Fermentációs technológia
2006
előadásvázlat
1. Általános bevezetés Többezer éves múlt, erjesztés-savanyítás, stb. A XX. században különböző korszakai voltak 1. Citromsav korszak (1940-ig) föleg élelmiszeripari, erjedésipari termékek (tejsav, etanol, aceton, butanol, riboflavin, enzimek) 2. Antibiotikum korszak (kb. 1960-1970) antibiotikumok, szteroidok, aminosavak, enzimek, stb. ekkor dolgozták ki a steril technikáknak, az oxigénellátásnak, a mikroorganizmusok nagyüzemi körülmények között való kezelésének, a törzsnemesítésnek a módszereit 3. Jelenlegi korszak (ez a biotechnológia) Jellemzői: Új energiaforrások alkalmazása Óriási fermentorok Műszerezés, optimalizálás, komputerizáció Új, molekuláris biológiai módszerek Tulajdonképpen ettől lett fontos, és érdekes, értékes a társadalom számára a biotechnológia Mik az új molekuláris biológiai módszerek? in vivo és in vitro DNS manipuláció immunológia Néhány adat az úgynevezett “új biotechnológia” jelenéről és jövőjéről: 1995-ben Európában 584 biotechnológiai cég volt, 1.16 Mrd Ecu bevétellel, 605 millió Ecu-t fektetve a kutatásba, 17200 alkalmazottal A globális biotechnológiai piac 2000-re a becslések szerint elérte a 218 Mrd USD-t. Ebből: mezőgazdasági: 53 Mrd USD gyógyszeripari: 50 Mrd USD élelmiszeripari: 20 Mrd USD növényt./ber. 5 Mrd USD Az európai biotechnológiai piac nagysága 2000-re elérte a kb. 85 Mrd USD-t, a német kormány 1996-ban kb. 900 M DEM-et költött biotechnológiára. Vannak egyes szakértők, akik nemes egyszerűséggel a 21. századot a biológiai tudományok századának tekintik. Kitekintő. A biotechnológiai iparág a nyugat-európai országokkal összehasonlítva Magyarországon még kezdeti fázisban van, de erőteljes ütemben bővül, fejlődése rendkívül ígéretes, az a magyar gazdaság motorjává válhat - a többi között ezt szögezi le az Ernst & Young 2006 évi globális biotechnológiai felmérése. (www.nkth.gov.hu) 2005-ben a tőzsdén jegyzett európai cégek árbevételei az előző év ötszázalékos csökkenésével szemben 17 százalékkal nőttek. A finanszírozás terén 2005 minden korábbinál jobb év volt az európai biotech számára: a vállalatok 3,2 milliárd euró tőkét teremtettek elő. Ekkor először az európai biotech az amerikai piacnál több tőkét vont be elsődleges nyilvános részvénykibocsátások (IPO) révén: az európai tőzsdei bevezetések
2
száma a 2004. évi nyolcról huszonháromra emelkedett, a részvénykibocsátásból származó összes bevétel a 2004-es 291 millió euróhoz képest 2005-ben elérte az 560 milliót. Miért pont a biotechnológia? •
Gyorsan növekvő ipari szektor
•
Jól fizető, magas kvalitású munkahelyeket teremt
•
Számos piaci területet érint, s egyben átfogja a k+f-et, a gyártást és a szolgáltatásokat
•
Számos egyéb ipari szektor növekedését előmozditja, egyebek között az infokommunikációt az elektronikát, az optikát, a finomgyártást
•
Hozzájárul az állampolgárok jólétéhez a termékeken és a szolgáltatásokon keresztül egyaránt Forrás: VG gyűjtés
Biotechnológia Magyarországon Erősségek •
Elismert tudományos kompetenciák - világhírű egyetemi oktatás
•
Erős kapcsolatrendszer az EU, az USA és Japán egyetemeivel és cégeivel
•
Szerveződő biotechnológiai ipar - harminc core biotech, néhány száz élettudományos cég
•
Gyógyszeripari hagyományok - bár a biotechnológia és a gyógyszeripar együttműködési potenciálját nem használjuk ki
•
Innovációbarát IP-jogi környezet - új innovációs törvény
•
Magyarország az infokommunikációban - méretéhez képest - erős - ez segíti a biotech fejlődését is
Gyengeségek •
Kevés az itthon maradt alkalmazott kutató - legtöbben külföldre távoztak-távoznak
•
Kevés a biotech menedzser - jelenleg néhány tíz fő
•
A tőkeellátottság gyakorlatilag teljes hiánya - összesen négy biotech-tőkeemelés 1990 óta
•
Biotechnológiai facilitások szinte teljes hiánya - inkubátorházak, kutatóparkok
•
A biotech cégek között kevés a gyógyszerkutató - a legtöbb vállalat a nemzetközi gyógyszeripar technológia- és eszközbeszállítója
•
Szektormarketing- és PR-hiányosságok - kevesen gondolnak Magyarországra mint biotech hatalomra (itthon és külföldön egyaránt) Forrás: Magyar Biotechnológiai Szövetség
3
Mi a biotechnológia? Biotechnológia az, ha mikroorganizmusok segítségével hajtunk végre valamilyen hasznos folyamatot. A mikroorganizmus lehet bármilyen eredetű, beleértve a növényi, állati sejteket, baktériumokat, gombákat. A BIOTECHNOLÓGIA a BIOKÉMIA, MIKROBIOLÓGIA és a MÉRNÖKI TUDOMÁNYOK integrált alkalmazása mikroorganizmusok állati és növénysejtek/szövetek vagy ezek részeinek (pl. enzimeinek) technológiai felhasználása céljából
Ennek a definíciónak egy grafikus megjelenítési formája a következő
Röviden azt mondhatjuk, mikrobiológia.
