Hepatitisz vírusok veszélyeztetett populációkban Doktori (PhD) értekezés Tresó Bálint okleveles biológus (MSc)
Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Biológia Doktori Iskola, Immunológia Doktori Program Iskola- és Programvezető:
Prof. Dr. Erdei Anna
Témavezető:
Prof. Dr. Takács Mária, PhD címzetes egyetemi tanár, főigazgató-helyettes
Készült:
Országos Epidemiológiai Központ, 2016.
1. TARTALOMJEGYZÉK 1. TARTALOMJEGYZÉK ............................................................................................................... 2 2. RÖVIDÍTÉSEK ........................................................................................................................... 5 3. BEVEZETÉS ............................................................................................................................... 7 3.1. A Hepatitis C virus ................................................................................................................ 8 3.1.1. A Hepatitis C virus felépítése ............................................................................................. 8 3.1.2. Fogékony szervezetek, gazdasejtek .................................................................................... 8 3.1.3. Kórokozó képesség ........................................................................................................... 10 3.1.4. Immunológiai vonatkozások ............................................................................................. 12 3.1.5. A vírus életciklusa ............................................................................................................. 16 3.1.6. Variabilitás ........................................................................................................................ 16 3.1.7. Terjedés módjai ................................................................................................................. 20 3.1.8. Epidemiológia ................................................................................................................... 22 3.2. A Hepatitis B virus .............................................................................................................. 25 4. CÉLKITŰZÉSEK ...................................................................................................................... 29 5. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK .................................................................................................... 30 5.1. Személyek és vizsgálati anyagok ....................................................................................... 30 5.1.1. BVI (büntetés-végrehajtási intézet)-vizsgálatok ............................................................... 30 5.1.2. DBS (Dried Blood Spots)-vizsgálatok .............................................................................. 31 5.2. Szerológiai vizsgálatok ....................................................................................................... 32 5.2.1. BVI-vizsgálatok ................................................................................................................ 32 5.2.2.DBS-vizsgálatok ................................................................................................................ 32 5.3. Kérdőívek ............................................................................................................................ 33 5.3.1. BVI-vizsgálatok ................................................................................................................ 33 5.3.2. DBS-vizsgálatok ............................................................................................................... 33 5.4. Molekuláris biológiai vizsgálatok ..................................................................................... 34 5.4.1. Nukleinsav izolálás ........................................................................................................... 34 5.4.1.1. BVI-vizsgálatok ............................................................................................................. 34 5.4.1.2. DBS-vizsgálatok ............................................................................................................ 35 5.4.2. Reverz-transzkripció ......................................................................................................... 35 5.4.2.1. BVI-vizsgálatok ............................................................................................................. 35 5.4.2.2. DBS-vizsgálatok ............................................................................................................ 36 5.4.3. PCR ................................................................................................................................... 36 5.4.3.1. BVI-vizsgálatok ............................................................................................................. 36
5.4.3.2. DBS-vizsgálatok ............................................................................................................ 37 5.4.4. Agaróz gélelektroforézis ................................................................................................... 39 5.4.5. Genotipizálás szekvenálást követően ................................................................................ 39 5.4.6. Szubtipizálás Line Probe Assay-vel .................................................................................. 41 5.4.7. Intravénás kábítószer-használókból származó 3a szubtípusú vírusok filogenetikai analízise....................................................................................................................................... 41 5.5. Statisztika ............................................................................................................................ 42 5.5.1. BVI-vizsgálatok ................................................................................................................ 42 5.5.2. DBS-vizsgálatok ............................................................................................................... 42 6. EREDMÉNYEK......................................................................................................................... 44 6.1. BVI-vizsgálatok eredményei ............................................................................................. 44 6.1.1 Szerológiai tesztek és PCR-vizsgálatok eredményei ......................................................... 44 6.1.2. A Hepatitis C virus prevalenciájának elemzése korcsoportonként és nemenként ............ 45 6.1.3. A Hepatitis B virus prevalenciájának elemzése korcsoportonkként és nemenként .......... 48 6.1.4. A kérdőívet kitöltő fogvatartottak korcsoportok szerinti elemzése injekciós droghasználat és HCV-fertőzöttség szempontjából ........................................................................................... 50 6.1.5. A kérdőívet kitöltő fogvatartottak jellemzői és a Hepatitis B virus és egyes kockázati magatartások kapcsolata ............................................................................................................. 52 6.2. DBS-vizsgálatok eredményei ............................................................................................. 53 6.2.1. A szerológiai és PCR-vizsgálatok eredményei ................................................................. 53 6.2.2. A genotípus meghatározás eredményei ............................................................................. 53 6.2.3. A szubtípus meghatározás eredményei ............................................................................. 58 6.2.4. A genotípusok kapcsolata a szerhasználat hosszával és a szerhasználó korával............... 60 6.2.5. Intravénás kábítószer-használókból származó 3a szubtípusú vírusok filogenetikai analízise....................................................................................................................................... 61 7. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK ........................................................................................... 65 8. MEGBESZÉLÉS........................................................................................................................ 67 8.1. BVI vizsgálatok .................................................................................................................. 67 8.1.1. A magyarországi BVI-kben fogvatartottak veszélyeztetett populáció .............................. 67 8.1.2. A magyarországi BVI-kben fogvatartottak között nemzetközi összehasonlításban alacsony a vizsgált vírusok prevalenciája ................................................................................... 67 8.1.3. Nem igazolható foglalkozás-eredetű fertőződés-halmozódás a BVI alkalmazottai körében ............................................................................................................................................... 68 8.1.4. A HCV gyakrabban fordult elő a női fogvatartottak között .............................................. 69 8.1.5. A fogvatartottak között a fiatal életkor korrelál a magas HCV-fertőzöttséggel................ 69 8.1.6. A kérdőívet kitöltő fogvatartottak válaszainak elemzése .................................................. 70
3
8.1.6.1. HCV-antitest pozitív személyek szignifikánsan nagyobb százalékban kerültek ki a droghasználók, különösen az i.v. droghasználók közül .............................................................. 70 8.1.6.2. Az i.v. droghasználók között a korral növekszik a HCV-fertőzöttség ........................... 72 8.1.6.3. A kérdőívet kitöltő fogvatartottak közül egyetlen személy sem bizonyult HIV fertőzöttnek ................................................................................................................................. 73 8.1.6.4. A HBV és a vizsgált kockázati magatartások kapcsolata............................................... 73 8.1.7. Az eredményeket befolyásoló tényezők vizsgálata ........................................................... 74 8.1.8. Fogvatartottak antivirális kezelése .................................................................................... 74 8.2. DBS-vizsgálatok ................................................................................................................. 75 8.2.1. A vizsgált populáció.......................................................................................................... 75 8.2.2. A DBS-minták használhatósága a HCV molekuláris epidemiológiai vizsgálatára az i.v. droghasználó populációban ......................................................................................................... 76 8.2.3. Az i.v. droghasználók között magasabb a 3-as genotípus és az 1a szubtípus előfordulása .. ............................................................................................................................................... 76 8.2.4. Földrajzi különbségek a genotípusok eloszlásában ........................................................... 77 8.2.5. A HCV-genotípusok és a droghasználók korának és a szerhasználat hosszának összefüggései .............................................................................................................................. 78 8.2.6. A kábítószer típusának kapcsolata a genotípusokkal ........................................................ 78 8.2.7. Az átlagos lakosság körében tapasztalt genotípus és szubtípus arányok .......................... 79 8.2.8. Az NS5B-t kódoló nukleotid szekvenciák filogenetikai elemzése ................................... 79 8.2.9. A genotipizálások hatása a klinikusi gyakorlara valamint a droghasználók magatartására .. ............................................................................................................................................... 80 9. ÖSSZEFOGLALÁS .................................................................................................................... 83 10. SUMMARY ............................................................................................................................. 84 11. IRODALOMJEGYZÉK ............................................................................................................ 85 12. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ................................................................................................... 106 13. Adatlap a doktori értekezés nyilvánosságra hozatalához……………………………….....108
4
2. RÖVIDÍTÉSEK ALT
szérum alanin aminotranszferáz/transzamináz
AOR
illesztett esélyhányados (adjusted odds ratio)
BVI
büntetés-végrehajtási intézet
bp
bázispár
CI
megbízhatósági (konfidencia) intervallum
DBS
beszárított vércsepp(ek) (dried blood spot(s))
ELISA
enzyme-linked immunosorbent assay
EMCDDA
European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction
GPT
glutamát-piruvát transzamináz
HBsAg
Hepatitis B virus felületi antigénje (Hepatitis B surface antigen)
HBV
Hepatitis B virus
HCC
hepatocelluláris carcinoma
HCV
Hepatitis C virus
HIV
Human immunodeficiency virus 1 és 2
HIV1
Human immunodeficiency virus 1
HIV2
Human immunodeficiency virus 2
HLA
humán leukocita antigén
ICTV
International Committee on Taxonomy of Viruses
IFN
interferon
IRES
belső riboszóma-belépési hely (internal ribosomal entry site)
i.v.
intravénás
kbp
kilobázispár
5
LIA
line immunoassay
LIPA
line probe assay
OEK
Országos Epidemiológiai Központ
ORF
nyitott leolvasási keret (open reading frame)
PCR
polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction)
PD-1
programmed death-1
PKR
protein kináz-R
RC
replikációs komplex (replication complex)
RIG-I
retinsav indukálta gén-I
SD
szórás (standard deviation)
SR-B1
scavenger receptor B osztály, 1-es típus
SVR
tartós virológiai válasz (sustained virological response)
TBE
Tris-bórsav-EDTA
Tim-3
T-sejt immunoglobulin mucin-3
TLR
toll-like receptorok
UTR
nem transzlálódó régió (untranslated region)
6
3. BEVEZETÉS Doktori munkám során a Hepatitis B virus (HBV) és Hepatitis C virus (HCV) előfordulását, valamint a HCV genotípusainak, szubtípusainak megoszlását vizsgáltam magyarországi veszélyeztetett populációkban. Ezek a vírusok súlyos betegségeket okozhatnak, a magyarországi átlagos lakosság körében viszonylag ritkán fordulnak elő, azonban egyes ún. veszélyeztetett populációkban gyakoriak lehetnek. Veszélyeztetett populációnak tekintjük a vérrel és testváladékokkal terjedő hepatitiszvírusok szempontjából azokat a közösségeket, amelyekben a fertőzést közvetítő rizikótényezők, kockázati magatartások előfordulnak vagy halmozottan fordulnak elő, ezért a HBV és a HCV jelenléte ezekben a közösségekben nagyobb arányú, mint az átlagos lakosság körében. Nemzetközi szakirodalom alapján a HCV és HBV szempontjából veszélyeztetett populációk közül legfontosabbak: a donorok szűrésének bevezetése előtt szervtranszplantációban,
vér,
vérkészítményben
részesülők,
különösen
a
politranszfundáltak, a hemodializáltak, az egészségügyi dolgozók, az intravénás (i.v.) kábítószer-használók, a fertőzöttek szexuális partnerei, gyermekei, a fertőzöttekkel egy háztartásban élők, a tetováltak, pirszinget viselők és a fogvatartottak. Magyarországról nem állt rendelkezésre adat arról, hogy a fogvatartottak között valóban
halmozottan
fordulnak-e
elő
a
vérrel
és
testváladékokkal
terjedő
vírusfertőzések. Munkánk egyik célja az volt, hogy megállapítsuk a hazai büntetésvégrehajtási intézetekre (BVI) jellemző HBV és HCV előfordulási gyakoriságokat. A HBV-fertőzések hátterében fellelhető kockázati magatartások felderítésére is kísérletet tettünk. A HCV-re nézve Tarján Anna szerzőtársam végezte el a kockázati magatartásokra vonatkozó elemzések korcsoportos/nemi bontást nem érintő részét. Vizsgáltuk, hogy a BVI-k dolgozói is veszélyeztetett populációnak számítanak-e a HBV és a HCV szempontjából. A hazai i.v. kábítószer-élvezőkről már korábbi vizsgálatok igazolták, hogy köztük a HCV-fertőzés gyakrabban fordul elő, mint az átlagos lakosság körében, azonban a HCV genotípusainak, szubtípusainak előfordulásáról nem rendelkeztünk információkkal. Ezért célul tűztük ki a HCV-genotípusok, szubtípusok meghatározását és a vírusok evolúciós kapcsolatainak feltárását az i.v. droghasználó közösségben.
7
3.1. A Hepatitis C virus 3.1.1. A Hepatitis C virus felépítése
A Hepatitis C virus (HCV) a Flaviviridae víruscsalád Hepacivirus genusába tartozik. A virionok szférikus szimmetriájúak, körülbelül 50 nm átmérőjűek; a nukleokapszidot a gazdasejt membránjából származó, de virális proteineket is tartalmazó detergens-érzékeny burok (envelope) veszi körül. A nukleokapszid belsejében foglal helyet a vírus genetikai állománya, mely egyszálú pozitív irányultságú ribonukleinsav (RNS). Hossza körülbelül 9,6 kilobázis, 5’ és 3’ végén is nem transzlálódó (UTR) konzervatív régiók találhatók [Tanaka és mtsai, 1996; Wang és mtsai, 1993; Choo és mtsai, 1989]. Az 5’UTR tartalmazza a belső riboszóma-belépési helyet (IRES), ahonnan kiindulva a gazdasejt citoplazmájában egy kb. 3010 aminosavmaradékból álló poliprotein képződik az egyetlen nyitott leolvasási keretről (ORF). Végül ko- és poszttranszlációs módosítások eredményeképpen legalább 11 darab virális fehérje képződik [Major és Feinstone, 1997] (1. táblázat).
3.1.2. Fogékony szervezetek, gazdasejtek
A vírus a vírusgazdát, a Homo sapienst leggyakrabban fertőzött vérrel vagy testváladékkal, perkután sérülés során fertőzi meg. Kísérletesen a közönséges csimpánz (Pan troglodytes) és az északi mókuscickány (Tupaia belangeri) is fertőzhető a vírussal, és bennük is kialakulhat heveny (akut) és idült (krónikus) májgyulladás (hepatitisz) is [Amako és mtsai, 2010]. A vírus legfőbb célsejtjei a hepatociták, bizonyos vizsgálatok szerint azonban Bsejtekben, T-sejtekben, monocitákban, makrofágokban és dendritikus sejtekben is képes szaporodni [Revie és Salahuddin, 2011].
8
aminosavmaradék pozíció az érett poliproteinen*
genom régió vagy fehérje
nukleotid pozíciók*
5' UTR
1-341
C
342-857
1-191/179/182
p21/p19
E1
915-1490
192-383
gp31‡
E2
14912579
384-746
gp70‡
E2-p7
14912768
384-809
p7 NS2 NS3 NS4A NS4B NS5A NS5B 3' UTR
25802768 27693419 34205312 53135476 54776257 62587600 76019374 93759621
fehérje méret (kDa) †
747-809 810-1026
funkció(k) replikáció, transzláció iniciációja strukturális, RNS enkapszidáció strukturális, burokfehérje, receptorkötés, sejtbejutás
strukturális, burokfehérje, receptorkötés, sejtbejutás nem ismert, valószínűleg gp70‡ strukturális vagy prekurzor ioncsatorna, p7 összeszerelődés, kijutás p21/p19 NS2-3 proteáz része
1027-1657
p70
1658-1711
p6
1712-1972
p27
1973-2420
p58
2421-3011
p68
NS2-3 proteáz része, szerin proteáz, helikáz, NTPáz NS3 szerint proteáz kofaktora replikációs komplex része replikációs komplex része RNS dependens RNS polimeráz replikáció, összeszerelődés
1. Táblázat. A Hepatitis C virus genomi és fehérje tulajdonságai Major és Feinstone, 1997 közleménye alapján, módosítva. Rövidítések: * a Hepatitis C virus H törzse alapján. † számos rövid nyitott leolvasási keretet tartalmaz, de polipeptidek képződése kérdéses ‡ N-glikozilált proteinek
9
3.1.3. Kórokozó képesség
Emberben a vírus lappangási ideje általában 14 és 180 nap közé esik. Ritkán alakul ki tünetekkel kísért heveny megbetegedés, a fertőződés leggyakrabban szubklinikai formában zajlik (>70%). A fulmináns, gyors lefolyású, halálos kimenetelű kór igen ritka, de létező jelenség. Az akut hepatitisz tünetei lehetnek a következők: pl. fáradékonyság, étvágytalanság, hányás, hányinger, jobb bordaív alatti fájdalom, hepatosplenomegalia, sárgaság (icterus), viszketés, sötét színű vizelet, világos színű széklet, láz, izületi fájdalmak, makulopapulózus kiütések, illetve bizonyos laboratóriumi eltérések: pl. emelkedett szérum alanin aminotranszferáz/transzamináz (ALT), korábbi nevén glutamát-piruvát transzamináz (GPT) szint, emelkedett szérum aszpartát aminotranszferáz/transzamináz (AST), korábbi nevén glutamát-oxálacetát transzamináz (GOT) szint, a konjugált és nem konjugált szérum bilirubin egyenlő arányú emelkedése, a vérképben leukopénia relatív limfocitózissal, mérsékelt anémia. A jelentős mértékű protrombinszint csökkenés (protrombinidő növekedés) nagymértékű májsejt pusztulásra utal, és rossz prognosztikus jelként értékelendő [Takács és Dencs, 2010; Telegdy és Szalka, 2005]. A fertőzöttek kis százaléka (kb. 20%) képes kezelés nélkül legyőzni a vírust, és vérsavójából/vérplazmájából eltűnik a HCV. A vírus ellen kialakult ellenanyagok hosszú
ideig,
akár
élethosszig
kimutathatók
maradnak
ép
immunrendszerű
személyekben. A ritkán kialakuló akut betegség tüneteit nem lehet teljes bizonyossággal elkülöníteni más kórokozók, különösen vírusok (pl. Hepatitis A virus, Hepatitis B virus, Hepatitis E virus stb.) által okozott hepatitisztől, ezért csak virológiai vizsgálat igazolhatja, hogy a megbetegedés hátterében a HCV áll-e [Telegdy és Szalka, 2005]. A fertőzöttek legnagyobb részében (~80%) a vírus 6 hónapnál tovább is kimutatható marad a vérszérumból/vérplazmából, ezt perzisztens fertőzésnek nevezzük. A perzisztensen fertőzöttek kb. 30%-a a régi felfogás szerint tünetmentes hordozó (tartósan normális ALT mellett HCV PCR pozitív), nagyobb részükben azonban hepatitisz alakul ki. A perzisztens fertőzés következtében kialakult májgyulladást krónikus hepatitisznek nevezzük [Telegdy és Szalka, 2005]. Az ALT normál tartományának értelmezésében lehetnek különbségek az egyes laboratóriumok között, így az említett arány is változhat [Pacifico és mtsai, 2013]. Vizsgálatok igazolták, hogy 10
a korábban tünetmentes hordozóknak hitt személyek több mint felénél (~80%) is kimutatható szövettani módszerekkel májkárosodás, így az úgynevezett valódi tünetmentes hordozók aránya jóval kisebb, mint azt korábban gondolták [Alberti és mtsai, 1992; Barrera és mtsai, 1995; Puoti, 2007; Puoti és mtsai, 2010]. A krónikus hepatitiszes betegek nagy részének (~80%) sincsenek számottevő tüneteik, vagy a tünetek, pl. gyengeség, nem súlyosak, így a betegek általában nem fordulnak orvoshoz. Ezért gyakran csak véradás alkalmával derül ki a fertőzöttség. A sokszor nem specifikus, és csak időnként megjelenő tünetek, pl. fáradékonyság, émelygés, étvágytalanság, viszketés, sötét vizelet, emelkedett ALT a klinikai felismerést nehezítik [Hoofnagle, 1997]. Fontos megjegyezni, hogy a valódi tünetmentes hordozók esetében sem lehet kizárni, hogy idővel krónikus hepatitisz alakul ki [Okanoue és mtsai, 2008]. Az idült májgyulladásban szenvedők kb. 15-30%-ában alakul ki három évtized leforgása alatt májzsugor (cirrózis), melynek során a pusztuló májsejtek helyét fokozatosan kötőszöveti állomány veszi át [Thein és mtsai, 2008]. A cirrózisos betegek évente 1-3%-ában hepatocelluláris karcinóma is kifejlődik [Fattovich és mtsai, 1997], valamint megjelenhetnek a végstádiumú májbetegség tünetei. Ilyen pl. az aszcites, a nyelőcső
és
a
gyomor
visszereinek
kitágulása
(varikozitás,
várixok),
ezek
megrepedésével képződő vérzések, nagyfokú fáradtság, hepatikus enkefalopátia, végül májkóma (a méregtelenítés csökkent mértéke miatt a toxikus anyagok, pl. a fehérjelebontásból felszabaduló ammónia, felhalmozódnak az agyszövetben és eszméletvesztéshez
vezethetnek).
Végstádiumú
májbetegségben
az
egyetlen
gyógyuláshoz vezető beavatkozás a májátültetés lehet [Hoofnagle, 1997]. Napjainkban az Amerikai Egyesült Államokban, Európában és Magyarországon is a májátültetések leggyakoribb oka a HCV-fertőzés következtében kialakult májbetegség [Nemes és mtsai, 2005; Gelley és mtsai, 2013; Thuluvath és mtsai, 2007]. A vírus nemcsak a máj megbetegedéseiben, hanem az ún. extrahepatikus manifesztációk összefoglaló néven ismert egyéb kórformák kialakításában is szerepet játszhat.
A
manifesztáció
bizonyítottan a
kevert
HCV-vel
kapcsolatos
krioglobulinémia
okozta
legfontosabb
extrahepatikus
vaszkulitisz,
melyhez
bőr,
idegrendszeri, nefrológiai és reumatológiai komplikációk társulhatnak. Gyakrabban fordul elő a HCV-fertőzés a következő kórképekben szenvedő betegcsoportokban: pl. B-sejt eredetű non-Hodgkin's limfóma, cukorbetegség, porfíria kutánea tarda, lichen plánusz, de a patomechanizmus - ha egyáltalán létezik a kapcsolat - egyik esetben sem 11
ismert. A HCV-vel kapcsolatba hozott egyéb kórképek a következők: pl. idiopátiás tüdő fibrózis,
autoimmun
pajzsmirigygyulladás,
krioglobulinémiával
kapcsolatos
Sjörgen
szisztémás
szindróma,
vaszkulitisz,
nem
nefropátiák,
glomerulonefritisz, aorta ateroszklerózis [Khattab és mtsai, 2010].
