Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Környezettudományi Doktori Iskola
Humán kórokozó vírusok kimutatása magyarországi felszíni vizekbıl
Kern Anita Témavezetı: Dr. Vargha Márta, Országos Környezetegészségügyi Központ Belsı konzulens: Dr. Márialigeti Károly, ELTE TTK Mikrobiológiai Tanszék
Bevezetés I. A vírusok helye az elıvilágban: élı vagy élettelen?
Két megjelenési forma: vegetatív vírus és virion DNS és RNS vírusok → Baltimore-féle rendszerezés
A vírusok is a vízi élettér részei Klasszikus vízmikrobiológiai modellszervezetek Escherichia coli Intesztinális Enterococcus Terjedésük és túlélésük eltér a humán kórokozó vírusokétól Kevésbé ellenállóak Szomatikus colifág „Indikátorok indikátorai”
Bevezetés II.
A legtöbb víz okozta megbetegedés esetén nem azonosítható a kórokozó ágens A fertızések többségét általában enterális vírusok okozzák
Fıként széklet-száj úton terjednek A fertızött, illetve vírushordozó humán populáció a vírusürítés fı forrása Szennyezett, továbbá a tisztított szennyvízzel kerülhetnek a fürdıvizekbe a vírusok
Rendkívül ellenálló, burok nélküli vírusok
Bevezetés III.
Adenoviridae (HAdV)
Humán Ad 6 csoport: A-F
Vízben leginkább F: Ad40, Ad41
Továbbá C: Ad2, Ad5
Fıként légúti megbetegedések
http://www.worsleyschool.net
Caliciviridae
2 humán genus: Norovirus (NoV), Sapovirus
Hányás, hasmenés
Nem bakteriális gastroenteritis járványok 70-90%-át okozhatják (kortól függetlenül) → „winter vomiting disease” Változatos terjedési út: kontaktus, széklet, aerosol, szennyezett víz, élelmiszer
Picornaviridae
http://www.defendingfoodsafety.com
Enterovirus (EV)
Legtöbb fertızés enyhe vagy tünetmentes lefolyású, de olykor fatális kimenetelő is lehet Megbetegedések széles spektruma
Bevezetés IV.
A vírusok vízben való jelenlétének kimutatására szolgáló módszerek még fejlesztés alatt állnak
A vírusok kópiaszáma természetes vizekben alacsony Klasszikus ↔ molekuláris technikák
Gyorsaság Specificitás Érzékenység Fertızıképesség Mennyiségi meghatározás Többféle vírus/minta
Célkitőzések
Víruskoncentrálási módszer beállítása felszíni vizekre a „Virobathe” projektben kidolgozott protokoll alapján
Víruskoncentrálás membránfilterrel Víruskoncentrálás üveggyapot tölteten A két koncentrálási módszer összehasonlítása
Nukleinsav kivonás, specifikus PCR módszer és szekvenciameghatározás optimalizálása vírusok (HAdV, EV, NoV) kimutatására felszíni vízbıl nyert koncentrátumból Emberi kórokozó vírusok kimutatása magyarországi felszíni vízmintákból Enterális vírusok jelenlétének és a bakteriális indikátorok csíraszámának, illetve a szomatikus colifágok mennyiségének összevetése a felszíni vízmintákban Víruskimutatást gátló hatás jelenlétének vizsgálata Humán patogén vírusok évszakfüggı jelenléte
Mintavételi helyszínek
Budapest, Dráva utca + Petıfi híd + Csepel Rózsa utca: 2008.11.19. + 2009.02.16. + 2009.05.13.
Gyır, Mosoni-Duna 2008.09.09.
Csongrád, Köröstorki strand 2008.08.06.
Szeghalom, Berettyó 2008.08.18. Körösladány, SebesKörös 2008.08.18. Balatonfüred, Koloska + Kékipatak 2008.09.11.
Tiszakécske, Tiszaparti Szabadstrand 2008.08.06.
Gyoma, HármasKörös 2008.08.18.
Anyag és módszer I.
→
10 L felszíni vízminta
→
pH beállítása 3,5-re
Szőrés üveggyapot tölteten, illetve membránfilteren
Anyag és módszer II.