hogy
a
biotechnológia
tulajdonképpen
alkalmazott
Osztályozás A biotechnológiai eljárásokat feloszthatjuk az eljárás célja, illetve az eljárás alkalmazási területe alapján. A későbbiekből kiderül, hogy természetesen van átfedés a kétféle osztályozás között. 4
Cél: 1. Sejtmassza előállítás (SCP) 2. Sejtkomponensek előállítása 3. Metabolizmus-termék előállítása 4. A mikroorganizmusok átalakító képességének kihasználása 5. A mikroorganizmusok lebontó képességének kihasználása Alkalmazási területek 1.Élelmiszeripar 2. Gyógyszergyártás 3. Vegyszergyártás 4. Környezetvédelem 5. Egyéb Célok 1. Sejtmassza előállítás (SCP) Mi a célja? Kiegészítő, főleg takarmányozási célra használható fehérjeforrás előállítása új típusú alapanyagokból. Normál esetben emberi fogyasztásra való alkalmazása nem célszerű, mivel a magas nukleinsav tartalma miatt húgysav keletkezik az emberi szervezetben, és ez köszvényt okoz. (A köszvény az ízületi gyulladások egyik fajtája, amely rendszerint a lábujjakat, legfőképpen a nagylábujjat érinti, de a tünetek jelentkezhetnek a bokán, a sarkon, a térden, a csuklón, a kézujjakon vagy a könyökön is. Kiváltó oka az, hogy a húgysav vérben lévő mennyisége magas szintet ér el, és ez a húgysavas nátriumsó ízületekben történő kiválásához vezet. A húgysav a szervezet purin-anyagcseréjének természetes végállomása. Purin-vegyületeket bizonyos élelmiszerek is tartalmaznak).
Előnye:
Hátrány:
független a mezőgazdasági termeléstől, nem szezonális gyártás nagyméretű készülékekben, automatizálható, kis munkaerőigény teljes biológiai értékű fehérjét tartalmaz eszközigényesség (100 000 t/év MeOH (metanol) alapú SCP-hez több Mrd Ft) nagy energia- és vízfelhasználás, sok szennyvíz
A MeOH alapú SCP előállítás jövője: 1. Műszakilag megoldott, tápértéke jó, Ny-Európában engedélyezett, Oroszországban az élelmiszerellátási problémák megoldására erőltetett ütemben fejlesztették. 2. Gazdaságosság - alapanyag ár-függvénye - legyen termotoleráns az eljárás - javuljon a termelékenység - esetleg termeljen további értékes anyagokat 3. Piaci helyzet: verseng a szójadarával, még nem olcsóbb 2. Sejtkomponensek előállítása Ipari enzimek: nukleinsavak poliszacharidok 5
xantán poli-β-hidroxi-butirát (lebomló műanyag) rDNS termékek
3. Metabolizmus-termék előállítása a/ Primer metabolitok Aminosavak Az élelmiszeriparban: ízjavító anyagként (Na-glutamát, Naaszpartát) antioxidánsként (cisztein gyümölcslevekben, triptofán, hisztidin) Takarmánykiegészítőként (lizin, metionin) Gyógyszerként (infúziós oldatokban) Vegyipari eljárások alapanyagaként alkalmazzák 6
Lizin, triptofán, glutaminsav A japánok a nagymenők, génmanipulált törzsekkel, számítógépes vezérlésű, 2-300 m3-es fermentorokban termelnek Alkoholok:
etanol: először vegyszerelőállítás, utána etilénből csinálták (olajbőség), majd megint erjesztéssel, benzin helyett aceton-butanol: csökken a jelentősége Szerves savak: citromsav: többszázezer tonna/év glükonsav ecetsav(de ez lehet inkább mikrobiológiai transzformáció) tejsav itakonsav b/ Szekunder metabolitok Vitaminok B2 (riboflavin),B12, A-provitamin (β-karotin) Alkaloidok: anyarozs alkaloidok: gyógyszerek Antibiotikumok: több tízezret írtak le, vizsgáltak meg, de csak néhány száz van kereskedelmi forgalomban. A hatásspektrum, a hatásmechanizmus, a termelő törzs, a bioszintézis útja és a kémiai szerkezet alapján lehet csoportosítani őket 4. A mikroorganizmusok átalakítóképességének kihasználása oxidáció, redukció hidrolízis, kondenzáció izomerizálás Szteroid-transzformációk (oxidáció, redukció, észterképzés) Glükóz-aszkorbinsav átalakítás (szorbit-szorbóz) glicerin - dihidroxi-aceton Prosztaglandinok (PGF2α) arachidonsavból Antibiotikumok sokféle transzformációja (hatástalanítás) Peszticidek transzformációja (környezetvédelem) DDT----(Acrobacter aerogenes)---TDE 5. A mikroorganizmusok lebontóképességének kihasználása Cellulóz-felhasználás Csirketoll (keratináz) Napraforgómag héja Lignin-lebontás Sajt savó, kipréselt cukornád
Felhasználási területek Élelmiszeripar Erjesztéses iparok Alkoholgyártás 7
hidrolízis,
