Cytogenetika 03
Funkční struktury chromosomu Magda Zrzavá František Marec
Schéma funkčních struktur chromosomu
2
Centromery
Centromera = primární konstrikce - rozděluje chromosom na raménka - místo nasedání kinetochoru - funkce: bezchybný rozchod chromosomů - ztráta centromery ztráta chromosomu - fúze chromosomů vznik dicentrického chromosomu zastavení buněčného dělení smrt buňky
Dělení chromosomů podle typu centromery • Monocetrické chromosomy – centromerická aktivita soustředěna do jednoho místa Podle velikosti dělíme na:
- bodové (point) – u Saccharomyces cerevisiae - regionální (regional) – např. Schizosaccharomyces pombe, člověk, kur, Drosophila
• Holocetrické chromosomy – tzv. difuzní centromera - kinetochor rozptýlen po celém chromosomu - např. Caenorhabditis elegans, motýli, mšice
Centromery Podle velikosti centromery rozdělujeme chromosomy na monocentrické a holocentrické (holokinetické). Monocentrické centromery jsou lokalizované v jediném místě na chromosomu a podle jejich délky je lze rozdělit na dva podtypy: - bodová (point) centromera, kdy je formování kinetochoru vázáno na určitou sekvenci DNA (např. Saccharomyces cerevisiae), zaujímá velice malou oblast (1 nukleosom), na kterou se upíná jeden mikrotubul. U S. cerevisiae je centromerická DNA tvořena 125 bp sekvencí složené ze tří elementů (CDEI, CDEII a CDEIII). - regionální (regional) centromera, kde je oblast centromery sice na jednom místě, ale zabírá větší oblast. Přestože se v těchto oblastech často nacházejí určité typy sekvencí DNA (u vyšších eukaryot je to často tandemové repetice, např. alfa satelitní DNA u primátů), zdá se, že fungování centromery je vymezeno spíše epigeneticky. Najdeme je např. u člověka, kura, drozofily a Schizosaccharomyces pombe. Lidská regionální centromera je komplexní. Dvě rodiny alfa satelitní DNA (červené a šedé šipky) se nacházejí pouze v centromeře. Alfa satelitní DNA typu I (červená šipka) je složena z chromosomálně specifických repetitivních jednotek vyššího řádu, obsahuje CENP-B boxy a nasedá na ní CENP-A. Alfa satelitní DNA typu II (šedé šipky) se skládá z různých alfoidních monomerů (různě barevné trojúhelníky). Kinetochor váže 20-30 mikrotubulů. U většiny studovaných eukaryot je funkční část centromerické DNA (jejíž délka je v řádu desítek kilobází) obklopena pericentromerickým heterochromatinem, který může mít i několik megabází, přičemž sekvence v těchto oblastech mohou být stejné (Plohl et al. 2014). Holokinetické chromosomy mají kinetochor lokalizovaný po celé nebo téměř celé délce chromosomu. Vyskytují se např. u motýlů, mšic, Caenorhabditis elegans. Obrázky z práce Varnagelli et al. 2008
5
Monocentrické versus holokinetické chromosomy
• Výskyt: od primitivních organismů po vyšší rostliny a živočichy • Metafáze - chromatidy – tvar X, V • Nízká odolnost vůči ionizačnímu záření a klastogenům obecně
• Výskyt: některé skupiny organismů (prvok Nyctotherus, Nematoda; rostliny čeledí Juncaceae, Cyperaceae a Liliaceae; roztoči, Hemiptera, Trichoptera, Lepidoptera) • Metafáze – chromatidy paralelně • Vysoká odolnost vůči ionizačnímu záření a klastogenům obecně
6
Monocentrické versus holokinetické chromosomy
Výhodou kinetochoru lokalizovaného podél (témeř) celého chromosomu je to, že dojde-li k zlomu chromosomu, oba vzniklé fragmenty se mohou přichytit k vláknům dělícího vřeténka a mohou se dostat do dceřiné buňky. Na druhou stranu centromera lokalizovaná do jednoho malého místa, má při chromosomálním zlomu za následek vznik acentrického chromosomu (nemá žádnou centromeru), a protože konce chromosomů bez telomer jsou lepivé a mají silnou tendenci se spojit, vznikne z druhého fragmentu dicentrický chromosom se dvěma chromatidami. Acentrický chromosom se nemůže přichytit na dělící vřetýnko a je při buněčném dělení ztracen. Dicentrický chromosom je pro buňku fatální, protože pokud nedojde k inaktivaci jedné centromery, obě centromery mohou táhnout chromosom k opačným pólům buňky (tzv. anafázní můstek), což vede k zastavení dělení a smrti buňky.
7
Centromerické proteiny Řada funkcí: - tvorba kinetochoru - vazba mikrotubulů - kontrolní bod mezi metafází a anafází - spojení sesterských centromer - motorové proteiny
Centromerické proteiny S centromerami je asociovány proteiny, které zajišťují řadu funkcí (účastní se tvorby kinetochoru, vazby mikrotubulů, kontrolního bodu mezi metafází a anafází, spojení sesterských chromatid, atd.). Některé z nich se označují CENP, což neznamená nic jiného než CENtromerický Protein, nemají společnou funkci ani strukturu a byly izolovány pomocí protilátek izolovaných z jedinců s autoimunitními chorobami. Některé jsou markery aktivních centromer a jsou nezbytné pro jejich fungování (např. CENP-A, CENP-C, ...), jiné jsou zbytné a nacházejí se i na neaktivních centromerách (např. CENP-B). Na obázku a na další snímku jsou savčí centromerické proteiny, z nichž některé mají homology i u bezobratlých a kvasinek. Obrázek podle Sumner 2001.
