Glikogén-foszforiláz inhibítorok előállítása doktori (PhD) értekezés tézisei
Nagy Veronika
Témavezetők: Dr. Jean-Pierre Praly Dr. Somsák László
University of Debrecen, Faculty of Sciences, Department of Organic Chemistry
University Claude Bernard Lyon 1,UMR-CNRS UCBL 5622 Debrecen, 2003.
1. Bevezetés Az szervezet energiaellátásában a glükóz központi szerepet játszik. A vércokorszint beállításáért a glükóz és a glikogén metabolizmusa felelős. Ezeket a folyamatokat enzimek és hormonok bonyolult rendszere szabályozza, amelyek együttesen biztosítják az egészséges szervezet normális vércukorszintjét. Ha ezek az enzimek, hormonok nem termelődnek megfelelő mennyiségben ill. működésük elégtelen, a vércukorszint megváltozik, általában kórosan megemelkedik, így cukorbetegség (diabetes) alakul ki. A 20. század végére a cukorbetegségben szenvedők száma világszerte drámaian megnövekedett. Ez a betegség a fejlett tárasadalmak lakosságának ~6%-át érinti. A cukorbetegséget (diabetes mellitus) két csoportra oszthatjuk attól függően, hogy a páciens szervezete termel-e inzulint vagy sem. Ez alapján megkülönböztetünk inzulinfüggő, vagy más néven I. típusú, valamint nem-inzulinfüggő, vagy II. típusú cukorbetegséget. A betegek mintegy 90%-a a II típusú diabetes-ben szenved. Szemben az I. típussal, a II. típusú betegségben szenvedők szervezete képes ugyan inzulin termelésére, de nem megfelelő mennyiségben, ill. az inzulin nem, vagy csak késve fejti ki hatását: a sejtek glükózfelvételének serkentését és a glikogénszintézis előmozdítását. A II. típusú cukorbetegségre jellemző, hogy a tünetek főként 40 éves kor felett jelentkeznek és sokkal lassabban fejlődnek ki. A betegek komplex kezelést igényelnek, mely a vércukorszint csökkentő szerek alkalmazása mellett magában foglalja a rendszeres fizikai tevékenységet és a diétás táplálkozást. A betegség közvetlen kiváltó okait, kialakulásának biológiai, biokémiai hátterét nem ismerjük. Mivel minden tünete és szövődménye a kórosan magas ill. változó vércukorszintre vezethető vissza, a kezelés a normálist megközelítő, állandó vércukorszint biztosítását jelenti. A II. típusú cukorbetegség ellen számos vércukorszintcsökkentő szert (szulfonil-karbamidok, biguanidok, tiazolidindionok, akarbóz) alkalmaznak, azonban ezek csak tüneti kezelést jelentenek és gyakran komoly mellékhatásokat okoznak. Ezért intenzív kutatás folyik egyéb terápiás lehetőségek (többek között új inzulinkiválasztást serkentő, ill. inzulinérzékenyítő anyagok, glükagon-receptor antagonisták, a máj glükóztermelését csökkentő szerek, kombinált terápiák) irányában. A II. típusú diabetes kezelésére egy újonnan vizsgált megközelítés a vércukorszint beállításáért felelős máj glikogén-foszforiláz (GP) enzim gátlása.
A PhD tanulmányaim kezdetén a 20 glükopiranozilidén-spiro-hidantoin és 21 tiohidantoin voltak a glikogén-foszforiláz leghatékonyabb glükózanalóg inhibítorai, azonban egyikük sem állt rendelkezésre a biológiai vizsgálatokhoz szükséges nagyobb mennyiségben.
HO HO
OH O NH X
HO O
NH
20 X = O RMGPb Ki = 3.1 µM 21 X = S RMGPb Ki = 5.1 µM
(RMGPb: nyúl izom-glikogén-foszforiláz b) A spiro-(tio)hidantoinok, mint vezérmolekulák alapján kutatómunkám célja a glikogén-foszforiláz enzim glükózanalóg inhibítorainak előállítása volt: – egy léptéknövélésre alkalmas szintézismódszer kidolgozása a glükopiranozilidénspiro-tiohidantoin 21 előállítására, – új, várhatóan GP gátlóhatással rendelkező glükopiranozilidén-spiro-heterociklusok kialakítása intramolekuláris spirociklizációs reakciókkal.