3.1.4. Immunológiai vonatkozások
Az immunrendszer aktiválódása nemcsak a vírus eliminálásában, hanem a HCV által okozott patobiológiai folyamatokban is döntő jelentőségű. A tünetek nagy részéért az immunológiai folyamatok tehetők felelőssé. Ezt támasztja alá az is, hogy a vírus valószínűleg nem közvetlenül citopatogén, vírusszaporodás a sejtek elpusztítása nélkül is végbemehet [Guidotti és Chisari, 2006]. Így akut fertőzés esetén a májsejtkárosodás megjelenése
nem a
vírusszaporodás
kialakulásával,
hanem az
immunválasz
megjelenésével esik egybe [Farci és mtsai, 1996]. Az extrahepatikus manifesztációk hátterében is legtöbbször immunológiai folyamatok állnak, mint pl. immunkomplexek, krioglobulinok kialakulása [Sansonno és Dammacco, 2005]. Legalább háromféle, a májsejtekben is kifejeződő mintázatfelismerő receptorról írták le, hogy képes felismerni a HCV-t és beindítani a megfelelő jelátviteli utakat [Mozer-Lisewska, 2011; Gale és Foy, 2005; Liu és mtsai, 2007]. A (1) retinsav indukálta gén-I (RIG-I)-szerű receptorok (a RIG-I és a melanóma differenciációs antigén 5), melyek a cap-pal nem rendelkező virális RNS-t érzékelik a sejt citoplazmájában; (2) a toll-like receptorok, mint pl. a TLR-3, mely a duplaszálú RNShez kapcsolódik az endoszomális kompartmentben; (3) és egy nem-tradícionális mintázatfelismerő receptor, a protein kináz-R (PKR), mely szintén a duplaszálú RNS-t ismeri fel. A RIG-1 intracelluláris helikáz a virális RNS megkötését követően konformációs
változást
szenved,
jelátviteli
folyamatokat
indít
be,
melyek
eredményeként transzkripciós faktorok aktiválódnak, mint pl. az interferon reguláló faktor-3, valamint a nukleáris faktor kappa B, melyek gyulladásos citokinek
12
megjelenését váltják ki [Loo és Gale, 2011]. A TLR-3 jelátvitelében a TIR-doméntartalmú-interferonβ-indukáló-adaptor fehérjének van központi jelentősége, amely végeredményben szintén interferonok és gyulladásos citokinek termelődését váltja ki. A PKR az RNS kötését követően egyrészt az eukarióta iniciációs faktor-2 foszforilálcióját eredményezi, és leállítja a cap-függő transzlációt, másrészt egy kináz-független jelátviteli kaszkádot is beindít, amely a mitokondriális antivirális jelátvivő fehérje részvételével aktiválja az IFNβ-t és az IFN által stimulált géneket [McAllister és Samuel, 2009; Arnaud és mtsai, 2011]. Annak ellenére azonban, hogy a HCV-t a természetes immunrendszer több komponense is képes érzékelni, a fertőzöttek kb. 80%-a mégsem tudja eltávolítani a vírust a szervezetéből. Kimutatták, hogy a HCV NS3/NS4A proteáza kulcsszerepet játszik az immunológiai folyamatok gátlásában. Képes például lehasítani a mitokondriális antivirális jelátvivő fehérjét az intracelluláris membránokról, gátolva ezzel a RIG-I jelátvitelét és az interferonok képződését [Baril és mtsai, 2009]. Képes továbbá hasítani a TIR-domén-tartalmú-interferonβ-indukáló-adaptor fehérjéket is, gátolva a TLR-3 jelátviteli útvonalát [Li K és mtsai, 2005]. Az NS3/NS4A proteázon kívül az E2 és az NS5A virális fehérjékről is megemlíti az irodalom, hogy képesek negatívan hatni a PKR-re és a PKR jelátvitelére [Gale és mtsai, 1997; Taylor és mtsai, 1999; Noguchi és mtsai, 2001]. A HCV core fehérjéje a STAT3 foszforilációját képes megakadályozni, gátolva ezzel az IFN-α hatását [Larrea és mtsai, 2006]. Mindezek a kölcsönhatások valószínűleg hozzájárulnak a virális perzisztencia kialakításához, fenntartásához. Természetesen a veleszületett immunrendszer fent nem említett komponensei és a HCV kölcsönhatásairól is egyre több információnk van, de ezek ismertetése meghaladná a disszertáció kereteit. Ha az adaptív immunfolyamatokat tekintjük, a HCV-fertőzés során főszereplő celluláris immunrendszer mellett a fertőzés során hamar megjelenő neutralizáló ellenanyagoknak is szerepük van a vírus eltávolításában [Pestka és mtsai, 2007; FafiKremer és mtsai, 2012]. A neutralizáló hatású ellenanyagok nagy része a virális burok (envelope) fehérjéi (E1, E2) ellen termelődik. Az envelope fehérjék azonban nagyon változékonyak, a vírusszaporodás során újabb és újabb változatok jelennek meg a szervezetben (quasispecies), melyekre a korábban kialakult neutralizáló hatású ellenanyagok már nem hatásosak. Ezen kívül a HCV-nek a vérplazmában lévő lipoproteinekkel történő kapcsolódása is akadályozhatja a neutralizáló antitestek általi 13
felismerést egyrészt, mert elfedik a virális epitópokat, másrészt, mert segítik a vírus sejtbe jutását a lipoprotein receptorokon keresztül. Alacsony gammaglobulin vérszinttel járó állapotban lévő betegek vizsgálata alapján valószínűsítik, hogy az antitestek azonban nem feltétlenül szükségesek a HCV-fertőzés felszámolásához [Semmo és mtsai, 2006]. A fertőzések felszámolásában legmeghatározóbb szerepe az adaptív sejtes immunrendszer elemeinek van. Mind a CD4, mind pedig a CD8 pozitív T-sejtek szerepe igazolt. A CD8+ T-sejtek jelentőségét a következő megfigyelések támasztják alá: (1) A CD8+-sejtek megjelenésének ideje korrelációt mutat mind a tünetek megjelenésével, (2) mind pedig a fertőzés felszámolásával [Grüner és mtsai, 2000; a,Cox és mtsai, 2005; Thimme és mtsai, 2002]. (3) Bizonyos humán leukocita antigén (HLA) I osztályú allélek szoros kapcsolatot mutatnak a HCV-fertőzés felszámolásának képességével (pl. A3, B27, Cw*01), illetve a krónikussá válással (pl. B8) [McKiernan és mtsai, 2004]. (4) In vito kísérletek alapján a HCV specifikus CD8+ T-sejtek erős antivirális effektor funkciókra képesek, elsődlegesen IFN-γ közvetítette nem citolítikus módon [Jo és mtsai, 2009]. (5) HCV-vel kísérletesen újrafertőzött csimpánzokban CD8+-sejtek depléciója a vírus folyamatos jelenlétéhez vezetett (annak ellenére, hogy vírusspecifikus memória CD4+ T-sejtek jelen voltak) mindaddig, amíg a CD8+-sejtek újra meg nem jelentek a májban [Shoukry és mtsai, 2003]. Míg a CD8+ T-sejtek a HCV-fertőzés felszámolásának legfőbb effektorsejtjei, a CD4+ T-sejtek központi regulátor szerepét igazolja számos közlemény. A CD4+sejteken belül különösen a T-helper 1-sejtek szerepe meghatározó. A HCV ellen irányuló CD4+ T-sejtes immunválasz köthető a gyógyuláshoz [Diepolder és mtsai, 1995; Schulze zur Wiesch és mtsai, 2005; Aberle és mtsai, 2006]. Másrészt bizonyos HLA II osztályú allélek korrelálnak a fertőzések kimenetelével (pl. a DRB1*1101 és a DQB1*0301 a kedvező kimenetellel) [Hong és mtsai, 2005]. A vírus nagyfokú változékonysága nemcsak az ellenanyagok, hanem a T-sejtes immunválasz elkerülését is lehetővé teszi. A CD4+ T-sejtes epitópokat érintő „escape mutációk” ritkábban fordulnak elő krónikusan fertőzött egyénekben, mint a CD8+ Tsejtes epitópokat érintők [Fuller és mtsai, 2010]. Több kísérletben vizsgáltak adott CD8+ T-sejtes HCV-epitópokat, és azt találták, hogy az „escape mutációk” éveken keresztül vizsgálva is csak 50-70%-ban történnek meg. Felvetődik tehát, hogy valószínűleg egyéb 14
mechanizmusok is szerepet játszanak a T-sejtes funkciók elvesztésében. Számos szerző leírja, hogy krónikus fertőzöttekben megfigyelhető a T-sejtek fukcionális kimerülése, diszfunkciója [b,Cox és mtsai, 2005; Neumann-Haefelin és mtsai, 2008]. Ezen sejtek citokintermelő képessége csökken, rajtuk megnövekedett mértékben mutathatók ki bizonyos gátló receptorok, mint pl. a programmed death-1 (PD-1), a citotoxikus T limfocita antigén-4 (CTLA-4), a T-sejt immunoglobulin mucin-3 (Tim-3) és a 2B4. Kísérletesen bizonyították, hogy a CTLA-4 és PD-1 jelátviteli útjainak együttes gátlását követően a HCV-specifikus T-sejtek képesek visszanyerni funkcióikat. Mint terápiás beavatkozás ez ígéretes lehet a jövőben [Golden-Mason és mtsai, 2007; Golden-Mason és mtsai, 2009; Nakamoto és mtsai, 2009; Schlaphoff és mtsai, 2011]. A T-sejtek funkcionális kimerülése következtében a vírus evolúciója során megjelenő újabb HCVepitópok már nem váltanak ki erős CD8+ T-sejtes választ, szelekciós nyomás híján az újabb epitópokat elkerülő escape mutációk sem gyakran fixálódnak [b,Cox és mtsai]. Azok a T-sejtek, amelyek már nem kapnak stimulust a virális escape miatt, nem mutatják a kimerülés „tüneteit”. Így úgy tűnik, hogy az antigén folyamatos jelenléte az, ami kiváltja a kimerülést perzisztens fertőzés során [Rutebemberwa és mtsai, 2008]. A fentiek alapján úgy tűnik, hogy a fertőzések kimenetelét nagyban befolyásolja a kezdeti immunválasz intenzitása. Ha a „betolakodóval” szemben egy azonnali, erős és komplex, mind veleszületett, mind pedig adaptív komponenseket is magába foglaló, hatékony immunválasz alakul ki, mely elpusztítja a HCV-vel fertőzött májsejteket, a szervezet képes felszámolni a fertőzést. Ez a folyamat azonban gyakran kiterjedt májkárosodást, esetenként súlyos tüneteket, dekompenzációt eredményezhet. Így a túl erős reakció nem biztos, hogy minden esetben jó stratégia. Ha a kezdeti immunválasz gyengébb, kisebb lehet a májkárosodás mértéke, azonban a szervezet azt kockáztatja, hogy a vírus képes lesz kiszabadulni az immunológiai folyamatok gátló hatása alól és immunmoduláló antigénjeinek folyamatos jelenlétével perzisztens fertőzést okozni [Spengler és mtsai, 2013].
15
3.1.5. A vírus életciklusa
A HCV sejtbe jutása igen komplex folyamat, melynek részletei nem teljesen ismertek. A vírus a gazdasejt felszínén lévő glükózaminoglikánokhoz (heparán-szulfát), DC-SIGN-hoz (CD209), L-SIGN-hoz (CD209L) vagy lipoproteidek közvetítésével alacsony sűrűségű lipoprotein (low density lipoprotein, LDL) receptorokhoz kötődhet. Ezt követően az E1 és E2 virális glikoproteinek legalább négy kofaktorral lépnek kölcsönhatásba a klatrin-mediált endocitózist megelőzően. Ezek a kofaktorok: a tetraspanin CD81; a scavenger receptor B osztály, 1-es típus (SR-B1); a klaudin 1 és az okkludin. A virális burok fúziója az endoszómával valószínűleg alacsony pH hatására az E1/E2 heterodimerben előidézett konformációs változások következtében történik meg [Helle és Dubuisson, 2008; Sharma és mtsai, 2011; Cormier és mtsai, 2004]. Ennek során a virális RNS kijut a gazdasejt citoplazmájába, ahol poliprotein szintetizálódik róla, valamint replikálódik. A replikáció – mint ahogyan az a pozitív irányultságú RNS genommal rendelkező vírusokra jellemző – a gazdasejt belső membránjaihoz kapcsoltan megy végbe [Ahlquist és mtsai, 2003], és egy ún. replikációs komplex (RC) felépülésével kezdődik. A RC a megváltozott intracelluláris membránokhoz kötődik, és kialakításában a vírus nem-strukturális fehérjéi, RNS-e és celluláris kofaktorok vesznek részt [Egger és mtsai, 2002; Gosert és mtsai, 2003]. Egy lehetséges modell szerint az endoplazmás retikulum membránjának hólyagszerű betüremkedéseiben foglalnak helyet a RC komponensei [Quinkert és mtsai, 2005].
3.1.6. Variabilitás
A vírus genomja nagyon variábilis, a genom replikációját végző RNS-dependens RNS-polimeráz – feltételezhetően random módon – hibákat vét, melyeket hibajavító aktivitás híján nem is korrigál. A mutációk lehetnek előnytelenek vagy letálisak, neutrálisak, illetve előnyösek a vírus szempontjából. A HCV genomban vannak olyan szakaszok, melyekben a mutációk nagy része előnyös a vírus szempontjából, ilyen pl. az
16
E2 fehérje hipervariábilis 1 régiója, amely a vírus felszínén foglal helyet és a humorális immunrendszer kikerülésében fontos. A vírusnak filogenetikai elemzések alapján 7 genotípusát (genotípus 1-7) és 82 szubtípusát különítik el [Smith és mtsai, 2014, Murphy és mtsai, 2007, International Committee
on
Taxonomy
of
Viruses
weboldal:
http://talk.ictvonline.org/ictv_wikis/w/sg_flavi/56.hcv-classification.aspx]. A különböző genotípusok egymástól 31-33%-ban térnek el nukleotid szinten. A genotípusokon belül megkülönböztetett szubtípusok legalább 15%-ban eltérnek egymástól nukleotid szinten, jelölésük a genotípust jelző arab számot követő kisbetűvel, betűkkel történik. A második táblázatban a jelenleg elfogadott genotípusokat, szubtípusokat (confirmed subtypes) tüntettem fel (2. táblázat).
17
Szubtípus
Génbanki azonosító
Szubtípus
Génbanki azonosító
1a 1c 1e 1h 1j 1l 1n
Genotípus 1 M62321, M67463 1b D14853, AY051292 1d KC248194, KJ439769 1g KC248198, KC248199 1i KJ439773 1k KC248193, KC248197 1m KJ439775, KJ439781
2a 2c 2e 2i 2k 2m 2r
Genotípus 2 D00944, AB047639 2b D50409 2d JF735120 2f DQ155561 2j AB031663 2l JF735111, JX227967 2q JF735115 2t
D10988, AB030907 JF735114 KC844042, KC844050 HM777358 JF735113 KC197235, KC197240 FN666428, FN666429 KC197238
3a 3d 3g 3i
Genotípus 3 D17763, D28917 3b KJ470619 3e JX227954, JF735123 3h FJ407092, JX227955 3k
D49374 KJ470618 JF735121 D63821, JF735122
4a 4c 4f 4k 4m 4o 4q 4t 4w
Genotípus 4 Y11604 4b FJ462436 4d EF589161, EU392175 4g EU392173, FJ462438 4l FJ462433 4n FJ462440 4p FJ462434 4r FJ839869 4v FJ025855, FJ025856
D90208, M58335 KJ439768 AM910652, KJ439770 KJ439772 KJ439774 KJ439778, KJ439782
FJ462435 DQ418786, FJ462437 FJ462432 FJ839870 FJ462441 FJ462431 FJ462439 HQ537009, JX227959
18
Szubtípus
Génbanki azonosító
Szubtípus
5a
Genotípus 5 Y13184, AF064490
6a 6c 6e 6g 6i 6k 6m 6o 6q 6s 6u 6w 6xb 6xd
Genotípus 6 Y12083, AY859526 6b EF424629 6d DQ314805 6f D63822 6h DQ835770 6j D84264 6l DQ835767 6n EF424627 6p EF424625 6r EU408329 6t EU246940 6v DQ278892, EU643834 6xa JX183552, KJ567645 6xc még nem közölt 6xe
Génbanki azonosító
D84262 D84263 DQ835760 D84265 DQ835769 EF424628 DQ278894, DQ835768 EF424626 EU408328 EF632071, EU246939 EU158186, EU798760 EU408330, EU408332 KJ567651 JX183557
Genotípus 7 7a
EF108306
2. Táblázat: Elfogadott Hepatitis C virus genotípusok és szubtípusok a 2014 novemberi állapot alapján. Az egyes szubtípusok mellett a referencia-törzseik génbanki azonosítóját is feltüntettem. Forrás: International Committee on Taxonomy of Viruses weboldal: http://talk.ictvonline.org/ictv_wikis/w/sg_flavi/56.hcv-classification.aspx
19
Magyarországon a Dr. med. Gervain Judit vezette munkacsoport vizsgálatai nyomán tudjuk, hogy az 1999 és 2001 között Hepatológiai Centrumokban megjelent HCV-hordozókban milyen genotípusú/szubtípusú vírusok fordultak elő. Az összesen 400 vizsgált páciens 85%-ában az 1b, 4,5%-ában az 1a, 4%-ában 1a+1b együtt, 0,5%ában 1a+1b+2 együtt, 2%-ában 1b+2 együtt és 0,5%-ában a 3-as genotípus volt kimutatható. A fertőzöttek 3,5%-ában több mint három szubtípus egyidejű jelenlétét valószínűsítették [Gervain és mtsai, 2003]. Hasonló genotípus eloszlást írtak le DélMagyarország vonatkozásában is azzal a különbséggel, hogy több genotípus együttes előfordulását nem figyelték meg [Müller és mtsai, 2003]. A magyarországi veszélyeztetett populációk HCV-genotípusairól azonban még semmilyen információval nem rendelkeztünk.
3.1.7. Terjedés módjai
A HCV-vel történő megfertőződés egyik leghatékonyabb módja a fertőzött vérrel történő perkután sérülés. A vírus terjedhet vérátömlesztéssel, vérkészítményekkel (pl.
véralvadási
faktorok
adásával),
szervátültetéssel.
1992
második
felétől
Magyarországon is bevezették a donorok HCV-ellenanyag szűrését, így napjainkra az ilyetén való terjedés csak nagyon ritkán fordul elő [Héjjas és mtsai, 1994]. Egyes országokban azonban továbbmentek, és az ablakperiódus csökkentése érdekében a vírus direkt kimutatását is elvégzik a véradók mintáiból, tovább csökkentve a terjedés valószínűségét [Offergeld és mtsai, 2005]. Napjainkban a világ csaknem minden részén, így Európában is, a HCV az i.v. droghasználók körében terjed a legnagyobb mértékben [Fontaine J és mtsai, 2011, CDC, 2011, Daniels és mtsai, 2009, AGDoHA, 2011, Xia X és mtsai, 2008, Basu D, 2010]. Ennek legfőbb útja az, amikor egy injekciós tűt/fecskendőt többen használnak egymás után. Azonban kimutatták azt is, hogy nemcsak az injekciós tű/fecskendő megosztása, hanem a drog „elkészítése” során használt különböző segédeszközök (pl. a drog összekeveréséhez és felmelegítéséhez használt kiskanál, vagy a drog megszűréséhez használt filter) megosztása is szerepet játszhat a vírus terjesztésében. Sőt, mivel a világ egyes részein a felvilágosító
20
kampányok és tűcsere programok eredményeképpen a használt tű/fecskendő megosztása háttérbe szorult, e segédeszközök szerepe felértékelődött a HCV-fertőzés terjesztésében [Hagan és mtsai, 2001, Hagan és mtsai, 2010]. Érdekes megfigyelés, hogy a drognak nemcsak az i.v. bejuttatása lehet felelős virális fertőzések átviteléért. Több vizsgálat is megállapította, hogy a nem-intravénás droghasználók körében magasabb arányban fordult elő a HCV, mint a nem droghasználók
között.
Felvetették,
hogy
ennek
oka
valószínűleg
a
heroin
felszippantásához használt segédeszközök (pl. szívószál vagy bankjegy), illetve a meggyújtott crack-kokain füst beszívásához használt pipa egymás közti megosztása lehet [Conry-Cantilena és mtsai, 1996, Scheinmann és mtsai, 2007]. Előfordulhat még fertőződés pl. a kórház-higiéniás szabályok figyelmen kívül hagyása esetén egészségügyi beavatkozások alkalmával (jatrogén infekciók); tetoválás során, testékszerek behelyezésekor, pedikűrözés/manikűrözés során, ha nem tartják be az aszeptikus munkavégzésre vonatkozó szabályokat; szexuális úton, különösen homoszexuális kapcsolatban, ahol hámsérülés gyakrabban fordul elő. A vírus terjedhet anyáról gyermekre szüléskor, ill. foglalkozás körében elszenvedett baleset során. Így egészségügyi dolgozók tűszúrásos balesetekor, mely leggyakrabban akkor következik be, amikor a dolgozó a használt tűt vissza kívánja helyezni a kupakjába, ezért ezt megtenni szigorúan tilos [Lauer és Walker, 2001; MacDonald és mtsai, 1996; Clarke és Kulasegaram, 2006; Bánhegyi és mtsai, 2003]. Fertőzött egyénekben a vírus jelenlétét azonban nemcsak vérben, hanem a különböző testváladékokban is kimutatták, mint pl. ondóban, női nemi váladékban, nyálban, vizeletben, izzadságban, anyatejben stb. Testváladékokkal történő terjedés általában csak ritkán fordul elő, bár nem teljesen kizárható. Az Egészségügyi Minisztérium szakmai protokollja pl. nem tartja ellenjavalltnak a HCV fertőzött anya számára a szoptatást, mivel a vírus anyatejjel történő átvitelére nincs kielégítő bizonyíték [Liou és mtsai, 1992, Ruiz-Extremera és mtsai, 2000, Ortiz-Movilla és mtsai, 2002, Bélec és mtsai, 2003, EM, 2009]. Meg kell azonban jegyezni, hogy szoptatás során hámsérülések is keletkezhetnek, melyek vérzéssel is járhatnak. Látható vérzés esetén a szoptatást a protokoll szerint is fel kell függeszteni, a mell gyógyulásáig a lefejt tej sem használható fel.
21
3.1.8. Epidemiológia
A HCV átlagos lakosság körében mérhető prevalenciájában jelentős földrajzi különbségeket tapasztalunk. A legmagasabb, akár 5%-ot is meghaladó értékek figyelhetők meg pl. Egyiptomban, Közép-Nyugat-Afrikában, Pakisztánban és Mongóliában. A lakosság kevesebb mint másfél százaléka fertőződött a vírussal Kínában,
Észak-Amerikában
és
az
európai
államok
többségében,
köztük
Magyarországon is [Gower és mtsai, 2014] (1. ábra).
1. Ábra. A Hepatitis C virus előfordulása a világ országaiban Gower és munkatársai nyomán, 2014.
22
Magyarországon az akut és a krónikus HCV által okozott májgyulladás is bejelentendő az Országos Epidemiológiai Központ Járványügyi Osztályának. 2006-tól 2010-ig 126 darab akut HCV hepatitisz bejelentés érkezett. A minden esetben elvégzett járványügyi vizsgálat 70 esetben derített fel rizikó tényezőt a fertőződést megelőző fél évben. A 70-ből 20 esetben (28,6%) i.v. droghasználat igazolódott az anamnézisben [dr. med. Csohán Ágnes engedélye alapján, Országos Epidemiológiai Központ, Járványügyi Osztály]. Egy 2008-as becslés szerint az Európai Unióban kb. 750 000 – 1 millió aktív i.v. droghasználó él, mely a teljes lakosság kb. 0,26%-a [EMCDDA, 2010]. Ezt a becslést azonban fenntartásokkal kell kezelnünk, mivel a 27 tagállamból mindössze 12 tagállam adatainak a figyelembevételével készült, azonban Norvégiát pl. belevették a számításokba, de Észtországot nem, mert onnan kiugró adatok érkeztek. Az is valószínű, hogy azok száma, akik nem rendszeresen, de életük során valaha már injektáltak drogot, ennél is magasabb [Sweeting és mtsai, 2009]. A legtöbb országból azonban nem állnak rendelkezésre erre vonatkozó adatok [EMCDDA, 2010]. Magyarországon is nagyon keveset tudunk az aktív injekciós droghasználók számáról. Az aktív ópiát használók számát 3500-ra teszik, ami kb. 0,05%-a a 18–64 éves magyar lakosságnak [Bozsonyi és mtsai, 2010]. Becsléseik szerint Magyarországon 6000 i.v. kábítószer-használó él, ami a 18–64 éves magyar lakosság kb. 0,08%-a [Bozsonyi és mtsai, 2010]. Az anti-HCV-ellenanyag prevalencia injekciós droghasználók között szinte mindig magasabb, mint a normál populációban: kb. 35% a Cseh Köztársaságban, 46% Horvát Köztársaságban, 76% Varsóban, a Lengyel Köztársaság fővárosában. Ezekben az országokban az átlagos populációban 1% alatti HCV-prevalenciákról számoltak be [Kolarić és mtsai, 2010; Vilibic-Cavlek és mtsai, 2015; Zabransky és mtsai, 2006; Laskus és mtsai, 1992; Gower és mtsai, 2014]. Az egyéb vérrel és testváladékokkal terjedő vírusfertőzéseket tekintve a Hepatitis B virus (HBV) hordozók aránya injekciós kábítószer-használók között 0,8%-nak adódott a Horvát Köztársaságban, 12%-nak Varsóban [Kolarić és mtsai, 2010; Laskus és mtsai, 1992]. A Human immunodeficiency virus 1 és 2 (HIV1 és HIV2, együttesen HIV) előfordulása a környező volt szocialista országok veszélyeztetett populációiban nem túl magas [EuroHIV, 2007, Kolarić és mtsai, 2010]. Az utóbbi években azonban Romániában a HIV-pozitív esetek halmozódását figyelték meg i.v. kábítószer-használók között [Niculescu és mtsai, 2015]. 23
Magyarországon 6 évvel ezelőtt az i.v. kábítószer-használók között a HCVprevalenciája magasabb volt (22,6% vs. <1%), míg a HBV (0,5%) és HIV (0%) %-os előfordulása nem különbözött jelentősen az általános népességétől [Cserszegi és mtsai, 2009]. Napjainkban mind a mért anti-HCV-ellenanyag, mind a HIV-pozitívak aránya növekszik a magyarországi i.v. droghasználók körében [Dudás és Csohán, 2015]. Külföldi felmérések arra utalnak, hogy a HCV és más vérrel és testváladékokkal terjedő vírusfertőzések - pl. HBV és HIV - szempontjából a büntetés-végrehajtási intézetek (BVI) magas kockázatú környezetek. Egyrészt, mivel a kábítószer-használat, illetve egyes országokban a prostitúció büntetendő cselekmény, azok, akik élnek velük, gyakrabban kerülnek BVI-be. Másrészt, a BVI-ben eltöltött idő alatt a fogvatartottak gyakran élnek úgy szexuális életet, hogy nem védekeznek a fertőzésekkel szemben, mivel a BVI-ben az óvszer nem mindig elérhető. A BVI-ben az i.v. droghasználók gyakran megosztják egymás között a fecskendőt/tűt, ill. az egyéb segédeszközöket, mint pl. a drog felmelegítésekor használt teáskanalat vagy a feloldáshoz használt vizet, mivel azok elérhetősége is limitált a zárt környezetben [Allwright és mtsai, 2000, Stark és mtsai, 1997]. A díszítő jelleggel készített tetoválások és bőrkarcolások is gyakoriak a BVI-kben [Hellard és mtsai, 2007]. Világszerte számos közlemény született, amelyek azt bizonyítják, hogy a BVIben magasabb arányban fordulnak elő a vérrel és testváladékokkal terjedő vírusfertőzések, mint az átlagos lakosság körében [Allwright és mtsai, 2000, Long és mtsai, 2001, Horne és mtsai, 2004, Hennessey és mtsai, 2009, Massad és mtsai, 1999, Weild és mtsai, 2000, Babudieri és mtsai, 2005, Meyer és mtsai, 2007, b,Mahfoud és mtsai, 2010]. A környező volt szocialista országokban csak kevés vizsgálat foglalkozott a vérrel és testváladékokkal terjedő vírusfertőzések prevalencia értékeinek becslésével a BVI-kben [Burek és mtsai, 2010; Staneková és mtsai, 2001; Caban és mtsai, 1990; a,
Nazare és mtsai, 2011; b,Nazare és mtsai, 2011]. Magyarországról nem találtunk ilyen
adatokat.
24
3.2. A Hepatitis B virus Eredményeim kisebb része kapcsolatos a Hepatitis B virussal (HBV), így a bemutatását a Hepatitis C virusénál kevésbé részletesen fogom megtenni. A HBV a Hepadnaviridae család Orthohepadnavirus genusának típusfaja. A vírus részlegesen kettősszálú, a HCV-nél jóval kisebb, ~3,2 kilobázis hosszúságú DNS-genommal rendelkezik. A genom cirkuláris formában van jelen a virionokban, melyet a 2 DNS szál 5’végeinek rövid komplementer szakaszai tesznek lehetővé [Summers és mtsai, 1975]. A genomot, a virális és sejt eredetű fehérjéket a 240 core protein által létrehozott ikozahedrális nukleokapszid veszi körül. A vírus a HCV-hez hasonlóan lipidburokkal rendelkezik, melybe a HBV felületi antigénjei épülnek be. A virionok (Danerészecskék) átmérője ~40-50 nm [Dane és mtsai, 1970]. A vérben azonban a Dane-részecskéknél nagyobb számban fordulnak elő szubvirális, ~22 nm-es pálca vagy gömb alakú részecskék. Ezek csak lipidmembránba ágyazott felületi fehérjékből állnak, nem tartalmazzák a virális genomot és nem fertőzőek. A napjainkban Hepatitis B surface Antigen (HBsAg) néven ismert fehérje korábban Australia antigén elnevezéssel terjedt el a szakirodalomban, mivel először egy ausztráliai őslakos véréből mutatták ki. A Hepadnavírusok reverz transzkriptázt kódolnak és a retrovírusokhoz hasonlóan replikálódnak, azzal a különbséggel, hogy a Hepadnavírusoknál először a gazdasejt magjában a sejt javító-mechanizmusai segítségével egy kovalensen zárt cirkuláris DNS minikromoszóma jön létre, melyről az RNS képződik [Summers és Mason, 1982; Bock és mtsai, 2001]. A pregenomiális RNS templátot másolva hozza létre a reverz transzkriptáz a DNS-genomot. A HCV-vel ellentétben nem egyetlen RNS átirat és poliprotein képződik, a HBV nem kódol proteázt. A minikromoszómákról 4 különböző promóter segítségével (core, S1, S2 és X) 4 fő, részben átfedő RNS (precore/pregenom, preS1, preS2/S és X) szintetizálódik. Az RNS-ekről 7 különböző protein keletkezik: (1) a polimeráz (reverz transzkriptáz, RNáz H aktivitás és primer), (2) a preCore protein, melyről az N-terminális szignálpeptid és a pozitív töltésű Cterminális domén levágódik, a maradék ún. e antigénként=HBeAg kerül szekrécióra a fertőzött sejtekből (immunfolyamatok gátlásában tulajdonítanak neki szerepet), (3) a core protein (a nukleokapszid egysége), (4) az X fehérje (minikromoszóma
25
transzkripcióját segíti) és a három burokfehérje [Wasenauer és mtsai, 1992], azaz, (5) az L (large, M+preS1), (6) az M (medium, S+preS2) és (7) az S (small). A M- és Lproteinekben található extra domaineket a preS2 és preS1-nek nevezik (2. ábra).
