Gyors-kinetikai módszerek
kinetika - mozgástan Gyorskinetika Reakciókinetika:
Biofizika 2009. november 26. Dudás Réka
reakciók időbeli leírása reakciómechanizmusok reakciódinamika (molekuláris szintű történés)
Egy reakció előrehaladottságának mértéke:
reakcióextenzitás: ξ (extent of reaction; magyarul néha „reakciókoordináta”)
sztöchiometriai együttható
reakciósebesség:
mólszám
térfogat
Sebességi törvény
Reakciósebesség koncentráció-függése
Reakciósebesség függ:
résztvevő anyagok minősége koncentrációk hőmérséklet katalizátor / inhibitor reakciórendek (Nem sztöchiometriai együtthatók!)
a+b: bruttó reakciórend
Folyamatok rendűsége és a molekularitás kapcsolata
sebességi állandó
0.
1.
kiindulási anyag koncentrációja termék(ek) koncentrációja
Molekularitás Unimolekulás reakció: egyetlen molekula átalakulása. Bimolekulás reakció: két molekula átalakulása azok ütközése útján. Trimolekulás reakció: ritka, mert több molekulának kell ütköznie. ELEMI REAKCIÓ REAKCIÓK nem bonthatók egyszerűbb lépésekre. Elemi reakciók rendűségét a reakció molekularitása határozza meg.
2.
1
http://hu.wikipedia.org/wiki/Reakci%C3%B3sebess%C3%A9g
http://hu.wikipedia.org/wiki/Reakci%C3%B3sebess%C3%A9g
Nulladrendű reakció pl. enzimkatalízis (ha az enzim koncentrációja kicsi) - NEM elemi reakció!!!
Elsőrendű reakció A Æ B vagy A Æ B + C
1. t1/2
2. t1/2 3. t1/2
A komponensek koncentrációja lineárisan változik az idő függvényében.
A komponensek koncentrációja exponenciálisan változik az idő függvényében.
http://hu.wikipedia.org/wiki/Reakci%C3%B3sebess%C3%A9g
Másodrendű reakció 2A Æ B (vagy A + B Æ C)
Összetett reakciók = reakciómechanizmusok Sorozatos kémiai reakciók: sebességmeghatározó lépés: B → C
sebességmeghatározó lépés: A → B
Párhuzamos kémiai reakciók: A komponensek koncentrációja hiperbola függvény szerint változik idő függvényében.
Energetika Az eredményes ütközéshez a molekuláknak aktív állapotba kell jutni, többletenergiával kell rendelkezni.
Egyensúlyi állandó:
Egyensúlyi kémiai reakciók:
Gyorskinetikai módszerek jelentősége biológiai mechanizmusok megértése biológiai folyamatok időskálája millisecundum skálán történő mérések gyorskinetikai módszerek időfelbontása:
A küszöbenergia és az átlagos energia közötti különbség az aktiválási energia.
100 s „lombik” reakció stopped flow
10-3 ms
10-6 μs
10-9 ns
10-12 ps
villanófény fotolízis egyfoton-számlálás Keszei Ernő előadása alapján
2
Gyorskinetikai módszerek
Stopped-flow (megállított áramlású reaktor) Surface Plasmon Resonance Flash Photolysis (villanófény fotolízis) Photon Counting (foton-számlálás)
Stopped-flow Megállított áramlású reaktor
0. Betöltés
1. Keverés
cella keverő stop
A
B
meghajtó
STOP szenzor
meghajtó
1. Keverés
meghajtó
STOP szenzor
STOP szenzor
1. Keverés
meghajtó
STOP szenzor
3
1. Keverés
2. Az áramlás megállítása
t=o
meghajtó
STOP szenzor
STOP!
meghajtó
3. kinetikai mérés
Holtidő
fluoreszcencia v. szórás
A folyadékok összekeverése és a hasznos mérés kezdete között eltelt idő. 0,5 – 1 ms.