II. Alkalmazott módszerek Munkám során a modern preparatív szerves kémia makro- illetve mikromódszereit alkalmaztam. A reakciók követésére és a termékek tisztaságának vizsgálatára vékonyrétegkromatográfiát használtam. Az anyagokat oszlopkromatográfiával vagy kristályosítással tisztítottam. Az előállított vegyületek szerkezetének és tisztaságának vizsgálatát olvadáspont-, elemanalízis-, optikai forgatóképesség-mérésekkel, valamint tömeg- és NMR spektroszkópiai módszerekkel végeztem.
III. A dolgozat új tudományos eredményei III.1. Glükopiranozilidén-spiro-tiohidantoin nagy léptékű előállítása A 21 glükopiranozilidén-spiro-tiohidantoin előállítására egy korábban használt, az enziminhibítort nagyon alacsony összhozammal (~2%) szolgáltatató eljárás (Ősz et al.
Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 1385-1390.) alapján kidolgoztunk egy új módszert, mellyel 21 hozama mintegy 15-szörösére növekedett. OBz O
BzO BzO
Hg(CN)2, CH3NO2 58%
BzO Br 104
BzO BzO
BzO
OBz O
Br2, hν, CHCl3 v. CH2Cl2 95% BzO CN BzO NBS, CCl4, Bz2O2
BzO
Br 106
BzO BzO
TiCl4, AcOH
HBr, AcOH
H2O, 53%
CN
BzO
62%
105 TiCl4, AcOH
CN
105
OBz O
BzO BzO
OBz O
89%
H2O, 54%
94% OBz O
HBr, AcOH
CONH2
Br2, hν, CHCl3 89%
OBz O
BzO BzO
BzO
CONH2
BzO Br
107
108
Ag2O, DMSO H2O 35% CH3NO2,
BzO BzO
OBz O
R CONH2
BzO OH 110
KSCN or NH4SCN S8, N2
80oC
O
R R
H N S
R O NaOMe/MeOH reflux, 92%
N H
109 R = OBz (79%) + 110 (6%) 21 R = OH
a.) A védőcsoportokat benzoilra cserélve a szintézis kulcsvegyületének, a 105 glükopiranozil-cianidnak a hozama 11%-ról 58%-ra nőtt, valamint a kromatográfiás elválasztások is elhagyhatóvá váltak. Az anyalúg kromatográfiás tisztításával azonban további 16-19% 105-t nyertünk ki a reakcióelegyből, mely arra utal, hogy a cianobenzilidén melléktermék képződése nem számottevő.
R = Ac*
OH HO HO
R = Bz
O OH OH
BzCl/piridin
OR RO RO
1. Ac2O/H2O
O OR
95%
2. P, Br2, H2O
RO
HBr/AcOH
OR RO RO
O
80% RO
Hg(CN)2 CN3NO2 kromatográfia
Br
OR RO RO
O
11%
CN
90% Hg(CN)2 CN3NO2
58%
OR HBr, AcOH OR RO RO
O
CONH2
NBS, Bz2O2 CCl4
94%
OR OR RO RO
O RO
RO RO
CN
83% TiCl4, H2O AcOH kromatográfia
Br
OR O
CONH2
68%
RO Br
KSCN, CH3NO2 kromatográfia
OR RO RO
O
H N
HO
NH4SCN, CH3NO2 S8, N2, 80°C (kromatográfia)
79%
NH
O
HO HO
87%
S
57%
RO
OH O
Br2, CHCl3, hν
NaOMe, MeOH H N
NaOMe, MeOH
S
78%
92%
NH
21 O teljes hozam
hat lépésre: ~2%
*Ősz et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 1385-1390.
