IDEGRENDSZERI TOXICITÁS KIMUTATÁSÁRA ALKALMAS VIZSGÁLATI MÓDSZEREK

IDEGRENDSZERI TOXICITÁS KIMUTATÁSÁRA ALKALMAS VIZSGÁLATI MÓDSZEREK

Világi Ildikó, Varró Petra, ELTE, Élettani és Neurobiológiai Tanszék, Budapest

TOX 2015, Harkány PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Neurotoxikológiai vizsgálatok A neurotoxikológiai vizsgálatok során különböző technikákat alkalmazhatunk a természetes és az ember által előállított toxikus anyagok (mérgek) idegrendszeri hatásának elemzésére. Az expozíció - akut vagy krónikus A hatás

- reverzibilis vagy irreverzibilis

A változások - működési vagy morfológiai változások Alkalmazott vizsgálati technikák csoportjai: - biokémiai, molekuláris biológiai vizsgálatok - morfológiai vizsgálatok - elektrofiziológiai vizsgálatok - képanalízises vizsgálatok - viselkedési vizsgálatok


Vizsgálati szintek, modellek magas

- in vivo - szerű komplexitás - emberi idegrendszerre vonatkoztathatóság mértéke

alacsony

teljes agy

agyszelet

aggregátum

primer tenyészet

egyedi sejtek


Hatásnak kitett sejtkomponensek Szinaptikus- és egyéb membrán területek

Másodlagos hírvivők, intracelluláris enzimek


Hatásnak kitett sejtkomponensek toxikus hatás toxikus hatás

toxikus hatás

toxikus hatás

toxikus hatás

toxikus hatás


Molekuláris biológiai technikák

Transzmitter és receptormennyiség vizsgálatok - HPLC mérések - receptorkötési tesztek - szinaptoszóma aktivitás mérés

Gén expressziós vizsgálatok - Korai gének aktiválódása, géntermék megjelenése (fos-, jun gének) nukleinsav és fehérje kimutatás - Stressz-fehérjék kimutatása (HSP-72 hősokkfehérjék, ubiquitin) - Gliális fehérjék meghatározása (gliális aktiváció sérüléskor – GFAP, laminin)


Neurotoxicitás meghatározása MTT festés

fluoro JadeB jelölés

MTT – tetrazólium só, élő sejtekben színtelen anyag színes termékké alakítása mutatható ki

zöld degenerálódó neuronok fluoro JadeB-vel festve


Strukturális változások kimutatása makroszkópikus: - súlymérés - térfogatmérés Súly- és méret meghatározás

Morfometriai vizsgálat


Strukturális változások kimutatása Különböző mikroszkópos technikák alkalmazásával - fénymikroszkópos (immunhisztokémia, autoradiográfia) - elektronmikroszkópos vizsgálatok Hisztopatológia A Nissl-festés az idegszövet festésére elterjedten alkalmazott eljárás (krezil ibolya vagy gallocianin)

Golgi festés ezüst impregnációval az idegsejtek jelölődnek

Weil-festés a myelinizált axonok alapfestésére

Toluidin kék festés az axonburok kimutatására


Immunhisztokémiai és citokémiai festések immuncitokémiai vagy immunhisztokémiai vizsgálatokban ellenanyagok segítségével határozhatók meg bizonyos fehérjék mennyiségi vátozásai (enzimek, receptorok) Színes csapadék vagy fluoreszcencia kimutatásán alapul a vizsgálat immunhisztokémia – c-fos protein

immuncitokémia

kettős vagy többes fluor jelölések


Elektronmikroszkópos vizsgálatok Szinapszisok elváltozásának kimutatása

Axonok degenerációjának kimutatása

üres vagy abnormális myelinburkok

TOX 2015, Harkány

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Működő sejtek tanulmányozása, in vitro modellek Modellek: • primer neuronális, idegi őssejt-, esetleg gliasejt tenyészetek • kokultúrák (többféle sejttípus) • túlélő agyszeletek

Mért paraméterek:

szövettenyészet elektrofiziológiai vizsgálata

•elektromos aktivitás • sejtpusztulás • neurotranszmitter-leadás • nyúlványnövekedés

túlélő agyszelet preparátum TOX 2015, Harkány PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Elektrofiziológiai vizsgálatok Szinte minden elektrofiziológiai módszer használható neurotoxikus hatás kimutatására, molekuláris szinttől a teljes idegrendszer szintjéig.

Patch clamp technikák Áramok alapján a csatorna nyitott vagy zárt állapotát lehet megkülönböztetni. Csatorna nyitvatartási idejét, nyitási valószínűségét, frekvenciáját változtathatják bizonyos anyagok.


Elektrofiziológiai vizsgálatok Kiváltott potenciálok, szinaptikus átvitel, spontán aktivitás vizsgálata túlélő agyszeleteken • Extracelluláris regisztrálás (mezőpotenciálok) - legjobban jellemzett agyterület: hippocampus - plaszticitás, görcskészség vizsgálata pl. ólom LTP ↓, MeHg, EPSP ↓

• Intracelluláris

regisztrálás - egyetlen sejt aktivitásának jellemzése


Elektrofiziológiai vizsgálatok In vivo elektrofiziológiai regisztrálás, spontán EEG • Akut preparátum (altatott állat) • Krónikus elektródok beépítése - Mezőpotenciál mérés pl. LTP - Spontán EEG mérése

Piretroid rovarirtószer ismételt adásával kiváltott görcsaktivitás


Elektrofiziológiai vizsgálatok In vivo elektrofiziológiai regisztrálás, kiváltott potenciálok Komplex idegi hálózat vizsgálata Sok neurotoxin okoz szenzoros diszfunkciót A jel alakjának, latenciaidejének elemzése • Vizuális KP (fényfelvillanás hatására) • Hallókérgi KP


Elektrofiziológiai vizsgálatok Ingerületvezetési sebesség mérése patkány, nyúl n. ischiadicus pl. organofoszfát rovarirtók csökkentik a vezetési sebességet (demielinizáció)


Optikai technikák Feszültségérzékeny festékek • festék abszorpciója/fluoreszcenciája •a membránpotenciállal változik Ionszenzitív festékek pl. Ca2+ • Sejten belüli Ca2+ -koncentrációtól függően a festék fluoreszcenciája változik

Képalkotó eljárások Pályák, agyterületek morfológiai és funkcionális vizsgálata


Viselkedési vizsgálatok Viselkedésvizsgálatok, Irwin-teszt • • • • •

aktivitásvizsgálat főként KIR-en ható szerek gyors tesztelésére reakció kézbevételkor, testtónus, testtartás, járás, éberség, bőr, szőrzet spontán viselkedés (pl. önápolás, hangadás) kóros jelenségek (remegés, görcsök, abnormális járás) reflexek (szemhéj, pupilla, kapaszkodás ferde lemezen, ráhelyezés)


Viselkedési, mozgáskoordinációs vizsgálatok Open field (explorációs motilitás, viselkedéselemek)

Mozgáskoordináció, egyensúlyozás vizsgálata

• az útvonal a szorongási szintről is informál


Tanulási és memória vizsgálatok •

klasszikus kondicionálás • operáns kondicionálás

• csillag labirintus • Morris vízi labirintus


Köszönöm a figyelmet!


IDEGRENDSZERI TOXICITÁS KIMUTATÁSÁRA ALKALMAS VIZSGÁLATI MÓDSZEREK

Recommend Documents