abszorpció
meghajtó
STOP szenzor
Forrás: Applied Photophysics
Holtidő
Holtidő
4
Stopped-flow alkalmazása
Mért jel spektroszkópiai jel Æ változzon a reakció során!
kötődési- és disszociációs kinetika vizsgálata fehérje-fehérje, illetve fehérje-ligandum kölcsönhatás esetén.
fluoreszcencia intenzitás (v. anizotrópia) fényszórás abszorpció
KD: disszociációs állandó
KD =
[A][B ] [AB]
párhuzamos detektálás!
merőleges detektálás!
detektor: PMT
Villanófény-fotolízis http://www.photophysics.com/images/rx2000/rx2k_da.jpg
Rövid élettartamú részecskék reakcióinak nyomon követésére.
Caged molekula: „ketrecbe zárva”, kémiai kötéssel inaktiválva. Nagy fényintenzitás hatására „kiszabadul” (az inaktiváló kémiai kötés felbomlik) Æ ekkor indul a folyamat. Előnye: A és B molekula már egymás mellett van (keverés nem vesz el időt). Csak akkor indul a folyamat, amikor „meglőjük” fénnyel. Detektálva a fényt, megmondható a spektroszkópiás mérés nulla időpontja.
http://itszotar.hu/?q=1663
Felületi plazmon rezonancia (SPR)
Felületi plazmonok Fémek felületén egy speciális fénysugárral hullámszerű mozgásra kényszerített elektronok. Hullámhossza rövidebb a gerjesztő fényénél. Távoli tér: megvilágított tárgyról visszaverődő fény segítségével megfigyelhetjük a tárgyat, mikroszkópon vagy távcsövön keresztül. Æ A fényhullámok elektromos és mágneses tere azonos nagyságú és kölcsönösen függ egymástól. Közeli tér: A fény azon komponense, ami a „felülethez ragad” Æ A mágneses komponens gyenge az elektromoshoz képest (nem lép fel diffrakció, sem interferencia).
5
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/78/SPR-schema.png
Az alapelv
Kretchmann konfiguráció
B partner A partner fémlemez (pl. arany v. ezüst) üveg
lt f
t er av sz
én y
vis ny fé
Diszperziós összefüggés: a plazmonok energiája és hullámhossza (impulzusa) közötti kapcsolatot írja le. Hatékony gerjesztés: ha a két hullámhossz vagy annak reciproka, az impulzus egyezik (impulzusmegmaradási törvény). Az üvegekben a fény hullámhossza rövidebb, mint a levegőben. Æ Az impulzus nagyobb. Megfelelően választott szög alatt beeső fény impulzusának a felületen lévő vetülete megegyezhet a fotonéval azonos energiájú felületi plazmon impulzusával. Ennek a feltételnek úgy tehetünk eleget, hogy üvegprizmára párolunk fémréteget, és azt a prizma oldaláról világítjuk meg. Teljes visszaverődés a prizma-levegő határfelületen, de a felület levegő felőli oldalához hozzátapadva és attól távolodva exponenciálisan csökkenő térerősséggel megjelenik a közeli tér.
po lar izá
Plazmon létrehozása
detektor
fényforrás
A rezonancia feltétele A gerjesztő fény impulzusának felülettel párhuzamos komponense meg kell egyezzen az azonos energiájú felületi plazmon impulzusával. A gerjesztés a fény egy adott beesési szögénél történik meg és ilyenkor a fém felületről visszavert fény intenzitásában egy minimum észlelhető (abszorpció!).
Az alapelv E
fémlemez (pl. arany v. ezüst) üveg
ny fé
vis t er av sz ny fé
l po
lt izá ar
elhajlás (csökkenés) az intenzitásban!
