórás: a megvilágító lézer fénye beleütközik a detektálandó részecskébe (sejt, gyöngy, stb)

•

Két típusa: előre szóródó (FSC=forward scatter) – sejt méret oldalra szóródó (SSC=side scatter) – granuláltság

Áramlási citofluorimetria

Előnyök •

Sejtenkénti multiparaméteres analízis

•

Nagy sebesség (akár 10.000 sejt/perc)

•

Sejtszortírozás lehetősége (tetszőleges tulajdonság alapján)

Felhasználás •

Klinikumban: sejtpopulációk arányának, sejttípusok abszolút számának meghatározása, aktivációs állapot meghatározása, citokinek mérése

•

Kutatásban: gyakorlatilag „bármire”: populációk mennyisége/minősége, sejtosztódás, sejtaktiváció, sejthalál, ionok, citokinek meghatározása

Eredmények feldolgozása

Sejtpopulációk a lépben. Kvadráns analízis limfocita markerekkel B limfociták

FL-2 : sIgM spec. antitest

Nincs kettősen pozitiv sejt !

nem limfoid sejtek

T limfociták

FL-1: anti-CD3

Kvadráns-analízis (pl. T sejt populációk a timuszban)

FL-2 : anti-CD8

érett, CD8+ citotoxikus T-limfocita (5-7%)

TÍMUSZ

éretlen, CD4- és CD8- T-sejt (3-5 %)

éretlen, CD4+ és CD8+ T-limfocita (~ 80 %)

sejtszám

TCR/CD3 expresszió ?

FL-3 : anti-CD3 érett, CD4+ helper T-limfocita (~ 10 %)

FL-1 : anti-CD4 (10-20.000 sejt)

Fluoreszcens (konfokális) mikroszkópia • a minta előkészítése gyakorlatilag azonos a FACS-al • lokalizáció meghatározására elsősorban • itt is a sejtekről érkező fluoreszcens jelet detektáljuk

Konfokális fluoreszcens mikroszkópia lézer-pásztázás, optikai szeletelés: Z-scan, 200-500 nm, digitális fluoreszcens képalkotás, 3D-rekonstrukció Fehérje-fehérje vagy fehérje-lipid kolokalizáció: CLSM Imaging

Dendritikus sejt zöld: iC3b piros: LAMP-1( lizosz.asszoc.mb.prot.) sárga (overlay) : iC3b-LAMP asszociáció

A fagocitózis vizsgálata Fagocitált partikulum:

latex, élesztő, baktérium opszonizált (IgG és/vagy komplement) formában is -

Inkubálás: 1 óra, 37 °C

-

Értékelés: fénymikroszkóppal CLM vagy citofluoriméterrel pl. FITC-jelzett partikulumok

fagocitózis index vagy fagocitózis % megállapítása, illetve flooreszcencia intenzitás mérése (Egér és humán makrofág sejtvonalak használata)

Konfokális lézer mikroszkópos felvétel DC fagocitózisról

Sejtkultúra készítés és fenntartás: •Pipetták •Steril tenyésztőedények •Steril tápfolyadék

•Steril fülke •CO2 termosztát

IMMUNKOMPETENS SEJTEK IZOLÁLÁSA Primer sejtek (állati, emberi): - lép - tímusz - csontvelő - nyirokcsomó - hasüreg - vér Vér - vérplazma ( alakos elemek ) - eritrociták - trombociták - leukociták - granulociták - neutrofil - bazofil - eozinofil - limfociták - monociták Sejtvonalak: Korlátlanul osztódó állati és humán eredetű sejtek

IMMUNKOMPETENS SEJTEK IZOLÁLÁSA Sejtpopulációk elválasztásának alapja: 1. Fajsúly különbség Sűrűség grádiensen történő centrifugálás

2. Egyedi funkciók Monocita, makrofág: adherencia, fagocitózis Neutrofil granulocita, dendritikus sejt: fagocitózis B-sejtek: ellenanyag termelés (tapadása nylon-vattához)

T-sejt: citotoxikus reakció (bvvs kötődés - rozetta-képzés) 4. Sejtfelszíni marker – Panning technikák, FACS Komplement-mediált lízis (ellenanyaggal megjelölt sejtek

komplement hozzáadására lizálnak, a markert nem expresszáló sejtek elkülöníthetők).