→
Eluálás
→
Flokkulálás majd centrifugálás
Feloldás foszfát pufferben
Anyag és módszer III. Nukleinsav kivonás mágneses gyöngy technikával 5 mL víruskoncentrátumból
↓ Vírus
Módszer
Célszekvencia
Termék (bp)
Forrás
Adenovírus
nested PCR
HEXON
301 → 171
Allard et al., 2001
Enterovírus
RT-PCR
5’ NTR
534
Puig et al., 1994
Norovírus
RT-seminested PCR
RNS-dependens RNS polimeráz
326 → 236
Vennema et al., 2002
↓ Pozitív PCR termékek szekvenálása és szekvenciaanalízise (CLUSTAL W1 és BLAST2) 1
http://npsa-pbil.ibcp.fr
2
http://www.ncbi.nih.gov/BLAST
Eredmények – Koncentrálás Adenovírus
Norovírus
Üveggyapot Membránfilter Üveggyapot Membránfilter Tisza - Csongrád
+
-
-
-
Tisza - Tiszakécske
+
-
+
+
Sebes-Körös - Körösladány
-
+
-
-
Duna - Csepel 2008.11.19.
+
+
+
-
Duna - Dráva utca 2009.02.18.
+
-
+
-
Duna - Petıfi híd 2009.02.18.
+
+
-
+
Duna - Csepel 2009.02.18.
+
+
+
-
Összes pozitív
12
9
9
7
Összes vizsgált
17
18
17
18
Eredmények – Vírusjelenlét
Adenovírus (21/35)
Tisza - Csongrád (1/3) Tisza - Tiszakécske (2/3) Sebes-Körös Körösladány (1/2) Duna - Budapest (17/18)
Tisza - Tiszakécske (2/3)
Tél (1/2)
Petıfi híd (6/6) Csepel, Rózsa utca (6/6)
1. PCR termék → ~326 bp
Duna - Budapest (14/18)
Dráva utca (5/6)
Dráva utca (5/6)
Norovírus (16/35)
Petıfi híd (5/6)
Tél (1/2) Tél (1/2)
Csepel, Rózsa utca (4/6)
İsz (1/2) Tél (1/2)
Eredmények Szekvenciaelemzés Minta
Eredmény Hasonlóság Lefedettség
Tisza - Tiszakécske
HAdV41
90 %
97 %
Duna - Dráva utca 2008.11.19.
HAdV41
95 %
98 %
HAdV40
93 %
98 %
Duna - Csepel 2008.11.19.
HAdV41
88 %
100 %
Duna - Petıfi híd 2008.11.19.
HAdV40
91 %
95 %
HAdV41
91 %
95 %
Kevert szekvenciák?
Eredmények – Enterovírus
Minden mintasorozat mellett ECHO11 vírusizolátummal elegyített csapvíz koncentrálása (pozitív kontroll)
Enterovírus specifikus RT-PCR (Puig et al., 1994) három hígításban Kimutathatóságot befolyásolta
A csapvízben található klórt közömbösítı Na-tioszulfát hozzáadásának mellızése Magasabb pH
s Ti z a H sz á a Cs Se rm - T on g be as i s-K -K sza rád ör örö k éc sk s ö Be s - K - G e y re tty örö om a s M ó os - S lad on z á n i- D egh y un alo m a D -G un a y Ko ır D -É un s a zak Ké lo sk - K -B k a i D öz ud -pa u ép a ta D na - -B pes k un D ud t a a ıs é D - É l-B pe z st un s u a zak dap ı s -K Bu est z ö D un Du zép da ı s z p a na D - É - D Bu est d un s té a zak él-B ape l -K st B u D öz ud dap t él un ép a p e s a - D Bu est t t é él dap tav l -B a ud est sz t ap av es as tt z av as z
Ti
lg CFU / 100mL
Eredmények – Összevetés 100000
10000
1000
100
N A
N AA A N A N N A A N A N AN A N A Összes vizsgált: 35
N A
1 E. coli
Enterococcus sp.
szomatikus colifág
10
A Adenovírus pozitív minták
N Norovírus pozitív minták
Eredmények - Inhibíció Adenovírus pozitív minták száma
30 25 20 15 10 5 0
2 2 2 2 2 1 2 2 2 1 2
2 2 2 1 1 2 2 2 1
1 1 1 2 1
1:1
1:10
1:100
Nukleinsav hígítási foka
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3
Duna - Dél-Budapest tavasz Duna - Közép-Budapest tavasz Duna - Észak-Budapest tavasz Duna - Dél-Budapest tél Duna - Közép-Budapest tél Duna - Észak-Budapest tél Duna - Dél-Budapest ısz Duna - Közép-Budapest ısz Duna - Észak-Budapest ısz Sebes-Körös - Körösladány Tisza - Tiszakécske
Összes vizsgált
Tisza - Csongrád
*
*
*
Eredmények – Évszakfüggés 100000
E. coli csíraszámváltozása
lg CFU/100mL
10000
ısz
1000
tél 100
tavasz
Vizsgált minták (18):
10 1
Enterococcus sp. csíraszámváltozása
lg CFU/100mL
10000
ısz 100
tél
lg CFU/100mL
2.