8
Savčí centromerické proteiny CENP-A – centromerická varianta histonu H3 (cenH3) - marker aktivních centromer (i neocentromer a umělých centromer) - lokalizován na vnitřní ploše kinetochoru CENP-B – vazba na CENP-B boxy v cen. DNA - i na neaktivních cen., chybí na Y - rozhoduje o vniku nových centromer a inaktivaci stávajících (povolává CENPA/zprostředkuje H3K9Me3) CENP-C a CENP-E – markery aktivních centromer, součásti kinetochoru - potřeba pro seřazení metafázních chromosomů do roviny hBUB1, hBUBR1, zw10 a hMAD - kontrolní bod mezi metafází a anafází MCAK a dynein - kinetochorové motorové proteiny, na vnější straně kinetochoru INCENps a CLiPs - drží pohromadě sesterské chromatidy
CENP-A je markerem aktivních centromer, je centromerickou variantou histonu H3 (též zvaný CenH3, Cse4 u S. cerevisiae, CID u D. melanogaster, ceHcp-3 u C. elegans a HTR12 u Arabadopsis thaliana). Je přítomen nejen u klasických centromer, ale i u přirozených nebo umělých neocentromer. Jeho knock-out/knock-down způsobí neschopnost centromer vykonávat svou funkci. Je lokalizován na vnitřní ploše kinetochoru (inner plate) a zřejmě centromerickému chromatinu uděluje větší pevnost (rigiditu), což je potřeba, aby centromera odolala tahu mikrotubulů při rozchodu sesterských chromatid. CENP-B je protein savčích centromer, na jejichž DNA se váže v místech specifických sekvencí DNA (CENP-B boxů). Může se nacházet i na neaktivních centromerách, naopak v některých aktivních chybí (např. lidský a myší chromosom Y), není tedy nutný pro fungování centromer (myši bez CENP-B přežívají, mají jen menší váhu a méně spermií). CENP-B je tedy zřejmě potřebný pro ustavené nové centromery, ale není potřeba k jejímu udržení. Ukazuje se, že CENPB má dvojí roli: 1) je schopen povolat k centromerické DNA CENP-A, což je klíčové pro vznik nových centromer (např. u umělých chromosomů), 2) navodit reprimující epigenetickou modifikaci H3K9Me3, která vede k formování heterochromatitu. Tyto antagonistické síly rozhodují o tom, jestli se satelitní sekvence stane centromerou nebo neaktivním heterochromatinem. CENP-C a CENP-E jsou markery aktivních centromer, jsou součástí kinetochoru a jsou potřeba pro seřazení metafázních chromosomu do roviny. Při jejich selhání buňka nemůže vstoupit do anafáze. Mají homology u S. cerevisiae a rostlin (Hordeum vulgare a Vicia faba). hBUB1, hBUBR1, zw10 a hMAD se účastní kontrolního bodu mezi metafází a anafází. BUB a MAD mají homology u S. cerevisiae a drozofily. MCAK (mitotic centromere-associated kinesin) a dynein (stejně jako CENP-E) jsou kinetochorové motorové proteiny umístěné na vnější straně kinetochoru. INCENps a CLiPs (chromatid linking proteins) drží pohromadě sesterské chromatidy, CLiPs jsou specifické pro sesterské centromery. Info z Sumner 2001, Varnagelli et al. 2008
9
Sclerodermia a studium kinetochorů Sclerodermia - autoimunitní multisystémová choroba poškození kůže, škáry, kloubů, pojiva vnitřních orgánů, plic, ledvin
Celková sklerodermie (Sclerodermia diffusa)
Lokalizovaná sklerodermie
Pacient tvoří protilátky proti centromerám Protilátky proti centromerám izolované ze séra pacientů se sklerodermií byly využívány k výzkumu kinetochorových proteinů u živočichů i rostlin kinetochorové proteiny jsou velmi konzervativní
Velký průlom ve výzkumu kinetochorů nastav v roce 1980, kdy se přišlo na to, že pacienti s CREST syndromem (forma sklerodermie, autoimunitní choroba) produkují protilátky proti centromerám. Protilátky byly použity pro výzkum kinetochorových proteinů u živočichů i rostlin, což svědčí o tom, že jsou tyto proteiny velmi konzervativní.
10
Centromerická DNA - Často tvořena repetitivní DNA obtížné sekvenovat - Co víme: 1) Často satelitní DNA/mobilní elementy, ale není pravidlem 2) Rychle se vyvíjí (concerted evolution), koevoluce s cent. proteiny reprodukční bariera speciace 3) Není známa univerzální eukaryotní centromerická sekvence, ale některé motivy jsou společné pro skupinu (CENP-B box u savců). 4) Funkční centromera (desítky kbp) často obklopena pericentromerickým heterochromatinem (i > Mb)
Centromerická DNA Sekvenování centromerické DNA a heterochromatinu obecně je problematická záležitost, protože obsahují repetitivní DNA, jejíž sekvence je obtížné bioinformaticky složit. Proto i u jinak osekvenovaných genomů centromery jsou oblasti, které často osekvenované nejsou. Nicméně u některých druhů rostlin, hub a živočichů sekvence centromerické DNA známe, a z nich vyplývá, že: 1) velmi často je centromera tvořena satelitní DNA nebo mobilními elementy, 2) centromerická DNA se rychle vyvíjí a liší se i mezi příbuznými druhy, 3) není známa žádná univerzální centromerická sekvence, ale některé motivy jsou sdíleny v rámci skupiny, např. tzv. CENP-B box, 17bp sekvence, na kterou se váže CENP-B a je klíčová pro formování kinetochoru. CENP-B box se vyskytuje v alfa-satDNA člověka a různých alfoidních satelitů v centromerách savců a podobná sekvence se stejnou funkcí byla nalezena i u některých bezobratlých a rostlin. SatDNA se vyvíjí podle principu tzv. concerted evolution, kdy jsou mutace mezi monomery sjednocovány nerovnoměrným crossing-overem, genovou konverzí, replikací valivou kružnicí a transpozicí. Těmito mechanismy se nová mutace může rychle rozšířit do všech monomerů satDNA chromosomu nebo chromosomů. Rychlá evoluce centromerické DNA vyžaduje koevoluci centromerických proteinů. Tyto změny mohou vést až k reprodukční izolaci a speciaci (Plohl et al. 2014). Lidské centromery V centromerách lidských chromosomů jsou dva typy alfa-satDNA: monomerická a repetice vyššího řádu (HOR, higher-order repeat). HORs se skládají z 2-20 různých 171 bazových monomerů a jsou obvykle chromosomálně specifické. Vyskytují se v aktivní centromeře i v pericentromerickém heterochtomatinu a jsou obklopené monomerickou alfa-satDNA (Plohl et al. 2014). Sondy k HORs se používají v lidské cytogenetice k identifikaci jednotlivých chromosomů.