2. Ábra. A Hepatitis B virus genomja, RNS-ei és fehérjéi. A legbelső körön a genomiális nukleotidok számozása van feltüntetve, 0-tól 3182-ig. Kijjebb a negatív (-strand) és pozitív (+strand) DNS-szálak láthatók, a szaggatott vonal jelzi, hogy a kódoló szál nem teljes. A DNS-re rajzolt geometriai elemek a különböző promótereket és enhancereket mutatják. Legkívül, tömör nyilakkal jelölve az RNSátiratok figyelhetők meg (a 3,5 kilobázis hosszú PreCore/Pregenom, a 2,4 kilobázis hosszú PreS1, a 2,1 kilobázis hosszú PreS2/S és a 900 báziosos X). Vékony nyilakkal és az AUG startkodonokkal jelölve a fehérje domainek szerepelnek.
26
A HBV a HCV-hez hasonlóan májsejteket fertőz, receptora a sejtek bazolaterális membránjában kifejeződő nátrium-taurokolát-kotranszporter polipeptid. Emberen kívül ugyancsak képes megfertőzni a közönséges csimpánzt [Zuckerman és mtsai, 1978], a gorillát [Linnemann és mtsai, 1984], az orángutánt [Warren és mtsai, 1999], a gibbont [Bancroft és mtsai, 1977], a makákót (Macaca fascicularis) [Dupinay és mtsai, 2013] és az északi mókuscickányt [Walter és mtsai, 1996]. A vírus kórokozóképessége az emberben hasonló a HCV-hez, ritkán akut, gyakrabban krónikus májgyulladást, majd májzsugort és májrákot képes okozni. A májat érintő betegségeken kívül extrahepatikus manifesztációk is előfordulhatnak, mint pl.
a
poliarteritisz
nodosa,
főként
gyermekekben
glomerulo-nefritisz,
a
szérumbetegségszerű arteritisz-dermatitisz prodróma. A Gianotti-Crosti-szindrómával és a kevert krioglobulinémiával felmerült kapcsolat ellentmondásos [Han, 2004]. Ha a fertőződés újszülött korban történik, perzisztens fertőzés akár az esetek 90%-ban is kialakulhat, míg felnőttkorban ez a szám kb. 10%-ra tehető. 1982 óta áll rendelkezésre aktív védőoltás a HBV ellen, melynek következtében a globális prevalencia némileg csökkent, ennek ellenére világszerte ~240 millió vírushordozó személy él napjainkban [Ott és mtsai, 2012; Lavanchy, 2012, Meireles és mtsai, 2015]. Az Egészségügyi Világszervezet adatai alapján évente ~620 000 ember hal meg a vírusfertőzés következtében (2002-es becslés). Magyarországon 1999-ban indult és azóta is megszakítás nélkül tart egy HBV vakcinációs program egy oltássorozat beadásával. Ennek keretében először elvégzték az általános iskola 8. osztályos tanulóinak kötelező védőoltását, amelyet 2009 óta a 7. osztályra helyeztek át [Straub és mtsai, 1999; Csohán és mtsai, 2009]. A HBV elleni oltóanyag egyben az első rák ellenes vakcina is az emberiség történetében. A fertőződés vér és testváladékok közvetítésével történhet, a veszélyeztetett populációk nagyban átfedőek a HCV esetében említettekkel, pl. i.v. kábítószerhasználók. A HBV-nél jelentős a vertikális átvitel: anyáról gyermekre történő terjedési mód, mely főként szüléskor és nem az anyaméhben töltött idő alatt következik be. Nemzetközi adatok alapján anyáról újszülöttre történő fertőzés valószínűsége az anya HBeAg pozitívitása esetében 65-78%, míg eAg negatív, de HBsAg pozitív anyáknál 923% [Wong és mtsai, 2014]. A HCV-nél sokkal jelentősebb a HBV esetében a szexuális úton történő átvitel, a nemzetközi irodalom ezért a vírust a szexuálisan terjedő 27
fertőzések
(STI-k)
csoportjában
is
említi.
Világszerte
sok
országban,
így
Magyarországon is 1995-ben bevezették a várandósok kötelező szűrését HBV-re (HBsAg), valamint a kiszűrt vírushordozók újszülöttjeinek közvetlenül a szülést követő aktív és passzív védőoltását. Az újszülöttek védőoltása a terjedés ezen módját a pozitív anyákról ~0,5%-ra csökkentette le. A Hepatitis B virus hordozók aránya eltérő a világ különböző területein [Ott és mtsai, 2012]. A legmagasabb 8%-t is eléri a HBV prevalencia a szubszaharai északnyugat-afrikai országokban. Magas, 5-7% a vírus előfordulása pl. Dél- és Dél-KeletAfrikában, Dél-Kelet-Ázsiában, Kazahsztánban, Grúziában, Azerbajdzsánban. Közepes, 2-4% pl. Oroszországban, Ausztráliában, Indiában, Észak-Afrikában, Nyugat-DélAmerikában, Kelet-Európában. Alacsony, 2% alatti pl. Észak-Amerikában, Brazíliában, Nyugat- és Észak-Európában és Magyarországon is. Mivel a HBV súlyos megbetegedéseket okozhat és a létező antivirális terápia (nukleozid analógok, interferon-α) csökkenti a betegségek progresszióját [You és mtsai, 2014], fontos a már fertőzött személyek, a „tünetmentes” hordozók felkutatása, kiszűrése is. Számukra nemcsak a kezelés lehetőségét kell biztosítani, hanem olyan információkkal is el kell látni őket, amelyekkel megakadályozható, hogy további személyeknek adják át a vírust. A „tünetmentes„ vírushordozók felkutatása legeredményesebben a rizikócsoportokban lehetséges, így a veszélyeztetett populációk és a rizikótényezők megismerése kulcsfontosságú.
28
4. CÉLKITŰZÉSEK Célul tűztük ki, hogy meghatározzuk (1) a magyarországi büntetés-végrehajtási intézetekben (BVI) fogvatartottakra jellemző HCV- és HBV-prevalenciát, hogy megállapítsuk, vajon a magyarországi BVI-kben fogvatartottak is a vérrel és testváladékokkal terjedő vírusfertőzések szempontjából veszélyeztetett populációk közé sorolhatóak-e, (2) az említett vírusfertőzések mutatnak-e életkori vagy nemre jellemző sajátosságokat a magyarországi BVI-kben, (3) az általános népességhez viszonyítva a vizsgált fertőző betegségek szempontjából jelent-e plusz kockázatot az, ha valaki a BVI személyzetéhez tartozik, (4) milyen kockázati magatartások játszhatnak fontos szerepet a HBVfertőzöttség terjesztésében, (5) a magyarországi i.v. kábítószer-használók körében előforduló HCVgenotípusok arányait, (6) a magyarországi i.v. kábítószer-használókban az egyes HCV-szubtípusok előfordulási arányait, (7) az egyes genotípusok, szubtípusok mutatnak-e valamilyen jellegzetes eloszlást földrajzi szempontból, (8) a különböző genotípusok jelenléte mutat-e összefüggést a kábítószer-élvezők életkorával és a használt szer típusával, (9) filogenetikai törzsfa készítésének segítségével a magyarországi i.v. drogosok HCV-ei milyen evolúciós viszonyban vannak a külföldön megszekvenált vírusokkal.
29
5. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 5.1. Személyek és vizsgálati anyagok 5.1.1. BVI (büntetés-végrehajtási intézet)-vizsgálatok
2007 júniusa és 2009 júniusa között 20 magyarországi BVI-ben történt meg a vérminták begyűjtése. Mind a 7 tervezési-statisztikai régióból érkeztek minták (KözépMagyarország,
Közép-Dunántúl,
Nyugat-Dunántúl,
Dél-Dunántúl,
Észak-
Magyarország, Észak-Alföld, Dél-Alföld). A BVI-k földrajzilag fedték az ország szinte teljes területét. A fogvatartottak és a BVI alkalmazottai a mintavétel előtt rövid ismeretterjesztő jellegű előadást hallgattak meg a szűrőprogram céljairól és az egyes vérrel és testváladékokkal terjedő vírusfertőzésekről. A szűrésben való részvétel önkéntes alapon történt. A részvételi arány növelése érdekében élelmiszertartalmú ajándékcsomagokat osztottak ki az együttműködő személyeknek. A fogvatartottak közül 4 894 egyén jelezte, hogy részt kíván venni a programban, mely a teljes fogvatartotti populáció (14 331) 34,2%-a volt. Közülük 9,2% volt nő, míg a teljes fogvatartotti populáció 6,7%-a volt nő. A BVI-ben dolgozó személyzet részére is felajánlottuk a szűrőprogramban való részvételt. Közülük 1 066-an jelezték, hogy részt akarnak venni a programban, ami a teljes személyzeti létszám 13,4%-a volt. Az együttműködő 1 066 munkavállaló 52,2%-a volt nő. A résztvevők életkora 21 és 60 év közé esett mind a fogvatartottak, mind pedig a BVI személyzete esetén. A vérvétel után a natív vérmintákat lecentrifugáltuk, és a vérsavókat -20 °C-on tároltuk. A kiolvasztott vérsavókból az enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) vizsgálatokat követően a nukleinsav izolálást még a kiolvasztás napján megkezdtük. Az ELISA-vizsgálatok ideje alatt (kb. 3-4 óra) a vérsavókat +4 °C-on tartottuk.
30
5.1.2. DBS (Dried Blood Spots)-vizsgálatok
2006-tól 2011-ig 15 magyarországi város 22 drogambulanciáján, ill. tűcsere programjában megjelent i.v. kábítószer-élvezőket kértek fel arra, hogy vegyenek részt vizsgálatainkban. A részvételi arány javítása érdekében a kábítószer-élvezőknek az együttműködésért csekély értékű étkezési utalványt ajánlottak fel. A szűrésben való részvétel önkéntes alapon történt. Összesen 2 133 i.v. droghasználó jelezte, hogy részt kíván venni a programban, mert kíváncsi a HCV-, HBV-, ill. HIV-szerostátuszára. Az együttműködő személyek ujjbegyéből kapilláris vérmintát vettek a drogambulanciákon, ill. a tűcsere programokban dolgozó munkatársak egyszer használatos vérvételi lándzsák segítségével. A kicseppenő vért szűrőpapíron (MachereyNagel GmbH, Duren, Germany) fogták fel, majd a vércseppeket beszárították (DBS, a dried blood spots angol kifejezésből). A beszárítást úgy végezték, hogy a különböző személyektől
levett
vércseppek
egymással
ne
érintkezhessenek,
ne
kontaminálódhassanak. A beszárítást követően a DBS-mintákat beszállították az OEK Hepatitisz Vírusok Nemzeti Referencia Laboratóriumába, ahol azokat -20 °C-ra helyeztük a vizsgálatok megkezdéséig. Amennyiben egy adott i.v. kábítószer-használó többször is mintát adott, a statisztikai analízisek során csak egy mintáját vettük figyelembe. Összehasonlításul 2006 és 2011 között 89 antivirális kezelésben nem részesült HCV-hordozó személytől (a továbbiakban: átlagos lakosság) vénást vért gyűjtöttünk be.
31
5.2. Szerológiai vizsgálatok 5.2.1. BVI-vizsgálatok
Kereskedelmi forgalomban kapható CE jelzésű in vitro diagnosztikumokkal, a gyártók előírásai szerint végeztük az ELISA-vizsgálatokat. Anti-HCV-ellenanyagok kimutatására a HCV Ab (Dia.Pro) ELISA reagens-készletet, a HBV felületi antigénjének (HBsAg) kimutatására a Hepanostika HBsAg Ultra kitet (Biomerieux) használtunk. A HCV specifikus ellenanyagok jelenlétének megerősítésére HCV Ab ELISA-kitet, illetve a HCV Inno-LIA line immunoassay (LIA)-kitet (Innogenetics) alkalmaztunk. A HBsAg jelenlétének megerősítését Hepanostika HBsAg Ultra Confirmatory (Biomerieux) reagensekkel végeztük.
5.2.2.DBS-vizsgálatok
A DBS-mintákat kivágtuk a szűrőpapírokról, és a 200 µl 0,05% TWEEN 20-at és 0,08% Na-azidot tartalmazó PBS-be helyeztük eppendorf csövekben. Vortexelést követően az eppendorf csöveket +4 °C-ra helyeztük egy éjszakára eluálás céljából. Anti-HCV-ellenanyagok kimutatására a HCV Ab (Dia.Pro) ELISA-szűrőkitet használtuk. A szűrőteszttel reaktívnak bizonyult mintákat a HCV Ab ELISA-kitettel, illetve a HCV Inno-LIA line immunoassay (LIA)-kitettel (Innogenetics) verifikáltuk.
32
5.3. Kérdőívek 5.3.1. BVI-vizsgálatok
A programban 2008 júniusa után részt vevő fogvatartottaknak 7 BVI-ben biztosítottuk a lehetőséget, hogy kitöltsenek egy kérdőívet, amely a vérrel és testváladékokkal terjedő vírusfertőzések szempontjából fontos kockázati magatartásokra vonatkozó kérdésekből állt. A kérdőívet Tarján Anna szerzőtársam állította össze a European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction (EMCDDA) ajánlásainak figyelembe vételével, valamint az adatok felvételét és kezelését is Tarján Anna irányította. A kérdőív kitöltése nem volt kötelező, a válaszok megtagadása nem vonta maga után a szűrésből történő kizárást. A kérdőíven személyes adatok nem kerültek feltüntetésre, csak egy egyedi azonosító szám, mely a mintán és a vizsgálatkérő lapon is szerepelt. Az űrlapokon lévő válaszokat személyhez köthetően nem hoztuk a BVI-k tudomására, erről a fogvatartottakat is biztosítottuk. Összesen 1 553 rab töltötte ki a kérdőívet, saját kezűleg.
5.3.2. DBS-vizsgálatok
A programban csak az az i.v. kábítószer-élvező vehetett részt, aki hajlandó volt kitölteni egy kérdőívet a droghasználattal kapcsolatos magatartásokról. A kérdőívet dr. med. Dudás Mária szerzőtársam állította össze a European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction (EMCDDA) ajánlásainak figyelembe vételével, valamint az adatok felvételét és kezelését is dr. med. Dudás Mária irányította. A kérdőív kitöltésekor a jelenlévő szociális munkás segítségét is igénybe lehetett venni. A kérdőíven, ill. a szűrőpapíron személyes adatok nem kerültek feltüntetésre, csak egy egyedi azonosító kód. Az azonosító kód segítségével kapcsoltuk össze a 33
meghatározott HCV-genotípust/szubtípust az adott személy kérdőívén szereplő válaszokkal.
5.4. Molekuláris biológiai vizsgálatok 5.4.1. Nukleinsav izolálás
5.4.1.1. BVI-vizsgálatok
A nukleinsav izolálást QIAmp MineluteTM virus Spin Kittel (QIAGEN) végeztük, amely egy szilika alapú nukleinsav izoláló kit. A nukleinsav tisztítás folyamatát mintánként 200 µl kiindulási vérsavóból a gyártó utasításainak betartásával végeztük. Az üvegfelület illeszkedő különböző
eppendorf centrifugában használható kis oszlopokba
szilika-gél membrán formájában van jelen. A szilika-gél membránt oldatokkal
(lizátum+binding
puffer,
mosópufferek,
eluáló
oldat)
centrifugálási lépések során mossuk át. A proteináz K-enzimet is alkalmazó feltárást követően a nukleinsavak a dehidratáló hatású alkohol és magas kaotróp sókoncentráció hatására az oldatból adszorbeálódnak a szilika (üveg) felületekhez. A poliszaharidok, lipidek és fehérjék nem kötődnek jelentős mértékben a szilikához. A nem kötődött anyagok sorozatos mosási lépések során eltávolításra kerülnek. A tiszta nukleinsavak ezután 35 µl alkoholmentes, alacsony só-koncentrációjú puffer és melegítés hatására eluálódnak az üvegfelületről. A kapott RNS-t is tartalmazó nukleinsav oldatot -70oC-on tároltuk.
34
5.4.1.2. DBS-vizsgálatok
A vércseppekből a totál RNS kivonását, izolálását a fenol-kloroformos extrakció, majd az alkoholos nukleinsav precipitáció elvét alkalmazva végeztem. TRI REAGENT BD-t (Sigma) használtam, amely fenolt és guanidin-tiocianátot tartalmaz, és lizálóként, denaturálószerként is funkcionál. A szűrőpapírból kivágott vércseppet eppendorf csőben 500 µl TRI REAGENT BD (Sigma) oldatba helyeztem, majd hozzáadtam 166 µl RNáz és DNáz-mentes vizet (Gibco) valamint 14 µl 5 N-os ecetsavat (Reanal) a savas kémhatás biztosításához. A csöveket 2 percig vortexeltem, majd 1 órán keresztül szobahőn inkubáltam. Ezt követően ismételten 2 perc vortexelés után 133 µl kloroformot adtam hozzájuk. 2 perc vortexelést majd centrifugálást (12 000 g 15 perc 4oC) követően három fázis alakult ki. Alul a szerves hidrofób fázis található, mely pl. a hidrofób zsírokat, denaturálás után hirofóbbá vált fehérjéket tartalmazza. Felül a vizes fázis látható, mely az RNS-t tartalmazza. Az RNS nirogénbázisaival enyhén savas pH-n is képes hidrogén-hidakat képezni a vízmolekulákkal. A két fázis között az úgynevezett interfázis van, amelyben a DNS helyezkedik el. A DNS töltése savas pH-n neutrálissá válik, és már nem képez hidrogén-hidakat a vízmolekulákkal. A vizes fázisból az RNS-t izopropanollal precipitáltam, és 75%-os etil-alkohollal mostam a gyártó ajánlásának megfelelően centrifugálási lépések mellett. Az etanol elpárologtatását követően az RNS-t 8 µl RNáz/DNáz-mentes vízben (Gibco) oldottam fel.
5.4.2. Reverz transzkripció 5.4.2.1. BVI-vizsgálatok
A virális RNS komplementer DNS-sé (cDNS) történő átírásához az Applied Biosystems által forgalmazott GeneAmp RNA PCR-kitet és reagenseket használtuk. A kitleírástól az alábbiak szerint tértünk el: 23 µl végtérfogat mellett minden egyes dezoxiribonukleozid-trifoszfátot (dNTP) 0,3 mM végső koncentrációban alkalmaztunk. Az egy mintára összemért reagensek a következők voltak: 2 μl 10x PCR puffer II (100
35
mM Tris-HCl, pH=8,3; 500 mM KCl) + 4 μl 25 mM-os MgCl2 + 0,75 μl 10 mM dATP + 0,75 μl 10 mM dCTP + 0,75 μl 10 mM dGTP + 0,75 μl 10 mM dTTP + 1 μl random hexamer (50 μM) + 1 μl RNáz inhibitor (20 U/μl) + 1 μl egér leukémia vírus reverz transzkriptáz (50 U/μl). Tizenegy µl RNS-oldatot vittük be a reverz-transzkripcióba. A reakciót 42 °C-on végeztük 15 percig, majd az enzimet 99 °C-on 5 perc alatt inaktiváltuk. A cDNS-oldatokat -20 °C-on tároltuk.
5.4.2.2. DBS-vizsgálatok
A virális RNS komplementer DNS-sé (cDNS) történő átírásához az Applied Biosystems által forgalmazott GeneAmp RNA PCR-kitet és reagenseket használtam. A kitleírástól az alábbiak szerint tértem el: 20 µl végtérfogat mellett minden egyes dezoxiribonukleozid-trifoszfátot (dNTP) 0,4 mM végső koncentrációban alkalmaztunk. Az egy mintára összemért reagensek a következők voltak: 2 μl 10x PCR puffer II (100 mM Tris-HCl, pH=8.3, 500 mM KCl) + 4 μl 25 mM-os MgCl2 + 0,75 μl 10 mM dATP + 0,75 μl 10 mM dCTP + 0,75 μl 10 mM dGTP + 0,75 μl 10 mM dTTP + 1 μl random hexamer (50 μM) + 1 μl RNáz inhibitor (20 U/ μl) + 1 μl egér leukémia vírus reverz transzkriptáz (50 U/ μl). Mind a 8 µl RNS-oldatot bevittük a reverz-transzkripcióba. A reakciót 42 °C-on végeztük 15 percig, majd az enzimet 99 °C-on 5 perc alatt inaktiváltuk. A cDNS-oldatokat -20 °C-on tároltuk.
5.4.3. PCR
5.4.3.1. BVI-vizsgálatok
A vérsavókban jelenlévő HCV nukleinsavának kimutatását a reverztranszkripciót követően – a vírus 5’UTR régiójára specifikus, az irodalomban közölt primerek segítségével [Dencs és mtsai, 2011] – nested polimeráz láncreakcióval (PCR) végeztük, mely minden ismert genotípus kimutatására alkalmas. Ezt korábban nemzetközi körkontrollban való részvételekkel bizonyítottuk. A PCR-hez Sigma REDTaq ReadyMixet használtunk. Az első köri PCR-ben a primereket 1-1 µM-os a 2. 36
köri PCR-ben 0,4-0,4 µM-os végkoncentrációkban alkalmaztuk. A cDNS-oldatból az első köri PCR-be 10 µl-t vittünk be, a másod köri PCR-be az első köriből pedig 3 µl-t, 50-50 µl végtérfogatok mellett.
5.4.3.2. DBS-vizsgálatok
A vércseppekeben esetlegesen jelenlévő HCV nukleinsavának kimutatását a reverz-transzkripciót követően a vírus 5’UTR régiójára specifikus nested PCR-rel, a BVI-vizsgálatoknál leírt módon végeztem el. A HCV 3a szubtípusú törzseinek filogenetikai vizsgálatához a vírus NS5B fehérjéjét kódoló nukleinsav-régiójának szekvenciáit használtam fel. Az NS5B fehérjéjét kódoló nukleinsav szakaszra az irodalomban találtam specifikus primereket [Cochrane és mtsai, 2002], melyeket azonban módosítottam referencia törzsek (D17763, D28917, AF046866, D49374, D63821) szekvenciáinak figyelembevételével, hogy lehetőleg minden 3-as genotípusú HCV-hez kötődjenek. Az általam tervezett primerek szekvenciáit a 3. táblázatban tüntetem fel a PCR-körülményekkel együtt.
37
2. PCR
1. PCR
Lépés
1. PCR
Pozíció 8503-8526 9071-9050 8555-8574 9032-9011
0:30 1:00 2:00 6:00
94 45 68 68
1
40
72
94 50 72
6:00
0:36 0:21 1:30
Idő (min:sec)
2. PCR
1
25
Ciklusszám
Primer nukleotidsorrendje 5’-ACA ATC ACT TGT TAC ATC AAR GCC-3' 5’-TCT ACT GGA GAG TAA CTG TGG A-3' 5'-GGR ACC CGG ACT TTC TTG TC-3' 5’-CCA TGG AGT CTT TCA ATG ATT G-3'
Hőmérséklet Hőmérséklet Idő Ciklusszám (°C) (°C) (min:sec)
Irány Sense Antisense Sense Antisense
3. Táblázat. A HCV NS5B régiójára specifikus nested PCR primerei (A) és körülményei (B) A primerek pozícióit a génbankban
Denaturáció Annelláció Lánchosszabbítás Végső lánchosszabbítás
Lépések
NS5B
Régió
D17763-as számon (accession number) nyilvántartott 3a szubtípusú referencia törzs szekvenciájához történt illesztéssel határoztam meg.
B
A
5.4.4. Agaróz gélelektroforézis Azt, hogy a PCR során képződött-e termék, illetve hogy a termék a megfelelő nagyságú-e, agaróz gél-elektroforézissel ellenőriztük. Két %-os agaróz gélt készítettünk 1X Tris-bórsav-EDTA (TBE) puffer (50 mM TRIS + 42 mM bórsav + 0,5 mM NaEDTA)
segítségével,
mely
375
ng/ml
végkoncentrációban
etídium-bromidot
tartalmazott. Az elektroforézis során 100 bázispáros (bp) molekulahossz kontrollt is alkalmaztunk (100 bp DNA Step Ladder, Promega) referenciának. A Sigma REDTaq ReadyMixszel készült PCR-termékekhez nem kellett felvivő festéket (loading dye-t) keverni, mivel a Ready-mix eleve tartalmazza a felvivő festékben lévő vegyületeket. Ezek a vegyületek egyrészt olyan fajsúlyt biztosítottak az oldatnak, amely segítette a minták zsebek aljára jutását, másrészt a piros festék révén látható fényben is nyomon tudtuk követni az elektroforézis állását. A DNS negatív töltéssel rendelkező molekula, mely az elektroforézis során a pozitív pólus felé vándorol. Minél nagyobb méretű a DNS, annál lassabb a vándorlás. Vándorlása során hozzá kötődnek a gélben lévő etídium-bromid molekulák, így az elekroforézis végeztével UV-fénybe helyezve azok fluoreszkálásukkal jelzik a gélben a DNS-molekulák helyzetét. A referenciaként alkalmazott molekulahossz kontrollhoz hasonlítva hozzávetőlegesen megállapítható a termék hossza, így annak specifikus volta is.
5.4.5. Genotipizálás szekvenálást követően Az 5’UTR PCR termékeit a Viogene PCR-M kitjével (Viogene, New Taipei City, Taiwan) tisztítottuk meg a sóktól, primerektől, a Taq polimeráztól és a dNTP-től. A módszer szilika alapú. Az üvegfelület mikro-centrifugában használható kis oszlopokba illeszkedő szilika-membrán formájában van jelen. Dehidratáló hatású alkohol és magas kaotróp sókoncentráció hatására az oldatból a 100 bp-tól 10 kbp hosszúságú nukleinsavak adszorbeálódnak a szilika (üveg) felületekhez. Majd akár 95%-uk visszanyerhető alacsony só-koncentrációjú puffer segítségével. Az így tisztított termékeket vittem be a szekvenálási PCR reakciókba. A reakciót követően a termékeket
etanolos precipitációval tisztítottam, majd a kapilláris elektroforézist és a detektálást MegaBACE 1000 (Amersham Biosciences) szekvenáló berendezésen végeztem el. A szekvenálási PCR-hez a Sanger-féle – dideoxi-nukleotidokat alkalmazó – láncterminációs elven működő DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kitet (General Electric Company) használtam a gyártó leírása szerint. A kitben a 4 különböző nukleozid-trifoszfát fluoreszceinnel és 4 különböző rodamin típusú festékkel van jelölve. Lézerfény hatására a fluoreszcenin (donor) gerjesztődik és átadja a gerjesztési energia egy részét a rodamin típusú festékeknek (akceptor festékek). A 4 különböző rodamin 4 különböző hullámhosszúságú fényt bocsájt ki, melyet a szekvenáló készülék detektál. Ezek jelzik, hogy mely nukleotid okozta a lánchosszabbítás megállását, mivel a láncba épült jelölt dideoxi-nukleotidokhoz további nukleozid-trifoszfátok nem tudnak kapcsolódni, a lánc szintézise megáll. A jelölt dideoxi-nukleozid-trifoszfátok mellett természetesen jelöletlen deoxinukleozid-trifoszfátokat is alkalmaztunk. Így biztosítható volt, hogy a szintézis ne álljon meg azonnal, hanem különböző hosszúságú termékek keletkezzenek. Minden vírust „oda-vissza” (sense és antisense primer használatával különkülön) is megszekvenáltam, ha szükséges volt többször is, hogy végül manuálisan kijavíthassam a gép által leolvasott szekvenciákat. A kijavított szekvenciákról a primereket levágtam. A kapott szekvenciákat a javítást követően a Clustal W internetes, online elérhető program [Thompson és mtsai, 1994] segítségével a 2. táblázatban látható egyes referencia törzsek szekvenciáihoz illesztettem. Ezt követően a Molecular Evolutionary Genetics Analysis (Mega) software 5 segítségével a neighbor-joining (szomszéd összevonó) módszert [Saitou és Nei, 1987; Tamura és mtsai, 2011] alkalmaztam arra, hogy a vizsgált szekvenciák közötti evolúciós kapcsolatokat feltárjam, a genotípusokat meghatározzam. Az evolúciós távolságokat a program a Maximum Composite Likelihood-módszer alkalmazásával állapította meg [Tamura és mtsai, 2004]. Ezerismétléses bootstrap vizsgálattal ellenőriztem a törzsfák topológiáját, azaz, hogy mennyire befolyásolták sztochasztikus hatások [Felsenstein J, 1985].
40
5.4.6. Szubtipizálás Line Probe Assay-vel A HCV szubtipizálását kereskedelmi forgalomban kapható in vitro diagnostic medical device jelzésű Line Probe Assay (LIPA; Siemens Versant HCV Genotype 2.0 Assay) alkalmazásával végeztem a gyártó utasításai szerint. A gyártó szerint a kit alkalmas a HCV 1-6 genotípusainak és több mint 15 szubtípusának meghatározására. A kit virális RNS-ből indul ki. A reverz transzkripciót követően a vírus 5’UTR és core régiójára specifikus biotinilált primerek segítségével PCR-t végeztem. A keletkezett és denaturált termékeket 50 °C-on hibridizáltattam olyan nitrocellulóz csíkokhoz, melyekre a HCV különböző szubtípusainak nukleotid szekvenciái voltak felvive. A hibridizált szekvenciákat – mosási lépéseket követően – sztreptavidinhez kapcsolt alkalikus foszfatáz és 5-bromo-4-kloro-3-indollilfoszfát + nitroblue tetrazólium kromogén szubsztrátok segítségével tettem láthatóvá (lilásbarna csapadék keletkezett). Leolvasó kulcs segítségével állapítottam meg az adott mintában jelenlévő szubtípust.
5.4.7. Intravénás kábítószer-használókból származó 3a szubtípusú vírusok filogenetikai analízise A 3a szubtípusú HCV-törzsek filogenetikai analíziséhez az ns5b régióra tervezett PCR termékeinek nukleotid szekvenciáit használtam fel. Huszonöt, random módon kiválasztott, 3a szubtípust hordozó hazai intravénás kábítószer-használóból amplifikált HCV ns5b PCR terméket az 5.4.5-ös fejezetben leírt módon megtisztítottam és megszekvenáltam. A javított szekvenciákat egyenlő hosszúságúra vágtam (420 nukleotid bázis hosszúra). A National Center for Biotechnology Information (NCBI) Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) internetes kereső algoritmust használva 3-as genotípusú HCV-szekvenciákat kerestem. Tizenegy országból 49 HCV ns5b szekvenciát gyűjtöttem össze a törzsfa készítéséhez. Ezek között nem volt Magyarországról származó, mivel egyetlen Magyarországról közölt szekvencia sem szerepelt az adatbázisban. A 49 letöltött szekvencia hivatkozási számai (accession numbers) a következők: FJ872277, GU814264, FJ024237, EU710377, DQ363095, DQ363092, EU710360, AY100070, AY100056, AY948166, FJ024207, FJ024204,
41
AY948160, FJ024250, FJ024249, FJ242248, FJ024238, AY948161, DQ898023, D14306, FJ024201, EF523598, AY100043, EU710441, AY100040, AY948162, FJ024217, EU710457, GQ356206, EU710426, AY100062, AY100061, FJ386781, FJ386790, DQ898022, EU710430, EU710428, DQ897988, DQ898018, D14308, EU081503, EU081319, FJ462955, EU081483, GQ285047, D28917, AY100032, AY100028, EU710371. MultAlin többszörös szekvenciaillesztő programmal [Corpet, 1988] egymáshoz illesztettem a szekvenciákat. A FindModel programcsomag, internetes felület használatával állapítottam meg az illesztés eredményét felhasználva, hogy melyik evolúciós modell írja le legjobban az adatainkat. A FindModel programcsomag a ModelTest elvén működik, és PAUP* programokat is használ [Posada és Crandall, 1998, Swofford, 2002]. Az analízis a Jukes-Cantor szubsztitúciós modellt választotta ki. A törzsfákat Maximum Likelihood-módszerrel, a PhyML 3.0 programot használva készítettem el [Guindon és Gascuel, 2003]. A törzsfa topológiájának megbízhatóságát 1000 ismétléses bootstrap vizsgálattal határoztam meg. Egy 3b szubtípusú referencia törzs (accession number: D49374) szekvenciáját használtam külcsoportként (outgroup).
5.5. Statisztika 5.5.1. BVI-vizsgálatok A statisztikai valószínűségek meghatározására χ2-tesztet, Fisher egzakt tesztet, logisztikus regressziót, likelihood ratio tesztet alkalmaztunk. A p<0,05 értékeket tekintettük szignifikáns különbségek jelzőinek. Az elemzéseket a STATA 11 software (StataCorp. 2010. Stat Statistical Software: Release 11. College Station, TX: StataCorp LP) illetve Microsoft Excel segítségével végeztük el.
5.5.2. DBS-vizsgálatok Minden statisztikai analízist a STATA 11 software (StataCorp. 2010. Stat Statistical Software: Release 11. College Station, TX: StataCorp LP) használatával 42
készítettünk el. A vizsgálatban részt vevő személyek kiindulási jellemzőit (mint például a korukat, a nemüket, a vizsgálatba belépéskori földrajzi helyüket, a kábítószerhasználati szokásaikat, azaz hogy milyen típusú szert használnak, illetve hogy mióta kábítószer-használók) és a belőlük kimutatott HCV-genotípusokat és szubtípusokat χ2teszt, valamint kis elemszám esetén Fisher egzakt teszt segítségével hasonlítottuk össze. Ezt követően kétváltozós Mantel–Haenszel summary χ2 analízist is végeztünk, hogy feltárjuk az esetlegesen előforduló zavaró hatásokat (confounding). A hatásmódosító tényezőket (effect modifing) esélyhányadosok és homogenitási teszt felhasználásával vizsgáltuk meg. A többváltozós logisztikus regressziós modellt használtuk az illesztett (adjusted) esélyhányadosok és a 95%-os megbízhatósági (konfidencia) intervallum kiszámításához. A statisztikai értékelések során csak a p<0,05 értékeket tekintettük szignifikáns különbségek jelzőinek.
43
6. EREDMÉNYEK 6.1. BVI-vizsgálatok eredményei 6.1.1. Szerológiai tesztek és PCR-vizsgálatok eredményei A 2007 júniusa és 2009 júniusa között 20 magyarországi büntetés-végrehajtási intézetben tartózkodó 4 894 vizsgált fogvatartott közül 72 bizonyult HBsAg pozitívnak és 241 személy anti-HCV-antitest pozitívnak. Ez HBsAg esetén 1,5%-os, anti-HCVellenanyag esetén 4,9%-os szeroprevalenciát jelent. Az anti-HCV-antitest pozitív személyek vérének 74%-ában detektáltuk HCV RNS jelenlétét a vírus 5’UTR-jére specifikus nested PCR-vizsgálattal. A vizsgált 1 066 BVI személyzet esetén a HBsAg prevalencia 0,4%-nak, az antiHCV szeroprevalencia pedig 0,5%-nak adódott. A fogvatartottakat és a személyzetet összevetve elmondható, hogy mind a HBsAg
(p=0,005),
mind
pedig
az
anti-HCV-antitest
prevalencia
(p<0,001)
szignifikánsan magasabb volt a fogvatartottak körében. Az említett szignifikáns különbségek korra és nemre történt adjusztálás után is kimutathatók maradtak. A HBsAg és anti-HCV-ellenanyag prevalencia különbözött a fogvatartottak között az egyes BVI-kben. A legmagasabb anti-HCV-antitest prevalenciát Budapesten mértük, ami 10,8% volt (N=777), a legalacsonyabbat 0% (N=170) egy, az ország keleti részén található BVI-ben. A legmagasabb 2,5% (N=277) és legalacsonyabb 0% (N=58) HBsAg prevalenciát is vidéki BVI-ben mértük. A 4 HBV hordozó BVI-dolgozó esetében nem mutatható ki halmozódás, míg az 5 HCV-vel fertőzött dolgozó közül 4 ugyanazon BVI-ben volt alkalmazásban ott, ahol egészségügyi intézmény is működik (4. táblázat).
44
fogvatartott
BVI-ben dolgozó
anti-HCV-ellenanyag Maximum: Minimum:
4 894/241 (4,9%)* 777/84 (10,8%) 170/0 (0%)
1 066/5 (0,5%)*
HBsAg Maximum: Minimum:
4 894/72 (1,5%)** 277/7 (2,5%) 58/0 (0%)
1 066/4 (0,4%)**
4. Táblázat. A fogvatarottak és a BVI-ben dolgozók Hepatitis B virus (HBsAg) és Hepatitis C vírus (anti-HCV-ellenanyag) fertőzöttségi adatainak összehasonlítása. Azon BVI-k prevalencia adatait is feltüntettem, melyekben a legnagyobb illetve, legkisebb értékeket kaptuk. *p<0,001 és **p=0,005.
6.1.2. A Hepatitis C virus korcsoportonként és nemenként
prevalenciájának
elemzése
A korcsoportokra és nemekre lebontott prevalencia adatainkat az 5. táblázatban foglaltuk össze. Nemekre bontva az elemzéseinket azt tapasztaltuk, hogy a fogvatartott nők között szignifikánsan gyakrabban fordul elő a HCV, mint a fogvatartott férfiak között (egzakt p=0,016; korra illesztve p<0,001; AOR: 3,33; 95% CI: 1,95-5,68). A BVI női dolgozói között is gyakoribb a HCV előfordulása, mint a BVI-ben dolgozó férfiak között, azonban ez statisztikailag nem alátámasztható. A nemeket korcsoportonként összevetve is mindig a rabnők között magasabb a mért HCV-prevalencia, kivéve a legidősebb korcsoportot (bár ebben a korcsoportban kevés nő szerepelt). Szignifikáns különbség azonban csak a 31-40 év közötti rabnők és rab férfiak között mutatható ki (egzakt p=0,033). Mind a férfiak, mind pedig a nők körében a fogvatartottak között szignifikánsan magasabb a HCV prevalenciája, mint BVI dolgozói között (egzakt p<0,001; korra 45
adjusztálva p=0,001; AOR: 25,04; 95% CI: 3,50-178,99 és egzakt p<0,001; korra adjusztálva p=0,034; AOR: 4,37; 95% CI: 1,12-17,04). A nemeken belül és korcsoportonként vizsgálva a HCV fertőzöttség szempontjából a különbségeket a dolgozók és a fogvatartottak között, megállapíthatjuk, hogy a különbség csak az 50 évnél fiatalabb nők és a 40 évnél fiatalabb férfiak esetén szignifikáns. Mind a férfi, mind a nőnemű rabok között a kor előrehaladtával csökken a HCV prevalenciája, férfiak esetében a lineáris trend statisztikailag is kimutatható (p<0,001). Statisztikailag releváns különbséget azonban csak a 21 és 30 éves fogvatartott férfiak és az egyéb korcsoportok között mutattunk ki. Az egyéb férfi korcsoportok között nincsenek statisztikailag szignifikáns különbségek e tekintetben. A női fogvatartottak esetén azonban egyik korcsoport HCV prevalenciája sem különbözött szignifikánsan bármelyik másik női korcsoportban mérttől. Ugyanez mondható el mind a férfi, mind a női BVI-ben dolgozó személyek korcsoportjainak elemzéséről is.
46
életkor (évek)
rab férfiak száma
HCVszeropozitívak száma (%)
BVI-ben dolgozó férfiak száma
HCVszeropozitívak száma (%)
21-30
1 457
93 (6,4%)
136
0 (0%)
31-40
1 773
77 (4,3%)
270
0 (0%)
41-50
888
30 (3,4%)
74
0 (0%)
51-60
328
8 (2,4%)
30
1 (3,3%)
összesen
4 446
208 (4,7%)*
510
1 (0,2%)
életkor (évek)
rab nők száma
HCVszeropozitívak száma (%)
BVI-ben dolgozó nők száma (%)
HCVszeropozitívak száma (%)
21-30
112
11 (9,8%)
79
0 (0%)
31-40
169
14 (8,3%)
216
1 (0,5%)
41-50
118
7 (5,9%)
151
1 (0,7%)
51-60
49
1 (2,0%)
110
2 (1,8%)
összesen
448
33 (7,4%)*
556
4 (0,7%)
5. Táblázat. A fogvatartottak és a büntetés-végrehajtási intézetekben (BVI) dolgozó nem rabok HCV-szeroprevalencia adatai kor és nem szerinti bontásban. *egzakt p=0,016; korra illesztve p<0,001; AOR: 3,33; 95% CI: 1,95-5,68)
47
6.1.3. A Hepatitis B virus korcsoportonként és nemenként
prevalenciájának
elemzése
A korcsoportokra és nemekre lebontott prevalencia adatainkat a 6. táblázatban foglaltuk össze. Nemekre bontva az elemzéseinket azt kaptuk, hogy mind a férfiak, mind pedig a nők között nagyobb százalékban fordul elő a HBsAg hordozás a fogvatartottak körében, mint a BVI nem rab dolgozói között. Az egyváltozós analízis a férfiak esetében statisztikailag szignifikáns különbséget mutatott (egzakt p=0,043), azonban korra történt illesztést követően a p 0,064-nek (AOR: 3,79; 95% CI: 0,9315,54) adódott. A nőkre vonakoztatva nem kaptunk szignifikáns külünbséget. A HBsAg-hordozás szempontjából korcsoportonként és nemenként vizsgálva a különbségeket a dolgozók és a fogvatartottak között, megállapítottuk, hogy egyik korcsoport között sincs szignifikáns eltérés sem a nők, sem a férfiak között. A 21 és 30 éves fogvatartott férfiak között minden egyéb férfi korcsoporthoz viszonyítva szignifikánsan alacsonyabb a HBV előfordulása. Ez éppen ellentétes azzal, mint amit a HCV esetében találtunk, hiszen a HCV-fertőzés éppen ebben a korcsoportban a leggyakoribb. Az egyéb férfi korcsoportok között nincsen kimutatható különbség a HBsAg-hordozás tekintetében. A női fogvatartottakat vizsgálva a 31-40 és a 41-50 évesek között szignifikáns különbség adódott (egzakt p=0,046). A többi női korcsoport esetén nem volt szignifikáns különbség a HBV-hordozás tekintetében. A dolgozók esetén sem a nők, sem a férfiak esetén nem kaptunk szignifikáns különbségeket a HBV-hordozás tekintetében az egyes korcsoportokat összevetve. A kapott különbségek alapján a 21-30 éves rabok korcsoportját két részre bontottam. Azokra, akik még a HBV elleni kötelező vakcináció bevezetése előtt születtek, és azokra, akik az után. Magyarországon 1999-ben vezették be kötelező jelleggel az általános iskolák 8. osztályos tanulóinak aktív védőoltását HBV ellen. Ezen tanulók nagy része 1985. június 1-e után született [Straub és mtsai, 1999]. Azóta az oltás folyamatos, csak korábbi életkorra tevődött át (általános iskola 7. évfolyam). Természetesen az is elképzelhető, hogy néhányan (tapasztalataink alapján elenyésző számban) az általam nem oltottnak valószínűsítettek közül mégis oltottak voltak, mivel az oltás már forgalomban volt az országban 1999-et megelőzően is. Az oltottak közé 386 személy került, közülük egy (0,3%) volt HBsAg-pozitív. A nem oltottnak valószínűsítettek közé 1183 főt soroltam, akik közül 9 (0,8%) volt HBVhordozó. A nem oltottnak valószínűsítettek között több mint kétszer gyakrabban fordult 48
elő a HBsAg-hordozás, azonban a különbség statisztikailag nem igazolható (p=0,467) a nemek szerinti bontás után sem.
életkor (évek)
rab férfiak száma
HBV-hordozók száma (%)
BVI-ben dolgozó HBV-hordozók férfiak száma száma (%)
21-30
1 457
10 (0,7%)
136
0 (0%)
31-40
1 773
31 (1,8%)
270
1 (0,4%)
41-50
888
15 (1,7%)
74
0 (0%)
51-60
328
10 (3,1%)
30
1 (3,3%)
összesen
4 446
66 (1,5%)
510
2 (0,4%)
életkor (évek)
rab nők száma
HBV-hordozók száma (%)
21-30
112
0 (0%)
79
0 (0%)
31-40
169
1 (0,6%)
216
0 (0%)
41-50
118
5 (4,2%)
151
1 (0,7%)
51-60
49
0 (0%)
110
1 (0,9%)
összesen
448
6 (1,3%)
556
2 (0,4%)
BVI-ben dolgozó HBV-hordozók nők száma (%) száma (%)
6. Táblázat. A fogvatartottak és a büntetés-végrehajtási intézetekben (BVI) dolgozó nem rabok HBsAg-prevalencia adatai kor és nem szerinti bontásban.
49
6.1.4. A kérdőívet kitöltő fogvatartottak korcsoportok szerinti elemzése injekciós droghasználat és HCV-fertőzöttség szempontjából A kérdőívet kitöltők átlag életkora 35,5 év (SD=9,6; medián=34; range=39), míg a BVI-ben eltöltött átlagos idő 2,7 év volt (SD=2,2; median=2; range=26), és 85,8%-uk volt férfi. A mért adatokból megállapítható, hogy minél fiatalabb korcsoportba tartozik egy fogvatartott, annál valószínűbb, hogy saját bevallása szerint életében legalább egyszer már élt intravénás kábítószerrel (trend p<0,001, nemre adjusztálva). Az i.v. kábítószerrel kapcsolatba került személyek között azonban a kor előrehaladtával, az első három korcsoportot vizsgálva kimutatható a HCV-fertőzöttség egyre fokozottabb mértékű előfordulása (trend p=0,005, nemre adjusztálva). Ugyanez a trend mondható el azokról a személyekről is, akik azt vallották, hogy soha életükben nem injektáltak magukba kábítószert (trend p=0,005, nemre adjusztálva). Minden elvégzett trend analízist likelihood ratio teszttel is megerősítettünk. A HCV-fertőzöttség csak a legfiatalabbak korcsoportjában tért el szignifikánsan (egzakt p=0,012, nemre illesztve p=0,012; AOR: 1,85; 95% CI: 1,14-2,99) a 4 894 fogvatartott elemzésénél bemutatott értékektől (7. táblázat).
50
561
560
309
123
1553
21-30
31-40
41-50
51-60
összesen
62 (4,0%)
5 (4,1%)
10 (3,2%)
26 (4,6%)
21 (3,7%)
HCV szeropozitív
209 (13,5%)
0 (0,0%)
14 (4,5%)
76 (13,6%)
119 (21,2%)
injektált kábítószert (%)
47 (22,5%)
0 (0,0%)
6 (42,9%)
22 (29,0%)
19 (16,0%)
5 (4,1%) 15 (1,1%)
1 344 (86,5%)
4 (1,4%)
4 (0,8%)
2 (0,5%)
123 (100%)
295 (95,5%)
484 (86,4%)
442 (78,8%)
köztük HCV nem injektált köztük HCV szeropozitív (%) kábítószert (%) szeropozitív (%)
nő, bár a droghasználók között minden korcsoportban jóval gyakoribb.
különbségek statisztikailag is alátámaszthatók. Mind az injektálók, mind a nem injektálók között a Hepatitis C virus előfordulása a korrral
szempontjából. Látható, hogy minél fiatalabb egy fogvatartott, annál valószínűbb, hogy intravénás droghasználatról számol be. A
7. Táblázat. A kérdőívet kitöltő fogvatartottak korcsoportok szerinti elemzése injekciós droghasználat és a HCV előfordulása
rabok száma
életkor (évek)
6.1.5. A kérdőívet kitöltő fogvatartottak jellemzői és a Hepatitis B virus és egyes kockázati magatartások kapcsolata A kérdőívet kitöltő 1 553 személy közül 18 (1,2%) volt HBV-hordozó. Azon fogvatartottak között, akiknek a tetoválása a BVI-ben készült, a HBV gyakrabban fordult elő, mint azok között, akiknek nem volt tetoválása vagy a tetoválása nem a BVIben készült. A HBV csak kissé gyakrabban fordult elő azon fogvatartottak között, akik i.v. droghasználatról számoltak be, ill. nem-biztonságos szexet folytattak, vagy akiknek tetoválása volt. Azonban a fent említettek közül egyik különbség sem volt statisztikailag szignifikáns (8. táblázat).
Kérdőívet kitöltők száma Kockázati magatartások: Droghasználat Igen Nem Injekciós droghasználat Igen Nem-injekciós droghasználat Nem Óvszerhasználat alkalmi partnerrel Igen Nem Tetoválás Igen Nem Tetoválás a BVI-ben Igen Nem
N
HBsAg pozitív (%)
1 553
1,2
553 (35,6%) 1 000
1,1 1,2
209 (13,5%) 344 (22,15%) 1 000
1,4 0,9 1,2
626 927
0,8 1,4
993 560
1,4 0,7
222 1 331
2,3 1
8. Táblázat. A Hepatitis B virus hordozás és egyes kockázati magatartások kapcsolata.
6.2. DBS-vizsgálatok eredményei 6.2.1. A szerológiai és PCR-vizsgálatok eredményei A 2 133 i.v. kábítószer-használó közül 509 egyén bizonyult anti-HCVellenanyag pozitívnak. Véletlenszerűen kiválasztott 323 anti-HCV-antitest pozitív személy mintájából végeztünk HCV RNS kimutatást nested PCR-el. Közülük 211-ben (65%) tudtuk kimutatni a HCV RNS-ét. A vizsgált 7 tervezési-statisztikai régióból 6ban találtunk HCV RNS pozitív személyt.
6.2.2. A genotípus meghatározás eredményei A 211 intravénás kábítószer-élvezőtől származó virális RNS-re pozitív mintából 198-nál tudtuk megállapítani a HCV-genotípust direkt nukleotid szekvenálást követően elvégzett filogenetikai analízissel. A MEGA5 software-rel készített számos törzsfa, illetve az előtte elvégzett szekvencia illesztések bemutatása meghaladná a dolgozatom kereteit, ezért egy reprezentatívnak tekinthető szekvencia illesztést (3. ábra) és törzsfát (4. ábra) mutatok be. A bemutatott fa segítségével, referencia törzsek szekvenciáinak felhasználásával 1es, 3-as és 4-es genotípusú HCV is meghatározásra került. Az egy gap kivételével a MEGA5 183 pozíció alapján készítette el a fát.
53
3. Ábra. Genotipizáláshoz készített nukleotid szekvencia illesztések példája. Az illesztés 15 különböző szubtípusú HCV referencia törzs, 6 intravénás kábítószerhasználótól származó és egy, az átlagos lakosságot reprezentáló személyből kimutatott HCV 5’UTR szekvenciáinak 184, illetve 183 bázis hosszú szakaszai alapján készült. A referencia törzseket a HCV-szubtípus megadását követően feltüntetett génbanki azonosító számmal jelöltem (pl. 1a_M62321). Az intravénás kábítószer-használókból és az összehasonlítási csoport tagjától származókat egy egyedi azonosító számot követően feltüntetett, a programba lépés helyével azonos városnévvel jelöltem (pl. 29Budapest). A szekvenciákon piros színnel jelölt nukleotidok a teljes azonosságra, a kék és fekete színűek a különbözőségekre hívják fel a figyelmet. (Lásd következő oldal.)
54
31Budapest 30Budapest 1a M62321 1c D14853 1b D90208 26Pécs 29Budapest 6n DQ278894 6h D84265 4d FJ462437 88
32Szeged 4a Y11604 3k D63821
86
3b D49374
99
3a D17763
85 90
27Szeged 28Szeged
5a Y13184 2b D10988
81 99
2a D00944 2k AB031663
7a EF108306 0,01
4. Ábra. Genotipizáláshoz készített törzsfák példája. A törzsfa 15 különböző szubtípusú HCV referencia törzs, 6 intravénás kábítószer-használótól származó és 1 az összehasonlítási csoportba tartozó személyből kimutatott HCV 5’UTR szekvenciáinak 183 bázis hosszú szakaszai alapján készült. A referencia törzseket a HCV-szubtípus megadását követően feltüntetett génbanki azonosító számmal jelöltem (pl. 1a M62321). Az intravénás kábítószer-használókból és az összehasonlítási csoport tagjaitól származókat egy egyedi azonosító számot követően feltüntetett, a programba lépés helyével azonos városnévvel, kivastagítottan jelöltem. A törzsfa alapján a 26 Pécs, 29, 30 és 31 Budapest jelzésű szekvenciák 1-es genotípusúnak, a 27 és 28 Szeged jelzésűek
3-as
genotípusúnak
és
a
32
Szeged
jelölésű
4-es
genotípusú
HCV-nek
valószínűsíthetőek. Az elágazások mellett feltüntettem az 1000 ismétléses bootstrap analízis eredményét százalékban kifejezve, amennyiben az legalább a 75%-ot elérte.
Összességében elmondható, hogy az intravénás kábítószer-használókból származó 198 genotipizált mintából 147 (74,2%) 1-es genotípusúnak, 45 (24,7%) 3-as genotípusúnak, és 6 (3,0%) 4-es genotípusúnak adódott. Míg az átlagos lakosság körében az általunk vizsgált 89 HCV RNS pozitív személy mintái közül 86 minta (96,6%) 1-es genotípusú HCV-t, 2 minta (2,2%) 3-as genotípusú HCV-t és 1 minta (1,1%) 4-es genotípusú HCV-t tartalmazott (5. ábra).
