Folyadékkromatográfiás detektorok Jelzett vegyületek elválasztástechnikája Dr. Szikra Dezső Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum Nukleáris Medicina Intézet
Ideális kromatográfiás detektorral szembeni elvárások • Érzékeny legyen • Minden komponenst detektáljon • Ne befolyásolja a hőmérséklet vagy az áramlási sebesség változása • Az eluensösszetétel ne befolyásolja • Ne járuljon hozzá a kolonnán kívüli csúcsszélesedéshez • Megbízható és kényelmes legyen • A válaszjel lineárisan változzon a mérendő komponens koncentrációjával • Ne károsítsa a mintát • Adjon minőségi információt a detektált csúcsról
Detektorok csoportosítása •
•
•
•
makroszkópos tulajdonságot mérő detektorok mindenre ad jelet, nem specifikus, alacsony érzékenység, pl: RI, fényszórás Minta specifikus detektorok a minta komponenseire ad válaszjelet, pl: UV, FL, vezetőképességi, elektrokémiai, RA Euenst módosító detektorok az eluenst megváltoztatva a mintakomponensek tulajdonságait is megváltoztatják, pl: származékképzés, CAD, MS, ELSD Csatolt technikák független analitikai műszer és HPLC összekapcsolásával létrehozott technika, pl: MS, IR, NMR
Detektorzaj •
Short-term noise: 1 percnél jóval rövidebb ciklusidejű alapvonal zavar • Peak-to-peak noise: az alapvonal szélsőértékeinek távolsága a megfelelő mértékegységben (Au, mV) Zajcsökkentés Hálózati kábel zajmentesítése: zavarszűrős elosztó Adatkábel zajmentesítése: árnyékolsá, megfelelő időállandójú RC tag Adatgyűjtési frekvencia csökkentése (de min. 20 pont/csúcs!) Long-term noise: az alapvonal hosszú távú ingadozása, elektromos zajszűréssel nem csökkenthető, oka: kosz Baseline drift: az alapvonal fokozatos eltolódása, eluensösszetétel, hőmérséklet változás okozza
jel/zaj arány Jel/zaj arányból adódó pontatlanság: LOD: S/N=3, 16% RSD LOQ: S/N=10, 5% RSD
RSD% =
50 S/N
Növelése: Detektálási hullámhossz változtatás Származékképzés Detektor típus változtatás Minta tömeg növelés Csúcsszélesség csökkentés (kolonna átmérő, retenció csökkentés) Jelsimítás Pontosabb termosztálás Tisztább eluensek Hatékonyabb minta tisztítás Hatékony eluens keverés (nagyobb dwellvolume)
Csúcsszélesítő hatás • •
Korai (2
k=2
UV-látható detektorok • • • • • • •
190-600nm tartomány Lambert-Beer törvény Linearitás: kb. 2 Au-ig Zaj: kb. 10-5Au HPLC méret: 1cm fényút, 1mm átmérő, 8ul térfogat >3um, 100 x 4,6mm kolonnához való Törésmutató változások miatt 1mm alatti átmérő nem jó
I A = log 0 = εcl I
Eluensek fényelnyelése víz TOC < 50 ppb oldott oxigén eltávolítása 200-240nm tartományban harmadával csökkenti az abszorbanciát
Fix hullámhosszú detektorok Olcsó Kicsi Levegő referencia Higanygőz lámpa (254nm)
Változtatható hullámhosszú detektorok • • • •
UV: deutérium lámpa Látható: wolfram lámpa Detektálás 1-2-3-4 hullámhosszon egyszerre Stopped-flow spektrumfelvétel
Diódasoros detektorok • • • •
512-1024 dióda Folyamatos spektrum felvétel: csúcsazonosításra alkalmas Nem elváló csúcsok különböző hullámhosszakon kvantitálhatók Csúcstisztaságvizsgálat
Bandwidth megadja, hogy hány dióda jelét átlagolja a detektor egy adott hullámhosszhoz a sávszélesség növelése csökkenti a zajt, rontja a spektrumot
Slit width Kis résszélesség magas felbontású spektrumot ad, mely alkalmas lehet csúcsazonosításra spektrumkönyvtár segítségével – de zajos alapvonal
Reference wavelength • A referencia hullámhossz használata a lámpa fényerejének változásait és az eluens törésmutatójából adódó változásokat kompenzálja (drift) • Ha túl közel van a detektálási hullámhosszhoz, a csúcsmagasságok csökkennek
csúcstisztaság vizsgálat: TUV
Csúcstisztaság vizsgálat: PDA
Hibalehetőségek • • •
Nem megfelelően gázmentesített eluensből buborékok keletkezhetnek a detektorcellában - „back pressure regulator” Lámpaélettartam véges 1-2000h garantált Rendszeresen ellenőrizni kell a lámpaenergiát pl: 230nm-en
Fluoreszcens detektorok • • • •
• • •
• •
Nagy érzékenység fluoreszkáló anyagokra Származékképzéssel sok anyag vizsgálható Széles spektrumú lámpa (deutérium) vagy xenon villanólámpa Gerjesztési- és detektálási hullámhossz külön-külön választható szűrő vagy monokromátor segítségével Emissziós hullámhossz mindíg magasabb, mint a gerjesztési Gyakran 100x érzékenység UV-hoz képest kb. 104 dinamikus tartomány, de kisebb lineáris taromány (néha csak 1 nagyságrend) Gradienssel használható, ha az eluensek tiszták A mintamátrix, vagy az oldott oxigén kioltást eredményezhet
Amperometriás detektorok • • • • • •
Egy polarizált és egy referencia elektród közötti áramerősséget méri az alkalmazott feszültség függvényében Az áramerősség arányos a vizsgált anyag koncentrációjával Elektromosan vezető eluens szükséges Finomhangolással nagyon szelektívvé tehető A legérzékenyebb HPLC-s detektor – de nagyon tiszta eluenst igényel Glassy carbon vagy arany munkaelektród
oxidácó fenolok oximok merkaptánok peroxidok aromás aminok purinok heterociklusos vegyületek
redukció ketonok aldehidek oximok konjugált savak konjugált észterek konjugált nitrilek aktivált halogenidek aromás halogenidek nitro vegyületek heterociklusos vegyületek
nem detektálható éterek alkánok alkoholok karbonsavak
Vezetőképességi detektorok • Elsősorban szervetlen ionok és szerves savak meghatározására Puffert tartalmazó eluensek a magas háttér vezetőképesség miatt csökkentik az érzékenységet • Ion szupresszor kolonnával csökkenthető az effluens vezetőképessége
Törésmutató detektorok • • • • • •
Ék alakú dupla flow cell: referencia és minta ág A minta ágban érkező eltérő törésmutatójú anyagok eltérítik a fényt – megváltozik a fotodiódákat érő fény aránya A mintától jelentősen eltérő törésmutatójú eluens esetén nagyobb érzékenység (így is maximum 0,1%-os koncentrációig használható) Gradienssel nem használhatóak (on-line keverés is kerülendő) Precíz termosztálás nagyon fontos (1-2 óra melegedés) Eluenst nem töltünk után mérés közben!