A detektálás
fémlemez (pl. arany v. ezüst) üveg
ny fé
t er av sz ny fé
l po
lt izá ar
vis
A rezonanciának megfelelő beesési szög értéke érzékenyen függ a másik közeg (prizma) törésmutatójától. A bekötődés megváltoztatja a felülettel érintkező réteg törésmutatóját Æ rezonancia szög eltolódás Æ érzékeny detektálás. Analitikai és kinetikai információ: rezonancia szög időbeli változása. Tranzisztor optikai analógja Æ a fény gyorsabb az elektronok mozgásánál Æ nagyobb sebesség!
A szenzogram – a jel eredete
II.
I.
A kötés megváltoztatja a visszaverődés szögét.
6
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/3d/SPR-curve.png
Alkalmazási területek
Affinitás meghatározása Kötési állandó meghatározása
Ellenanyag – antigén DNS hibridizáció Protein – protein Receptor – biomolekula
kölcsönhatások
Kinetikai állandók és molekuláris kölcsönhatások specificitásának meghatározása Nyomanalitikai meghatározások Spektroszkópos mérések felületi érzékenységének növelése: fluoreszcencia, Raman-szórás.
Időkorrelált egyfotonszámlálás TCSPC
A termék egyensúlyi állandója: asszociációs állandó / disszociációs állandó. csali ligand rákötése a felszínre Æ préda ligand injektálása Æ préda köt a csalihoz Æ SPR jel növekszik. Asszociáció után: Prédamentes oldat injektálása Æ disszociáció Æ SPR jel csökken. Asszociációs és disszociációs ráta Æ kötési állandó
Time Correlated Single Photon Counting Jelmagyarázat PMT: photomultiplier tube MCP‐PMT: micro channel plate PMT TAC: time‐to‐amplitude converter CFD: constant fraction discriminator Fast discriminator (FD)
foto‐elektron sokszorozó (cső) idő amplitúdó átalakító konstans arányú diszkriminátor gyors diszkriminátor
adatfel‐ dolgozás PMT
Time Correlated Single Photon Counting
START Fényforrás (Lézer)
Minta (emisszió)
TAC
CFD vagy FD
MCP‐PMT
MCA
STOP
Forrás: NIST Single Photon Detector Workshop
Time Correlated Single Photon Counting Gyors, nagy érzékenységű MCP PMT detektor fotonton MCP: multichannel plate •a PMT előtt felgyorsítja az elektronokat •érzékenyíti a detektort: akár egyetlen fotont is érzékel! PMT: photomultiplier tube •fotoelektron-sokszorozó
fény → elektromos jel
Faceplate Fotokatód
ΔV ~ 300V fotoelektron Dual MCP
Time Correlated Single Photon Counting A fluoreszcencia intenzitásának folyamatos mérése helyett a gerjesztő és a detektált impulzus közötti időt mérjük. indító impulzus START
ΔV ~ 3000V Elektron által kilökött elektronok
időamplitúdó átalakító
ΔV ~ 300V PMT-ből származó impulzus
Anód
erősítés ~ 106
STOP
TAC
UTAC
sokcsatornás impulzusanalizátor MCA
Idő(különbség) → elektromos jel (amplitúdó)
7
Idő-amplitúdó átalakító (time to amplitude converter; TAC) UTAC
gyakoriság
t start csatornaszám (idő)
stop
Ha nem jön STOP jel, akkor maxi-mális amplitúdójú TAC jelet kapunk!
A fluoreszcencia élettartama általában összemérhető a lézerimpulzus hosszával → Dekonvolúció-t igényel! E(t): a lézerimpulzus és a készülék együttes profilja (rendszerfüggvény) F(t): a fluoreszcencia (valós) lecsengése L(t): a mért görbe (az előző kettő konvolúciója)
MEM – maximum enthropy method t
L(t ) = ∫ E (t ′) ⋅ F (t − t ′)dt ′
Fourier transzformáció
0
I(t) rendszerfüggvény E(t) Fluoreszcencia válaszfüggvény L(t)
t
8