Élesztőgyártás Tejtermékek Savanyúságok, húsipar Gyógyszeripar Gyógyítás Antibiotikumok Szteroid alapanyagok HIV ellen antiszensz RNS Tripla hélix DNS (jobbnak várják mint az anti-szensz RNS-t) Génterápia: az első elfogadott eljárások bevezetését 1997-re várták Human Genome Project Farmakogenomiális vizsgálatok azaz annak vizsgálata, hogy az egyes emberek eltérő genetikai háttere hogyan befolyásolja az új gyógyszerjelöltek hatását Megelőzés vakcinálás Diagnosztizálás In vitro gyógyszeripari vizsgáló és ellenőrzési eljárások USA: 290 M USD/év a kísérleti állatok felhasználására, évi 5%-kal nő. Ma még ennek csak nagyon kis részét váltják ki in vitro módszerekkel, de gyorsan növekedő terület Vegyszergyártás Alkoholok, savak, stb. Finomvegyszergyártás A becslések szerint ezeknek a termékeknek az 1996-os piaca 100 M USD fölött van, és a következő években várhatóan 300%-kal nő Mosószergyártás Hőnek, oxidációnak ellenálló, széles pH-tartományban működő amilázok, proteázok készítése, mosó- és mosogatószerekhez Környezetvédelem Szennyeződések eltávolítása biotechnológiai (mikrobiológiai) módszerekkel Lebontható műanyag (polihidroxi-vajsav, politejsav, polihidroxi alkanoát) Ausztrál adat: 6 Mrd műanyag zacskót használnak évente Talajtisztítás (olaj, nehézfém) Szennyvíztisztítás, metántermelés Ivóvíz nitrátmentesítése Nehézfémek megkötése, eltávolítása Starterkultúrák készítése az előzőkhöz Bányászat Gyenge ércek kilúgozása fémkötő mikroorganizmusokkal (Thiobacillus ferrooxidans) 8
Fe2+ --------Fe3+ S -----------H2SO4 Réz- és uránbányászat Kriminalisztika Tettesek azonosítása Mezőgazdaság Cél: a vegyszerezés szintjének csökkentése Japán: rizsallergiát okozó fehérjét nem tartalmazó rizs előállítása USA: rovarkártevőknek ellenálló gyapot előállítása szabályozott érésű paradicsom előállítása Génmanipulált burgonya: Régészet Fáraók közötti rokonság megállapítása Katonai alkalmazások Antrax teszt Végtelen széles lehetőségek a felhasználásra, és újabbakkal bővül, a molekuláris biológiai módszerek alkalmazásával (mesterséges enzimek, nem vizes közegben működő enzimes katalízisek, biológiai számítógép, molekuláris méretű mechanikai konstrukció, kihalófélben levő állatok, (pl. panda nyúlban) klónozással való szaporítása, stb.)
Néhány termelési adat Termék (kg) 1998
1999
2000
Etanol Glutaminsav citromsav L-lizin Glükonsav
18 100 000 108 300 3 300 000 552 900 32 900
17 000 000 105 700 3 300 000 548 200 31 800
23 800 000 107 400 3 400 000 564 300 31 200
Évi 75 millió tonna sört és bort termelnek. (2004) Kb. 23 Mrd USD értékű antibiotikum termelés. (2004)
9
2000 1000 USD 154 163 417 522 580 152 807 261 166 936
Egy fermentációs folyamat megvalósítása
Mikor érdemes biotechnológiai (fermentációs) eljárásokat alkalmazni: Néhány példa: - komplex molekulák (antibiotikumok, fehérjék monoklonális ellenanyagok, stb.) előállításakor - izomerek szelektív előállításakor - sok konszekutív reakció egyidejű végrehajtásakor - amikor a sejtek nagyobb hozammal alakítanak át
10
Hátrányok A termékek tisztítása híg oldatokból történik, bonyolult és drága Megújuló alapanyagok, amik olcsón és nagy Nagy mennyiségű, nagy BOD tartalmú mennyiségben hozzáférhetők szennyvíz keletkezik nagyobb specifikusság fertőződésveszély nagyobb hozam, kisebb energiaigény fertőzésveszély rDNS technikák alkalmazhatósága társadalmi idegenkedés Előnyök Enyhe reakciókörülmények
A fermentációs technológiák fejlesztése A fermentációk optimalizálása. Elvileg két különböző módon végezhető: - Ismert metabolizmus alapján tudatosan beavatkozunk (legalábbis azt hisszük) - fekete doboznak tekintjük a folyamatot (azaz változtatásokat eszközlünk a rendszerben, és a változtatásokra adott válaszból következtetünk arra, hogy mi is lehet a rendszerben, illetve, hogy milyen irányban kell változtatni az egyes paramérereket ahhoz, hogy javítsunk a fermentáción)
A technológia optimalizálását sajnos több szinten is el kell végezni: rázott lombikban (többezer) laborfermentorban (néhányszáz) kísérleti üzemi fermentorban (néhány tucat) termelő fermentorban (már nem nagyon) A technológia optimalizálása rázott lombikban Az inokulum és a termelési folyamat optimalizálása egymástól függetlenül, de egymással szoros összhangban folyik, itt lehet a genetikai munka eredményét is felhasználni, kipróbálni, technológia- igényét figyelembe venni Inokulum táptalaj hőmérséklet kor (mennyi ideig szaporítjuk) oltóanyag Termelési folyamat táptalaj összetétel hőmérséklet oxigén-ellátottság Előny: sok kísérleti pont beállítható (lásd későbbiekben a kísérlettervezést) Hátrány: sok technológiai paraméter nem mérhető, korlátozott számú a mintavételek száma és a minták nagysága is a kis térfogat miatt, adagolásos fermentációknál nem alkalmazható, levegőztetési problémákra nem ad választ Egészen alapvető paraméterek megismerésére alkalmas: hány fokon nem termel egyáltalán 11