hét lépésre: ~30%
b.) A gyökös brómozási reakciókban korábban használt N-bróm-szukcinimidet elemi brómmal váltottuk ki, ezáltal leegyszerűsödött a reakcióelegyek feldolgozásának módja. Megmutattuk, hogy az ilyen reakciókban általánosan alkalmazott széntetraklorid oldószer helyettesíthető könnyebben hozzáférhető kloroformmal ill. diklórmetánnal, amelyek mellett a reakciók alacsonyabb hőmérsékleten is kivitelezhetővé válnak. c.) A cianocsoport részleges hidrolízisét 105 és 106 esetén jégecetes HBr-dal végeztük, így tiszta, kristályos nyerstermékként, jó hozammal nyertük a megfelelő benziolezett C-(β-D-glükopiranozil)-formamidokat (107, 108). d.) Nitrogén atmoszféra alatt nitrometánban, a gyökös mechanizmusú mellékreakciók csökkentése céljából elemi kén jelenlétében 108-at ammónium- vagy kálium-tiocianáttal reagáltattuk és jó hozammal kaptuk 109 spiro-tiohidantoint valamint kevés 110 hidroxi-amid mellékterméket.
A
110
hidroxi-amidot
független
úton
is
előállítottuk
108-ból
dimetilszulfoxidban ezüstsó-katalizált hidrolízissel. 109-et metanolban Zemplén-módszerrel debenzoileztük és 92%-os hozammal kaptuk 21-t. e.) Az új módszerrel grammos tételben állítottuk elő a tiohidantoint, melynek a máj glikogén-foszforiláz enzim aktivitására gyakorolt hatását a Debreceni Egyetem Orvosi Vegytani Intézetében vizsgálták meg. Ezek szerint a tiohidantoin 21 mind in vitro, mind in vivo körülmények között igen jelentősen csökkenti az enzimaktivitást, illetve in vivo kísérletekben a vércukorszintet, így egy potenciálisan vércukorszint-csökkentő terápiás szer nagy léptékű szintézisét dolgoztuk ki. III.2. N-acil-N’-β-D-glükopiranozil karbamidok előállítása és fotoreakciói Szénhidrátok anomer centrumán a gyökös reakciók nagymértékben regio- és sztereoszelektíven játszódnak le, ezért, a retroszintetikus ábra szerint, Norrish II. típusú fotokémiai reakcióval terveztük a 20 glükopiranozilidén-spiro-hidantoinhoz hasonló szerkezetű vegyületek előállítását. H N
O
O NH
O
~
H N
O
H N
O
. NH
.
O
O
H N
H N
R
HO
R
O
H N
H N
R
NH O
HO
O
. O.
O
O
R
a.) A 95 per-O-acetil glükopiranozil-azidból kiindulva két úton állítottunk elő a fotolízis prekurzorainak szánt védett N-acil-N’-glükopiranozil karbamidokat (92, 93, 112117): glükopiranozil-aminból acil-izocianátokkal (A) vagy glükopiranozil-karbamid acilezésével (B).