Kinetochor Kinetochory se podílejí na: 1) přichycení mikrotubulů dělícího vřeténka a srovnání metafázních chromosomů do roviny 2) opravě chybného přichycení mikrotubulů na chromosom 3) metafázním kontrolním bodu, kdy buňka nepokračuje do anafáze, dokud nejsou obě chromatidy všech chromosomů přichycené na dělící vřeténko 4) napětí v centromerách, které je signálem pro opuštění metafázního kontrolního bodu a vstup do anafáze
12
Typy kinetochorů - U některých organismů není patrný, mikrotubuly vstupují přímo do chromatinu (kvasinky) - Typy kinetochorů: 1) „ball and cup“ – vyšší rostliny a některý hmyz (Orthoptera) kinetochor = kulička sedící na prohlubni (centromeře)
EM řezu metafázního chromosomu s kinetochorem „Ball and cup“
2) třívrstvý (trilaminar) – nižší rostliny, většina živočichů - vnější a vnitřní vrstva husté, prostřední řídká. - vnější vrstva – vazba mikrotubulů - vnitřní – nasedá na centromeru Model trojvrstevného kinetochoru: chromatinová vlákna spojují vnitřní a vnější vrstvu
Kinetochor je struktura, která zprostředkovává kontakt mezi centromerou a mikrotubuly dělícího vřeténka. Některé organizmy (např. kvasinky) kinetochor nemají (nebo není patrný) a mikrotubuly vstupují přímo do chromatinu. Kinetochory jsou dvou typů: 1) „ball and cup“, kdy se kinetochor jeví jako nepravidelná masa (kulička) sedící na prohlubni, kterou je centromera (pohárek). Tento typ je přítomen u vyšších rostlin a u některých skupin hmyzu (Orthoptera). Druhým typem je třívrstvý kinetochor, který je složen z husté vnější vrstvy, husté vnitřní vrstvy sedící na centromeře, a řídké prostřední vrstvy. Většina mikrotubulů se upíná k vnější vrstvě, ale některé pronikají až do vnitřní vrstvy. Třívrstvý kinetochor je přítomen v pozdní profázi a metafázi, i když některé jeho složky lze detekovat i v interfázi. Nachází se u nižších rostlin a většiny živočichů.
13
Typy kinetochorů
EM řez monocentrickým metafázním chromosomem řasy Oedogonium EM řez holokinetickým metafázním chromosomem mikrojádra prvoka Nyctotherus ovalis
NOR
Oblast organizátoru jadérka “nucleolus organizing region“ (NOR) • Je tvořena rDNA geny – místo intenzivní transkripce ribosomální RNA (=> kódují rRNA) • rRNA tvoří spolu s proteiny ribosomy => NOR přímo zodpovídá za vznik jadérka (nucleolus) • Počet NOR – druhově specifický (člověk – 5 párů autosomů nese NOR)
Místo, kde je lokalizována rDNA (geny pro 18S, 28S a 5,8S rRNA), je nazýváno organizátor jadérka (NOR, nucleolus organizer region), protože se kolem něj v interfázním jádře formuje jadérko. U člověka je rDNA lokalizována na praménkách pěti párů akrocentrických chromosomů, které nesou sekundární konstrikci, což je místo, kde je právě lokalizovaná 45S rDNA. To, proč se toto místo jeví jako konstrikce není jasné, ale protože rDNA je transkribována až do začátku profáze, je možné, že se tato oblast jednoduše začne později kondenzovat.
16
Schéma rDNA transkripční jednotky vyšších eukaryot
(tato struktura vysoce konzervovaná)
rDNA jsou klastry genů kódujících ribosomální RNA. Klastr obsahuje stovky kopií tzv. 45S rDNA, což je název pro operon obsahující kromě genů pro 18S, 5,8S a 28S rRNA i přepisující se oblasti ETS (external transcribed spacer) a ITS (internal transcribed spacer). Kopie 45S jsou odděleny nepřepisující se oblastí (nontranscribed spacer, NTR). Počty ribosomálních genů se u různých organizmů liší. Ty, které mají malý genom, mají méně než 100 rRNA genů, naopak některé rostliny a obojživelníci, kteří mají velmi velké genomy, mohou mít až 10 000 kopií rRNA genů. Geny pro 5S rRNA jsou lokalizované mimo klastr, často na jiném chromosomu než 45S, a jsou srovnatelně početné jako 45S.