A limfocita populációk megoszlása emberi vérben

A vér összetevői

vérsavó: natív (alvadásgátló mentes) vér része

Sűrűség grádiens centrifugálás B

Plazma

VÉR Gr

T

Ficoll

PMNS:

perifériás mononukleáris sejtek

Mo

Centrifugálás: 500g, 30 min

Fajsúly:

80% T+B+Gr

1.077g/c m3

10% Mo

vvt

Adherens sejtek (Mo) eltávolítása:

T és B

adherencia (kitapasztás) Mo

Monocita eredetű dendritikus sejtek (MDC) in vitro differenciáltatása ÉRETLEN DC

imMDC

CD14MHCII+ CD83MR+

GM-CSF IL-4

GM-CSF IL-4 TNF-α Patogén stimulus

Mo maMDC

MONOCITA

ÉRETT DC

GM-CSF

CD14+ MHCII+

MAKROFÁG CD14+ MHCII+

Mf

CD14MHCII++ CD80+ CD83+ CD86+ MR-

Sejtek tenyésztése: NHS/FCS(magzati borjú savó)-tartalmú tápfolyadékban vagy szérummentes médiumban

FAGOCITASEJTEK FUNKCIONÁLIS JELLEMZÉSÉRE

LEGGYAKRABBAN ALKALMAZOTT VIZSGÁLATOK 1. Korai aktivációjának kimutatása (NF-κB magi transzlokációja aktivált dendritikus sejtekben) 2. Dendritikus sejtek citokin produkciója (Pl. aktivált DC-k által termelt IL-12 meghatározása: mRNS, microbead assay, ELISA, immunhisztokémia) 3. Dendritikus sejtek kölcsönhatása más sejtekkel Allogén CD4+ T-sejtek proliferációjának mérése

4. Dendritikus sejtek migrációja A kemokinek a DC-k kemotaxisát és endotélen keresztüli migrációját váltják ki. A migráció mértéke transwell plate-ben vizsgálható. 5. Dendritikus sejtek antigén felvétele FITC-dextrán, torma-peroxidáz endocitózisa

NF-κB magi transzlokációja LPS aktivált dendritikus sejtekben Konfokális lézer mikroszkópos vizsgálat Kontroll

Sejtmag NFkB

LPS aktivált

Opszonizált fagocitózis

Kemotaxis teszt

- Kemotaktikumok kiváltják az immunsejtek migrációját - felső edényben sejtszuszpenzió, alsó edényben kemotaktikum, a kettő között filter - kemotaktikus inger hatására

membránon átjutó sejtek számának meghatározása - standard alkalmazása

transwell plate

Limfociták izolálása Sejtpopulációk elválasztása:

1. Sűrűség grádiensen történő centrifugálás (alvadásgátolt vér) 2. Monocita-granulocita eltávolítás: adherencia, fagocitózis 3. Limfocita: T, B (B-sejtek tapadása nylon-vattához,

T-sejt bvvs kötődés - rozetta-képzés) 4. Panning technikák 5. Komplement-mediált lízis

Sűrűség grádiens centrifugálás B

Plazma

VÉR Gr

T

Ficoll

PMNS:

perifériás mononukleáris sejtek

Mo

Centrifugálás: 500g, 30 min

Fajsúly:

80% T+B+Gr

1.077g/c m3

10% Mo

vvt

Adherens sejtek (Mo) eltávolítása:

T és B

adherencia (kitapasztás) Mo

T sejtek izolálása rozetta képződés segítségével

B

T

T sejtek Rozetta: emberi T sejteken: CD2 + birka vörösvértest

T

T

TT T T T Ficoll

B sejtek Ficoll

T T T sejtek T TT T

További szeparálási módok: Panning (kipányvázás): • Petri csésze felszín fedése ellenanyaggal, amely egy adott sejtfelszíni markerra specifikus

• A nem kötődő sejtek óvatos lemosása

Ellenanyaggal fedett sejtek komplement függő lízis útján való eltávolítása: T/B limfocita szuszpenzió