b.) A fotolíziseket 92 per-O-acetil N-acetil- és 93 N-benzoil-N’-β-D-glükopiranozil karbamidokkal végeztük el különböző körülmények között. Ezen kísérletek során azt tapasztaltuk, hogy a várt átalakulás helyett ún. Norrish I. típusú N-dezacileződés történt, így azt mondhatjuk, hogy a vizsgált karbamidok nem alkalmasak fotolitikus gyűrűzárásra. c.) A védőcsoportokat klasszikus Zemplén-módszerrel vagy metanolban KHSO4 ill. ammónia segítségével távolítottuk el és kaptuk 118-125 vegyületeket, míg a 126 4aminoszármazékot 120 Raney-Ni-lel végzett redukciója során nyertük. OAc
OAc O
AcO AcO
H2, Raney-Ni
N3
O
AcO AcO
71%
NH2
AcO
AcO
95
111 O
NH3, CO2 PPh3, THF 46%
B 60-75% O
OAc AcO AcO
O
R
H N
AcO
NH2
OAc
Cl
O
AcO AcO
ZnCl2 CHCl3
O
R NCO CH3CN, Ar
AcO
A
91 92 R = CH3 56% (A) 93 R = C6H5 30% (A) 112 R = 4-NO2-C6H4 60% (A) 65% (B) 113 R = 3-Cl-C6H4 74% (B)
O
114 R = 4-OAc-C6H4 72% (A) 20% (B) 115 R = 1-naftil 73% (A) 116 R = 2-naftil 29% (A) 117 R = 2-indolil 41% (A)
Ki (µM), RMGPb OH O
O
R
92, 93, 112-117
60-80%
HO HO
H N
H N
H N
H N
HO
O
R O
118
R = CH3
370.5
119
R = C6H4
4.6
120
R = 4-NO2-C6H4
3.0
121
R = 3-Cl-C6H4
122
R = 4-OH-C6H4
3.6
123
R = 1-naftil
7.8
113.6
124
R = 2-naftil
0.4
125
R = 2-indolil
8.0
126
R = 4-NH2-C6H4
IC50 = 14
d.) Az így kapott vegyületek a glikogén foszforiláz inhibítorainak bizonyultak. Ezen inhibítorok
közül
a
124
N-2-naftoil-N’-β-D-glükopiranozil
karbamidot
találták
a
leghatékonyabbnak mely nanomólos Ki értékével a jelenleg ismert legjobb glükózanalóg GP inhibítor. A krisztallográfiai vizsgálatok szerint az általunk előállított karbamidszármazékok közül egyesek nemcsak a GP enzim katalitikus helyén kötődnek, hanem az ún. új allosztérikus helyen is, mely eddig nem tapasztalt, egyedülálló tulajdonság a glükózanalóg inhibítorok között. III.3. Kísérletek glükopiranozilidén-spiro-1,2,4-oxadiazolinok előállítására A fenti molekulákkal, valamint egyes, hatékony GP inhibítornak talált glükopiranozilidén-spiro-oxatiazolokkal végzett kinetikai és röntgenkrisztallográfiai vizsgátatok eredményei alapján új glükopiranozilidén-spiro-oxadiazolinok előállítását terveztük per-Oacetilezett
N-β-D-glükopiranozil-amidoximok
oxidatív
körülmények
között
végzett
fotolízisével. OAc AcO AcO
AcO
R
OAc
O
H N
R' O
O
AcO AcO
H N
AcO
N
N
HO
a.) E prekurzorokat módosított Staudinger-reakcióval per-O-acetilezett-β-D-glükopiranozil azidból készítettük trimetil-foszfin majd aril-hidroximinoil-kloridok hozzáadásával.
AcO AcO
OAc O
N3
1. Me3P, toluol CH2Cl2 2.
AcO
R'O R'O Cl
R
OR' O R'O
N
95
HO
136-139
136 R' = Ac, R = C6H5 57% H N
R N
137 R' = Ac, R = 4-NO2-C6H4 64% 138 R' = Ac, R = 4-CN-C6H4 59%
139 R' = Ac, R = 2-naftil 6% OH 147 R' = H, R = 4-NO2-C6H4 148 R' = H, R = 4-CN-C6H4
b.) A 137 acetilezett N-β-D-glükopiranozil-4-nitrobenzamidoxim fotolízisét NBS jelenlétében végeztük el különböző körülmények között. A képződött termékek szerkezete alapján feltételezzük a kívánt 143 spiro-oxadiazolin kialakulását, melyben azonban a