17
Metody lokalizace NOR a jadérka - Barvení AgNO3 vizualizuje některé proteiny v jadérku (interfáze) a v NORech, které byly v interfázi aktivní (mitóza, meióza) NORy na metafázních chromosomech
Jadérko v interfázním jádře
- FISH s rDNA sondou lokalizuje i neaktivní NORy
- YOYO – fluorochrom barvící DNA i RNA
rDNA-FISH se sondou pro 18S rDNA
pozdní profáze (YOYO-1)
Detekce rDNA na chromosomech Klasickou metodou vizualizace NORů a jadérek je barvení dusičnanem stříbrným. Tato metoda detekuje jadérka v interfázi a na metafázních chromosomech NORy, které byly aktivní v předchozí interfázi. Z toho ovšem vyplývá, že takto nemusejí (a obvykle nejsou) detekovány všechny NORy (u člověka obvykle jen 7-8 z 10). Barvení AgNO3 detekuje některé proteiny, které byly součástí jadérka a zůstaly asociované s NOR i během buněčného dělení. Jsou to především RNA polymeráza I a transkripční faktory. Další metodou vizualizace rDNA je FISH. Výhodou je to, že lze detekovat i neaktivní rDNA. Obrázky z Bombarová et al. 2007 a Novotná et al. 2010
18
Jadérko v interfázi Ultrastruktura: Fibrillar centre – lokalizace rDNA a RNA polymerázy I syntéza rRNA Dense fibrillar component – asociace rRNA s ribosomálními proteiny Granular component – skládání preribosomů Jadérko přítomno jen v interfázi a v profázi (do rozpuštění jaderné membrány)
Jadérko existuje pouze v interfázi a na začátku buněčného dělení (profáze) do rozpuštění jaderné membrány. Funkcí jadérka je transkripce 45S rDNA, rozdělení vzniklé RNA na 18S, 5,8S a 28S RNA a jejich spojení s ribosomálními proteiny v pre-ribosomech. Jadérko se skládá z tří vrstev: vláknité centrum (fibrillar centre, FC), obklopené tenkou vrstvou o vysoké hustotě (dense fibrillar component, DFC) a vnější hmotou (granular component, GC). V FC jsou lokalizované rDNA a RNA polymeráza I, v DFC se rRNA váže na proteiny a v GC dochází k skládání pre-ribosomů. Obrázek ultrastruktury jadérka z http://users.path.ox.ac.uk/~pcook/students/14nucbm.html
19
Telomery
Telomery = fyzické konce eukaryotních chromosomů - řada funkcí: 1) ochrana chromosomů před fúzemi 2) řeší problém replikace konců 3) omezuje počet buněčných dělení role ve stárnutí a rakovině
Telomery jsou DNA-proteinové struktury na koncích eukaryotních chromosomů. Mají řadu funkcí: 1) Telomery chrání chromosomy před fúzemi, protože chromosomy bez nich mají tendenci se k sobě „lepit“ a tvořit dicentrické chromosomy. Zároveň zajišťují, že konce chromosomů nejsou rozpoznávány reparačními mechanismy buňky jako dvouřetězcové zlomy, což by mohlo vést až ke smrti buňky. 2) Telomery řeší problém replikace konců, tj. fakt, že díky neschopnosti DNA polymerázy začít syntézu DNA bez volné OH- skupiny při každé replikaci ubyde kousek DNA (viz dále). 3) Počet dělení , která může buněčná linie absolvovat, je omezená (Hayflickův limit), což slouží jako ochrana před rakovinným bujením. Negativní stránkou tohoto mechanismu je stárnutí, kdy v tkáních nemohou být nahrazeny odumřelé buňky. Telomery v tomto mechanismu díky postupnému ubývání při každé replikaci DNA slouží jako počítadlo buněčných dělení, která buňka již absolvovala.
21
Objev telomer Barbara McClintock - Přirozené konce chromosomů se chovají jinak než chromosomální zlomy - Telomery (telos – konec a meros – část)
Chromosomy chráněné telomerami
Chybějící telomery
Napojení chromosomů na dělící vřeténko
Vznik dicentrického chromosomu
Úspěšný rozchod chromosomů
Rozchod chromosomů znemožněn
Smrt buňky
Barbara McClintock pozorovala u kukuřice, že se přirozené konce chromosomů chovají jinak než dvouřetězcové zlomy, a že tedy musejí mít nějaký ochranný mechanismus, který brání jejich fúzím. Tyto konce byly pojmenovány telomery z řeckého telos – konec a meros – část (název vymyslel Herman Muller, který objevil telomery u drozofily paralelně s McClintock). Až později byla objevena role telomer v zachování integrity genomu, jejich struktura a způsob fungování. B. McClintock - americká cytogenetička, 1983 dostala Nobelovu cenu za fyziologii a medicínu za objev mobilních elementů u kukuřice. Studovala centromery a telomer, rekombinaci, vytvořila první genetickou mapu chromosomů kukuřice.
22
Jak telomery vypadají Elisabeth Blackburn – práce s modelovým organismem Tetrahymena thermophila Prvok Tetrahymena thermophila - 2 jádra: Micronucleus - předáváno do další generace (ochrana DNA) - transkripčně neaktivní Macronucleus - genetický materiál modifikován – nedědí se - transkripčně aktivní - masivní fragmentace DNA syntéza telomer
Mochizuki 2010
Objev první telomerické sekvence (TTGGGG)
V roce 1978 se podařilo Elisabeth Blackburn identifikovat v telomerách u prvoka Tetrahymena thermophila (Ciliophora, Ciliata, Chromalveolata) sekvenci TTGGGG , která je v telomeře v mnoha tandemově uspořádaných kopiích. Výběr nálevníka byl geniální v tom, že tato skupina má dva typy jader. Mikronukleus obsahuje normální chromosomy, které ale zůstávají neaktivní a slouží jen k meióze a k přenosu genetické informace do další generace. Makronukleus vzniká z mikronuklea fragmentací chromosomů, delecemi, amplifikacemi a syntézou nových telomer. Výsledkem je polyploidní jádro plné transkripčně aktivních acentrických fragmentů DNA, z nichž každý je opatřen vlastními telomerami. Při vzniku makronuklea je tedy telomerická sekvence zastoupena ve vysoké koncentraci. O pár let později prokázali Blackburn a Jack Szostak, že telomerická sekvence z Tetrahymeny může iniciovat vznik nové telomery u kvasinky.