T sejtek + anti-CD3 + komplement forrás (nyúl savó) T sejtek lizálnak, B sejtek használhatók

Nyugvó és aktivált B sejtek elkülönítése: Percoll gradiensen 55 %, 58 % 65 % Percoll oldat

Sejtszeparálás mágneses mikrogyöngyökkel Dynabead gyöngyök sejt marker specifikus ellenanyaggal fedve

Gyors, egyszerű, hatékony elválasztás pozitív – negatív szelekció

Negatív sejtek

99% depléció Többféle ellenanyag keverve Sejtek érintetlenek

Pozitív sejtek mágnes

99% tisztaság

A sejtszeparálás hatékonyságának ellenőrzése Kontroll, Izolálás előtt (T+B) 1 Izolálás előtt (T+B) T sejtek eltávolítása komplementtel 2 T sejtek eltávolítása B sejtek eltávolítása panning-el

Folyadék áramlási citometriás méréssel

3

B sejtek eltávolítása

B220: B sejt marker

CD3: T sejt marker B220

TB-

CD3

TB-

Funkcionális vizsgálatok Antigén: szolubilis, vagy antigénprezentáló sejt + peptid

B sejt

T sejt

Mitogén:LPS, PWM, SpA, PHA, ConA, Anti-antigén receptor (BCR, TCR): anti-IgGAM, anti-könnyűlánc, anti-idiotípus ellenanyagok, vagy anti-CD3

Poliklonális aktiválás

Limfociták funkcionális vizsgálata

Ellenanyag termelés ELISA ELISPOT Plakk

Citokin termelés ELISA FACS PCR Proliferáció DNS festés (sejtciklus) CFSE festés Triciált (3-H) timidin beépülés

Apoptózis DNS festés Citokróm-C felszabadulás Caspase aktivitás Annexin

Primer és szekunder humorális válasz



Apoptózis: DNS festés Citokróm c felszabadulás Caspase aktivitás Annexin

IL - 10

Cytokin mérés ELISA-val

1,2

OD492

1 0,8 0,6 0,4 0,2

y = 0,0087x - 0,0031

0 0

50

100

150

citokin (pg/ml)

IFN-gamma

OD492

0,6

Szendvics ELISA:

0,4

0,2 y = 0,0061x + 0,086 0 0

20

40

80

citokin (pg/ml)

Ellenanyag –citokin – ellenanyag* Eltérő epitópokra specifikus ellenanyagok

IL-4 1 0,8 OD492

Kanatitatív mérés: ismert koncentrációjú citokin hígítási sorral

60

0,6 0,4 0,2

y = 0,0064x + 0,0126

0 0

50

100 citokin (pg/ml)

150

Ellenanyagtermelő B sejtek kimutatása B sejtek tenyésztése antigénnel fedett edényben

Limfokintermelő T sejtek kimutatása A T sejtel tenyésztése a kérdéses limfokinre specifikus ellenanyaggal fedett edényben

mosás

Enzimmel konjugált anti-Ig-vel való inkubálás

mosás A limfokinnek egy másik epitopját felismerő, enzimmel konjugált ellenanyaggal való inkubálás

mosás

mosás

Kromogén hozzáadása

Kromogén hozzáadása

pozitív sejtek megszámolása

ELISPOT A citokint termelő Tsejtek, vagy az ellenanyagot termelő plazmasejtek gyakoriságának meghatározása



Apoptózis: DNS festés Citokróm c felszabadulás Caspase aktivitás Annexin

Limfocita aktiváció lép

Proliferáció (3H-timidin beépülés)

LPS ConA

LPS tímusz

ConA

+ + +

Proliferáció meghatározása CFSE CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)

osztódás: 3

2

1

0

osztódás: 3 2 1 0

CFSE

FL-1

•Beépül az élő sejtekbe •Észterázok hasítják az acetát csoportot •A hasított molekula fluoreszcenssé alakul és a sejtben marad

Proliferáció meghatározása CFSE

Az osztódó sejtek arány meghatározható

Immunológiai módszerek

Recommend Documents