Evaporative Light-Scattering Detector (ELSD) • Az eluens elpárologtatása után a nem illékony komponens részecskék fényszórásának méri • Illékony anyagokra alacsony érzékenység • Gradiens elúcióval alkalmazható, hőmérsékletre nem érzékeny • Illékony eluenst kell alkalmazni • 1-2 nagyságrend lineáris tartomány, de magasabb dinamikus tartomány • RI-nél 1-2 nagyságrenddel érzékenyebb
Condensation Nucleation Light-Scattering detector (CNLSD) • Magasabb érzékenység (10-100x) • Szélesebb lineáris (103) és dinamikus (105) tartomány • Az eluens bepárlása után telített oldószergőzt kevernek a részecskékhez, melyeken kondenzálódik
Laser Light-Scattering Detectors (LLSD) • • • •
Fényszórás mérés elpárologtatás nélkül Lézer fény szóródását mérik 3-18 különböző irányban Anyagmennyiség meghatározására alkalmas kalibráció nélkül Polimerek molekulatömegének meghatározása 103-106 Da tartományban
Corona-Discharge Detector (CAD) •
•
• •
Az eluenst elpárologtatva korona kisüléssel ionizált nitrogén gázzal keveri és a képződött ionokat elektrométerrel méri Az eluensnél alacsonyabb illékonyságú komponensek mérhetőek Széles dinamikus tartomány (104) Érzékeny, akár 0,05% szennyező is mérhető a főkomponens mellett
MS „detektorok” Analizátor • MS • MS/MS • TOF • Q-TOF • Iontrap Interfész • ESI • APCI • APPI
Kolonna előtti származékképzés
ninhidrin
Aminosav analízis
Kolonna utáni származékképzés
•
• •
Ryuji Nakaoa, Takehito Itoa, Masatoshi Yamaguchi, Kazutoshi Suzuki, Improved quality control of [18F]FDG by HPLC with UV detection, Nuclear Medicine and Biology 32 (2005) 907–912 Inertsil NH2 kolonna, 90%ACN 100 oC, 10m 0,5mm PTFE reaktor
Hibaelhárítás Rendszeres ellenőrzés • „System suitability” tesztek: felbontás, tányérszám, csúcsaszimmetria • „System performance” tesztek Megelőző karbantartás Javítás
Gradiens teszt A: víz B: 0,1% aceton Det: 265nm Flow: 1ml/min 1m 0,1mm PEEK cső 20 perc gradiens idő Egyenest kell kapnunk
Lépcső teszt •
10-20-30-40-45-50-55-60-70-80-90-100%B lépcsők 3 percenként
Gradiens keverőszelep teszt
System performance
Megelőző karbantartás
Folyadékszállítás • • • •
Buborékmentesítés: metanol Eluens szabad áramlás: min 10x flow Golyósszelep tisztítás: UH metanolban Csatlakozók: meghúzás, újra csatlakoztatás, csere
Tisztaság – szellemcsúcsok elkerülése • • • • •
HPLC minőségű oldószerek és sók az eluenskészítéshez Milli-Q víz: 0,22um szűrés, ioncsere, aktív szén, UV oxidáció Minden oldatot szűrni kell (0,45um, 0,22um) Eluenstartó edényeket mosogatás után 10x öblíteni TFA tisztán bomlékony – ampullázottat érdemes venni
Keresztszennyezések 1. Térfogati keresztszennyezés: állandó arányú szennyezés tűmosás, csatlakozások, rotor seal 2. Adszorpciós keresztszennyezés: lassan csökkenő mértékű szennyezés Minta oldat és mosófolyadék szerves oldószertartalmának növelése 3. Részleges elúció: izokratikus elválasztásnál, nagy csúcsszélesség
Hibaelhárítási szabályok • • • • • •
Oszd meg és uralkodj, pl: módszer vagy készülék Könnyű – hatásos, pl: áramlási sebesség vagy eluens Egyszerre csak egyet Csak az hiba, ami kétszer előfordul Moduláris csere Tedd vissza