23
Podoba telomer je velice konzervativní Nalezeno několik variant sekvencí – často stejné v rámci velkých skupin:
TTTAGGG – většina rostlin
TTAGG – většina členovců
TTAGGG – většina mnohobuněčných živočichů
ALE existují výjimky – jiné sekvence a mechanismy prodlužování telomer
Po objevu telomerické sekvence u Tetrahymeny se podařilo identifikovat několik dalších telomerických sekvencí. Zajímavé je, že jsou často společné pro velké skupiny eukaryot (např. TTTAGGG u většiny rostlin, TTAGG u většiny členovců). Byly ale objeveny i druhy, které nemají žádnou ze známých telomerických sekvenci, takže mohou mít buď dosud nenalezenou variantu nebo vynalezly jiný mechanismus udržování telomer. Dva z těchto alternativních mechanismů se podařilo prozkoumat, oba u dvoukřídlého hmyzu – 1) transpozice retroelementů u drozofily a 2) rekombinace mezi satelitní DNA (Chironomus, Anopheles) (viz dále).
24
Struktura telomer
Struktura telomer DNA: Jednořetězcový převis bohatý na guanin (je prodlužován telomerázou) invaduje do dvouřetězcové oblasti a vytvoří T-smyčku (tzv. telomerickou smyčku). T-smyčka tak ukryje konec telomery před exonukleázami a reparačními mechanismy buňky, které by volný konec považovaly za zlomenou DNA. Proteiny: Na telomery se váže multiproteinový komplex shelterin. Ten obsahuje jak proteiny, které se váží na jednořetězcový převis (Pot1 (protection of telomeres) +TPP1 heterodimer), tak na dvouřetězcovou oblast: TRF1 a TRF2 (telomere repeat binding factors), jejich kofaktory Rap1 (repressor activator protein 1) a Tin2 (TRF1-interacting nuclear protein 2). TRF1 a jeho interagující proteiny zřejmě regulují prodlužování telomer tím, že ovlivňují přístup telomerázy. TRF2 a Pot1 také ovlivňují délku telomer a navíc brání spojování konců chromosomů. Obrázek z Martínez a Blasco 2010
Struktura telomer u drozofily - Telomery prodlužovány transpozicí - Non-LTR retrotransposony – vmezeřují se do telomery - Konec chráněn čepičkou – proteinovým komplexem konec není rozpoznán jako zlom DNA + chráněn před degradací
Telomera u drozofily je tvořena non-LTR retrotransposony Het-A, TART a TAHRE, které se do ní vmezeřují. Úplný konec telomery nese čepičku – proteinový komplex, díky kterému je konec chromosomu chráněn před degradací a není rozpoznán jako dvouřetězcový zlom DNA. Obrázek z Mason et al. 2007.
26
Prodlužování telomer rekombinací • Chromosomy dvoukřídlého hmyzu zakončeny dlouhými satelitními repeticemi - např.: – pakomár Chironomus – komár Anopheles
• Alternativní mechanismus prodlužování telomer (ALT): REKOMBINACE
Druhým alternativním mechanismem prodlužování telomer je rekombinace mezi různě dlouhými telomerickými sekvencemi. Podle tohoto modelu se telomery prodlužují invazí 3’ konce řetězce DNA s krátkou telomerou do dvoušroubovice s dlouhou telomerou. Dlouhá telomera pak poslouží jako templát pro syntézu DNA (čili k prodloužení telomery invadujícího řetězce). Po návratu toto prodloužené vlákno poslouží jako templát pro prodloužení 5’ konce druhého vlákna s krátkou telomerou. Obrázek z Mefford & Trask, 2002
27
Telomery řeší problém replikace konců DNA James Watson Při replikaci DNA dochází ke zkrácení molekuly (problém replikace konců) Schéma replikace DNA
DNA polymeráza neumí začít syntézu nového vlákna DNA, RNA polymeráza ano
dvoušroubovice DNA replikace DNA začíná od RNA primerů
S každou replikací se DNA o kus zkrátí Řešení: dlouhé nekódující úseky DNA na koncích chromosomů neboli telomery.
Ale i telomery se musejí nějak obnovovat!
syntéza nových vláken DNA podle původních vláken
odbourání RNA primerů - nová vlákna nejsou kompletní
V 70. letech poznamenal James Watson, že způsob, jakým se DNA replikuje, neumožňuje zreplikovat i její úplné konce, takže by se při každém dělení buňky měla kousek zkrátit. Nazval tento jev problémem replikace konců. Přibližně ve stejnou dobu pochopil Alexej Olovnikov, že zkracování konců chromosomů může být příčinou omezeného počtu dělení normálních buněk a našel tak souvislost mezi problémem replikace konců a Hayflickovým limitem. Zkracování konců chromosomů funguje jako hodiny, které odměřují počet dělení, která již buňka absolvovala a kolik jich ještě absolvovat může. Problém replikace konců je založen na faktu, že DNA polymeráza potřebuje k syntéze DNA volnou OH- skupinu na deoxyribóze, bez níž nedokáže začít. Replikace DNA začíná tedy syntézou krátkých RNA primerů, protože RNA polymeráza volný OH- konec nepotřebuje a může začít syntézu RNA kdekoli. Na vzniklé primery nasedne DNA polymeráza a začne je prodlužovat vznikající DNA. RNA primery jsou následně odstraněny, DNA polymeráza vyplní vzniklé mezery DNA (využívá OH-skupiny z DNA, kterou syntetizovala předtím pomocí RNA primerů) a řetězce jsou spojené ligázou. Jedinou výjimkou jsou úplné začátky chromosomů, kde po odstranění RNA primeru nemá DNA polymeráza kam nasednout a kde se tedy DNA nezreplikuje. Každou replikací DNA by se tedy molekula DNA měla o kus zkrátit. Problém replikace konců a jejich prodlužování je dobře znázorněn na tomto videu: http://www.youtube.com/watch?v=AJNoTmWsE0s