alapvető táptalaj-komponensek szénforrás nitrogénforrás kell-e valamilyen speciális adalékanyag habzásgátlók hatása (PPG 1000 és 2000) sterilezés előtti pH értékmérés kidolgozása a fermentáció követéséhez Technológia optimalizálás laborfermentorban A laboratóriumi (lombik) szint kezdeti eredményei nem alkalmazhatók az ott kapott formában Tulajdonképpen itt végezhető el igazán a technológiai paraméterek beállítása, innen ha továbblépünk a kísérleti üzemi fermentorokba, akkor az már inkább méretnövelési problémát jelent, nem optimalizálást, technológia-fejlesztést. Fontos fermentációs technológiai paraméterek: Táptalaj-összetétel A sterilezés módja Inokulálás módszere Adagolások kidolgozása Biokémiai paraméterek mérése Biomassza mérése, becslése, elemzése A fermentáció hőmérséklete, hőmérséklet-profilja A fermentáció pH-ja, pH-profilja Oldott-oxigén koncentráció Elmenő levegő elemzése (tömegspektrométer) A belső nyomás beállítása Habzásgátlás Viszkozitás, bekevert teljesítmény mérése A fermentor súlyának mérése Mérik még az oldott széndioxid mennyiségét, a redoxpotenciál értékét is. Ismereteim szerint nem olyan paraméterek, amelyekkel a gyakorlatban fermentációkat szabályoznak Az már komoly tudomány, amikor ezeket a paramétereket on line számítógépes kapcsolat révén gyűjtik, feldolgozzák, majd az előzetes többéves tapasztalatok alapján készített számítógépes programmal beavatkoznak Táptalaj-összetétel A fermentációs iparokban alkalmazott mikroorganizmusok termelőképessége alapvetően két tényezőtől függ: a mikroorganizmus genomjától és attól a környezettől, amiben a mikroorganizmust tenyésztjük. Egy adott mikroorganizmus esetében tehát a környezet a meghatározó. Ennek több eleme van, most a táptalajt járjuk körül. Egy mikroorganizmushoz többféle táptalajt kell alkalmazni. Más táptalajon kell tárolni, más táptalajon kell a törzsnemesítési feladatokat elvégezni, más táptalajon kell az oltóanyagot előállítani, és más táptalajon kell a termelési folyamatot megvalósítani A fermentáció elméletével foglalkozó könyvekben sok-sok oldalon keresztül tárgyalják, hogy a mikroorganizmus elemösszetétele és a tápanyagok elemösszetétele alapján
12
milyen táptalajt kell biztosítani a mikroorganizmusnak. A gyakorlatban ez nem így van. Van néhány ismert alap-táptalaj típus, amivel elkezdik a kísérletezést, az összetétel módosítását Az iparban használt fermentációs folyamatokhoz olcsó, maximális termékszintet biztosító táptalaj kell, amiben: a szén- és nitrogénforrás aránya megfelelő nem a mikroorganizmusra van optimalizálva, hanem a termékképződésre Nem tartalmaz a termelést represszáló mennyiségben komponenseket (katabolit represszió), azaz például magas koncentrációjú glükózt, szervetlen foszfátot, lassan felszabaduló nitrogén van benne (halliszt, szójaliszt) A tulajdonképpen definiálatlan és definiálhatatlan természetes táptalaj komponensek egyelőre nem pótolhatók (biosz anyagok?) Példák: kukoricakeményítő, dextrin, kukoricalekvár, szójaliszt, kazein, zselatin, szeszmoslék por, szulfitlúg, cellulóz, vágóhídi hulladék, malátakivonat, halliszt, élesztőkivonat, pepton A sterilezés módja A sterilitás biztosítása az egyik leglényegesebb követelmény. Nagyon drága dolog, ha egy 100 m3-es fermentor tartalmát ki kell dobni Elvileg két útja létezik: Az idegen mikroorganizmusok eltávolítása Szűrés (levegő, üledékmentes folyadék) mélységi szűrő egyik fajtája a koksztorony membránszűrő Az idegen mikroorganizmusok elpusztítása Hővel, vegyszerrel, besugárzással Laborfermentort lehet autoklávban, vagy helyben, kevertetés közben sterilezni. Ez az utóbbi a jobb, mert ez felel meg az ipari körülményeknek
13
Előnyös: magas hőmérséklet, rövid sterilezési idő, hogy a táptalajok fontos komponenseit (pl. vitaminok) ne károsítsuk, pl: Sterilezés hőm. 100 110 120 130 140 150
N/No=10-16 843 75 7,6 0,85 0,11 0,01
Tiamin veszteség (%) 99,99 89 27 10 3 1
Relatív rezisztencia: vegetatív baci, élesztő baci spóra gombaspóra vírus, fág
1 3x106 2-10 1-5