Intravénás kábítószer-használók:
Átlagos népesség:
5. Ábra. A Hepatitis C virus genotípus vizsgálataink adatai az intravénás kábítószer-használók és az átlagos népesség körében. Látható, hogy mindkét populációban legalább három különboző genotípus van jelen, a domináns genotípus mindkét esetben az 1-es. A 3-as genotípus szignifikánsan gyakrabban fordul elő az injekciós droghasználók között (p<0,001; AOR: 57,27; 95% CI: 11,83 – 277,17). A 4-es genotípus előfordulása nem különbözik egymástól a két populációban.
57
A fenti eredmények alapján megállapítottuk, hogy az i.v. kábítószer-használók szignifikánsan gyakrabban hordozzák a HCV 3-as genotípusát, mint az átlagos lakossághoz tartozó személyek (p<0,001). Az 1-es genotípusú HCV pedig szignifikánsan ritkábban fordul elő az i.v. kábítószer-élvezőkben, mint az átlagos lakosság körében (p<0,001). Ugyanakkor a 4-es genotípus előfordulása nem különbözik a két vizsgált populáció között. Miután az adatokat az egyének korához, neméhez és földrajzi elhelyezkedéséhez statisztikailag hozzáigazítottuk, a szignifikáns különbség a 3-as genotípus előfordulási gyakorisága szempontjából az i.v. kábítószer-használók és az átlagos népesség között továbbra is erős maradt (p<0,001; AOR: 57,27; 95% CI: 11,83 – 277,17). Azt, hogy a 3as genotípus szignifikánsan gyakrabban mutatható ki a vidéken élő i.v. kábítószerhasználókból, mint a Budapesten élőkből, a korra (<34 vagy >34 évesek), nemre és a droghasználat hosszára történt hozzáigazítás után a többváltozós logisztikus regressziós analízis is megerősítette (p<0,001; AOR: 4,59; 95% CI: 2,13 – 9,90). Az adatokat adjusztáltva korra, nemre és földrajzi elhelyezkedésre, a szignifikáns különbség a 1-es genotípus előfordulási gyakorisága szempontjából az i.v. kábítószerhasználók és az átlagos népesség között továbbra is erős maradt (p<0,001; AOR: 42,84; 95% CI: 11,13 – 164,81). A többváltozós logisztikus regresziós analízis is igazolta, hogy az 1-es genotípus az i.v.droghasználók között szignifikánsan gyakrabban fordul elő Budapesten, mint az ország többi részén, korra (<34 vagy >34 évesek), nemre és a droghasználat hosszára történt hozzáigazítás után is (p<0,001; AOR: 5,66; 95% CI: 2,66 – 12,08).
6.2.3. A szubtípus meghatározás eredményei A vizsgálatok tárgyát képező populációkban a HCV-nek nemcsak a genotípus, hanem a szubtípus eloszlását is tanulmányoztuk. A 91 véletlenszerűen kiválasztott i.v. kábítószer-használó mintáját használtuk fel a virális szubtípus meghatározásához, melyet a Versant HCV Genotype 2.0 Assay kittel végeztünk. A 91-ből 79 esetben sikerült pontosan meghatározni a HCV-szubtípust (36: 3a, 31: 1a és 12: 1b), 6 esetben a kit 1-es vagy 6-os genotípus jelenlétét valószínűsítette, és a szubtípust sem volt képes
58
meghatározni. A kit mind a 6 darab szekvenálást követően a 4-es genotípusúnak adódott mintát 4-es genotípusúnak minősítette, de a szubtípust egyik esetben sem határozta meg. A 147 darab 1-es genotípusú i.v. kábítószer-használó közül 43-ból történt meg a szubtípus meghatározás. Ezek közül 31 (72,1%) 1a szubtípusúnak, 12 (27,9%) pedig 1b szubtípusúnak bizonyult. Az 1-es genotípusú HCV-k szubtípusainak eloszlása nem különbözött egymástól Budapest és vidék összehasonlításban. Az átlagos lakosság körében azonban a 71 vizsgált mintából csak 3 (4,2%) lett 1a szubtípusú, és 68 (95,8%) 1b szubtípusú HCV. Az 1-es genotípusú HCV-k szubtípusainak eloszlása szintén nem különbözött egymástól Budapest és vidék összehasonlításban. Az 1a szubtípus szignifikánsan gyakrabban fordul elő az i.v. kábítószerhasználók között, mint az átlagos lakosság körében (egzakt p<0,001) (6. ábra).
Intravénás kábítószer-használók:
Átlagos népesség:
6. Ábra. Az 1-es genotípusú Hepatitis C virusok szubtípusainak eloszlása az intravénás
kábítószer-használók
és
az
átlagos
népesség
körében.
Mindkét
populációban két különböző szubtípus mutatható ki, az 1a és az 1b, azonban az injekciós kábítószer-élvezőkben az 1a, míg az átlagos népesség körében az 1b az uralkodó. A különbség statisztikailag szignifikáns.
59
A 45 darab 3-as genotípusú HCV-t hordozó i.v. kábítószer-használó mintája közül 36 esetben történt meg a szubtípus meghatározása. Mindegyik minta 3a szubtípusúnak adódott. A 3-as genotípusú HCV szignifikánsan gyakrabban fordult elő vidéken, mint Budapesten (egzakt p<0,001). Különbségeket láttunk a 3-as genotípus szempontjából Budapest különböző kerületei között is, bár nem minden kerületből érkezett kielégítő számú minta. Elmondható, hogy az i.v. kábítószer-élvezők között a 13. és 23. kerületekben szignifikánsan gyakrabban fordult elő a 3-as genotípusú HCV a 8. kerülethez viszonyítva (egzakt p<0,001 és p=0,003). Ugyanakkor a 3-as genotípus prevalenciája rendkívül alacsony (2,2%) volt az átlagos népesség körében és nem különbözött az egyes települések között.
6.2.4. A genotípusok kapcsolata a droghasználat hosszával és a szerhasználó korával Megállapítottuk, hogy a 3-as genotípusú HCV szignifikánsan gyakrabban fordult elő azok között, akik hosszabb ideje (>5 év) injektáltak drogot és az idősebb korosztályokba tartoztak (25-34 évesek és >34 évesek), mint azok között, akik rövidebb ideje injektáltak drogot (<5 év) és a fiatalabb korcsoportokba tartoztak. Az 1-es genotípusú HCV szignifikánsan gyakrabban fordult elő azok között, akik rövidebb ideje injektáltak drogot és a fiatalabb korosztályokba tartoztak, mint azok között, akik hosszabb ideje injektáltak drogot és az idősebb korcsoportokba tartoztak. A korcsoportok esetében lineáris trend mindkét genotípusra kimutatható (9. táblázat).
60
Genotípus Korcsoportok (évek)
1
3
4
N
(%)
N
(%)
N
(%)
<25
35
(89,7)
1
(2,6)
3
(7,7)
25-34
74
(81,3) 17 (18,7) 0
(0,0)
>34
38
(55,9) 27 (39,7) 3
(4,4)
Egzakt p Intravénás drog-
<0,001*
<0,001*
0,021
N
(%)
N
(%)
N
(%)
<5
33
(94,3)
1
(2,9)
1
(2,9)
>5
111 (69,8) 43 (27,0) 5
(3,1)
használat tartama (évek)
Nem ismert Egzakt p
3
(75,0) 0,002
1
(25,0) 0 0,001
(0,0) 1,000
9. Táblázat. Az intravénás kábítószer-használókból amplifikált Hepatitis C virusok genotípusainak és a droghasználók korának, illetve a droghasználat időtartamának összefüggései. Az egzakt p a Fisher-teszttel számolt statisztikai valószínűségeket mutatja. * jelöli a lineáris trendet.
6.2.5. Intravénás kábítószer-használókból származó 3a szubtípusú vírusok filogenetikai analízise Hazai i.v. kábítószer-használók 3-as genotípusú HCV-inek és a nemzetközi irodalomban közölt 3-as genotípusú HCV-k megszekvenált ns5b szakaszának nukleotid szekvenciái alapján gyökeres törzsfát készítettem. A törzsfán a magyarországi i.v. droghasználókból amplifikált HCV-szekvenciák nem formálnak jól elkülönülő kládot, azonban egyes magyar szekvenciák kisebb csoportokba, szubklaszterekbe rendeződtek
61
magas bootstrap értékekkel. Legalább 3 ilyen szubklaszter figyelhető meg (7. ábra).
62
63
7. Ábra. Maximum likelihood gyökeres törzsfa, melyen a hazai intavénás kábítószer-élvezőkből nyert 3a szubtípusú Hepatitis C virus ns5b szekvenciák, valamint a génbankban található szekvenciák láthatóak. A 25 magyarországi injekciós droghasználóból származó szekvencia négy városból (Budapest, Szeged, Pécs és Debrecen) került ki. A 49 külföldi szekvenciát a génbanki azonosítójukkal jelöltem, az azonosító utáni két karakter a szekvencia származási országára utal (AU: Ausztrália, BE: Belgium, CH: Svájc, CN: Kína, IT: Olaszország, NL: Hollandia, NZ: Új-Zéland, UK: Egyesült Királyság, US: Amerikai Egyesült Államok, TH: Thaiföld). Az elágazások mellett feltüntettem az 1000 ismétléses bootstrap analízis eredményét százalékban kifejezve, amennyiben az legalább a 75%-ot elérte.
64
7. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 1. Megállapítottuk, hogy a magyarországi büntetés-végrehajtási intézetekben fogvatartottak veszélyeztetett populációnak minősülnek a parenterálisan terjedő Hepatitis C virus és Hepatitis B virus szempontjából. Nagyszámú személy vizsgálata alapján mindkét vírus szignifikánsan gyakrabban fordult elő a fogvatartottak között, mint az átlagos lakosság vagy a büntetésvégrehajtási intézményekben dolgozó nem-fogvatartottak körében. 2. Az átlagos populációban és a BVI-kben dolgozók között nem különbözött statisztikailag a HCV és a HBV előfordulása, ami arra utal, hogy nem jelentős a foglalkozás körében elszenvedett fertőződések száma. 3. Feltártuk, hogy a női fogvatartottak között szignifikánsan magasabb a HCVprevalencia, mint a férfiak körében. 4. A kérdőívet kitöltő fogvatartottak között minél fiatalabb volt a vizsgált személy, annál gyakrabban számolt be intravénás kábítószer-használatról. Az intravénás kábítószerrel kapcsolatba került személyek között a kor előrehaladtával kimutatható a HCV-fertőzöttség egyre fokozottabb mértékű előfordulása. 5. A HBV magyarországi fogvatartottak között tapasztalható alacsony előfordulása következtében a vizsgált populáción statisztikailag nem támasztható alá egyik vizsgált kockázati magatartás szerepe sem a terjedésben. 6. Magyarországon először határoztunk meg HCV-genotípusokat beszárított vércseppekből. Az intravénás kábítószer-használók között a HCV 3-as genotípusa szignifikánsan gyakrabban fordult elő az átlagos lakossághoz viszonyítva, míg az 1-es genotípust gyakrabban mutattuk ki az átlagos populációban. A 4-es genotípus előfordulása statisztikailag nem különbözött a két csoportban. 7. A HCV 1a szubtípusa szignifikánsan gyakrabban fordult elő az injekciós droghasználók között az átlagos lakossághoz viszonyítva. 65
8. Megállapítottuk, hogy minél rövidebb ideje injektál valaki drogot és minél fiatalabb, annál gyakrabban hordozza a HCV 1-es genotípusát, és annál ritkábban a 3-as genotípusát. 9. A HCV 3-as genotípusa az injekciós droghasználók között szignifikánsan gyakrabban fordult elő a vidéki városokban, mint Budapesten. Budapest különböző kerületei között is különbségeket láttunk e tekintetben. 10. Az általam tervezett HCV ns5b specifikus primerek felhasználásával készített filogenetikai törzsfa alapján a magyarországi i.v. kábítószerhasználók HCV-ei nem formálnak egységes kládot, de egyes szekvenciák kisebb csoportokba rendeződtek.
66
8. MEGBESZÉLÉS 8.1. BVI-vizsgálatok 8.1.1. A magyarországi BVI-kben fogvatartottak veszélyeztetett populáció Munkánk az első olyan munka, amely nagyszámú minta vizsgálatán alapszik, és a vérrel és testváladékokkal terjedő leggyakoribb vírusfertőzéseket vizsgálta a magyarországi BVI-kben. Azt találtuk, hogy a fogvatartottak között az anti-HCVantitestek prevalenciája (4,9%), a HBsAg-é (1,5%) és a HIV-prevalenciája (0,04%) mind magasabb, mint a BVI-kben foglalkoztatott nem rab személyek körében. Ez a különbség azonban csak a HCV és HBV esetében volt statisztikailag szignifikáns. Megállapítható
tehát,
hogy
a
magyarországi
BVI-kben
büntetésüket
töltők
veszélyeztetett populációnak tekintendők a HCV- és HBV-fertőzöttség szempontjából. A különböző rizikótényezőknek kitett, ill. különböző kockázati magatartásokat mutató személyek valószínűleg halmozottan fordulnak elő ebben a környezetben.
8.1.2. A magyarországi BVI-kben fogvatartottak között nemzetközi összehasonlításban alacsony a vizsgált vírusok prevalenciája Csak néhány környező országban vizsgálták a HBV, a HCV és a HIV jelenlétét fogvatartottak között. A szerzők a Horvát Köztársaságban 20 BVI-t vizsgálva 12,5%-os prevalenciát határoztak meg anti-HCV-ellenanyagokra, 1,3%-ost HBsAg-ra és 0,16%ost HIV-re [Burek és mtsai, 2010]. Romániában, a bákói (Bacău, Kelet-Románia) BVIben végzett felmérésben 5,21%-os fertőzöttséget találtak HCV-re és 10,74%-ost HBVre (HBsAg) [a,Nazare és mtsai, 2011; b,Nazare és mtsai, 2011]. Lengyel és szlovák vizsgálatok szintén azt találták, hogy a HIV csak kis százalékban mutatható ki az elítéltek között [Staneková és mtsai, 2001, Caban és mtsai, 1990]. Vizsgálataink alapján megállapíthatjuk, hogy a magyarországi BVI-ben fogvatartottak körében alacsonyabb a
67
HCV és a HIV előfordulása, mint a horvát BVI-kben [Burek és mtsai, 2010]. Ugyanakkor mindhárom vírus esetén a kapott prevalencia értékek a világ különböző BVI-iben kapott értékek között is a legalacsonyabbak közül valók. Németország egyik büntetés-végrehajtási intézetében 2002-ben végzett tanulmány szerint a fiatal férfi újoncok 8,6%-a volt anti-HCV-pozitív [Meyer és mtsai, 2007]. Egy dán börtönben 325 főt vizsgálva 43,1%-ban fordult elő a HCV, 4,3%-ban a HBsAg, HIV-pozitivitást nem találtak [Christensen és mtsai, 2000]. Egy spanyol BVI-ben 2001-ben a HCVfertőzöttség 38,2%, a HIV 19,1% volt [Sáiz de la Hoya és mtsai; 2005]. Nyolc olaszországi BVI vizsgálata során a HIV 7,5%-ban, a HCV 38,0%-ban, a HBsAg 6,7%ban fordult elő [Babudieri és mtsai, 2005]. Anglia és Wales 135 BVI-e közül 8-at mintázva (3930 rab) 0,4% volt HIV-pozitív és 7% volt anti-HCV-pozitív [Weild és mtsai, 2000]. Az amerikai egyesült államokbeli Rhode Islanden 1998 és 2000 között vizsgált felnőtt férfi rabok közül 23,1% HCV, 3,1% HBV (HBsAg) és 1,8% volt HIVfertőzött [Macalino és mtsai, 2004]. Pakisztánból 2,0%-os HIV, 5,9%-os HBV (HBsAg) és 15,2%-os HCV-prevalenciát közöltek [Kazi és mtsai, 2010]. Libanonból 2.4%-os HBV (HBsAg), 3,4%-os HCV és 0,17%-os HIV előfordulást írtak le [b,Mahfoud és mtsai, 2010]. Egy ghánai felmérésben a HIV 5,9%-ban, a HBsAg 25,5%-ban, a HCV 19,2%-ban volt kimutatható [Adjei és mtsai, 2008]. Brazíliából a fogvatartottak között 16%-os HIV- és 34%-os HCV-fertőzöttségről számoltak be [Massad és mtsai, 1999].
8.1.3. Nem igazolható foglalkozás-eredetű fertőződés-halmozódás a BVI alkalmazottai körében Elemzéseink során összehasonlítottuk a BVI-kben foglalkoztatottak prevalencia értékeit az átlagos lakosság körében mért prevalencia értékekkel is (Az Országos Epidemiológiai Központ által 1999-2000-ben végzett szeroepidemiológiai felmérés adatai). Sem HIV, sem HBV és HCV szempontjából nem volt szignifikáns különbség a két populáció között, miután az adatokat korra és nemre is adjusztáltuk. Mindez arra utal, hogy a foglalkozás körében elszenvedett vírusfertőzések valószínűsége nem számottevő a magyarországi BVI-kben. Csak kevés publikáció vizsgálta a vérrel és testváladékokkal terjedő vírusok előfordulását a BVI-kben foglalkoztatottak körében. Legtöbbjük magasabb prevalenciát mért HIV-re, HBV-re és HCV-re a fogvatartók
68
között az átlagos lakossághoz viszonyítva, ami foglalkozás körében elszenvedett vírusfertőzésekre utal [Chiaramonte és mtsai, 1982, Adjei és mtsai, 2006, Adjei és mtsai, 2008]. Meg kell azonban jegyezni, hogy mi a BVI-kben foglalkoztatottak közül nemcsak a fogvatartók mintáit vizsgáltuk, hanem minden egyéb BVI-ben dolgozó személy (pl. közalkalmazott) mintáinak eredményét is tartalmazzák elemzéseink.
8.1.4. A HCV gyakrabban fordult elő a női fogvatartottak között Nemekre és korcsoportokra bontva is elemeztük a mért vírusprevalencia adatainkat. A HCV mind a fogvatartottak, mind pedig a BVI dolgozók esetén a nők között gyakrabban fordult elő, mint a férfiak között, bár ez a különbség csak a fogvatartottak között volt szignifikáns. A megfigyelés hátterében álló pontos okot nem sikerült feltárnunk, ehhez további vizsgálatok végzése lenne szükséges. A nők és férfiak között mérhető különbséget találtak más szerzők is, akik felvetik, hogy a női nem képviselői bizonyos körülmények között nagyobb kockázatnak vannak kitéve a HCVfertőzés szempontjából, mint a férfiak. Ennek oka lehet pl. a nők között valószínűleg nagyobb arányban előforduló prostitúció vagy a droghasználattal összefüggő kockázati magatartások [Puri és mtsai, 2014; Evans és mtsai, 2003].
8.1.5. A fogvatartottak között a fiatal életkor korrelál a magas HCV-fertőzöttséggel Megfigyeltük, hogy a fogvatartottak között a fiatal életkor korrelál a magas HCV-fertőzöttséggel mind a férfiak, mind pedig a nők között. Ez ellentétben áll az 1999-2000-ben az átlagos magyar lakosság körében az Országos Epidemiológiai Központ által végzett szeroepidemiológiai felmérés adataival, melyeken nem mutatható ki csökkenés a kor előrehaladtával, inkább a HCV-prevalencia növekedése dominál, ahogy a BVI-ben dolgozóknál is. A kapott eredmények felhívják a figyelmet arra, hogy a
fiatal
fogvatartottak
fokozott
veszélynek
vannak
kitéve
a
HCV-fertőzés
szempontjából, mert valószínűleg valamely kockázati magatartás vagy magatartások
69
népszerűvé váltak a körükben. Ezek alapján joggal feltételezhetjük azt is, hogy a jövőben növekedni fog a BVI-k HCV-terheltsége.
8.1.6. A kérdőívet kitöltő fogvatartottak válaszainak elemzése 8.1.6.1. HCV-antitest pozitív személyek szignifikánsan nagyobb százalékban kerültek ki a droghasználók, különösen az i.v. droghasználók közül
Összesen 1 553 fogvatartott töltötte ki a kockázati magatartásokra vonatkozó kérdőívet. Közülük egy sem volt HIV-pozitív, 1,2%-uk volt HBsAg-pozitív és 4,0%-uk anti-HCV-antitest pozitív. Összesen 49,6%-uk jelezte a kérdőíven, hogy már volt tetoválása, amikor BVI-be zárták, és 14,3%-uk azt állította, hogy a BVI-ben tetoválta/tetováltatta magát. Az 1 553 személy közül 553 (35,6%) vallotta, hogy életében legalább egyszer már használt illegális kábítószert valamilyen formában (a továbbiakban: droghasználók). Ezen személyek közül 209 (37,8%) intravénás drogot (vagy intravénás drogot is) használt (a továbbiakban: i.v. droghasználók). Az i.v. drogot használók 44%-a vallotta azt a kérdőíven, hogy a bebörtönzés előtt egy hónapon belül injektált utoljára, és 18,7%-uk, hogy a bebörtönzés előtt egy éven belül injektált utoljára. A valaha i.v. droghasználók 8,6%-a állította, hogy a BVI területén injektált utoljára [Tresó és mtsai, 2012]. Az elvégzett egyváltozós statisztikai elemzés alapján elmondható, hogy az antiHCV-antitest pozitív személyek szignifikánsan nagyobb százalékban kerültek ki a droghasználók, és különösen az i.v. droghasználók közül, mint a kábítószerrel sohasem élők közül (a továbbiakban nem droghasználók). Azonban a nem intravénásan, de drogot használók között az anti-HCV-antitest pozitivitás nem volt szignifikánsan magasabb a nem droghasználókhoz viszonyítva [Tresó és mtsai, 2012]. A nem biztonságos módon történő közösülés (óvszerhasználat hiánya), a tetoválás és a tetoválás a BVI-ben nem mutatott kapcsolatot a HCV-fertőzöttséggel. Fontos megjegyezni továbbá, hogy a BVI-ben eltöltött idő hossza nem korrelált a HCVfertőzöttséggel. Elemzéseink arra utalnak, hogy a fogvatartottak között mért magas HCV-prevalencia legfőbb oka az i.v. droghasználat lehet, hiszen a HCV-prevalencia azon fogvatartottak között volt a legmagasabb, akik a kérdőíven jelezték, hogy 70
életükben már injektáltak kábítószert. Az i.v. droghasználók között 48-szor volt magasabb a HCV előfordulási gyakorisága a BVI-kben foglalkoztatottakhoz mérve [Tresó és mtsai, 2012]. Bár a kérdőívet kitöltő fogvatartottak 13,5%-a vallotta be, hogy életében valaha már injektált kábítószert, magában a BVI-ben csak kis százalékuk élt i.v. kábítószerrel, az i.v. droghasználók ~9%-a [Tresó és mtsai, 2012]. Ezt egy nemrégiben végzett másik tanulmány is alátámasztja [Cserszegi és mtsai, 2009]. Ugyanakkor nem találtunk összefüggést a jelenlegi büntetés idejének hossza és a HCV-fertőzöttség előfordulási gyakorisága között [Tresó és mtsai, 2012]. Ezek a megfigyelések alátámasztják azon feltételezésünket, miszerint a BVI-be frissen belépők, az újoncok már eleve fertőzöttek. Ezt a feltételezést támogatják azon külföldi vizsgálatok is, amelyek az újoncok között találtak magas prevalencia értékeket a vérrel és testváladékokkal terjedő vírusokra [Long és mtsai, 2001; Solomon és mtsai, 2004; Meyer és mtsai, 2007]. Nem meglepő, hogy a legmagasabb HCV-prevalencia értéket budapesti BVI-ben mértük, hiszen a szabadlábon lévő i.v. kábítószer-használók között is Budapesten a legmagasabb ez az érték 4-szer magasabb, mint Budapesten kívül [Cserszegi és mtsai, 2009; Tresó és mtsai, 2012]. Az i.v. kábítószer-használattal összefüggő kockázati magatartások kapcsolatát is vizsgáltuk anti-HCV-antitest poztitivitás szempontjából. Mind az injekciós tű és/vagy fecskendő megosztása, mind pedig az injektálás során használt segédeszközök (pl. kanál, szűrő, érszorító, alkoholos törlőkendő, desztillált víz) közös használata összefüggést mutatott a HCV-fertőzöttséggel [Tresó és mtsai, 2012]. Szerencsére az i.v. kábítószer-használat nem túl gyakori a magyarországi BVI-kben, azonban a BVI-k kiváló színhelyei lehetnének a droghasználattal összefüggő problémák megvitatásának, így a vérrel és testváladékokkal terjedő vírusfertőzések megelőzéséről szóló oktatóprogramoknak és az egyénre szabott tanácsadásnak.
71
8.1.6.2. Az i.v. droghasználók között a korral növekszik a HCVfertőzöttség
Az 1 553 kérdőívet kitöltött fogvatartott személy korcsoportos elemzését is elvégeztük. Megállapítottuk, hogy minél fiatalabb volt egy fogvatartott, annál valószínűbb, hogy i.v. droghasználatról számolt be. Ez összhangban van azzal a korábbi megállapítással, amelyet a 4 894 rab vonatkozásában tettünk, miszerint a fiatal fogvatartottak fokozott veszélynek vannak kitéve a HCV szempontjából, mert valószínűleg valamely kockázati magatartás vagy magatartások népszerűvé váltak a körükben. Az i.v. kábítószer-élvezők között vizsgálva a korral növekszik a HCVfertőzöttség. Mivel az aktív droghasználat időtartama és a kor között valószínűleg összefüggés van, mint ahogy azt a DBS-vizsgálatoknál megállapítottunk, így nem meglepő ez a tendencia. Hiszen minél hoszabb ideje használ valaki i.v. drogot, annál többször injektál, és ennek következtében nagyobb az esélye a vérrel átvihető ágensekkel való fertőződésre. A nem i.v. droghasználók között az i.v.droghasználókénál lényegesen alacsonyabb HCV-prevalenciát tapasztaltunk, ez a különbség minden (elemszámmal rendelkező) korcsoportban szignifikáns volt. Érdemes megjegyezni, hogy a nem i.v. kábítószer-használók anti-HCV-antitest előfordulása korcsoportra és nemre illesztve szignifikánsan magasabb, mint a BVI-dolgozók között mért adatok (p=0,012; AOR=4,08; 95% CI: 1,36-12,29). Ez utalhat arra, hogy néhány i.v. droghasználó nem vallotta be a droghasználatot, vagy arra is, hogy az i.v. kábítószer-használaton kívül egyéb rizikótényező is jelen van a fogvatartottak között, amit a vizsgálataink nem tudtak feltárni. A korral a nem i.v. droghasználó rabok HCV-prevalenciája is lineárisan növekvő trendet mutat, hiszen nemcsak az i.v. kábítószerek élvezete, hanem egyéb rizikótényezők is, mint pl. a vérátömlesztés, szexuális kapcsolat fertőzött személlyel stb. gyakorisága vagy valószínűsége a korral emelkedhet. Összességében a kérdőívet kitöltők és a teljes vizsgált rab populáció között korra és nemre illesztve statisztikailag nincs igazolható különbség a HCV-fertőzöttség szempontjából (4,9% versus 4,0%, p=0,072; AOR: 1,30; 95% CI: 0,98-1,73), kivéve a legfiatalabbak korcsoportját (p=0,012; AOR: 1,85; 95% CI: 1,14-2,99). Ez arra enged következtetni, hogy valószínűleg a kérdőívet kitöltők alapján kissé alábecsültük az i.v. kábítószer-élvezők arányát a legfiatalabbak között. 72
8.1.6.3. A kérdőívet kitöltő fogvatartottak közül egyetlen személy sem bizonyult HIV-fertőzöttnek
A kérdőívet kitöltő fogvatartottak közül egyetlen személy sem bizonyult HIVfertőzöttnek [Tresó és mtsai, 2012]. Magyarországon, akárcsak a többi környező volt szocialista országban alacsony a HIV-prevalencia [EuroHIV, 2007; HIV/AIDS surveillance in Europe, 2013]. Ugyanakkor nőtt az újonnan dignosztizált esetek száma 2004 és 2013 között vizsgálva [HIV/AIDS surveillance in Europe, 2013]. A térségben járványokról is beszámoltak, pl. Romániában 1989 után orvosi beavatkozások következtében jelentős számú személy, főleg gyermek fertőződött meg a vírussal [Hersh és mtsai, 1991]. Hazánkban 1985 és 2015 júniusa között csak 24 HIV-fertőzöttről derítette fel a járványügyi vizsgálat, hogy életében már használt i.v. kábítószert (évenkénti növekedés nem tapasztalható). A 24 esetből csak 5 esetben valószínűsíthető, hogy a megfertőződés nem külföldön történt (dr. med. Dudás Mária személyes közlése, OEK, Járványügyi Osztály). Az országban számos államilag támogatott és alapítványi kezdeményezésre működő program létezett és létezik, melyek megelőző tevékenysége eddig kielégítően működött. Ugyanakkor fontos lenne annak tudatosítása is, hogy a gyógyszertárakban elérhető áron az i.v. kábítószer-használók számára is – orvosi recept nélkül – megvásárolható a steril fecskendő tűvel.
