Debreczeni L., Schill J., Kereszturi J. Nemzeti Élelmiszerlánc – biztonsági Hivatal Élelmiszer- és Takarmánybiztonsági Igazgatóság Takarmányvizsgáló Nemzeti Referencia Laboratórium Budapest
Fuzárium toxinok egyidejű vizsgálati lehetőségei HPLC-MS technikával NIVALENOL DON FUSARENON-X NEOSOLANIOL 3-Ac-DON DAS HT-2 T2 és F-2
Fuzárium toxinok, kémiai szerkezet alapján
• 4 fő csoport - „A” típusú trichotecének - „B” típusú trichotecének - Fumonizinek - Egyéb toxinok
„A” típusú trichotecének: 8-s C atom keto csoportot nem tartalmaz
„B” típusú trichotecének: 8-s C atom keto csoportot tartalmaz
Fumonizinek
Egyéb toxinok
Műszeres mikotoxin vizsgálati módszerek •
•
•
Egyedi módszerek - általában szelektív immonoaffin előkészítés, emiatt csak egy, vagy csak néhány komponens mérése (pl. AFL 4 komponens, ZEA, OCHR stb. 1-1) - általában szabványosított módszerek, egyszerűen kivitelezhetők, HPLC technika - elterjedten használt ELISA módszerek Multimódszerek szűrésre (screening) - sok komponens jelenlétéről van egyidejű információ LC-MS-MS - mennyiségi meghatározásra korlátozottan alkalmas (különböző kémiai komponensek, széles visszanyerési tartomány (20-120 %) - standardizáció problémás Multimódszerek quantitatív meghatározásra - 5-15 komponens vizsgálata, mennyiségi meghatározás - ténylegesen egyidejűleg megjelenő, veszélyt jelentő komponensek csoportját vizsgálja (pl. trichotecének) - egyszerű, olcsó minta-előkészítés, HPLC-MS-MS - kereskedelemben kapható standard mix
Trichotecén és F2 toxinok extrakciója takarmányokból és tisztításuk AflaZon+ oszlopon
Extrakció 25 g/100 ml ACN/víz 86/14 2 óra rázógép
Visszaoldás 2 ml MeOH/víz 1/1-ben
Felülúszó szűrése
4 ml tisztított extrakt szárazra párlása
8 ml kémcsőbe töltése és savanyítása 80 µl ecetsavval
Az AflaZon+ oszlop átnyomása a kémcső tartalmán
Mérés
Alkalmazott kromatográfiás paraméterek Kolonna: GROM-Sil 120 ODS-5 ST 250*4,6 mm*5 µm
A eluens: B eluens:
1 g/l Ammónium-acetát/víz Metanol
Áramlási sebesség:
0,6 ml/perc
Gardiens: 0-6 perc 6-15 perc 15-25 perc Stop time: Post time:
A:75% B: 25% A:75-5% B 25-95% lineáris gradiens A:5% B:95% 24 perc 7 perc
Injektált térfogat:
5 µl
Tömegszelektív detektor beállításai különböző toxinokra Ionforrás (APES)
Parameter Gas Temp (°C) Gas Flow (l/min) Nebulizer (psi) Capillary (V)
Q1
Q2
Prec Ion
Prod Ion
CE (V)
pol
nivalenol
311,2
281,1
10
neg
nivalenol
311,2
191,1
20
don
297,1
249,1
8
don
297,1
231,2
12
neosol
400,2
305,2
12
neosol
400,2
215,1
20
neosol
400,2
185,1
22
fus
355,1
247,1
10
fus
355,1
229,1
20
fus
355,1
175
20
acdon
339,2
291,1
8
35
acdon
339,2
231,1
12
acdon
339,2
202,9
17
2500
acdon
339,2
175
22
t2
484,2
305
15
t2
484,2
215
20
t2
484,2
185
20
ht2
442,3
263
15
ht2
442,3
215
20
das
384,2
307
8
das
384,2
199
20
f2
317,2
187
20
f2
317,2
175,2
20
f2
317,2
132,2
25
Value 300 8
Compound Name
Q3
pos pos
pos
pos
neg
Kalibrációs egyenesek
5 pontra nullán átmenő egyenest fektettünk, mind a 9 egyenes esetén R2>0,995
A módszer kimutatási és meghatározási határai Név Nivalenol DON FUSARENON-X NEOSOLANIOL 3-Ac-DON DAS HT2-TOXIN T2-TOXIN F2-TOXIN
LOD µg/kg 8 8 8 2 8 2 4 2 2
LOQ µg/kg 40 40 40 10 40 10 20 10 10
Standard kromatogramm
Egy minta kromatogramjai két féle minta-előkészítéssel: 25g/100 ml ACN/víz 84/16 clean-up 4/2 25g/100 ml ACN/víz 84/16 clean-up nélkül (multitoxin)
HT2: ionelnyomás? Data File st_1_1.d st_2_1.d st_3_1.d st_4_1.d st_5_1.d 934_1mi.d 934_1a.d