Teljes sterilitást elvileg nem lehet elérni, csak azt, hogy az elpusztítani kívánt mikroorganizmusok számát bizonyos valószínűséggel a kiindulási szintről egy alacsonyabb szintre csökkentsük. Gond: nem tudjuk a kiindulási szintet A fermentorok méretnövelésénél gondot okoz a sterilezéshez szükséges idő hosszának növekedése, mivel a fermentor térfogata az átmérővel köbösen növekszik, míg a palást felülete csak négyzetesen, és a fermentortérbe beleszerelt hőátadó felület sem növelhető minden határon túl. De létezik folyamatos sterilezési eljárás, amit általában úgy tekintenek, hogy a tejiparból vettek át (UHT tej). Előnyei: rövidebb ideig, magasabb hőmérsékleten végezhető a sterilezés Hátránya: az igazi (pl. antibiotikum) fermentációban nem alkalmazható, az üledékes táptalajok miatt Különböző megoldási formái vannak, pl.:
A hőérzékeny táptalajkomponenst külön kell sterilezni, adagolni A kisterilezett fermentort (szerelvényekkel együtt kisterilezett!) sterilen is kell tartani. Fertőzési lehetőségek: mintavétel, adagolás, levegőbevezetés, rossz szigetelés (pl. a keverőnél) 14
A fermentorok tervezésénél már gondolni kell a sterilezhetőségre, kerülni kell a nehezen kisterilezhető, pangó részeket, a lehető legrövidebb csonkokkal kell dolgozni A steril, jellemző minta vételének kidolgozása igen fontos. Egészen extra mintavevő berendezések léteznek. Inokulálás módszere Az oltóanyag-lépcsők beállítása Hány lépcsőben készül az inokulum, van-e inokulum fermentor vagy lombikból oltunk? Biomassza mérése, becslése, elemzése Mikroszkópos vizsgálat Szélesztés Sterilitás vizsgálata Centrifugálás Biomassza-tömeg becslése PMV (packed micelial volume) Keverés A kémiai eljárásokkal szemben – ahol igen gyakran homogén folyékony fázisok, vagy heterogén fázisok reagálnak egymással, a fermentációnál háromfázisú rendszerekkel dolgozunk. 1.
Folyékony fázis oldószer (víz) az oldott sókkal, szubsztrátokkal és metabolitokkal. Esetenként jelen lehet egy második folyékony, ez elsővel nem elegyedő folyadék is (például alkánok fermentációja, szteroid transzformáció) 2. Szilárd fázis egyes sejtek, szemcsék, fel nem oldott szubsztrátok vagy metabolitok tartoznak ide 3. Gázfázis oxigénellátásra, és a CO2 eltávolítására szolgáló levegő A keverő feladata a fermentoron belül a hő- és anyagszállítás. Lényeges, mert az egyes tápanyagok transzportja a fermentáció sebességét meghatározó tényező lehet. A három fázis miatt a fermentorban a keverés feladatai a következők: • Energiabevitel • A levegő diszpergálása a táptalajban • Homogenizálás: a táptalajt alkotó anyagok koncentráció-különbségeinek és a hőmérsékleti különbségeknek a kiegyenlítése • A mikroorganizmusok és a táptalaj szilárd részeinek szuszpendálása • Az egymással nem elegyedő folyadékok diszpergálása A keverő, keverés típusa felső vagy alsó keverés (mágneses keverő) fontos a keverőtípus: Turbina, lapát, egy vagy több keverő, stb., hogy az egész fermentor egyenletesen át legyen keverve, ne legyenek benne pangó részek (főleg viszkózus fermentleveknél) A keverés fordulatszáma 15
Nyíróerők lépnek fel, ez főleg a fonalas mikroorganizmusok fermentációjánál lényeges Oldott-oxigén koncentráció A mikroorganizmusok a táptalajban oldott oxigént tudják felvenni. Először volt a felületi tenyésztés (a penicillint először még nagyfelületű tepsiken szaporított gombával állították elő), majd ennek hatékonysága növelésére találták ki a szubmerz (süllyesztett) tenyésztési körülményeket. Az a tapasztalat, hogy a mikroorganizmusok tápoldatok belsejében is képesek növekedni, teremtette meg a nagyléptékű fermentációs ipar lehetőségét. A legtöbb esetben az oldott oxigén a limitáló szubsztrát (oldhatósága 9 mg/l vízben, táptalajban még kisebb). Ennek koncentrációját is folyamatosan mérik és regisztrálják sterilezhető elektróddal (ez az elektród is könnyen megbolondul). Gyorsan növekvő tenyészet esetében az oxigén koncentrációja nullára eshet, ekkor a levegőztetés, keverés hatékonysága határozza meg a sejtek oxigén-ellátottságát. Ismételt megjegyzés: az oxigén-koncentrációnak a számunkra hasznos folyamat számára kell optimálisnak lennie (a sejtek eltérő oxigén-ellátottság mellett eltérő bioszintézis utakat aktiválnak, más metabolitokat termelnek) Befolyásoló paraméterek: keverés típusa, fordulatszáma levegőbevezetés alul vagy felül porlasztva, csőlírán keresztül kísérleti üzemi fermentoroknál belső nyomás a fermentlé tulajdonságai, hőmérséklete A fermentorok különböző típusai is lényegében különböző levegőztetési megoldásokat jelentenek.
Biokémiai paraméterek mérése oldatban levő nitrogén, foszfát, cukor mérése az igazi az on line mérés lenne, a gyakorlat az, hogy jó ha néhány óránként vett mintát meg tudnak mérni, és annak alapján be tudnak a rendszerbe (Contiflo) a termék mennyiségének mérése (mikor érdemes leállítani a fermentációt, becslés!) on-line HPLC
avatkozni
Habzásgátlás A legtöbb problémát tudja okozni a habzás Rendkívül nagy figyelmet követel mind a fermentációs technológia kidolgozásakor, mind a fermentorok futtatásakor. Léteznek habzásgátló szondák (sok galibát tudnak okozni, jobb ha technológiát sikerül kikísérletezni, amellyel a habzást el lehet kerülni) Van mechanikus és kémiai habzásgátlás
16
olyan
a habzásgátló a termelést ne gátolja, ne gátolja a feldolgozást (pálmaolaj), jól adagolható legyen, kis mennyiségben, és adott esetben nagyon gyorsan hasson Adagolások kidolgozása A fermentor habzása, a biokémiai paraméterek mérése, a pH változása, a termékképződésről összegyűlt ismereteink alapján a fermentorba mindenféle dolgokat adagolni kell: cukrot, foszfort, nitrogént, pH-szabályozó anyagot, habzásgátlót, termék prekurzort Az adagoló bombabiztos legyen, ne engedje bele egyszerre az egész tartály mennyiségét A fermentáció hőmérséklete, hőmérséklet-profilja Az egyik leglényegesebb növekedési paraméter A fermentáció során a lehető legpontosabban szabályozni kell. (1 fokos pontossággal ) Esetleg egy előre meghatározott hőmérséklet-profilt kell beállítani a fermentáció során, a fermentáció típusától függően A fermentáció pH-ja, pH-profilja A másik nagyon fontos fermentációs paraméter A pH-görbe felvétele fontos információkat ad a fermentáció lefutására. A gyors növekedés periódusában savanyodik a fermentlé, a pusztulási stádiumban lúgosodik, az egyes táptalaj-komponensekről másikra való áttérésnél egyéb változás történik. Az első biokémiai paraméter, amelynek folyamatos mérését, regisztrálását megoldották (a sterilezhető elektród drága, nagyon tudni kell kezelni, sok baj van vele) Lényeges, hogy mivel végzem a pH-szabályozást, mivel a szabályozó sav vagy lúg könnyen metabolizálódhat Elmenő levegő elemzése (tömegspektrométer) széndioxid és oxigéntartalom, egyéb gázok és gőzök Jellemző a sejtek légzésére a respirációs hányados (CO2/O2), az egyéb gőzök, gázok jelenlétéből is lehet tapasztalati következtetéseket levonni A belső nyomás beállítása ez is a levegőztetés, kilevegőztetés fontos paramétere Meghatározza, hogy az oxigén, a széndioxid mennyire oldódik a fermentlében. Ha nagyon habzik a fermentor, a dómtéri nyomás növelésével vissza lehet szorítani a habzást. A magas CO2 koncentráció például akár nullára is tudja csökkenteni a sisomicin nevű antibiotikum termelési szintjét Viszkozitás Misztikus paraméter, a fermentációs paraméterek számításához lenne jó, de nagyon nehéz megbízhatóan mérni. (Üledékes, gázzal telített folyadék viszkozitásának mérése). A fermentlevek a viszkozitásuk alapján két csoportba sorolhatók: a) tisztán viszkózus, newtoni és nem-newtoni folyadékok
17
b) viszkózus-elasztikus oldatok amikben normál áramlási viszonyok nem figyelhetők meg (a gyógyszeripari fermentációs folyamatok ide tartoznak). A fermentáció folyamán a fermentlé viszkozitása a micélum mennyiségének növekedése és a kiválasztott anyagcseretermékek miatt nő, a tápanyag komponensek fogyása miatt csökken. A gyakorlatban egy Micromonospora fermentáció során a kinematikus viszkozitás körülbelül 100-szorosra nő A bekevert teljesítmény mérése Amint említettem, a fermentáció során általában változik a fermentlé viszkozitása és sűrűsége, ennek következtében adott fordulatszám mellett kisebb vagy nagyobb energiával lehet a keverőt forgatni. A keverőmotorra szerelt teljesítménymérő valamelyest információt ad a fermentorban, a folyamat során beállt aktuális viszkozitásról. Emellett scale-up paraméter is. Lényeges eltérés van a levegőztetett és nem levegőztetett fermentor átkeveréséhez szükséges teljesítményfelvétel között, ez a kísérletek alapján számítható is. A fermentor súlyának mérése Érdekes módon az egyik leginformatívabb paraméter. Megtudhatjuk belőle (ha elég pontos a mérés), hogy mennyi anyagot adagoltunk a fermentorba, mennyire párlódott be. A bepárlódás vizsgálata, mérése, megakadályozása egy hosszú idejű fermentáció esetében rendkívül fontos, még a termelési szint becslésénél is. __________________________________________________________________________
Természetes anyagok keresése mikrobiológiai forrásokból A lényeg az, hogy mindenféle mikroorganizmus forrásból a szakma szabályai szerint valamelyes előszelekció alkalmazásával mikroorganizmusokat szelektálunk, azokat a szakma szabályai szerint megtisztítjuk, szaporítjuk, majd a fermentlevüket a megfelelő szűrővizsgálati rendszeren áteresztjük. Ha egy intézetben (pl. GYKI) a megfelelő szakismeret és a megfelelő kapacitás megvan a mikroorganizmusok megfelelő számban és minőségben való szaporításához, akkor már csak invenciózus screen-rendszerek kidolgozásán múlik, hogy milyen típusú anyagokat keresünk a fermentlevekben. Egy fermentlével (kb. 100 ml) akár 40-60 különböző tesztet is el lehet végezni. A nemzetközi tudományos életben eddig felhalmozott tapasztalatok alapján minimum 10 ezer törzset kell évente átvizsgálni, hogy egy új, hatásos molekula felfedezésének meglegyen az esélye néhány éven belül. Séma: Mikroorganizmus forrás: rendszerint talajminta trópusi, uránbányából származó, férgek beléből származó, tengeri szervezetekben található, meg amit még csak ki lehet találni. Feldolgozás: szuszpendálni folyadékban (ha lehet, legyen benne felületaktív anyag, hogy a talajrészecskékre tapadt mikroorganizmusok is a szuszpenzióba kerüljenek. A szuszpenziót utána szélesztik (milyen táptalajra?!). Itt lehet az első szelekció (bacik mellől a gombákat, vagy fordítva, ki lehet irtani megfelelő szelekciós ágens alkalmazásával, itt lehet először nagyobb számban elveszíteni az érdekes új törzseket). Szélesztés után, ha a higítást 18
eltaláltuk, és nem növi be egy mikroorganizmus sem szép egyenletes rétegben az egész lemezt, akkor lehet az egyedi telepeket izolálni. Ilyenkor kell a gyakorlati mikrobiológiai, taxonómiai szakismeret. Milyen megjelenési formájú mikroorganizmus teleptől várható, hogy valami hasznosat termel, mely telepek állnak azonos illetve eltérő mikroorganizmusokból (azonosakat leszedni pocsékolás). A kiválasztott telepeket ferde agarra izolálják (minimum 3 párhuzamosban). Ezután kerül sor a ferdékről rázott lombik oltására (milyen táptalajon?!) 1. ferde: az első fermentáció, első screen, van-e aktivitása a fermentlének 2. ferde: az első menetben volt valami aktivitás, le kell ellenőrizni, hogy nem csak valami műtermék volt-e 3. ferde: a legritkább esetben kerül használatba, akkor, ha a törzs a második fermentációban is termeli az aktív anyagot; ekkor szélesztünk róla, sokszáz izolátumot készítünk belőle; rázott lombikban elkezdünk vele kísérletezni. Megpróbáljuk a hatást hordozó anyagot előállítani, meghatározni a szerkezetét, eldönteni, hogy ismert anyagról van-e szó, vagy nem, ha ismert anyagot találtunk, akkor legalább a termelő mikroorganizmus új-e, vagy az is ismert már (az a szerencse és alapos taxonómiai ismeretek dolga, hogy az ismert, de nagyon értékes anyagot termelő törzs új legyen). A munka során végig rettentően észnél kell lenni, mert nem lehet tudni, hogy az anyag nem mérgező, mutagén, karcinogén-e, illetve a termelő mikroorganizmus nem patogén-e. Igazából csak profiknak való munka, a biztonsági megfontolások miatt, meg azért is, mert rettentő nagyméretű, szerteágazó tevékenység (az évi 10000 új izolátum mellett a bíztató törzsek újra fermentálása, anyagelőállítás minimális termelési szint mellett, stb.), és a taxonómiától a szerkezetkutatásig rengeteg tudományág profi művelésére van szükség. Uj farmakológiai hatások keresése speciális screenekkel "A természet a legjobb vegyész" elv alapján olyan molekulákat keresnek mikrobiológiai forrásokból, amelyek a szokványos (antibiotikum, átalakítás, nehézfém megkötés) mellett egyéb farmakológiailag fontos hatásokat hordoznak (CNS, kardiovaszkuláris, stb.). Fermentáció és környezetvédelem A környezetet terhelő forrásokból a természetbe kerülő anyag koncentrációját, ha lehet, akkor kémiai módszerekkel csökkentik. Ennek nem feltétlenül az az oka, hogy nem akarják szennyezni a környezetet, sok esetben inkább az, hogy értékes nyersanyagokat akarnak visszanyerni a távozó szennyből (például galvánüzemek). A probléma az, hogy az a szint, amelyre a kémiai módszerekkel le lehet csökkenteni a szennyeződések koncentrációját, az sokkal magasabb, mint amit a környezet (meg a környezetvédelmi szabványok) még eltűr. Itt jön, jöhet be a mikrobiológia, olyan mikroorganizmusok alkalmazásával, amelyek képesek a szennyeződéseket lebontani, ártalmatlanítani, illetve sejtjeiken belül akkumulálni. Ez utóbbinak akkor van igazán jelentősége, ha a sejtjeikben mérgező anyagot