8.1.6.4. A HBV és a vizsgált kockázati magatartások kapcsolata
A kérdőívet kitöltő azon fogvatartottak között, akiknek a tetoválása a BVI-ben készült, a HBV gyakrabban fordult elő, mint a többi fogvatartott körében. Azon fogvatartottak között, akik i.v. droghasználatról számoltak be, nem biztonságos szexet folytattak vagy tetoválásuk volt, csak kissé gyakrabban fordult elő a HBV. Azonban a fent említettek közül egyik különbség sem volt statisztikailag szignifikáns. Megjegyzendő, hogy a kis mintaszám és az alacsony HBsAg-prevalencia elfedhetett valódi különbségeket is. A statisztikai értékelés szempontjából szerencsésebb lett volna az anti-HBc-ellenanyagok vizsgálata a HBsAg-nál magasabb előfordulása miatt. Az anti-HBc-ellenanyagok önmagukban azonban nem adnak információt az aktuális vírushordozás fennállásáról.
73
A még nem oltott fogvatartottak HBV elleni védőoltása szakmailag indokolt lehet, az anyagi vonatkozásokat is figyelembe véve kell dönteni a lehetőségről. A vakcináció sok pénzbe kerül ugyan, de az antivirális terápia még költségesebb.
8.1.7. Az eredményeket befolyásoló tényezők vizsgálata Bár a fogvatartottak és a dolgozók nagyszámban vettek részt a szűrőprogramban, mégis meg kell említenünk az alábbi, az eredményekre esetlegesen hatást gyakorló tényezőket. A vizsgálat előtt elmondtuk a fogvatartottaknak, hogy a kérdőívre adott válaszaikat nem adjuk át személyhez köthetően a BVI-nek és a hatóságoknak. Mivel a droghasználat illegális és büntetendő cselekmény, elképzelhető, hogy egyesek eltitkolták a kábítószerek használatát. Ez a feltételezett lehetőség a droghasználók számának és a kapott prevalencia értékeknek az alulbecslését eredményezhette. A kérdőívek felvétele csak egy évvel a szűrőprogram indulása után kezdődött, és csak bizonyos BVI-kben. A fogvatartottak a kérdőíveket maguk töltötték ki, ami eredményezhette egyes kérdések félreértését és a nem valós válasz megadását.
8.1.8. A fogvatartottak antivirális kezelése A szűrések eredményeit visszajutattuk a BVI-kbe. Szakorvosok vizsgálták meg, hogy a hatályos kezelési protokollok alapján az egyes fertőzöttek milyen kezelésnek vethetők alá beleegyező nyilatkozatuk mellett. A HCV PCR pozitív eredmény alapján vírushordozónak bizonyult személyek 60,1%-ánál kezdték meg az antivirális kezelést. Ahogy vizsgálataink megállapították, a legtöbb HCV-fertőzött személy i.v. kábítószerhasználó volt [Tresó és mtsai, 2012]. Az i.v. droghasználók különböző okok miatt csak nagyon ritkán kerülnek kezelés alá. Ilyen okok lehetnek pl. az absztinencia hiánya, a társadalombiztosítás hiánya, a hiányos ismeretek a különböző betegségekről és egyéb akadályok. Magyarországon a HCV antivirális kezelés csak tiltott drogot nem használó személyeknél kezdhető meg. Az addiktológus által rendelt methadon vagy suboxone fenntartó kezelés nem minősül kontraindikációnak [ISZK, 2011; b,EMMI, 2015]. A magyarországi BVI-k zárt intézetek, ahol az i.v. kábítószer-használók viszonylag ritkán 74
injektálnak drogot [Tresó és mtsai, 2012]. Így kiváló helyszínül szolgálhatnak az antivirális kezeléseknek. A szabadlábon lévő i.v. kábítószer-használók viszont csak nehezen elérhetőek és vehetők rá a kezelésre. A jelenleg hatályos jogszabályok (1997. évi LXXX. törvény 16.§ (1) bekezdés n, pontja alapján) közfinanszírozott módon biztosítják az egészségügyi ellátást, így az antivirális kezelést is a fogvatartottak részére. Magyarországon nem hárul akadály a kezelések elvégzése elé a BVI-kben, nem úgy, mint egyes államokban [Solomon és mtsai, 2004, Kheirandish és mtsai, 2009]. Eredményeink alapján megfontolandó a BVI-kbe kerülő újoncok szűrésének bevezetése és a kiszűrt fertőzöttek antivirális kezelése. A hatályos finanszírozási eljárásrend nemcsak a kezelésre, hanem a szűrésre is lehetőséget ad közfinanszírozott módon [EüM, 2010].
8.2. DBS-vizsgálatok 8.2.1. A vizsgált populáció Vizsgálatunk az első olyan vizsgálat, mely a különböző HCV-genotípusok és szubtípusok eloszlását elemzi magyarországi injekciós kábítószer-használók körében. A magyarországi i.v. droghasználók becsült számának kb. harmadát (2133 főt) sikerült bevonnunk a vizsgálatokba [Bozsonyi és mtsai, 2010]; 15 településről érkeztek a DBSminták. Így elmondhatjuk, hogy a vizsgált személyek nagy valószínűséggel jól reprezentálták a magyarországi i.v. droghasználó populációt.
75
8.2.2. A DBS-minták használhatósága a HCV molekuláris epidemiológiai vizsgálatára az i.v. droghasználó populációban A DBS-minták nagy előnye, hogy levételükhöz nem szükséges egészségügyi szakszemélyzet alkalmazása, a drogfókuszpontok, drogambulanciák e feladatra kiképzett személyzete is el tudja végezni a mintavételt. További előnyként említhető, hogy a mintaadási hajlandóság is általában nagyobb, mint vénapunkció esetén [Hickman és mtsai, 2008]. A DBS-minták tárolása, szállítása nem igényel speciális körülményeket, pl. hűtést [Abe és Konomi, 1998]. Más szerzőkkel egyetértésben bizonyítottuk, hogy a DBS-minták alkalmasak a HCV molekuláris epidemiológiai vizsgálatára az i.v. droghasználó populációban [Hope és mtsai, 2011; a,Mahfoud és mtsai, 2010]. Bár a DBS-minta használatának meglehet az a hátránya, hogy néhány esetben álnegatív eredményt adhat [Tuaillon és mtsai, 2010], ez azonban valószínűleg nem befolyásolta jelentősen az egyes HCV-genotípusokra és szubtípusokra kapott prevalencia értékeket.
8.2.3. Az i.v. droghasználók között magasabb a 3-as genotípus és az 1a szubtípus előfordulása Minden genotípusnak, ill. szubtípusnak sajátos, rá jellemző földrajzi elterjedése van. Napjainkban az 1-es, 2-es és 3-as genotípusok szinte a világ minden részén előfordulnak. Az 1a szubtípus az amerikai kontinensen, az 1b Európában a leggyakrabban előforduló szubtípus. A 3-as genotípus valószínűleg Ázsiából, az Indonéz szigetvilágból ered, de a 3a szubtípus napjainkra szinte az egész világot meghódította, jellemzően az intravénás kábítószer-használat révén. A 4-es genotípus Észak- és Közép-Afrikában, valamint a Közel-Keleten, az 5-ös genotípus DélAfrikában, míg a 6-os genotípus HongKongban és környékén gyakori. A 7-es genotípust eddig csak - feltehetően Közép-Afrikában (Kongói Demokratikus Köztársaság) fertőződött - két belga és egy kanadai személyből mutatták ki [Morice és mtsai, 2006; Murphy és mtsai, 2007]. Vizsgálataink alapján megállapíthatjuk, hogy a magyarországi i.v. kábítószerhasználókból kimutatható HCV-genotípusok és szubtípusok előfordulási gyakorisága 76
különbözik az átlagos lakosság körében tapasztaltaktól. A 3-as genotípus és az 1a szubtípus gyakori megjelenése az i.v. droghasználókban más fejlett országokra is jellemző [Morice és mtsai, 2006; Pybus és mtsai, 2005], beleértve a környező országokat is, úgymint a Szlovén Köztársaságot [Seme és mtsai, 1997], a Horvát Köztársaságot [Vince és mtsai, 2006] és a Cseh Köztársaságot [Krekulová és mtsai, 2009]. Mivel a HCV 3-as genotípusa és 1a szubtípusa csak ritkán fordul elő a magyarországi átlagos népesség körében, joggal feltételezhető, hogy Magyarország is érintett a 3-as genotípus és az 1a szubtípus i.v. kábítószer-használók körében zajló világjárványában, így valószínű az is, hogy ennek keretében külföldről érkezett hozzánk ez a genotípus és szubtípus a közelmúltban.
8.2.4. Földrajzi különbségek a genotípusok eloszlásában A 3-as genotípus szignifikánsan gyakrabban fordult elő a vidéki i.v. droghasználókban, mint a budapestiekben. A fővároson belül a 3-as genotípus a 13. és 23. kerületekben szignifikánsan gyakoribb volt a 8. kerülethez viszonyítva. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy Magyarországon, sőt még a fővároson belül is különböző i.v. droghasználó közösségek léteznek, melyekben a különböző genotípusok eltérő gyakorisággal fordulhatnak elő. A vizsgált i.v. droghasználók között összesen 4 személy hordozta a HCV 4-es genotípusát, közülük három ugyanabban a városban, a kb. 64 000 fő lakosú Veszprémben vett részt a programban. Veszprémben összesen 4 i.v. droghasználó mintája bizonyult HCV PCR-pozitívnak, közülük három személy 4-es genotípust hordozott, egy pedig 3-as genotípust. Bár Veszprémből csak kevés vírust genotipizáltunk, a kapott eredmények arra utalnak, hogy az i.v. kábítószer-használók között Veszprémben egy 4-es genotípus által okozott HCV-járvány zajlik. Ezt alátámasztja az is, hogy a veszprémi átlagos lakosság körében talált 5 darab HCVhordozó személy közül mindegyik a HCV 1-es genotípusával volt fertőzött. Európában a 4-es genotípus előfordulása, akárcsak a 3-asé, gyakran az i.v. droghasználattal hozható összefüggésbe [Chlabicz és mtsai, 2011].
77
8.2.5. A HCV-genotípusok és a droghasználók korának és a szerhasználat hosszának összefüggései Elemzéseink alapján megállapítottuk, hogy minél rövidebb ideje injektál valaki drogot és minél fiatalabb, annál gyakrabban hordozza a HCV 1-es genotípusát, és annál ritkábban a 3-as genotípusát. A fiatalabb kábítószer-használók valószínűbb, hogy rövidebb ideje fertőződtek, mint az idősebbek. Így elképzelhető, hogy a jövőben az 1-es genotípus irányába tolódnak el majd az arányok. Ez azonban nem általános tendencia a környező országokban, mert pl. a Cseh Köztársaságban vagy Romániában a 3-as genotípus irányába történik kimutatható elmozdulás, amely csak nemrégen bukkant fel az i.v. kábítószer-használók között [Krekulová és mtsai, 2009; Sultana és mtsai, 2011].
8.2.6. A kábítószer típusának kapcsolata a genotípusokkal Megvizsgáltuk, hogy van-e valamilyen kapcsolat a használt kábítószer típusa (ópiát vagy nem ópiát) és a fertőzöttek HCV-genotípusai között. A 3-as genotípus gyakrabban fordult elő az ópiát használók között, mint a nem ópiát használók között (p=0,022), azonban miután az adatokat korrigáltuk az i.v. droghasználat hosszára és a földrajzi elhelyezkedésre, a különbség nem bizonyult szignifikánsnak, csak közel szignifikánsnak (p=0,053; AOR: 3,22; 95% CI: 0,99–10,54). Következésképpen a nem korrigált adatokon kimutatott különbség oka az lehetett, hogy az idősebb korúak és a régebb óta szerhasználók között több az ópiát injektáló, mint a fiatalabbak és a rövidebb ideje injektálók között.
78
8.2.7. Az átlagos lakosság körében tapasztalt genotípus és szubtípus arányok Gervain Judit és munkatársai határozták meg először Magyarországon HCVgenotípusok, szubtípusok előfordulását az átlagos lakosság körében. Vizsgált mintáik 1999-től 2001-ig Hepatológiai Centrumokban megjelent személyektől származtak [Gervain és mtsai, 2003]. Az általuk mért prevalencia értékek nagyon hasonlóak a mi vizsgálataink során az átlagos lakosságra kapott értékekhez. Fontos megemlíteni azonban, hogy míg mi egyetlen, különböző genotípusokkal, szubtípusokkal történt kettős vagy többszörös fertőzést sem találtunk sem az i.v. kábítószer-használók, sem az átlagos lakosság körében, addig Gervain és munkatársai több ilyen esetről is beszámoltak. Megemlítik, hogy a több genotípussal vagy szubtípussal fertőzöttek között i.v. kábítószer-használók is voltak. Az említett különbség egyik lehetséges oka az lehet, hogy mi a LIPA kitnek már egy fejlesztett verzióját (2.0) használtuk, nem azt, amit Gervainék.
8.2.8. Az NS5B-t kódoló nukleotid szekvenciák filogenetikai elemzése Pybus és munkatársai a leszármazási vonalak egyesülésének elméletét (coalescent theory) alkalmazva rekonstruálták a HCV 3a szubtípus epidemiológiai történetét. Becsléseik szerint a 3a szubtípus járványos terjedése a 20. század első évtizedeiben indult meg, feltételezhetően egy új terjedési mód, az i.v. droghasználat megjelenésével. Feljegyzésekből ismert, hogy már az I. világháború idején, megfigyelték az injekciós droghasználatot a katonák között, és már az 1950-es évekből rendelkezünk olyan adatokkal, amelyek a HCV jelenlététére utalnak londoni ópiátinjektáló közösségekben. A 3-as genotípus valószínűleg Ázsiából eredeztethető, ahol számos szubtípusa fordul elő, ami több száz évre visszanyúló jelenlétre utal a térségben [Pybus és mtsai, 2005]. A fentiek alapján, véleményem szerint a gyarmattartó birodalmak révén juthatott a 3a szubtípus Európa i.v. kábítószer-használó közösségeibe. Egyes birodalmaktól nem állt távol a kábítószerek kereskedelme sem, pl. a Brit Birodalom Kelet-Indiai Társasága Indiában termelt ópiumot adott el Kínában, mely az ún. ópiumháborúk idejéből jól ismert [Bayer, 2000]. 79
Az NS5B-t kódoló nukleotid szekvenciák filogenetikai elemzései alapján elmondhatjuk, hogy a magyarországi i.v. droghasználókból kimutatott 3a szubtípusú vírusok nem formálnak külön klasztert, elkülönülve a külföldi szekvenciáktól. Ezt megerősítik azok a korábbi vizsgálatok is, amelyek nem találtak jól elkülönülő kládokat a különböző földrajzi területekről származó i.v. droghasználókból kimutatott 3-as genotípusú HCV-szekvenciák elemzésekor [Morice és mtsai, 2006]. A törzsfánkon a magyarországi szekvenciák azonban legalább négy szubklasztert, csoportot formáltak, melyek közül hármat erős bootstap értékek is megerősítettek. Az egy adott csoportba rendeződött vírusok hordozói valószínűleg közös forrásból fertőződhettek, pl. az injekciós tű/fecskendő közös használata révén.
8.2.9. A genotipizálások hatása a klinikusi gyakorlatra, valamint a droghasználók magatartására
A különböző genotípusú Hepatitis C virusok megbetegedés-okozó képessége különbözhet, pl. a 3-as genotípus gyakrabban vált ki zsírmájat (szteatózis), mint a többi genotípus [Rubbia-Brandt és mtsai, 2000; Rubbia-Brandt és mtsai, 2001; Sharma és mtsai, 2004]. A különböző genotípusú vírusok különböző módon reagálnak az interferon-α (IFN-α), ill. az interferon-α + ribavirin, ún. „kettős kezelésre” is. Magyarországon kezelésre mind az interferon-α-2a, mind az interferon-α-2b használatban van, melyeket leggyakrabban pegilált formában alkalmaznak. A kezelés legfőbb célja az ún. tartós virológiai válasz (SVR) elérése, mely akkor következik be, ha már a kezelés alatt a beteg vérplazmájából vagy vérsavójából nem mutatható ki a virális RNS megfelelően érzékeny polimeráz láncreakcióval (PCR), és a PCR negativitás még a kezelés befejezését követő 6. hónapban is fennáll. Ez természetesen nem jelenti azt, hogy a beteg véglegesen meggyógyult, hiszen előfordulhat, hogy a vírus a PCR érzékenységi küszöbe alatti kópiaszámban van jelen a vérben, vagy ha a vérben nincs is jelen a vírus, de pl. a májsejtekben megtalálható. Ezért SVR után is fontos a betegek nyomonkövetése az esetleges relapszus időbeni észleléséhez. Ez általában a vérszérum alanin
aminotranszferáz/transzamináz
(ALT),
korábbi
nevén
glutamát-piruvát
transzamináz (GPT) szintjének ellenőrzésével történik.
80
Negyvennyolc hét IFN-α + ribavirin kombinált kezelést követően az 1-es genotípust hordozó betegek körében 40-50%-ban alakul ki SVR, 4-es genotípust hordozók esetén 60-70%-ban. A 2-es vagy 3-as genotípusú HCV-vel fertőzött betegek csak 24 hét kezelést igényelnek, és az esetek >70%-ában SVR érhető el. Az 5-ös és 6-os genotípusokra vonatkozó kezelési hatékonyság a kis esetszámok miatt nem pontosan ismert [Rosen, 2011; Kamal és mtsai, 2005; El Makhzangy és mtsai, 2009]. A kezelés mellékhatásai igen gyakoriak és súlyosak is lehetnek, pl. krónikus fáradtság (~60%), fejfájás (~60%), izomfájdalom (~50%), láz (~40%), hányinger (~40%), álmatlanság (~40%), depresszió (~30%), ingerlékenység (~30%), étvágytalanság (~30%), izületi fájdalmak (~30%), hajhullás (~30%), hasmenés (~20%), viszketegség (~20%), bőrtünetek (~20%), nehézlégzés (~20%), köhögés (~15%), neutropénia (~20%), vérszegénység (~15%), trombocitopénia (~5%) [McHutchison és mtsai, 1998; Manns és mtsai, 2001; Fried és mtsai, 2002]. A HCV-genotípus vizsgálatainknak tehát nem csak epidemiológiai jelentősége van, hanem hatással van a magyarországi klinikusi gyakorlatra, valamint az i.v. droghasználók kezeléshez való hozzáállására is. Hiszen a 3-as genotípust hordozó betegek rövidebb kezelési időt igényelnek, ezáltal rövidebb ideig kell tolerálni a „kettős kezelés” miatt fellépő mellékhatásokat, ugyanakkor a gyógyulási esélyük jóval nagyobb, mint az 1-es genotípussal fertőzött személyeké. Mindezek a kezelés felvételére ösztönzhetik a HCV-hordozó i.v. droghasználókat. Vizsgálataink idején, illetve az angol nyelvű publikáció beküldésekor (2012. december 4.) érvényben lévő és a korábbi kezelési protokollok [ISZK, 2011] alapján az antivirális terápia megkezdése előtt nem volt kötelező előírás a HCV-genotipizálás, hiszen az átlagos populációból származó korábbi epidemiológiai adatok alapján Magyarországon szinte kizárólag az 1-es genotípus fordult elő. Csak a „célszerű” kifejezést olvashattuk a protokollokban, ill. a külföldön szerzett fertőzés esetén a „különösen javasoltat”. Ha nem történt genotipizálás, a protokoll szerint az 1-es genotípus kezelési algoritmusát kellett alkalmazni. Saját tapasztalatom és egy korábbi publikáció szerint nem volt általános gyakorlat a kezelés előtti genotípus meghatározás [Gazdag, 2011]. Az Emberi Erőforrások Minisztere által rendeletbe foglalt [EMMI, 2013], az Országos Egészségbiztosítási Pénztár 2013. május 1-étől hatályos finanszírozási protokolljával az ún. hármas kezelést (IFN-α + ribavirin + 1. generációs proteináz gátló) 81
is befogadta a hazai közfinanszírozott ellátásba. Anyagi okok miatt azonban csak a már kettős kezelésen átesett, és az arra nem megfelelően reagálók esetén alkalmazzák, várólista alapján. A protokoll szerint a HCV-genotípus meghatározása szükséges minden olyan betegnél, akinél a genotípus nem ismert, és vélhetően hármas kezelésre alkalmas lehet. A „hármas kezelés” előtt azért szükséges mindenképpen a genotípust meghatározni, mert az alkalmazott proteináz gátlók csak az 1-es genotípusú HCV-re hatásosak, egyéb genotípus esetén nem alkalmazhatók. Amennyiben genotípus vizsgálat nem történt, vagy a genotípus nem meghatározható, csak „kettős kezelés” végezhető. 2015. március 1-én és 2015. augusztus 18-án ismét újabb direkt ható vírusellenes szerek (NS5A, NS5B és NS3/4A gátlók) befogadása történt meg [a,EMMI, 2015; b,EMMI, 2015]. Ezek a szerek különböző kombinációkban IFN-mentes kezelést tesznek lehetővé közfinanszírozott módon azoknak az 1-es genotípusú HCV-t hordozó személyeknek, akik sem az IFN alapú kettős, sem a hármas kezelésre nem reagáltak, vagy azok számára, akiknek az IFN alkalmazása ellenjavallt. Ebbe a legújabb finanszírozási protokollba már beépítésre került, hogy kezelés előtt meg kell határozni a vírus genotípusát. A protokoll megemlíti, hogy amennyiben nem ellenjavalt, mindenkinél az új IFN-mentes szerek alkalmazása lenne indokolt, de a finanszírozási okok miatt került sor a protokoll fentiek szerinti meghatározására. Mivel vizsgálataink alapján az i.v. kábítószer-használók között a 3-as genotípus elfordulási aránya jóval gyakoribb, mint az átlagos népességben, az i.v. droghasználók „kettős kezelése” előtt mindenképpen szükségesnek tartjuk a vírus genotípusának meghatározását. Hiszen a 3-as genotípusra a gyakran mellékhatásokkal kísért „kettős kezelés” rövidebb ideig alkalmazva is jobb gyógyulási esélyeket nyújt, mint az 1-es genotípusra. Tehát nemcsak költségmegtakarítás érhető el, hanem a droghasználók nagyobb arányban léphetnek be a kezelési programba. Eredményeinkből látható, hogy a magyarországi BVI-kben fogvatartottak veszélyeztetett populációnak minősülnek a vizsgált vírusfertőzések, különösen a HCV szempontjából. A HCV legfőbb rizikótényezője az i.v. droghasználat a BVI-kben. A BVI-k jó környezetek a fertőzöttek kiszűrésére és az antivirális kezelések végrehajtására, különösen a nehezen elérhető i.v. droghasználók között. Arra is rámutattunk, hogy a 3-as genotípusú HCV gyakrabban fordul elő kábítószer-használók között, mint az átlagos populációban, ez a kezelések előtti genotipizálás fontosságát hangsúlyozza, és kedvező hatással lehet a kezelésben való részvételi hajlandóságra.