Duna – KözépBudapest
3.
Duna - DélBudapest
tavasz 10
1
titerváltozása
Duna – ÉszakBudapest
1000
10000
Szomatikus colifág
1.
1000 ısz 100
tél tavasz
10
1
1
2
3
Következtetések I.
A víruskoncentrálás és kimutatás hatékonyságát enterovírusra igazoltuk ECHO11 vírussal elegyített csapvízzel A két vizsgált víruscsoportból a vízmintákban (35 minta) humán adenovírusokat (21 minta) és norovírusokat (16 minta) sikerült kimutatni
Adenovírusok stabilabbak vizes közegben DNS vírus vs. RNS vírus A minták nem tartalmazták a vizsgált vírusokat Nem megfelelı a módszer(ek) érzékenysége Esetleges inhibíció, amely a hígítás fokának növelésével és bovin szérumalbumin hozzáadásával sem csökkent kellıképpen
Következtetések II.
Az adenovírus vizsgálatok alapján igazolható a vírusok kimutatását gátló anyagok jelenléte
A hígított mintából olyan esetben is detektálni lehetett a vírust, amikor a tömény mintából nem Szennyvízbeömlésnél kisebb hatékonyságú vírusvisszanyerés
Összevetve a vírus és baktérium vizsgálatok eredményeit, elmondható, hogy a humán enterális vírusok jelenléte nem korrelál az indikátor baktériumok magas csíraszámával (Koloska, Kéki-patak) Hasonlóan, a szomatikus colifágok titere sem jelzi megfelelıen a humán enterális vírusok jelenlétét a felszíni vizekben Mind a három mikrobiológiai indikátor nagy koncentrációban volt jelen télen a Dunában, mégis ezekbıl a vízmintákból volt a legkisebb hatékonyságú az enterális vírusok kinyerése ↔ ıszi minták
Kitekintés
A víruskoncentrálást és kimutatást gátló anyagok mennyiségének, illetve a gátló hatás csökkentése
Alkalmazott PCR-k további optimalizálása
Kondíciók Belsı kontroll
Enterovírus, hepatitis A vírus és rotavírus kimutatás Kvantifikálás
Szervetlen ionok (pl.: fémionok) Humuszsavak BSA, glicerin, DTT
Visszanyerés hatékonyságának meghatározása
Mintaspektrum kiszélesítése
A témában megjelent közlemények
Tudományos elıadások
Kern Anita, Kapusinszky Beatrix, Bánfi Renáta, Barna Zsófia, Farkas Ágnes, Dr. Vargha Márta: Vírusok kimutatása magyarországi felszíni vizekbıl – Vízmikrobiológusok VII. Országos Konferenciája, Budapest, 2008. november 18. Kern Anita, Kapusinszky Beatrix, Bánfi Renáta, Barna Zsófia, Farkas Ágnes, Dr. Vargha Márta: Humán patogén vírusok kimutatása – EpiBathe - Záróértekezlet, Budapest, 2009. március 9.
Tudományos poszterek
Kern Anita, Kapusinszky Beatrix, Vargha Márta: Humán patogén vírusok kimutatása magyarországi felszíni vizekbıl – Fiatal Higiénikusok Fóruma, Gyır, 2008. május 28-30. Kern Anita, Kapusinszky Beatrix, Vargha Márta: Humán patogén vírusok kimutatása magyarországi fürdıvizekbıl – Magyar Higiénikus Társaságának XXXVIII. Vándorgyőlése, Balatonvilágos, 2008. szeptember 30 - október 2. Kern A., Kapusinszky B., Banfi R., Barna Zs, Farkas Á., Kadar M., N. Szomor K, Berencsi Gy., Vargha M.: Human pathogen viruses in Hungarian bathing waters – COST929 Current developments in food and environmental virology, Pisa, Olaszország, 2008. október 9-11. Kern Anita, Kapusinszky Beatrix, Vargha Márta: Humán patogén vírusok kimutatása magyarországi felszíni vizekbıl – A Magyar Mikrobiológiai Társaság 2008. évi Nagygyőlése, Keszthely, 2008. október 15-17.