Telomeráza - Objevena u Tetrahymena thermophila - Enzym doplňující telomerickou DNA - Reverzní transkriptáza – syntetizuje DNA podle RNA - RNA matrice je součástí enzymu 2009 – udělena Nobelova cena za fyziologii a medicínu za objev telomerázy
Elizabeth Blackburn Carol W. Greider Jack W. Szostak
V roce 1985 Blackburn a Carol Greider objevily telomerázu, enzym, který prodlužuje telomery a kompenzuje tím jejich zkracování během replikace DNA. Telomeráza byla izolována z Tetrahymeny po páření v době formování makronuklea, kdy se masově syntetizují telomery. Telomerázu původně pojmenovaly telomerická terminální transferáza, později po její purifikaci zjistily, že enzym v sobě obsahuje RNA složku, komplementární k sekvenci telomery, která slouží jako templát pro syntézu telomerické DNA, zatímco proteinová složka (TERT) má enzymatickou aktivitu. Telomeráza je tedy reverzní transkriptáza, enzym, který syntetizuje DNA podle RNA matrice. Telomeráza složena z několika podjednotek: TERT – reverzní transkriptáza TR (TERC) – RNA templát
Telomery - stárnutí vs. nesmrtelnost August Weissmann - stárnutí je způsobeno omezeným množstvím buněčných dělení A. Weissmann
Alexis Carrel - kultivoval kuřecí fibroblasty 34 let stárnutí je vlastností těla, ne buněk - nepodařilo se zopakovat A. Carrel
Paul Moorhead a Leonard Hayflick - kultivace lidských fibroblastů počet buněčných dělení omezen na 40-50 Hayflickův limit
L. Hayflick
V roce 1881 přišel německý biolog August Weismann s myšlenkou, že smrt je důsledkem omezenému množství buněčných dělení a tím pádem i neschopnosti tkání se donekonečna obnovovat. Tuto myšlenku napadl Alexis Carrel (nositel Nobelovy ceny za fyziologii a medicínu 1912), který ve své laboratoři pěstoval buněčnou kulturu z kuřecích fibroblastů kontinuálně 34 let, a tvrdil, že buňky se mohou dělit donekonečna a to, že to nedělají, je způsobeno chybnou kultivací. Stárnutí bylo podle něj znakem mnohobuněčného těla jako celku. Jeho práci se ale nikomu nepodařilo zopakovat a jeho koncept nesmrtelných buněk byl opuštěn po publikování práce Paula Moorheada a Leonarda Hayflicka, kteří prokázali, že počet dělení buněk je omezen na konkrétní počet. Kultivovali lidské fibroblasty izolované z kůže a zjistili, že se tyto buňky přestali dělit po 40-50 děleních. Počet dělení, které může buňka absolvovat, se nazývá Hayflickův limit.
Hayflickův limit neplatí pro všechny Platí
Neplatí ryby
většina savců
plazi
ptáci
obojživelníci
bezobratlí
Hayflickův limit – obrana proti rakovině Alexej Olovnikov Zkracování konců chromosomů může být příčinou omezeného počtu dělení normálních buněk našel tak souvislost mezi problémem replikace konců a Hayflickovým limitem (1971).
Hayflickův limit (1961) – počet dělení, která buňka může absolvovat telomery = marker stáří buňky (mnoho dělení = krátké telomery)
Ale co telomeráza?
Alexej Olovnikov je ruský biolog, který v roce 1971 postuloval teorii, že příčinou omezeného množství dělení buněk je zkracování telomer. Ty tedy slouží jako biologické hodiny odměřující kolik dělení ještě může buňka absolvovat. Přestože byl první, kdo tuto teorii publikoval, nebyl navržen na Nobelovu cenu, ale v roce 2009 dostal Demidovovu cenu, prestižní ocenění udělované členům Ruské akademie věd.
Telomeráza, kmenové buňky a rakovina U člověka je telomeráza aktivní pouze během embryonálního vývoje a v dospělosti v kmenových buňkách
Cca 85% lidských nádorů má aktivovanou telomerázu. Model role telomer v stárnutí a rakovině založený na kmenových buňkách Kmenové buňky mají, narozdíl od většiny somatických buňek, aktivní telomerázu. Množství telomerázy je ale malé, takže ztrátu telomer jen zpomaluje, ale není schopná jí zcela kompenzovat. Kmenové buňky se v tkáních nacházejí v nikách. Jak buňky v tkáních odumírají, kmenové buňky proliferují, aby ztrátu kompenzovaly. To ale vede ke zkracování jejich telomer, takže když je dosaženo Hayflickova limitu, kriticky krátké telomery jsou rozpoznávány jako poškozená DNA a kmenové buňky přestanou odpovídat na svou mobilizaci. Tkáň přestane regenerovat, což nakonec vede k selhání orgánu. Pokud se kmenové buňky naučí doplňovat si telomery, může to vést ke vzniku rakoviny. Obrázek z Donate a Blasco 2011 V roce 1994 byla vyvinuta TRAP assay, metoda, která je schopna detekovat přítomnost telomerázy v buňce. S její pomocí se zjistilo, že 85% nádorů obsahuje aktivní telomerázu, která je od té doby předmětem výzkumu protinádorových terapií.
Telomery a stárnutí Délka telomer u člověka je kolem 13 000 bp, ale záleží na: - věku (novorozenci mají telomery delší i o několik tisíc bazí než století stařečci)
Hayflickův limit
Telomeráza je u člověka aktivní během embryonálního vývoje, čímž je kompenzováno zkracování telomer při masivní proliferaci buněk v rostoucím embryu. U dospělého člověka je telomeráza aktivní jen v některých buňkách. Proto nejdelší telomery má novorozenec a jejich délka se během života zkracuje.
34
Telomery a stárnutí Délka telomer u člověka je kolem 13 000 bp, ale záleží na: - věku (novorozenci mají telomery delší i o několik tisíc bazí než století stařečci) - tkáni
Např: Epidermis – 33 bp/rok Střevní sliznice – 59 bp/rok Játra – 120 bp/rok Endotel – 147 bp/rok Srdce – nedetekovatelné Mozek - nedetekovatelné
Telomery a stárnutí Délka telomer u člověka je kolem 13 000 bp, ale záleží na: - věku (novorozenci mají telomery delší i o několik tisíc bazí než století stařečci) - tkáni - genetické dispozici
Těžký život bez telomerázy Myši s deaktivovanou telomerázou měly: - kratší život - nestabilní genom - zvýšený výskyt nádorů - zkrácené telomery
Mnoho informací o roli telomerázy pochází z myší, které měly deletovanou RNA komponentu z telomerázy. I když chybějící telomeráza nezpůsobovala všechny projevy stárnutí, myši některé projevy měly: zkrácené telomery, genetickou nestabilitu, sníženou reakci na stimulaci hematopoezy, kratší život a zvýšené množství maligních nádorů.
Těžký život bez telomerázy Lidská onemocnění způsobena nedostatkem funkční telomerázy: Kongenitální dyskeratóza - pigmentové skvrny na kůži, bílé skvrny v ústech, anémie - úmrtí většinou na selhání kostní dřeně - způsobena mutacemi v genech pro telomerázu nebo asociované proteiny Aplastická anémie - útlum kostní dřeně málo krevních buněk - může být způsobena mutacemi v genech pro telomerázu Idiopatická plicní fibróza - zjizvení plic snížená kapacita chronický kašel, zadýchávání - může být způsobena mutacemi v genech pro telomerázu
Dyskeratosis congenita (DKC, Kongenitální dyskeratóza) je dědičné onemocnění, které se projevuje hyperpigmentací (tmavé skvrny na kůži), orální leukoplakií (bílé skvrny v ústech a nehtovou dystrofií (chybějící nehty). Úmrtí ve většině případů nastává selháním kostní dřeně, dále imunodeficiencí, dýchacími obtížemi a rakovinou. Autosomálně dominantní forma je způsobena mutací v genech kódujících TR nebo TERT, které redukují aktivitu telomerázy a tím i schopnost proliferace kmenových buněk. To vede i nízkému množství bílých a červených krvinek (aplastická anemie). Rodiny s DKC vykazují zhoršování projevů z generace na generaci kvůli zkracujícím se teloomerám, které jsou předávány potomkům. Aplastic anemia (AA) je většinou získaná choroba, ale vzácně s objevují rodiny, kde je děděná. Její příčinou je pak mutace v genech pro TR nebo TERT. Často je spojena s DKC, ale v některých případech chybějí typické projevy. Při AA má pacient malé množství krevních buněk a smrt nastává většinou v důsledku selhání kostní dřeně. Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) idiopathic = vyskytující se spontánně bez jasné příčiny IPF je onemocnění, jehož příčina je často neznámá. Projevuje se vazivovými jizvami na plicích, což zmenšuje jejich kapacitu. Symptomy jsou chronický kašel a zadýchání bez fyzické námahy. V některých rodinách je toto onemocnění dědičné a je způsobeno mutací v genech pro TERT a TR.
Další choroby spojené s redukcí telomer Lidská onemocnění bez mutací v telomeráze, ale s krátkými telomerami, např: Wernerův syndrom - předčasné stárnutí po 10. roce (šedivé vlasy, slabá kůže, diabetes, arteroskleróza, rakovina) - rychlé zkracování telomer a nestabilita genomu - nejčastější příčina smrti – infarkt nebo rakovina - mutace v genu WRN (DNA helikáza) – interaguje s telomerickým proteinem Trf2 rozplétání telomer při replikaci?
Wernerův syndrom WS je autosomálně recesivní onemocněním jehož jedinou známou příčinou je mutace v genu WRN, který kóduje DNA helikázu. Při tomto onemocnění bylo pozorováno rychlé zkracování telomer a nestabilita genomu. První příznaky nastávají obvykle po 10. roce, po pubertě následuje rychlé stárnutí. Projevy jsou: chybějící růstové sprouty, šedivění vlasů, slabá kůže, diabetes, katarakta, hypogonadismus, arteroskleróza a rakovina. Častou příčinou smrti je infarkt nebo rakovina. Není známo propojení mezi funkcí helikázy a telomerami, ale tato helikáza má silnou afinitu k telomerickému proteinu Trf2 (TTAGGG repeat binding factor 2) a její funkcí by mohlo být rozplétání telomer pro replikaci (Opresko et al. 2002)
Další choroby spojené s redukcí telomer Lidská onemocnění bez mutací v telomeráze, ale s krátkými telomerami, např: Fanconiho anemie - vzácná genetická choroba, průměrná doba života 30 let - způsobená vyřazením některého z 15 genů pro opravu DNA - často nízká postava, abnormality kůže, rukou, hlavy, ... , - rakovina (nejčastěji AML) - telomery se zkracují odlamováním spojování chromosomů nestabilita genomu
Fanconiho anemie FA je vzácná genetická choroba (častější u Židů Aškenazi a v Jižní Africe), způsobená vyřazením některého z 15 genů, které se účastní reparace DNA. Většina pacientů dostane rakovinu (většinou akutní myeloidní leukemii), průměrný věk úmrtí je 30 let. Většina pacientů má i další problémy, často nízká postava, abnormality kůže, rukou, hlavy, ... U FA bylo prokázáno, že dochází k progresivnímu zkracování telomer vlivem zlomů v telomerických oblastech (fragmenty telomer pozorovány po FISH mimo chromosomy), důsledkem je 10x vyšší frekvence spojování chromosomů než u zdravých lidí, a tím i vysoká nestabilita genomu (Callén et al. 2002).
Telomery a stárnutí Délka telomer u člověka je kolem 13 000 bp, ale záleží na: - věku (novorozenci mají telomery delší i o několik tisíc bazí než století stařečci) - tkáni - genetické dispozici - životním stylu
Negetické faktory ovlivňující délku telomer • Vysoký krevní tlak • Kardiovaskulární choroby • Obezita • Zánět tlustého střeva • Dlouhodobé vystavení cigaretovému kouři • Dlouhodobý stres
Na délku telomer u člověka mají vliv i negenetické faktory – prostředí a biochemie. Na krátké telomery mají vliv ulcerózní kolititida (zánět tlustého střeva), obezita, vysoký krevní tlak, kardiovaskulární choroby a chronické vystavení cigaretovému kouři. Rovněž vysoká produkce stresových hormonů (glukokortikoidů) má negativní vliv na udržování telomer. E. Blackburn a její tým ukázali, že staří lidé s krátkými telomerami mají kratší život a méně zdravých let.
Směry výzkumu telomer Telomery a stárnutí – potenciální aplikace v kosmetice – krémy/nápoje aktivující/dodávající telomerázu - genová terapie - aktivace telomerázy v dospělých somatických buňkách – problematické, riziko rakoviny
Směry výzkumu telomer Telomery a stárnutí – potenciální aplikace v kosmetice – krémy aktivující/dodávající telomerázu - genová terapie - aktivace telomerázy v dospělých somatických buňkách – problematické, riziko rakoviny
Klonování zvířat ze somatických buněk - délka telomer klonovaných zvířat je různá - záleží na použité buňce
Telomery a klonování savců
Dolly – první vytvořený savčí klon - narozena v r. 1997 – klon z buňky mléčné žlázy
Dolly zemřela mladá (6,5 roku místo 11-12 let) Její telomery byly kratší, než odpovídalo věku Dolly byla biologicky starší než její skutečný věk! Robert Lanza a kolektiv (2000): 6 telat klonovaných z dělících se nediferencovaných buněk (fibroblastů) - dle délky telomer dokonce biologicky mladší!!!
Klonování savců se provádí tak, že ze somatické buňky dospělého jedince je odebráno jádro, které je vloženo do vajíčka zbaveného vlastního pronuklea. Z této diploidní buňky se začne vyvíjet embryo, které je implantováno náhradní matce, která je donosí a porodí. Mládě nese stejnou genetickou informaci jako jedinec, kterému byla odebrána somatická buňka. Klonování savců je problematické, protože má velmi malou účinnost a i narozené klony často trpí zdravotními problémy nebo umírají bez zjevné příčiny. Prvním klonovaným savcem byla ovce Dolly, která vnikla ze somatické buňky odebrané z vemene dospělé ovce. Dolly zemřela poměrně mladá (cca v polovině věku, kterého se ovce dožívají). Při analýze délky jejích telomer se ukázalo, že neodpovídají věku Dolly, ale věku Dolly plus věku ovce, ze které pocházela somatická buňka použitá ke klonování. Na druhou stranu to, že klon bude mít krátké telomery, není pravidlem. Jiná práce, popisující klonování krávy, ukázala, že narozené klony měly telomery ještě delší, než by měla přirozeně počatá telata (Lanza et al. 2000).
45
Směry výzkumu telomer Telomery a stárnutí – potenciální aplikace v kosmetice – krémy aktivující/dodávající telomerázu - genová terapie - aktivace telomerázy v dospělých somatických buňkách – problematické, riziko rakoviny
Klonování zvířat ze somatických buněk - délka telomer klonovaných zvířat je různá - záleží na použité buňce
Telomery a rakovina - inhibice telomerázy v nádorech – často toxické in
vivo nebo neefektivní - nejslibnější očkování proti telomeráze
Vývoj léků Protože telomeráza a udržování telomer hraje roli ve vývoji různých malignit, pracuje se na vývoji léků, které cílí na telomerázu nebo telomery. Navzdory velkému úsilí jen minimum léků se dostalo až do klinických zkoušek, protože většina vykazovala buď malou efektivitu nebo toxicitu in vivo. Roli hraje samozřejmě i to, že o regulaci telomerázy a jejích funkcích víme stále velice málo. Zatím nejslibnější je vakcinace pacientů s rakovinou proti hTERT epitopům (Vonderheide 2008/2009).
46
Prodlužování telomer rekombinací aneb proč nás vypnutí telomerázy neochrání před rakovinou Alternativní mechanismus prodlužování telomer (ALT): REKOMBINACE - nalezen i u člověka Nepotřebují telomerázu 85% lidských nádorů má aktivní telomerázu zbytek používá alternativní prodlužování telomer
V roce 1990 byl u kvasinek objeven způsob prodlužování telomer nezávislý na telomeráze, v roce 1994 bylo totéž objeveno u savců. Ukázalo se, že 10-15% nesmrtelných buněčných linií tento ALT (Alternative Lengthening of Telomeres) systém využívá. Protože 85% lidských nádorů má aktivní telomerázu, je tato slibným cílem pro nádorovou terapii, nicméně už teď je jasné, že na zbývajících 15% tato terapie fungovat nebude.
47
Co si odnést z této přednášky 1) Centromery – místo nasedání kinetochoru, funkce: bezchybný rozchod chromosomů 2) Monocentrické vs. holokinetické chromosomy 3) DNA centromer – rychlá evoluce, často repetitivní DNA, důležité jsou epigenetické markery 4) Centromerické proteiny – řada funkcí (vazba mikrotubulů, motorové proteiny, kontrolní bod, ...) 5) NOR (organizátor jadérka) – rDNA, různé počty + různý počet genů 6) Jadérko – transkripce rDNA, jen v interfázi a profázi
Co si odnést z této přednášky 7) Telomery – konce eukaryotních chromosomů, jsou nezbytné pro fungování buňky (replikace konců, nelepivé konce, Hayflickův limit). 8) Telomery jsou složené z DNA a proteinů. Sekvence telomerické DNA je často společná pro velké skupiny organismů. Ale existují výjimky! 9) Telomeráza, enzym prodlužující telomery, je u člověka aktivní pouze během embryonálního vývoje a v dospělosti v kmenových buňkách. Její aktivace v dospělých somatických buňkách může vést k rakovině. 10) Na délku telomer má vliv i životní styl. Takže sportujte, jezte zdravě a nestresujte se.
Don’t worry, be happy!