cukorgyűrű felnyílik és egy aromás 1,2,4,-oxadiazol (145) jön létre. A keletkezett szekunder alkohol a reakciókörülmények között 146 oxovegyületté alakulhat át. Az elvégzett kísérletek alapján a célvegyület N-β-D-glükopiranozil-amidoxim feltehetően instabil és az általunk vizsgált módszerrel nem állítható elő. A 147 és 148 elszappanosított származékok nem gátolják a glikogén-foszforiláz enzimet. OAc
OAc H N
O
AcO AcO
Ar NBS
O
AcO AcO
hν
AcO
AcO
N
H N Ar O
N
HO 137
143
OAc
OAc OH
O
AcO AcO
N
AcO
O
AcO AcO
Ar
N AcO
N
146
O
Ar N
145
Az NBS mennyisége: Az IR lámpa teljesítménye: AcO AcO
OAc O AcO
H N
4 ekv. 4x1 ekv. 4 ekv. 60W 60W 375W
0%
0%
0%
31%
0%
0%
0%
0%
20%
~3%
45%
10%
Ar O
N
143
AcO AcO
OAc O AcO
137 Ar = p-C6H4-NO2
AcO AcO H N
Ar
OAc O AcO
NBS
Ar
N N
O
144
hν
N
OAc OH
OH AcO AcO
N AcO
Ar O
145
N
OAc AcO AcO
O N AcO
Ar O
N
146
IV. Az eredmények alkalmazási lehetőségei
Kidolgoztuk a 21 glükopiranozilidén-spiro-tiohidantoin
D-glükózból
kiinduló nagy
léptékű előállításának egyszerű és igen hatékony módszerét, mellyel grammos tételben állítottuk elő az inhibítort. Ezáltal lehetővé vált 21-nek a máj glikogénmetabolizmusára gyakorolt hatásának in vitro és in vivo vizsgálata. A hidantoin „nyílt láncú” analogonjainak tekinthető különféle N-acil-N’-β-Dglükopiranozil karbamidokat (118-126) is előállítottunk. Ezek a GP nagyon hatékony inhibítorainak bizonyultak, közülük került ki a jelenleg ismert legjobb glükózanalóg gátlószer, a 124 2-naftoil származék (Ki = 0.4 µM). Az N-acil-N’-β-D-glükopiranozil karbamidok előállításával új vezérmolekulákat fedeztünk fel a GP enzim gátlására. Megvizsgáltuk új glükopiranozilidén-spiro-oxadiazolinok fotokémiai előállításának lehetőségeit per-O-acetil-N-β-D-glükopiranozil amidoximból kiindulóan. Tapasztalataink alapján a célvegyület oxadiazolinok feltehetően instabilak és az általunk vizsgált módszerrel nem állíthatók elő.
5. Közlemények jegyzéke 5.1. Közlemények 1. László Somsák, Veronika Nagy, Tibor Docsa, Béla Tóth, Pál Gergely Gram-scale synthesis of a glucopyranosylidene-spiro-thiohydantoin and its effect on hepatic glycogen metabolism studied in vitro and in vivo Tetrahedron: Asymmetry 2000, 11, 405-408. 2. László Somsák, Veronika Nagy A new, scalable preparation of a glucopyranosylidene-spiro-thiohydantoin: one of the best inhibitors of glycogen phosphorylases Tetrahedron: Asymmetry 2000, 11, 1719-1728. 3. Nikos G. Oikonomakos, Magda Kosmopoulou, Spyros E. Zographos, Demetres D. Leonidas, László Somsák, Veronika Nagy, Jean-Pierre Praly, Tibor Docsa, Béla Tóth, Pál Gergely Binding of N-acetyl-N’-β-D-glucopyranosyl urea and N-benzoyl-N’-β-D-glucopyranosyl urea to glycogen phosphorylase b European Journal of Biochemistry 2002, 269, 1684-1696.