Sample Amt. Dil. 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 25,00 100,00 25,00 50,00
Type Cal Cal Cal Cal Cal Sample Sample
niv µg/kg 10,59 20,02 39,79 101,41 199,30
don µg/kg 10,70 21,47 39,81 101,54 199,09 729,12 782,11
fus µg/kg 11,55 25,13 41,35 105,15 196,56
neo µg/kg 10,71 20,42 39,61 100,83 199,59
3acdon µg/kg 10,29 21,00 40,83 102,47 198,49
das µg/kg 11,05 22,22 42,80 103,95 197,19
ht2 µg/kg 10,25 21,51 40,13 100,19 199,72 28,21 58,42
t2 µg/kg 11,05 22,63 42,97 106,03 196,07 24,09 22,28
f2 µg/kg 10,45 21,55 42,70 103,65 197,46 62,27 62,08
A módszer F2 eredményeinek összehasonlítása a szabvány szerint (MEOH/Víz-es extrakció, immunaffin mintaelőkészítés, HPLC-FLD mérés)mért F2 eredményeivel Szabvány módszer
LC-MS/MS módszer
Arány
µg/kg
µg/kg
%
1
<10
<10
2
258
245
3
<10
<10
4
<10
<10
5
12,3
14,8
120,3
6
37
39,1
105,7
7
58
52,7
90,9
8
19,1
21,4
112,0
9
67,1
59,8
89,1
10
616
543
88,1
11
180
189
105,0
12
23,5
18,7
79,6
95,0
Az egyik 2014-es körvizsgálat eredményei
HPLC
ELISA
Mérések számokban: Évente kb. 500-1000 db különböző takarmány-, illetve élelmiszerminta vizsgálatát végezzük el akkreditáltan az ismertetett módszerrel DON-ra több mint 10 , T2 HT2-re 3 körvizsgálaton vettünk részt, melyeken a Z-score értékeink minden esetben belül maradtak a ±1 értéken F2 körvizsgálatok esetében rendre hasonló párhuzamos értékeket mértünk, mint a szabvány módszerrel kapott és megfelelt eredményeink
Aktualitás:
a tavalyi év időjárási viszonyai kimondottan „ kedvezőek” voltak Különösen a DON és F2 szennyezettség erős növekedése figyelhető 30 mg/kg feletti DON, illetve 5 mg/kg feletti F2 tartalmú kukorica ( is ) termett! TRICHOTECÉN VÁZAS TOXINOK- biológiai hatás Takarmány visszautasítás Cytotoxikusak Gátolják a fehérjeszintézist Károsítják az ideg-, és immunrendszert Gyulladásos elhalásos folyamatokat indítanak el Károsítják a vese kéreg- és velőállományát.
ZEARALENON/ F2 / - biológiai hatás
Hüvelyduzzanat Belső nemi szervek ödémája Petefészek funkcionális zavarai Csecsbimbó gyulladás Elmaradó fogamzás Spermiogenezis károsodása Halva ellések nőnek
Határértékek1881/2006 EK • • • • • • •
Élelmiszer Gabonafélék Kivétel Durumbúza, zab Kukorica Kenyérfélék,tésztafélék Bébiétel – gabonaalapú
DON 1250
ZEA /ug/kg / 100
1750 1750 750 200
100 350 75 20
Ajánlási szintek576/2006 EK • • • • • • • • • • • • •
Takarmány DON Alapanyagok- gabona 8 Kukorica 12 Teljesértékű táp 5 Kivételek Malac - kocasüldő 0,1 Tenyészkoca- hízósertés Borjak, tejelő marhák, juhok, Kecskék ÚJ: Malac , borjú Hízósertés Baromfi
ZEA 2 3
HT/T2
0,25 0,5 0,2 0,4 0,5
/mg/kg /
EU Referencia laboratóriumának szabványosítani kívánt módszere: Vizsgált komponensek:
DON, AflaB1, Fumoniszin B1 és B2, T-2, HT-2, F-2 és Ochratoxin
Extrakció:
5 g minta/25 ml ACN/VÍZ/HCOOH 79/20/1
Teszt oldat:
500µl extraktot+25µl minden komponenst tartalmazó C-13 jelzett belső std.-et szárazra párolunk, majd 250µl eluensben felveszünk.
Kromatográfia:
Kolonna: Supelco Ascentis Express C 18 75mm*2.1mm*2.7µm Kromatográfia I. Kromatográfia II: Mobil A 0.1%HCOOH/VÍZ 5mM NH4Ac_0.3%Ecetsav/VÍZ Mobil B 0.1%HCOOH/MeOH 5mMNH4Ac_0.3%Ecetsav/MeOH
Gradiens elúció Detektálás:
Hármas quadrupol A két féle kromatográfia esetén a vizsgált ionátmenetek az eluens minőségétől függően egyes komponenseknél változnak. T-2, HT-2, DON
Kiértékelés:
ISTD kalibráció
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET
