Immunhisztokémiai módszerek
Fixálás I.
A szövet eredeti szerkezetének megőrzéséhez, az enzimatikus lebontó folyamatok gátlásához: fixálószerek! kompromisszumkeresés - alkoholok: vízelvonók!!! - aceton ún. koagulációs fixálók - aldehidek: paraformaldehid, glutáraldehid fehérjék aminocsoportjai között alakítanak ki keresztkötéseket ún. additív fixálók - pikrinsavas-ecetsavas formaldehid (Bouin), szublimátos-formaldehid (B5) ún. keverék - ozmium-tetroxid: elektronmikroszkópos munkák utófixálás lehető legkisebb károsodást okozza a szövetben!
Fixálás II. Immerziós fixálás: a fixálószer diffúzióval járja át a mintát, ügyelnünk kell a megfelelő szövetvastagságra és a fixálás optimális idejére!!! Perfúziós fixálás: a kísérleti állatot altatjuk, a fixálóanyag, a keringés révén jut el a szövetekbe.
Fixálás III. Vérkenet, sejtcentrifuga által nyert preparátum fixálása: Szárítás – gyakran gyenge immunjel detektálása → kromogén szubsztráttal való inkubációs idő növelése Citológiai kenet fixálása: Azonnali nedves fixálás (96%-os etanol) • etanol: leukocita marker jelölést gátolja Nedves fixálás: sejtek elvesztése, összecsapzódása → inkubációs idő rövidítése hőmérséklet és az antitest koncentráció növelésével Fagyasztva metszett anyagok: Ha az antigén az aldehid rögzítést tolerálja: Ilyenkor a penetráció akadályozott, mert az alkohol/xilol oldja a lipidek nagy részét → aceton utórögzítés, detergens alapú pufferes mosás, rövid proteáz emésztés javíthatja. Valamint a kisebb háttér érdekében, ha lehet válasszunk monoklonális antitestet
Fixálás IV. Paraffinba ágyazott anyagok: Formalin: → sok antigén kimutathatóvá válik: proteolitikus emésztés, antigén feltárás és poliklonális antitest használatával Ha monoklonálisat akarunk használni, akkor utána kell járni: Reagál-e a formalin vagy a paraffin a kimutatandó epitóppal
Bouin fixálás: 1-12 óra, utána már törékeny lesz a metszet!! nagyon gyorsan és jól fixál A pikrinmaradványok eltávolítása 70%-os etanollal és vízzel való mosás A sárga szín: Na-tioszulfát oldattal és vízzel való mosás
Beágyazás Metszéshez a fixált mintát be kell ágyazni! Sok beágyazószer nem járja át a vizes anyagokat! → víztelenítés! - felszálló alkoholsor •ezután olyan közeg, amely elegyedik alkohollal és a beágyazószerrel is pl. xilol, toluol, benzol, kloroform - cukoroldat Beágyazószerek: - paraffin: 56 °C-on folyékony állapotú, szobahőmérsékleten szilárd, hidrofób anyag - kriogél / fagyasztómédium - zselatin - műgyanta: elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz
Metszetkészítés Szánka mikrotóm: - paraffinba ágyazott blokkok - 5-12 µm ideális metszetvastagság; a mikrotóm késéről a metszeteket ecset segítségével meleg vízre terítjük, majd a tárgylemezekre úsztatjuk. Ultramikrotóm: - Elektronmikroszkópos ultravékony metszetek - 60-70 nm készítéséhez használunk Kriosztát (fagyasztva): - -20°C-on kriosztátban metszünk Vibratóm Csiszolatok: - Kemény anyagokból, mint pl. a csont vagy a fogak Nyúzat preparátumok (whole-mount): - sztereomikroszkóp alatt csipesz segítségével akár több szövetréteget is eltávolíthatunk a mintánkról Probléma lehet a nem megfelelő tárgylemezválasztás! - Adhéziós tárgylemez
Antigénfeltárás I. Fixáláshoz leggyakrabban használt a formalin, de ezzel sok antigén elveszti az immunreaktivitását Minden antigén egy, de a legtöbb több epitópot tartalmaz, mindegyike minimum 5 aminosavból áll. Sok epitópban a formalin kémiai változást eredményezhet. Keresztkötések- antigén immunreaktivitás elvesztése!!! Proteolitikus emésztés: megbontja a szöveti szerkezetet és engedi, hogy a rejtett antigéndeterminánsok előtűnjenek. proteináz K, pronáz E, pepszin, tripszin, kimotripszin, ficin hatásuk eltérő Hatékonyságuk függ: enzimkoncentrációtól, a puffertől, hőmérséklettől, időtől A proteáz emésztés - enzimtől függően - peptid kötés specifikus és erőteljes; hathat az epitópra is!! → ezek miatt a metszet könnyen szétemésztődik; az optimalizálás mintatípusonként szükséges
Antigénfeltárás II. Hőinkubált antigénfeltárás: vizes közegben, magas hőmérsékleten, változó ideig Leggyakrabban használt pufferek: -0,01 M-os, pH 6,0-os citromsav-citrát puffer - 0,1% detergens (Tween 20) - 0,1-0,5 M-os, pH 8-10-es Tris-HCl - 0,001 M-os, pH 8-as EDTA-NaOH (Újabban 0,01 M-os TRIS-HCl pH 1 vagy 10 jobb, mint a citrátpuffer) - gyárilag előállított target retrieval solution
Antigénfeltárás III. Az optimális hőmérséklet nem meghatározható 10-60 perc (20 perc!!) Leggyakoribb a mikrohullámú főzés (100 oC-on működő rendszer esetén kb 1 liter pufferbe, max teljesítményen 20 percig..... ez kb. 10-15 perc forralás) Fontos, hogy a lehűtést lassan kell végezni!!! Reaktív aldehid csoportok lehetnek jelen, ezért a metszeteket lehet kihűlésig szobahőmérsékletű neutrális Tris-HCl-be vagy TBS-be tenni Ez a lépés már akár összevonható a nem specifikus kötőhelyek telítését célzó blokkoló lépéssel.
Antigénfeltárás IV. Koagulációs módszerrel fixált szöveteknél a főzés nem hatásos, ráadásul a metszet hamar dezintegrálódik. Ha kevert módszer van, ott viszont kevesebb ideig kell főzni, mivel a formaldehid keresztkötő képessége nem érvényesül annyira. Citológiai mintáknál módosítani kell, hogy a sejtmembrán permeabilitását növeljük, így sejtmagi antigének is elérhetők lesznek. Módosítás: - 0,1% detergens hozzáadása (SDS, Triton-X, Tween 20, NP40) - csökkentjük a hőmérsékletet 37 oC-ra
Pan-cytokeratin:AE1/AE3 Forrás: http://www.frank-diagn.hu/pdf/dako2/Dako_Szimpozium_3.pdf
nincs
proteáz
Hőmérséklet inkubált
Vimentin (V9): - HIER sorozat eltérő időkkel
Elvárás: Minden lymphocyta 30’ citrát pH6,0 elégtelen pozitív!
40’ citrát pH6,0 optimális
Forrás: http://www.frank-diagn.hu/pdf/dako2/Dako_Szimpozium_3.pdf
normál ph 6,0 TRIS-EDTA ph 9,0 normál citrát-puffer ph 6,0erős citrát-puffer
HER22+ emlőrák
Blokkolás Aspecifikus kapcsolatforrás lehet: - pozitív töltésű szöveti molekulák és a reagens negatív csoportjai között - szöveti szabad aldehid csoportok és az immunglobulinok között - szövet és az immunglobulinok között A nem-specifikus kötőhelyeket nagy koncentrációjú indifferens fehérjével telítenünk kell! (30-60 perc) Erre a célra 1-5%-os szarvasmarha szérum albumin (BSA), újszülött marha szérum (FCS), normál állati szérum (legtöbbször a második antitestet szolgáló állatfajból), sovány tejpor vagy kazein alkalmazható a megfelelő pufferben hígítva.
Antitestek, inkubációs körülmények I. Az antitestek hígításához és az immunreakció mosási lépéseihez Tris pufferelt sóoldatot (TBS-t) vagy foszfát pufferelt sóoldatot (PBS-t) használunk. Immunreagensek hígítása: - 1% BSA - 0,1% Na-azid - puffer - Peroxidáz konjugált antitest hígításához azidos-TBS nem használható, mivel az azid blokkolja az enzimet!!! Tárolás: - 4 oC, ha nem kellően stabil aliquotokban -20 oC-on
Antitestek, inkubációs körülmények II. Inkubálás: - metszetről való lefolyás elkerülése: körberajzolás hidrofób, zsírszerű anyaggal töltött tollal (PAP Pen, DAKO Pen, wax pen) - a specifitás érdekében elnyújtott (éjszakás) inkubálás 4 oC-on - rövidebb idejű inkubálásnál érdemes az antitest töménységét növelni Antitest-titer: Az optimális antitest titer: a monoklonális antitest vagy antiszérum legnagyobb arányú hígítása, amely még maximális érzékenységű és specifitású immunreakciót ad a legkisebb mértékű háttérreakció mellett.
Antitestek, inkubációs körülmények III. Antitestek hígítása: - a hígítás, az inkubációs idő és a hőmérséklet szoros kapcsolatban állnak - ha az egyiket változtatom, az kihatással lesz a másik kettőre is → optimalizáláskor mindig csak az egyiket változtassuk!!! Fontos: Általában előhígított oldatokat kapunk vagy egy hígítási tartományt ajánlanak a különböző módszerekhez, inkubációs időhöz, inkubációs hőmérséklethez → megkapjuk a hígításhoz használatos puffer összetételét is De van olyan, hogy ezek az infok nem állnak rendelkezésünkre → hígítás mértékét titrálással kell megállapítani. Állandó inkubációs idő mellett kis adagokat (100-300 ul) készítünk különböző hígítási értékekből. → meghatározott optimális hígítási érték alapján: stabilan eltartható törzsoldat.
Antitestek, inkubációs körülmények IV. Formalin fixált, paraffinba ágyazott anyagok: - háttérreakció szinte mindig → maximális jel/zaj arány Monoklonális antitestek: - érzékenysége nagyobb a pH-ra, a puffer iontartalmára - Sokan PBS puffert használnak oldószerként → enyhén gátolhatja a monoklonális antitest reaktivitását
Antitestek, inkubációs körülmények V. Inkubációs idő: - fordított arányosság: magasabb antitest koncentrációhoz rövidebb idő → optimalizáláskor az inkubációs időt tartsuk állandó értéken! - 10-30 perctől-48 óráig tarthat → hosszú időtartamnál a háttérfestődésre figyelni kell!!! Inkubációs hőmérséklet: - 37 oC-on hamarabb elérhető az antitest/antigén kapcsolódási egyensúly a szobahőhöz képest - magasabb hőmérsékletnél: növelhető az antitest hígítása csökkenthető az inkubációs idő - hosszú inkubálásnál és/vagy magas hőmérsékletnél érdemes a 4 oC-ot választani nedves kamra
Forrás: http://www.frank-diagn.hu/pdf/dako2/Dako_Szimpozium_3.pdf
EGFR Oesophagus RT 120 perc
RT 30 perc
Technikák
Előny: Immun-enzimatikus tecnikák: kiváló morfológiai kép Direkt-egylépéses fénymikroszkóppal értékelhető Indirekt-kétlépéses metszetek sokáig tárolhatók Indirekt-háromlépéses a festett metszet újra felhasználható Enzim anti-enzim módszer olcsóbb ABC módszer-avidin-biotin-peroxidáz Hátrány: Jelzett avidin módszer időigényes gyakori háttérreakciók Előny: Immun-fluoreszcens tecnikák: gyors Direkt (a fluorochrom az elsődleges éles jelek antitesten) több színreakció ugyanazon a Indirekt (a fluorochrom a második preparátumon antitesten) minimális háttérreakció Fluoreszcensen jelzett avidin módszerHátrány: instabil fluorochrom drága fluoreszcens mikroszkóp
Háttérreakciók, aspecifikus jelölődés I. Hidrofób interakciók: Immunreakcióban hidrofób kölcsönhatások a szöveti fehérjék és a specifikus antitest között jön létre. A formalin és a glutáraldehid hatására a szöveti fehérjék még hidrofóbbak lesznek! A fixálás során létrejövő hidrofób keresztkötések függnek: - fixálási időtől - hőmérséklettől - pH-tól Leggyakoribb szövetek, amelyek ezen hidrofób kölcsönhatások miatt adnak háttérreakciót: - kötőszövet, hámszövet, zsírszövet
Háttérreakciók, aspecifikus jelölődés II. Hidrofób interakciók: A formalin túlfixálás okozta háttérreakciók csökkenthetők: - Bouin, Zenker vagy B5 utófixálással Antitestek hidrofobicitását, az aggregációt és a polimerizációt a tárolás befolyásolja! Az oldószer ionerejének csökkentésével a hidrofób interakciók csökkenthetők! Detergensek (Tween 20, etilén-glikol) hatására szintén csökkennek ezen kölcsönhatások! 1%-os BSA, kazein és a tejporos blokkolás nagymértékben csökkenti a hidrofób interakciók miatti háttérfestődést!
Háttérreakciók, aspecifikus jelölődés III. Ionos és elektrosztatikus hatások: Antigén-antitest kötődés elsősorban a töltéssel rendelkező molekulafelszínek kapcsolódásának eredménye. Azonban a háttérfestődéseknek is ez a fő komponense! → Ezek a kölcsönhatások NaCl hozzáadásával megszüntethetők!
Háttérreakciók, aspecifikus jelölődés IV. Endogén enzimaktivitás: Immunenzimatikus folyamatokban a leggyakrabban használt két enzim: - torma-peroxidáz - alkalikus foszfatáz A szövetekben természetesen előforduló enzimaktivitások aspecifikus reakciót hozhatnak létre. Endogén peroxidáz aktivitás: gátlásához közvetlenül a blokkolás előtt 3%-os H2O2-os inkubálás szükséges metanol/peroxid használata is gyakori, de számos epitóp kimutathatósága a metanol hatására csökken! Endogén alkalikus foszfatáz aktivitás: - gyomor-bélrendszer sejtjeiben magas - 5mM-os Levamisol oldattal lehet szelektíven blokkolni - valamint a blokkolás előtt gyenge savas kezelés (20% ecetsav ~ 10 másodperc) beiktatható
Háttérreakciók, aspecifikus jelölődés V. Egyéb okok: - szövet fizikai sérülése - fixálás előtt a szövet kiszárad - fixálószer penetrálása nem teljes - beágyazóanyag maradvány Forrás: http://www.frank-diagn.hu/pdf/dako2/Dako_Szimpozium_3.pdf - fertőzések
Túlzott antigénfeltárás CD3
Kiszáradási gyűrű Széli intenzitás különbség Hőkezelt; CD3 CD79
Elsődleges- és másodlagos antitestek
http://www.millipore.com/immunodetection/id3/immunostainingprotocols http://www.ihcworld.com/troubleshooting.htm http://www.histochem.net/troubleshooting.htm