82
9. Összefoglalás Húsz magyarországi büntetés-végrehajtási intézetből gyűjtöttünk vérmintákat 2007 és 2009 között, a fogvatartottak közül önkéntesen 4 894, az alkalmazottak közül 1 066 személy vett részt a vizsgálatainkban. Meghatároztuk a Hepatitis C virus (HCV) szeroprevalenciát, valamint a Hepatitis B virus (HBV) felületi antigénjének előfordulását. A fogvatartottak 4,9%-a, az alkalmazottak 0,47%-a volt HCV-antitest pozitív, míg a HBV-t a fogvatartottak 1,5%-a, az alkalmazottak 0,38%-a hordozta. Megállapítottuk, hogy a magyarországi büntetés-végrehajtási intézetekben fogvatartott személyek mindkét vírus szempontjából veszélyeztetett populációnak számítanak, mert szignifikánsan gyakrabban fordult elő közöttük a HCV és a HBV, mint a büntetésvégrehajtás dolgozói, ill. az átlagos lakosság körében. Ezért a büntetés-végrehajtási intézetek a szűrőprogramok, és az antivirális kezelés szempontjából lényeges környezetek. A mért értékek ugyanakkor a világ legalacsonyabb értékei közé tartoznak. Magyarország mind a 7 statisztikai és tervezési régiójából 2006-tól 2011-ig 15 város 22 drogambulanciáján, illetve tűcsere programjában megjelent intravénás (i.v.) kábítószer-élvezőket kértük fel arra, hogy önkéntesen vegyenek részt vizsgálatainkban. Összesen 2 133 i.v. droghasználó ujjbegyéből vett kapilláris vérmintát vizsgáltunk meg. Összehasonlításul 89 antivirális kezelésben nem részesült HCV-hordozó személytől (átlagos népesség) vénást vért gyűjtöttünk be. A beszárított vércseppekből és vérsavóból mutattunk ki anti-HCV-antitesteket, valamint a vírus 5’nem kódoló régiójára specifikus nested PCR termékét megszekvenálva, filogenetikai törzsfa segítségével határoztuk meg a genotípusokat. Nukleinsav hibridizáció elvét alkalmazó LIPA-vizsgálattal állapítottuk meg a HCV-szubtípusokat. A 198 i.v. kábítószer-élvező közül, 147 (74,2%) a HCV 1-es genotípusát, 45 (22,7%) a 3-as genotípusát, míg 6 (3,0%) a 4-es genotípusát hordozta. A 43 1-es genotípust hordozó személyből 31 (72,1%) 1a szubtípussal volt fertőzött. A 3-as genotípus szignifikánsan gyakrabban fordult elő a vidéki városokban, mint Budapesten. Az idősebb életkor és a hosszabb ideje tartó droghasználat a 3-as genotípus gyakoribb előfordulásával korrelált, mely a jövőbeni genotípus arányokat jelezheti. Az i.v. droghasználók között szignifikánsan gyakrabban fordult elő a HCV 3-as genotípusa és 1a szubtípusa, mint az átlagos népesség körében, ahol az 1b szubtípus dominált. Mindezek az antivirális kezelés előtti genotipizálás fontosságát is hangsúlyozzák. 83
10. Summary We conducted a national, multicenter, cross-sectional study from 2007 to 2009 in order to assess the prevalence of Hepatitis B virus (HBV) and Hepatitis C virus (HCV) among prisoners. Overall, 4,894 inmates from 20 prisons were enrolled. To have a comparison group, prison staff were also asked to take part. Participation was voluntary. By ELISA and LIA 1.5% and 4.9%, of the prisoners were tested positive for HBsAg and anti-HCV antibodies, respectively. The prevalence of HBV and HCV in the Hungarian prison staff was significantly lower (0.38% and 0.47%, respectively), similar to the general population. This suggests that people who incarcerated in Hungarian prisons should be considered as a population at risk in terms of HBV and HCV infections. These prevalence data are among the lowest reported from prisons worldwide, although comparable to the Central European data. The opportunity to reach HCV infected people for treatment underlines the importance of screening programs for blood-borne viruses in prisons. We managed a study to determine the geographical distribution of HCV genotypes and subtypes among people who inject drugs (PWID). PWID recruited at 22 needle exchange sites and drug outpatient services in all seven Planning and Statistical Regions of Hungary and dried blood samples were collected. Of 198 such PWID, 147 (74.2%), 45 (22.7%) and six (3.0%) carried genotype 1, 3 or 4, respectively, and 31 (72.1%) of the 43 genotype 1 sequences were of subtype 1a. Genotype 3 was significantly more prevalent in provincial towns than in the capital, Budapest. Injecting for a longer period and an older age both correlated with a higher prevalence of genotype 3, suggesting possible future changes in genotype distribution. The distributions of hepatitis C virus genotypes and subtypes differed significantly between the tested PWID and the general population. Genotype 3 and subtype 1a was significantly more prevalent in the PWID population. The identification of genotype 3 and subtype 1a reflected theirs worldwide occurrence among PWID. Our results underline the importance of genotyping before treatment, especially among people who have ever injected drugs in Hungary.
11. Irodalomjegyzék Abe K, Konomi N. Hepatitis C virus RNA in dried serum spotted onto filter paper is stable at room temperature. J Clin Microbiol. 1998 Oct;36(10):3070-2. Aberle JH, Formann E, Steindl-Munda P, Weseslindtner L, Gurguta C, Perstinger G, Grilnberger E, Laferl H, Dienes HP, Popow-Kraupp T, Ferenci P, Holzmann H. Prospective study of viral clearance and CD4(+) T-cell response in acute hepatitis C primary infection and reinfection. J Clin Virol. 2006 May;36(1):24-31. Adjei AA, Armah HB, Gbagbo F, Ampofo WK, Boamah I, Adu-Gyamfi C, Asare I, Hesse IF, Mensah G. Correlates of HIV, HBV, HCV and syphilis infections among prison inmates and officers in Ghana: A national multicenter study. BMC Infect Dis. 2008 Mar 7;8:33. Adjei AA, Armah HB, Gbagbo F, Ampofo WK, Quaye IK, Hesse IF, Mensah G. Prevalence of human immunodeficiency virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus and syphilis among prison inmates and officers at Nsawam and Accra, Ghana. J Med Microbiol. 2006 May;55(Pt 5):593-7. AGDoHA (Australian Government Department of Health and Ageing). Australia’s notifiable disease status, 2009: Annual report of the national notifiable diseases surveillance system. Communicable Diseases Intelligence, Volume 35 No 2, 2011. (http://www.health.gov.au/internet/main/publishing.nsf/Content/cda-cdi3502-pdfcnt.htm/$FILE/cdi3502.pdf) Hozzáférés: 2012-04-03 Ahlquist P, Noueiry AO, Lee WM, Kushner DB, Dye BT. Host factors in positivestrand RNA virus genome replication. J Virol. 2003 Aug;77(15):8181-6. Alberti A, Morsica G, Chemello L, Cavalletto D, Noventa F, Pontisso P, Ruol A. Hepatitis C viraemia and liver disease in symptom-free individuals with anti-HCV. Lancet. 1992 Sep 19;340(8821):697-8. Allwright S, Bradley F, Long J, Barry J, Thornton L, Parry JV. Prevalence of antibodies to hepatitis B, hepatitis C, and HIV and risk factors in Irish prisoners: results of a national cross-sectional survey. BMJ. 2000;321:78-82. 85
Amako Y, Tsukiyama-Kohara K, Katsume A, Hirata Y, Sekiguchi S, Tobita Y, Hayashi Y, Hishima T, Funata N, Yonekawa H, Kohara M. Pathogenesis of hepatitis C virus infection in Tupaia belangeri. J Virol. 2010 Jan;84(1):303-11. Arnaud N, Dabo S, Akazawa D, Fukasawa M, Shinkai-Ouchi F, Hugon J, Wakita T, Meurs EF. Hepatitis C virus reveals a novel early control in acute immune response. PLoS Pathog. 2011 Oct;7(10):e1002289. Babudieri S, Longo B, Sarmati L, et al. Correlates of HIV, HBV, and HCV infections in a prison inmate population: results from a multicentre study in Italy. J Med Virol. 2005;76:311-317. Bancroft WH, Snitbhan R, Scott RM, Tingpalapong M, Watson WT, Tanticharoenyos P, Karwacki JJ, Srimarut S. Transmission of hepatitis B virus to gibbons by exposure to human saliva containing hepatitis B surface antigen. J Infect Dis. 1977 Jan;135(1):7985. Baril M, Racine ME, Penin F, Lamarre D. MAVS dimer is a crucial signaling component of innate immunity and the target of hepatitis C virus NS3/4A protease. J Virol. 2009 Feb;83(3):1299-311. Barrera JM, Bruguera M, Ercilla MG, Gil C, Celis R, Gil MP, del Valle Onorato M, Rodés J, Ordinas A. Persistent hepatitis C viremia after acute self-limiting posttransfusion hepatitis C. Hepatology. 1995 Mar;21(3):639-44. Basu D. Overview of substance abuse and hepatitis C virus infection and co-infections in India. J Neuroimmune Pharmacol. 2010 Dec;5(4):496-506. Bayer István. A drogok történelme. A kábítószerek története az ókoról napjainkig. Aranyhal Könyvkiadó Budapest, 2000. Bánhegyi D, Böröcz K, Kertész A, Melles M, Milassin M, Pechó Z, Pintér I, Szilágyi E. Tájékoztató a betegellátás során a vérrel és testváladékokkal terjedő vírusfertőzések megelőzéséről. Epinfo. 2003 Feb; 10. évf. 2. különszám. Bélec L, Legoff J, Si-Mohamed A, Bloch F, Mbopi Keou FX, Becquart P, Matta M, Prazuck T, Petite JP, Gutmann L, Payan C. Mucosal humoral immune response to hepatitis C virus E1/E2 surface glycoproteins and HCV shedding in saliva and
86
cervicovaginal fluids from chronically HCV-infected patients. J Hepatol. 2003 Jun;38(6):833-42. Bock CT, Schwinn S, Locarnini S, Fyfe J, Manns MP, Trautwein C, Zentgraf H. Structural organization of the hepatitis B virus minichromosome. J Mol Biol. 2001 Mar 16;307(1):183-96. Bozsonyi K, Csesztregi T, Dudás M, et al. National Report to the EMCDDA by the Reitox
National
Focal
Point.
2010.
http://www.drogfokuszpont.hu/dfp_docs/?id=nr_10_en.pdf. Hozzáférés: 2011-05-03 Burek V, Horvat J, Butorac K, Mikulic R. Viral hepatitis B, C and HIV infection in Croatian prisons. Epidemiol Infect. 2010;138:1610-1620. Caban J, Dolezal M, Błach A, Wiśniowski Z. Detection of HIV antibodies among prisoners from penitentiary units within the district penal institutions in Cracow. Przegl Epidemiol. 1990;44:155-159. CDC. Viral Hepatitis Surveillance – United States, 2009.
frissítve: 2011-09-22.
(http://www.cdc.gov/hepatitis/Statistics/2009Surveillance/PDFs/2009HepSurveillanceR pt.pdf) Hozzáférés: 2012-04-03 Chiaramonte M, Trivello R, Renzulli G, Zampieri L, Fanecco A, Floreani A, Naccarato R. Hepatitis B virus infection in prisons. A seroepidemiological survey in prisoners and attending staff. J Hyg (Lond). 1982 Aug;89(1):53-8. Chlabicz S, Flisiak R, Lapinski TW, Kowalczuk O, Wiercinska-Drapalo A, PytelKrolczuk B, Grzeszczuk A, Chyczewski L, Pancewicz J. Epidemiological features of patients infected with HCV genotype 4 in Poland: Epidemiology of HCV genotype 4 in Poland. Hepat Mon. 2011 Mar;11(3):191-4. Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW, Houghton M. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 1989 Apr 21;244(4902):359-62. Christensen PB, Krarup HB, Niesters HG, Norder H, Georgsen J. Prevalence and incidence of bloodborne viral infections among Danish prisoners. Eur J Epidemiol. 2000;16(11):1043-9.
87
Clarke A, Kulasegaram R. Hepatitis C transmission -- where are we now? Int J STD AIDS. 2006 Feb;17(2):74-80; quiz 80. Cochrane A, Searle B, Hardie A, Robertson R, Delahooke T, Cameron S, Tedder RS, Dusheiko GM, De Lamballerie X, Simmonds P. A genetic analysis of hepatitis C virus transmission between injection drug users. J Infect Dis. 2002 Nov 1;186(9):1212-21. Conry-Cantilena C, VanRaden M, Gibble J, Melpolder J, Shakil AO, Viladomiu L, Cheung L, DiBisceglie A, Hoofnagle J, Shih JW, et al. Routes of infection, viremia, and liver disease in blood donors found to have hepatitis C virus infection. N Engl J Med. 1996 Jun 27;334(26):1691-6. Cormier EG, Durso RJ, Tsamis F, Boussemart L, Manix C, Olson WC, Gardner JP, Dragic T. L-SIGN (CD209L) and DC-SIGN (CD209) mediate transinfection of liver cells by hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Sep 28;101(39):14067-72. Epub 2004 Sep 15. Corpet F. Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic Acids Res. 1988 Nov 25;16(22):10881-90. a,
Cox AL, Mosbruger T, Lauer GM, Pardoll D, Thomas DL, Ray SC. Comprehensive
analyses of CD8+ T cell responses during longitudinal study of acute human hepatitis C. Hepatology. 2005 Jul;42(1):104-12. b,
Cox AL, Mosbruger T, Mao Q, Liu Z, Wang XH, Yang HC, Sidney J, Sette A, Pardoll
D, Thomas DL, Ray SC. Cellular immune selection with hepatitis C virus persistence in humans. J Exp Med. 2005 Jun 6;201(11):1741-52. Cserszegi T, Csohán Á, Elekes Zs, et al. National Report to the EMCDDA by the Reitox
National
Focal
Point.
2009.
http://www.drogfokuszpont.hu/dfp_docs/?id=nr_09_en.pdf. Hozzáférés: 2012-05-29 Csohán Á, Molnár Zs, Jelenik Zs, Melles M, Pauliny Zs, Békési Zs. Módszertani levél a 2009. évi védőoltásokról. Epinfo. 16. évf. 1. különszám. Dane DS, Cameron CH, Briggs M. Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen-associated hepatitis. Lancet. 1970 Apr 4;1(7649):695-8.
88
Daniels D, Grytdal S, Wasley A; Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Surveillance for acute viral hepatitis - United States, 2007. MMWR Surveill Summ. 2009 May 22;58(3):1-27. Dencs A, Hettmann A, Martyin T, Jekkel C, Bányai T, Takács M. Phylogenetic investigation of nosocomial transmission of hepatitis C virus in an oncology ward. J Med Virol. 2011 Mar;83(3):428-36. Diepolder HM, Zachoval R, Hoffmann RM, Wierenga EA, Santantonio T, Jung MC, Eichenlaub D, Pape GR. Possible mechanism involving T-lymphocyte response to nonstructural protein 3 in viral clearance in acute hepatitis C virus infection. Lancet. 1995 Oct 14;346(8981):1006-7. Dudás M, Csohán Á. Az intravénás kábítószer-használattal összefüggő hazai HIV-, illetve HCV-prevalencia 2014-ben. Epinfo.22. évf. 18. szám. 189-194. Dupinay T, Gheit T, Roques P, Cova L, Chevallier-Queyron P, Tasahsu SI, Le Grand R, Simon F, Cordier G, Wakrim L, Benjelloun S, Trépo C, Chemin I. Discovery of naturally occurring transmissible chronic hepatitis B virus infection among Macaca fascicularis from Mauritius Island. Hepatology. 2013 Nov;58(5):1610-20. Egger D, Wölk B, Gosert R, Bianchi L, Blum HE, Moradpour D, Bienz K. Expression of hepatitis C virus proteins induces distinct membrane alterations including a candidate viral replication complex. J Virol. 2002 Jun;76(12):5974-84. El Makhzangy H, Esmat G, Said M, Elraziky M, Shouman S, Refai R, Rekacewicz C, Gad RR, Vignier N, Abdel-Hamid M, Zalata K, Bedossa P, Pol S, Fontanet A, Mohamed MK. Response to pegylated interferon alfa-2a and ribavirin in chronic hepatitis C genotype 4. J Med Virol. 2009 Sep;81(9):1576-83. EM (Egészségügyi Minisztérium) szakmai protokollja Az egészséges csecsemő táplálásáról (1. módosított változat) Egészségügyi Közlöny. 2009 Nov;59(21):30433070. EMCDDA (2010) Annual report on the state of the drugs problem in Europe. EMCDDA,
Lisbon,
November
2010.
http://www.emcdda.europa.eu/publications/annual-report/ 2010. Hozzáférés: 2012-05-23
89
EMMI, 32/2013. (IV. 30.) rendelete a finanszírozási eljárásrendekről szóló 31/2010. (V. 13.) EüM rendelet módosításáról. Magyar Közlöny. 2013Ápr;71:50719-50740. a,
EMMI, 10/2015. (II.23.) rendelete egyes gyógyszerészeti és orvostechnikai tárgyú
miniszteri rendeletek módosításáról Magyar Közlöny. 2015Feb;21:1576-1637. b,
EMMI, 38/2015. (VIII.17.) rendelete a törzskönyvezett gyógyszerek és a különleges
táplálkozási igényt kielégítő tápszerek társadalombiztosítási támogatásba való befogadásának szempontjairól és a befogadás vagy a támogatás megváltoztatásáról szóló 32/2004. (IV. 26.) ESZCSM rendelet és a finanszírozási eljárásrendekről szóló 31/2010. (V. 13.) EüM rendelet módosításáról. Magyar Közlöny. 2015Aug;117:1885418894. EuroHIV. HIV/AIDS Surveillance in Europe: Mid-year report 2007. Saint-Maurice, France:
Institut
de
Veille
Sanitaire;
2007.
No.
76.
http://www.ecdc.europa.eu/en/activities/surveillance/hiv/Documents/report_eurohiv_mi dyear_2007.pdf. Hozzáférés: 2011-05-05 EüM, 31/2010. (V.13.) EüM rendelet a finanszírozási eljárásrendekről. Magyar Közlöny. 2010Máj;77:16739-16891. Evans JL, Hahn JA, Page-Shafer K, Lum PJ, Stein ES, Davidson PJ, Moss AR. Gender differences in sexual and injection risk behavior among active young injection drug users in San Francisco (the UFO Study). J Urban Health. 2003 Mar;80(1):137-46. Fafi-Kremer S, Fauvelle C, Felmlee DJ, Zeisel MB, Lepiller Q, Fofana I, Heydmann L, Stoll-Keller F, Baumert TF. Neutralizing antibodies and pathogenesis of hepatitis C virus infection. Viruses. 2012 Oct 9;4(10):2016-30. Farci P, Alter HJ, Shimoda A, Govindarajan S, Cheung LC, Melpolder JC, Sacher RA, Shih JW, Purcell RH. Hepatitis C virus-associated fulminant hepatic failure. N Engl J Med. 1996 Aug 29;335(9):631-4. Fattovich G, Giustina G, Degos F, Tremolada F, Diodati G, Almasio P, Nevens F, Solinas A, Mura D, Brouwer JT, Thomas H, Njapoum C, Casarin C, Bonetti P, Fuschi P, Basho J, Tocco A, Bhalla A, Galassini R, Noventa F, Schalm SW, Realdi G. Morbidity and mortality in compensated cirrhosis type C: a retrospective follow-up study of 384 patients. Gastroenterology. 1997 Feb;112(2):463-72. 90
Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 1985 39:783-791. Fontaine J, Likatavicius G, Salminen M, van de Laar M. Sexually transmitted infections, including HIV and blood-borne viruses In: Epidemiological Report 2011. Reporting on 2009 surveillance data and 2010 epidemic intelligence data. European Centre for Disease
Prevention
and
Control.
Stockholm:
ECDC;
2011.
(http://ecdc.europa.eu/en/publications/Publications/1111_SUR_Annual_Epidemiologica l_Report_on_Communicable_Diseases_in_Europe.pdf). Hozzáférés: 2012-03-28 Fried MW, Shiffman ML, Reddy KR, Smith C, Marinos G, Gonçales FL Jr, Häussinger D, Diago M, Carosi G, Dhumeaux D, Craxi A, Lin A, Hoffman J, Yu J. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection. N Engl J Med. 2002 Sep 26;347(13):975-82. Fuller MJ, Shoukry NH, Gushima T, Bowen DG, Callendret B, Campbell KJ, Hasselschwert DL, Hughes AL, Walker CM. Selection-driven immune escape is not a significant factor in the failure of CD4 T cell responses in persistent hepatitis C virus infection. Hepatology. 2010 Feb;51(2):378-87. Gale MJ Jr, Korth MJ, Tang NM, Tan SL, Hopkins DA, Dever TE, Polyak SJ, Gretch DR, Katze MG. Evidence that hepatitis C virus resistance to interferon is mediated through repression of the PKR protein kinase by the nonstructural 5A protein. Virology. 1997 Apr 14;230(2):217-27. Gale M Jr, Foy EM. Evasion of intracellular host defence by hepatitis C virus. Nature. 2005 Aug 18;436(7053):939-45. Gazdag G, Horváth G, Szabó O, Ungvari GS. Difficulties with interferon treatment in former intravenous drug users. Braz J Infect Dis. 2011 Mar-Apr;15(2):163-6. Gelley F, Gámán G, Gerlei Z, Zádori G, Görög D, Kóbori L, Fehérvári I, Schuller J, Szőnyi L, Nagy P, Doros A, Fazakas J, Lengyel G, Schaff Z, Kiss A, Sárváry E, Nemes B. Hepatitis C-vírus-fertőzés kiújulása májátültetés után. Mi változott az elmúlt 10 évben? Orv Hetil. 2013 Jul 7;154(27):1058-66.
91
Gervain J, Simon Jr G, Simon J; Hungarian Viral Hepatitis Group. Genotype distribution of hepatitis C virus in the Hungarian population with chronic viral hepatitis C. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2003 Apr;15(4):449-50. Golden-Mason L, Palmer BE, Kassam N, Townshend-Bulson L, Livingston S, McMahon BJ, Castelblanco N, Kuchroo V, Gretch DR, Rosen HR. Negative immune regulator Tim-3 is overexpressed on T cells in hepatitis C virus infection and its blockade rescues dysfunctional CD4+ and CD8+ T cells. J Virol. 2009 Sep;83(18):9122-30. Golden-Mason L, Palmer B, Klarquist J, Mengshol JA, Castelblanco N, Rosen HR. Upregulation of PD-1 expression on circulating and intrahepatic hepatitis C virusspecific CD8+ T cells associated with reversible immune dysfunction. J Virol. 2007 Sep;81(17):9249-58. Gosert R, Egger D, Lohmann V, Bartenschlager R, Blum HE, Bienz K, Moradpour D. Identification of the hepatitis C virus RNA replication complex in Huh-7 cells harboring subgenomic replicons. J Virol. 2003 May;77(9):5487-92. Gower E, Estes C, Blach S, Razavi-Shearer K, Razavi H. Global epidemiology and genotype distribution of the hepatitis C virus infection. J Hepatol. 2014 Nov;61(1 Suppl):S45-57. Grüner NH, Gerlach TJ, Jung MC, Diepolder HM, Schirren CA, Schraut WW, Hoffmann R, Zachoval R, Santantonio T, Cucchiarini M, Cerny A, Pape GR. Association of hepatitis C virus-specific CD8+ T cells with viral clearance in acute hepatitis C. J Infect Dis. 2000 May;181(5):1528-36. Guidotti LG, Chisari FV. Immunobiology and pathogenesis of viral hepatitis. Annu Rev Pathol. 2006;1:23-61. Guindon S, Gascuel O. A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood. Syst Biol. 2003 Oct;52(5):696-704. Hagan H, Thiede H, Weiss NS, Hopkins SG, Duchin JS, Alexander ER. Sharing of drug preparation equipment as a risk factor for hepatitis C. Am J Public Health. 2001 Jan;91(1):42-6.
92
Hammett TM. HIV/AIDS and other infectious diseases among correctional inmates: transmission, burden, and an appropriate response. Am J Public Health. 2006 Jun;96(6):974-8. Epub 2006 Jan 31. Review. Hammett TM, Harmon MP, Rhodes W. The burden of infectious disease among inmates of and releasees from US correctional facilities, 1997. Am J Public Health. 2002 Nov;92(11):1789-94. Han SH. Extrahepatic manifestations of chronic hepatitis B. Clin Liver Dis. 2004 May;8(2):403-18. Hellard ME, Aitken CK, Hocking JS. Tattooing in prisons—not such a pretty picture. Am J Infect Control. 2007;35:477-480. Helle F, Dubuisson J. Hepatitis C virus entry into host cells. Cell Mol Life Sci. 2008 Jan;65(1):100-12. Hennessey KA, Kim AA, Griffin V, Collins NT, Weinbaum CM, Sabin K. Prevalence of infection with hepatitis B and C viruses and co-infection with HIV in three jails: a case for viral hepatitis prevention in jails in the United States. J Urban Health. 2009;86:93-105. Hersh BS, Popovici F, Apetrei RC, Zolotusca L, Beldescu N, Calomfirescu A, Jezek Z, Oxtoby MJ, Gromyko A, Heymann DL. Acquired immunodeficiency syndrome in Romania. Lancet. 1991 Sep 14;338(8768):645-9. Héjjas M, Medgyesi GA, Falus A, Hajnal A, Forster T, Szabó J. HCV antibodies in Hungarian blood donations. Experiences collected by ELISA tests, immunoblot assays and polymerase chain reaction and protocols for donor management. Transfus Med. 1994 Dec;4(4):273-80. Hickman M, McDonald T, Judd A, Nichols T, Hope V, Skidmore S, Parry JV. Increasing the uptake of hepatitis C virus testing among injecting drug users in specialist drug treatment and prison settings by using dried blood spots for diagnostic testing: a cluster randomized controlled trial. J Viral Hepat. 2008 Apr;15(4):250-4.
93
HIV/AIDS surveillance in Europe. SURVEILLANCE REPORT. 2013. ECDC, WHO. http://ecdc.europa.eu/en/publications/Publications/hiv-aids-surveillance-report-Europe2013.pdf Hozzáférés: 2015.11.10. Hong X, Yu RB, Sun NX, Wang B, Xu YC, Wu GL. Human leukocyte antigen class II DQB1*0301, DRB1*1101 alleles and spontaneous clearance of hepatitis C virus infection: a meta-analysis. World J Gastroenterol. 2005 Dec 14;11(46):7302-7. Hoofnagle JH. Hepatitis C: the clinical spectrum of disease. Hepatology. 1997 Sep;26(3 Suppl 1):15S-20S. Hope VD, Hickman M, Ngui SL, Jones S, Telfer M, Bizzarri M, Ncube F, Parry JV. Measuring the incidence, prevalence and genetic relatedness of hepatitis C infections among a community recruited sample of injecting drug users, using dried blood spots. J Viral Hepat. 2011 Apr;18(4):262-70. Horne JA, Clements AJ, Drennan P, Stein K, Cramp ME. Screening for hepatitis C virus in the Dartmoor prison population: an observational study. J Public Health (Oxf). 2004;26:372-375. ISZK (Infektológiai Szakmai Kollégium) A Nemzeti Erőforrás Minisztérium szakmai protokollja a C hepatitis antivirális kezeléséről. Egészségügyi Közlöny 2011. 61. évf. 7. szám 1393-1401. Jo J, Aichele U, Kersting N, Klein R, Aichele P, Bisse E, Sewell AK, Blum HE, Bartenschlager R, Lohmann V, Thimme R. Analysis of CD8+ T-cell-mediated inhibition of hepatitis C virus replication using a novel immunological model. Gastroenterology. 2009 Apr;136(4):1391-401. Kamal SM, El Tawil AA, Nakano T, He Q, Rasenack J, Hakam SA, Saleh WA, Ismail A, Aziz AA, Madwar MA. Peginterferon {alpha}-2b and ribavirin therapy in chronic hepatitis C genotype 4: impact of treatment duration and viral kinetics on sustained virological response. Gut. 2005 Jun;54(6):858-66. Kazi AM, Shah SA, Jenkins CA, Shepherd BE, Vermund SH. Risk factors and prevalence of tuberculosis, human immunodeficiency virus, syphilis, hepatitis B virus, and hepatitis C virus among prisoners in Pakistan. Int J Infect Dis. 2010 Sep;14 Suppl 3:e60-6. 94
Khattab MA, Eslam M, Alavian SM. Hepatitis C virus as a multifaceted disease: a simple and updated approach for extrahepatic manifestations of hepatitis C virus infection. Hepat Mon. 2010 Fall;10(4):258-69. Kheirandish P, SeyedAlinaghi S, Jahani M, Shirzad H, Seyed Ahmadian M, Majidi A, Sharifi A, Hosseini M, Mohraz M, McFarland W. Prevalence and correlates of hepatitis C infection among male injection drug users in detention, Tehran, Iran. J Urban Health. 2009 Nov;86(6):902-8. Kolarić B, Stajduhar D, Gajnik D, Rukavina T, Wiessing L. Seroprevalence of bloodborne infections and population sizes estimates in a population of injecting drug users in Croatia. Cent Eur J Public Health. 2010;18:104-109. Krekulová L, Rehák V, Strunecký O, Nēmecek V. [Current situation and trends in the hepatitis C virus genotype distribution among injecting drug users in the Czech Republic]. Epidemiol Mikrobiol Imunol. 2009 Apr;58(2):84-9. Larrea E, Aldabe R, Molano E, Fernandez-Rodriguez CM, Ametzazurra A, Civeira MP, Prieto J. Altered expression and activation of signal transducers and activators of transcription (STATs) in hepatitis C virus infection: in vivo and in vitro studies. Gut. 2006 Aug;55(8):1188-96. Laskus T, Radkowski M, Lupa E, et al. Prevalence of markers of hepatotropic viruses among drug addicts in Warsaw, Poland. J Hepatol. 1992;15:114-117. Lauer GM, Walker BD. Hepatitis C virus infection. N Engl J Med. 2001 Jul 5;345(1):41-52. Lavanchy D. Viral hepatitis: global goals for vaccination. J Clin Virol. 2012 Dec;55(4):296-302. Li K, Foy E, Ferreon JC, Nakamura M, Ferreon AC, Ikeda M, Ray SC, Gale M Jr, Lemon SM. Immune evasion by hepatitis C virus NS3/4A protease-mediated cleavage of the Toll-like receptor 3 adaptor protein TRIF. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Feb 22;102(8):2992-7. Linnemann CC Jr, Kramer LW, Askey PA. Familial clustering of hepatitis B infections in gorillas. Am J Epidemiol. 1984 Mar;119(3):424-30.