4. László Somsák, Veronika Nagy, Zsuzsa Hadady, Tibor Docsa, Pál Gergely Glucose analog inhibitors of glycogen phosphorylases as potential Antidiabetic agents: recent developments Current Pharmaceutical Design 2003, 9, 1177-1189. invited review
5.2. A dolgozat témakörében bemutatott előadások és poszterek 1. Marietta Tóth, Veronika Nagy, László Somsák Synthesis of D-gluco- and D-xylopyranosylidene-spiro-(thio)hydantoins and their effect on muscle and liver glycogen phosphorylases MTA Szénhidrátkémiai Munkabizottságának Nemzetközi Előadóülése, May 26-27. 1999. Mátrafüred 2. Veronika Nagy, Zsuzsa Hadady, László Somsák, Nikos G. Oikonomakos, Tibor Docsa, Béla Tóth, Pál Gergely New glucose analogue inhibitors of glycogen phosphorylases which can also bind at the new allosteric site MTA Szénhidrátkémiai Munkabizottságának Nemzetközi Előadóülése, May 15-16. 2001. Mátrafüred 3. BélaTóth, Tibor Docsa, Veronika Nagy, László Somsák, Pál Gergely A glikogén foszforiláz glükózanalóg inhibítorai, mint lehetséges hipoglikémiás szerek A Magyar Fiziológiai Társaság LXVI. Kongresszusa, June 6-8. 2001. Szeged 4. Veronika Nagy, Zsuzsa Hadady, László Somsák, Nikos G. Oikonomakos, Tibor Docsa, Béla Tóth, Pál Gergely Glikogén foszforiláz enzimek új glükózanalóg inhibítorainak előállítása Magyar Kémikusok Egyesülete, Vegyészkonferencia, June 27-29. 2001. Hajdúszoboszló 5. László Somsák, Veronika Nagy, Zsuzsa Hadady, Nikos G. Oikonomakos, Tibor Docsa, Béla Tóth, Pál Gergely New Glucose Analogue Inhibitors of Glycogen Phosphorylase 11th European Carbohydrate Symposium, September 2-7. 2001. Lisboa, Portugal 6. Veronika Nagy, Zsuzsa Hadady, László Somsák, Jean-Pierre Praly, Nikos G. Oikonomakos, Tibor Docsa, Béla Tóth, Pál Gergely
New glucose analogue inhibitors of glycogen phosphorylase VIème Journée du Groupe Lyonnais des Glycosciences, November 29. 2001. Lyon, France 7. Veronika Nagy, Zsuzsa Hadady, László Somsák, Jean-Pierre Praly, Nikos G. Oikonomakos, Tibor Docsa, Béla Tóth, Pál Gergely Nouveaux dérivés du D-glucose inhibiteurs de la glycogène phosphorylase XIXème Journées de Chimie et Biochimie des Glucides, May 20-24. 2002. Albé, France 8. Evangelia D. Chrysina, Magda N. Kosmopoulou, C. Tiraidis, G. Loupasakis-Loupasis, Demetres D. Leonidas, Nikos G. Oikonomakos, Veronika Nagy, László Somsák, Pál Gergely, Jean-Pierre Praly Structural studies of N’-β-D-glucopyranosyl urea analogues in complex with glycogen phosphorylase b Congress of the Hellenic Society of Biochemistry & Molecular Biology, October 25-27. 2002. Ioannina, Greece 9. Veronika Nagy, Tibor Docsa, Pál Gergely, Nikos G. Oikonomakos, Jean-Pierre Praly, László Somsák N-acyl-N’-β-D-glucopyranosyl-ureas as glycogen phosphorylase inhibitors 12th European Carbohydrate Symposium, July 6-11. 2003. Grenoble, France 10. Veronika Nagy, László Somsák, Jean-Pierre Praly Experiments towards new glucopyranosylidene-spiro-heterocycles 1st Hungarian-Austrian Carbohydrate Conference, September 24-26. 2003. Burg Schlaining, Austria 11. László Somsák, Veronika Nagy, Zsuzsa Hadady, Attila Krakomperger, Matietta Tóth New glucose analogue inhibitors of glycogen phosphorylase 1st Hungarian-Austrian Carbohydrate Conference, September 24-26. 2003. Burg Schlaining, Austria
5.3. Lecture in other field– V. 3. Egyéb témakörben bemutatott előadás Veronika Nagy, László Somsák Preparation of 1-carboxamido-glycosides as potential glycosidase inhibitors/ inactivators
MTA Szénhidrátkémiai Munkabizottságának Nemzetközi Előadóülése, May 15-16. 2001. Mátrafüred