95
Liou TC, Chang TT, Young KC, Lin XZ, Lin CY, Wu HL. Detection of HCV RNA in saliva, urine, seminal fluid, and ascites. J Med Virol. 1992 Jul;37(3):197-202. Liu WL, Su WC, Cheng CW, Hwang LH, Wang CC, Chen HL, Chen DS, Lai MY. Ribavirin up-regulates the activity of double-stranded RNA-activated protein kinase and enhances the action of interferon-alpha against hepatitis C virus. J Infect Dis. 2007 Aug 1;196(3):425-34. Long J, Allwright S, Barry J, et al. Prevalence of antibodies to hepatitis B, hepatitis C, and HIV and risk factors in entrants to Irish prisons: a national cross-sectional survey. BMJ. 2001;323:1209-1213. Loo YM, Gale M Jr. Immune signaling by RIG-I-like receptors. Immunity. 2011 May 27;34(5):680-92. Macalino GE, Vlahov D, Sanford-Colby S, Patel S, Sabin K, Salas C, Rich JD. Prevalence and incidence of HIV, hepatitis B virus, and hepatitis C virus infections among males in Rhode Island prisons. Am J Public Health. 2004 Jul;94(7):1218-23. Erratum in Am J Public Health. 2004 Nov;94(11):1847. MacDonald M, Crofts N, Kaldor J. Transmission of hepatitis C virus: rates, routes, and cofactors. Epidemiol Rev. 1996;18(2):137-48. a,
Mahfoud Z, Kassak K, Kreidieh K, Shamra S, Ramia S. Distribution of hepatitis C
virus genotypes among injecting drug users in Lebanon. Virol J. 2010 May 13;7:96. b,
Mahfoud Z, Kassak K, Kreidieh K, Shamra S, Ramia S. Prevalence of antibodies to
human immunodeficiency virus (HIV), hepatitis B and hepatitis C and risk factors in prisoners in Lebanon. J Infect Dev Ctries. 2010;4:144-149. Major ME, Feinstone SM. The molecular virology of hepatitis C. Hepatology. 1997 Jun;25(6):1527-38. Manns MP, McHutchison JG, Gordon SC, Rustgi VK, Shiffman M, Reindollar R, Goodman ZD, Koury K, Ling M, Albrecht JK. Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C: a randomised trial. Lancet. 2001 Sep 22;358(9286):958-65.
96
Massad E, Rozman M, Azevedo RS, et al. Seroprevalence of HIV, HCV and syphilis in Brazilian prisoners: preponderance of parenteral transmission. Eur J Epidemiol. 1999;15:439-445. McAllister CS, Samuel CE. The RNA-activated protein kinase enhances the induction of interferon-beta and apoptosis mediated by cytoplasmic RNA sensors. J Biol Chem. 2009 Jan 16;284(3):1644-51. McHutchison JG, Gordon SC, Schiff ER, Shiffman ML, Lee WM, Rustgi VK, Goodman ZD, Ling MH, Cort S, Albrecht JK. Interferon alfa-2b alone or in combination with ribavirin as initial treatment for chronic hepatitis C. Hepatitis Interventional Therapy Group. N Engl J Med. 1998 Nov 19;339(21):1485-92. McKiernan SM, Hagan R, Curry M, McDonald GS, Kelly A, Nolan N, Walsh A, Hegarty J, Lawlor E, Kelleher D. Distinct MHC class I and II alleles are associated with hepatitis C viral clearance, originating from a single source. Hepatology. 2004 Jul;40(1):108-14. Meireles LC, Marinho RT, Van Damme P. Three decades of hepatitis B control with vaccination. World J Hepatol. 2015 Aug 28;7(18):2127-32. Meyer MF, Wedemeyer H, Monazahian M, Dreesman J, Manns MP, Lehmann M. Prevalence of hepatitis C in a German prison for young men in relation to country of birth. Epidemiol Infect. 2007;135:274-280. Morice Y, Cantaloube JF, Beaucourt S, Barbotte L, De Gendt S, Goncales FL, Butterworth L, Cooksley G, Gish RG, Beaugrand M, Fay F, Fay O, Gonzalez JE, Martins RM, Dhumeaux D, Vanderborght B, Stuyver L, Sablon E, de Lamballerie X, Pawlotsky JM. Molecular epidemiology of hepatitis C virus subtype 3a in injecting drug users. J Med Virol. 2006 Oct;78(10):1296-303. Mozer-Lisewska I, Kowala-Piaskowska A, Mania A, Jenek R, Samara H, Kaczmarek E, Sikora J, Służewski W, Zeromski J. Expression of pattern recognition receptors in liver biopsy specimens of children chronically infected with HBV and HCV. Folia Histochem Cytobiol. 2011;49(3):410-6. Murphy D, Chamberland J, Dandavino R, Sablon E. A new genotype of hepatitis C virus orginating from central Africa [Abstract]. Hepatology. 2007;46:623A. 97
Müller Z, Deák J, Ross RS, Nagy E, Kovács L, Roggendorf M, Kessler HH. Hepatitis C virus genotypes in Hungarian and Austrian patients with chronic hepatitis C. J Clin Virol. 2003 Apr;26(3):295-300. Nakamoto N, Cho H, Shaked A, Olthoff K, Valiga ME, Kaminski M, Gostick E, Price DA, Freeman GJ, Wherry EJ, Chang KM. Synergistic reversal of intrahepatic HCVspecific CD8 T cell exhaustion by combined PD-1/CTLA-4 blockade. PLoS Pathog. 2009 Feb;5(2):e1000313. a,
Nazare C, Girleanu I, Cojocariu-Salloum C, Trifan A. [Characteristics of hepatitis C
virus (HCV) infection in closed communities]. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2011 Jul-Sep;115(3):736-41. b,
Nazare C, Gîrleanu I, Cojocariu-Salloum C, Trifan A. [Prevalence of chronic hepatitis
B virus (HBV) infection in closed communities and risk behaviour]. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2011 Apr-Jun;115(2):325-30. Nemes B, Sárváry E, Kóbori L, Gerlei Z, Fehérvári I, Görög D, Perner F, Ther G, Varga M, Szonyi L, Telegdy L, Schuller J, Weszelits V, Járay J. A hazai májátültetési program demográfiai, perioperatív és mortalitási adatai. Orv Hetil. 2005 Jul 3;146(27):1423-32. Neumann-Haefelin C, Timm J, Spangenberg HC, Wischniowski N, Nazarova N, Kersting N, Roggendorf M, Allen TM, Blum HE, Thimme R. Virological and immunological determinants of intrahepatic virus-specific CD8+ T-cell failure in chronic hepatitis C virus infection. Hepatology. 2008 Jun;47(6):1824-36. Niculescu I, Paraschiv S, Paraskevis D, Abagiu A, Batan I, Banica L, Otelea D. Recent HIV-1 Outbreak Among Intravenous Drug Users in Romania: Evidence for Cocirculation of CRF14_BG and Subtype F1 Strains. AIDS Res Hum Retroviruses. 2015 May;31(5):488-95. Noguchi T, Satoh S, Noshi T, Hatada E, Fukuda R, Kawai A, Ikeda S, Hijikata M, Shimotohno K. Effects of mutation in hepatitis C virus nonstructural protein 5A on interferon resistance mediated by inhibition of PKR kinase activity in mammalian cells. Microbiol
Immunol.
2001;45(12):829-40. Erratum
in
Microbiol
Immunol.
2002;46(4):305
98
Offergeld R, Faensen D, Ritter S, Hamouda O. Human immunodeficiency virus, hepatitis C and hepatitis B infections among blood donors in Germany 2000-2002: risk of virus transmission and the impact of nucleic acid amplification testing. Euro Surveill. 2005 Feb;10(2):8-11. Okanoue T, Itoh Y, Minami M, Hashimoto H, Yasui K, Yotsuyanagi H, Takehara T, Kumada T, Tanaka E, Nishiguchi S, Izumi N, Sata M, Onji M, Yamada G, Okita K, Kumada H. Guidelines for the antiviral therapy of hepatitis C virus carriers with normal serum aminotransferase based on platelet counts. Hepatol Res. 2008 Jan;38(1):27-36. Ortiz-Movilla N, Lázaro P, Rodríguez-Iñigo E, Bartolomé J, Longo I, Lecona M, Pardo M, Carreño V. Hepatitis C virus replicates in sweat glands and is released into sweat in patients with chronic hepatitis C. J Med Virol. 2002 Dec;68(4):529-36. Ott JJ, Stevens GA, Groeger J, Wiersma ST. Global epidemiology of hepatitis B virus infection: new estimates of age-specific HBsAg seroprevalence and endemicity. Vaccine. 2012 Mar 9;30(12):2212-9. Pacifico L, Ferraro F, Bonci E, Anania C, Romaggioli S, Chiesa C. Upper limit of normal for alanine aminotransferase: quo vadis? Clin Chim Acta. 2013 Jun 25;422:2939. Pestka JM, Zeisel MB, Bläser E, Schürmann P, Bartosch B, Cosset FL, Patel AH, Meisel H, Baumert J, Viazov S, Rispeter K, Blum HE, Roggendorf M, Baumert TF. Rapid induction of virus-neutralizing antibodies and viral clearance in a single-source outbreak of hepatitis C. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Apr 3;104(14):6025-30. Posada D, Crandall KA. MODELTEST: testing the model of DNA substitution. Bioinformatics. 1998;14(9):817-8. Puoti C. Hepatitis C with normal aminotransferase levels. Dig Dis. 2007;25:277–8. Puoti C, Bellis L, Guarisco R, Dell' Unto O, Spilabotti L, Costanza OM. HCV carriers with normal alanine aminotransferase levels: healthy persons or severely ill patients? Dealing with an everyday clinical problem. Eur J Intern Med. 2010 Apr;21(2):57-61.
99
Puri N, DeBeck K, Feng C, Kerr T, Rieb L, Wood E. Gender influences on hepatitis C incidence among street youth in a Canadian setting. J Adolesc Health. 2014 Dec;55(6):830-4. Pybus OG, Cochrane A, Holmes EC, Simmonds P. The hepatitis C virus epidemic among injecting drug users. Infect Genet Evol. 2005 Mar;5(2):131-9. Quinkert D, Bartenschlager R, Lohmann V. Quantitative analysis of the hepatitis C virus replication complex. J Virol. 2005 Nov;79(21):13594-605. Revie D, Salahuddin SZ. Human cell types important for hepatitis C virus replication in vivo and in vitro: old assertions and current evidence. Virol J. 2011 Jul 11;8:346 Rosen HR. Clinical practice. Chronic hepatitis C infection. N Engl J Med. 2011 Jun 23;364(25):2429-38. Rubbia-Brandt L, Leandro G, Spahr L, Giostra E, Quadri R, Malé PJ, Negro F. Liver steatosis in chronic hepatitis C: a morphological sign suggesting infection with HCV genotype 3. Histopathology. 2001 Aug;39(2):119-24. Rubbia-Brandt L, Quadri R, Abid K, Giostra E, Malé PJ, Mentha G, Spahr L, Zarski JP, Borisch B, Hadengue A, Negro F. Hepatocyte steatosis is a cytopathic effect of hepatitis C virus genotype 3. J Hepatol. 2000 Jul;33(1):106-15. Ruiz-Extremera A, Salmerón J, Torres C, De Rueda PM, Giménez F, Robles C, Miranda MT. Follow-up of transmission of hepatitis C to babies of human immunodeficiency virus-negative women: the role of breast-feeding in transmission. Pediatr Infect Dis J. 2000 Jun;19(6):511-6. Rutebemberwa A, Ray SC, Astemborski J, Levine J, Liu L, Dowd KA, Clute S, Wang C, Korman A, Sette A, Sidney J, Pardoll DM, Cox AL. High-programmed death-1 levels on hepatitis C virus-specific T cells during acute infection are associated with viral persistence and require preservation of cognate antigen during chronic infection. J Immunol. 2008 Dec 15;181(12):8215-25. Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol. 1987 Jul;4(4):406-25.
100
Sansonno D, Dammacco F. Hepatitis C virus, cryoglobulinaemia, and vasculitis: immune complex relations. Lancet Infect Dis. 2005 Apr;5(4):227-36. Sáiz de la Hoya P, Bedia M, Murcia J, Cebriá J, Sánchez-Payá J, Portilla J. [Predictive markers of HIV and HCV infection and co-infection among inmates in a Spanish prison]. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2005 Feb;23(2):53-7. Scheinmann R, Hagan H, Lelutiu-Weinberger C, Stern R, Des Jarlais DC, Flom PL, Strauss S. Non-injection drug use and Hepatitis C Virus: a systematic review. Drug Alcohol Depend. 2007 Jun 15;89(1):1-12. Schlaphoff V, Lunemann S, Suneetha PV, Jaroszewicz J, Grabowski J, Dietz J, Helfritz F, Bektas H, Sarrazin C, Manns MP, Cornberg M, Wedemeyer H. Dual function of the NK cell receptor 2B4 (CD244) in the regulation of HCV-specific CD8+ T cells. PLoS Pathog. 2011 May;7(5):e1002045. Schulze zur Wiesch J, Lauer GM, Day CL, Kim AY, Ouchi K, Duncan JE, Wurcel AG, Timm J, Jones AM, Mothe B, Allen TM, McGovern B, Lewis-Ximenez L, Sidney J, Sette A, Chung RT, Walker BD. Broad repertoire of the CD4+ Th cell response in spontaneously controlled hepatitis C virus infection includes dominant and highly promiscuous epitopes. J Immunol. 2005 Sep 15;175(6):3603-13. Seme K, Poljak M, Lesnicar G, Brinovec V, Stepec S, Koren S. Distribution of hepatitis C virus genotypes in Slovenia. Scand J Infect Dis. 1997;29(1):29-31. Semmo N, Lucas M, Krashias G, Lauer G, Chapel H, Klenerman P. Maintenance of HCV-specific T-cell responses in antibody-deficient patients a decade after early therapy. Blood. 2006 Jun 1;107(11):4570-1. Sharma NR, Mateu G, Dreux M, Grakoui A, Cosset FL, Melikyan GB. Hepatitis C virus is primed by CD81 protein for low pH-dependent fusion. J Biol Chem. 2011 Sep 2;286(35):30361-76. Epub 2011 Jul 7. Sharma P, Balan V, Hernandez J, Rosati M, Williams J, Rodriguez-Luna H, Schwartz J, Harrison E, Anderson M, Byrne T, Vargas HE, Douglas DD, Rakela J. Hepatic steatosis in hepatitis C virus genotype 3 infection: does it correlate with body mass index, fibrosis, and HCV risk factors? Dig Dis Sci. 2004 Jan;49(1):25-9.
101
Shoukry NH, Grakoui A, Houghton M, Chien DY, Ghrayeb J, Reimann KA, Walker CM. Memory CD8+ T cells are required for protection from persistent hepatitis C virus infection. J Exp Med. 2003 Jun 16;197(12):1645-55. Smith DB, Bukh J, Kuiken C, Muerhoff AS, Rice CM, Stapleton JT, Simmonds P. Expanded classification of hepatitis C virus into 7 genotypes and 67 subtypes: updated criteria and genotype assignment web resource. Hepatology. 2014 Jan;59(1):318-27. Solomon L, Flynn C, Muck K, Vertefeuille J. Prevalence of HIV, syphilis, hepatitis B, and hepatitis C among entrants to Maryland correctional facilities. J Urban Health. 2004;81:25-37. Spengler
U,
Nischalke
HD,
Nattermann
J,
Strassburg
CP.
Between Scylla and Charybdis: the role of the human immune system in the pathogenesis of hepatitis C. World J Gastroenterol. 2013 Nov 28;19(44):7852-66. Staneková D, Ondrejka D, Habeková M, Wimmerová S, Kucerková S. Pilot study of risk behaviour, voluntary HIV counselling and HIV antibody testing from saliva among inmates of prisons in Slovakia. Cent Eur J Public Health. 2001;9:87-90. Stark K, Bienzle U, Vonk R, Guggenmoos-Holzmann I. History of syringe sharing in prison and risk of hepatitis B virus, hepatitis C virus, and human immunodeficiency virus infection among injecting drug users in Berlin. Int J Epidemiol. 1997;26:13591366. Straub I, Csohán Á, Lontai I, Melles M. A Johan Béla Országos Epidemiológiai Központ módszertani levele a 1999. évi védőoltásokról. Epinfo 1999. 6. évfolyam, 1. különszám 9.o. Sultana C, Oprisan G, Szmal C, Vagu C, Temereanca A, Dinu S, Teleman MD, Ruta S. Molecular epidemiology of hepatitis C virus strains from Romania. J Gastrointestin Liver Dis. 2011 Sep;20(3):261-6. Summers J, Mason WS. Replication of the genome of a hepatitis B--like virus by reverse transcription of an RNA intermediate. Cell. 1982 Jun;29(2):403-15.
102
Summers J, O'Connell A, Millman I. Genome of hepatitis B virus: restriction enzyme cleavage and structure of DNA extracted from Dane particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 1975 Nov;72(11):4597-601. Sweeting M, De Angelis D, Ades A, Hickman M. Estimating the prevalence of exinjecting drug use in the population. Stat Methods Med Res. 2009;18:381-395. Swofford DL. PAUP*. Phylogenetic analysis using parsimony (* and other methods). Sunderland, Mass: Sinauer Associates, 2002. Takács M, Dencs A. Hepacivírus nemzetség: A Hepatitis C vírus. In: Klinikai és járványügyi virológia. Szerk.: Takács M. Vox medica, 2010. p.271-277 Tamura K, Nei M, Kumar S. Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Jul 27;101(30):11030-5. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol. 2011 Oct;28(10):2731-9. Tanaka T, Kato N, Cho MJ, Sugiyama K, Shimotohno K. Structure of the 3' terminus of the hepatitis C virus genome. J Virol. 1996 May;70(5):3307-12. Taylor DR, Shi ST, Romano PR, Barber GN, Lai MM. Inhibition of the interferoninducible protein kinase PKR by HCV E2 protein. Science. 1999 Jul 2;285(5424):10710. Telegdy L, Szalka A. A máj és az epeút fertőzései. In: Infektológia. Szerk.: Szalka A, Timár L, Ludwig E, Mészner Zs. Medicina, 2005. p.469-495. Thein HH, Yi Q, Dore GJ, Krahn MD. Estimation of stage-specific fibrosis progression rates in chronic hepatitis C virus infection: a meta-analysis and meta-regression. Hepatology. 2008 Aug;48(2):418-31. Review. Thimme R, Bukh J, Spangenberg HC, Wieland S, Pemberton J, Steiger C, Govindarajan S, Purcell RH, Chisari FV. Viral and immunological determinants of hepatitis C virus clearance, persistence, and disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Nov 26;99(24):15661-8.
103
Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 1994 Nov 11;22(22):467380. Thuluvath PJ, Krok KL, Segev DL, Yoo HY. Trends in post-liver transplant survival in patients with hepatitis C between 1991 and 2001 in the United States. Liver Transpl. 2007 May;13(5):719-24. Tresó B, Barcsay E, Tarján A, Horváth G, Dencs A, Hettmann A, Csépai MM, Gyori Z, Rusvai E, Takács M. Prevalence and correlates of HCV, HVB, and HIV infection among prison inmates and staff, Hungary. J Urban Health. 2012 Feb;89(1):108-16. Tuaillon E, Mondain AM, Meroueh F, Ottomani L, Picot MC, Nagot N, Van de Perre P, Ducos J. Dried blood spot for hepatitis C virus serology and molecular testing. Hepatology. 2010 Mar;51(3):752-8. Vilibic-Cavlek T, Kucinar J, Kaic B, Vilibic M, Pandak N, Barbic L, Stevanovic V, Vranes J. Epidemiology of hepatitis C in Croatia in the European context. 2015 Aug 28;21(32):9476-93. Vince A, Iscić-Bes J, Zidovec Lepej S, Baća-Vrakela I, Bradarić N, Kurelac I, Vince DB. Distribution of hepatitis C virus genotypes in Croatia--a 10 year retrospective study of four geographic regions. Coll Antropol. 2006 Dec;30 Suppl 2:139-43. Walter E, Keist R, Niederöst B, Pult I, Blum HE. Hepatitis B virus infection of tupaia hepatocytes in vitro and in vivo. Hepatology. 1996 Jul;24(1):1-5. Wang C, Sarnow P, Siddiqui A. Translation of human hepatitis C virus RNA in cultured cells is mediated by an internal ribosome-binding mechanism. J Virol. 1993 Jun;67(6):3338-44. Warren KS, Heeney JL, Swan RA, Heriyanto, Verschoor EJ. A new group of hepadnaviruses naturally infecting orangutans (Pongo pygmaeus). J Virol. 1999 Sep;73(9):7860-5. Wasenauer G, Köck J, Schlicht HJ. A cysteine and a hydrophobic sequence in the noncleaved portion of the pre-C leader peptide determine the biophysical properties of
104
the secretory core protein (HBe protein) of human hepatitis B virus. J Virol. 1992 Sep;66(9):5338-46. Weild AR, Gill ON, Bennett D, Livingstone SJ, Parry JV, Curran L. Prevalence of HIV, hepatitis B, and hepatitis C antibodies in prisoners in England and Wales: a national survey. Commun Dis Public Health. 2000;3:121-126. Wong F, Pai R, Van Schalkwyk J, Yoshida EM. Hepatitis B in pregnancy: a concise review of neonatal vertical transmission and antiviral prophylaxis. Ann Hepatol. 2014 Mar-Apr;13(2):187-95. Xia X, Luo J, Bai J, Yu R. Epidemiology of hepatitis C virus infection among injection drug users in China: systematic review and meta-analysis. Public Health. 2008 Oct;122(10):990-1003. You CR, Lee SW, Jang JW, Yoon SK Update on hepatitis B virus infection. World J Gastroenterol. 2014 Oct 7;20(37):13293-305. Zabransky T, Mravcik V, Korcisova B, Rehak V. Hepatitis C virus infection among injecting drug users in the Czech Republic—prevalence and associated factors. Eur Addict Res. 2006;12:151-160. Zuckerman AJ, Thornton A, Howard CR, Tsiquaye KN, Jones DM, Brambell MR. Hepatitis B outbreak among chimpanzees at the London Zoo. Lancet. 1978 Sep 23;2(8091):652-4.
105
12. Köszönetnyilvánítás Először témavezetőmnek, Dr. Takács Máriának mondok köszönetet, amiért biztatott, hogy jelentkezzek a doktori képzésbe, hogy bízott bennem, elfogadott diákjának, és biztosította számomra, hogy ezen az érdekes témán dolgozhassak. Mindig fordulhattam hozzá kérdéseimmel. Hálás vagyok dr. med. Melles Márta főigazgató főorvos asszonynak, amiért engedélyezte és támogatta, hogy a doktori képzésben részt vegyek. Legnagyobb hálával Dr. med. Rusvai Erzsébetnek tartozom, akivel folyamatos konzultációt folytathattam. Önzetlenül, szabadidejét sem kímélve segítette munkámat. Beszélgetéseink mindig gondolatébresztők, tanácsai, kritikái rendkívül hasznosak voltak. Hatalmas tudásán mindig elámulok! Nagyon büszke vagyok, hogy a barátjának érezhetem magam. Köszönöm minden szerzőtársamnak: Horváth-Tarján Annának, Horváth Gergelynek, Prof. Dr. med. Pár Alajosnak, dr. med. Dudás Máriának, Dr. Dencs Ágnesnek, dr. med. Csohán Ágnesnek, dr. med. Barcsay Erzsébetnek, Hettmann Andreának, Phalerné dr. med. Csépai Mária Magdolnának, dr. med. Győri Zoltánnak, Dr. Gyarmathy Annának, hogy gyümölcsöző együttműködést folytathattunk. Kimondhatatlanul hálás vagyok dr. med. Horváth Judit Krisztinának, hogy szabadidejét feláldozva vezetett be a statisztika rejtelmeibe, dr. med. Prantner Idának is köszönöm a konzultációkat a statisztika terén. Nagy örömömre szolgált, hogy egyetemi szakdolgozatom témavezetője Prof. Dr. med. Gönczöl Éva sem hagyott magamra. Nagyon szépen köszönöm Neki az építő jellegű tanácsait, észrevételeit. Köszönöm a munkáját az Országos Epidemiológiai Központ minden, a vizsgálatokban részt vevő dolgozójának és a területen dolgozó kollégáknak, akik a mintavételekben és a kérdőívek felvételénél segédkeztek. Köszönöm a Magyar Mikrobiológiai Társaságnak és Alapítványának, valamint a Magyar Epidemiológia Fejlesztéséért Alapítványnak, hogy anyagilag is támogatta a 106
képzésemet. Hálás vagyok a Diagnosticum Zrt-nek, a Schering-Plough Hungary Kftnek, az Országos Tisztifőorvosi Hivatalnak, hogy anyagilag és reagensekkel támogatták a vizsgálatainkat. A Büntetés-végrehajtás Országos Parancsnokságának, hogy lehetővé tette a szűréseket és a kérdőívek felvételét. Nagyon köszönöm Bertók Istvánnak, hogy nyelvileg ellenőrizte a kéziratot. Végül, de nem utolsó sorban családomnak, elsősorban feleségemnek, köszönöm, hogy ösztönöztek és segítettek az elmúlt évek során.
107