felhalmozott mikroorganizmusokat el lehet választani a léből, majd a mérgező anyagot ártalmatlan formában ki lehet nyerni a sejtekből (nehézfémek: nedves oxidáció). A mikroorganizmusokat használják még olajszennyeződések eltávolítására. Léteznek mikroorganizmus starterkultúrák (Alaszka), amelyek 0-15°C-on alkánokat, aromás vegyületeket bontanak le. Léteznek DDT, poliklórozott difenolokat, fenolokat bontó, nagy proteáz-, lipáz-, vagy celluláz aktivitással rendelkező tenyészetek. A szennyvíztisztításnál a derítőiszaptól is meg kell valahogy szabadulni, ennek egyik módja, ha keverék tenyészettel metánt termelnek. A fakultatív anaerobok lebontják (elfolyósítják) az 19
iszapot, az obligát anaerobok közül nagyon kevés képes metánt termelni a keletkezett kis molekulasúlyú lebontási termékekből. A mikroorganizmusok szelektálására egy általános elv, hogy a mérgezett környezetből izolált mikroorganizmusok között lehetnek olyanok, amelyek oly módon élik túl a barátságtalan környezetet, hogy ártalmatlanítják a mérgeket. Példa: Anglia: 11 hektár ciánnal, fenolokkal, stb. szennyezve. Egy cég 200m3 földet szállított a laborba, és vizsgált át, hogy van-e benne baci. 20-50 fajt találtak, ezekből választják ki azokat, amelyek képesek méregteleníteni a talajt. Két módszer: egyszerűen kipermetezik a mikroorganizmusokat, illetve dombokba hordják össze a földet és abba viszik be őket. Az utóbbi jobban ellenőrizhető. Genetikai módszerek: metallotionein nevű nehézfémet kötő fehérjét kódoló gének elterjedtek a természetben. Gombáknál: CUP1. Az aromás vegyületek gyűrűit eloxidáló gének főleg a Pseudomonas-okban terjedtek el. A biotechnológiai folyamatok is okozhatnak "klasszikus" környezeti károsodásokat. Ilyen például, ha a fermentleveket tisztítás, a szerves anyagok eltávolítása nélkül kieresztik a csatornába. Hosszú időre agyonvághatja a víz minőségét. Biztonságtechnikai megfontolások Minden technikát lehet megfontoltan és lehet felelőtlenül használni. A biotechnológiai, fermentációs technológiai módszerek alkalmasak az emberek életének jobbá tételére, de alkalmasak lehetnek biológiai fegyverek készítésére is (a klasszikus példa erre egy olyan mikroorganizmus eljuttatása az ellenséges területre, amely az emberek pusztulását okozza, az ellenszer nagyon specifikus, csak az ismeri, aki a mikroorganizmust elkészítette). A világban ezeknek a fegyvereknek a készítése nemzetközi egyezmények révén be van tiltva. Tehát kizárólag olyan, szigorúan titkos laboratóriumok léteznek, amelyekben kizárólag azért foglalkoznak ezeknek a szervezeteknek a szaporításával, vizsgálatával, hogy ha a másik fél nem tartja be az egyezményeket, akkor fel legyenek készülve a védelemre. Az egész biotechnológia, fermentáció attól lett érdekes, fontos az emberek számára, hogy bevezették a molekuláris biológiai módszereket, azaz megteremtődött a tájékozatlan emberek agyában annak a lehetősége, hogy a tudósok szabadon garázdálkodva mindenféle genetikai szörnyűségeket szabadítanak a világra (lásd radioaktivitás - atombomba párhuzam). A biotechnológiai biztonságtechnikai tevékenységnek tehát több rétege van. Az első az, hogy valójában meg kell ismerni azokat a mikroorganizmusokat, génkombinációkat, amelyek az emberre, a környezetre károsak lehetnek. Ezek ellen egyrészt úgy kell védekezni, hogy meg kell akadályozni a létrejöttüket, azaz olyan mikroorganizmusokat, DNS molekulákat kell a tudósok rendelkezésére bocsátani, elterjeszteni a világban, amelyek önmagukban ártalmatlanok, és ráadásul meg is nehezítik azoknak a dolgát, akik káros szervezeteket akarnak létrehozni. A klónozott DNS mérete a szükséges minimumnál ne legyen nagyobb, szerkezetét, az egyes átvitt géneket ismerni kell. A második réteg az, hogy olyan laboratóriumi körülményeket kell biztosítani, amelyek nem teszik lehetővé, hogy a génsebészeti tevékenység során véletlenszerűen esetleg előállítható új szervezetek kontaktusba kerüljenek azokkal, akik dolgoznak velük. A harmadik réteg az, hogy nullára kell csökkenteni annak a lehetőségét, hogy az ilyen mikroorganizmusok kijussanak a környezetbe. A negyedik réteg az, hogy olyan mikroorganizmusokat kell készíteni, amelyeknek a genetikai struktúráját célzottan, in vitro módszerekkel megváltoztattuk ugyan, mégis száz százalékig biztosak vagyunk benne, hogy nyugodtan kiereszthetők a környezetbe, 20
mert csak jótékony hatásuk lehet a környezetre (Pseudomonas fluorescens fagyfehérje, Bacillus thuringiensis rovarpusztító toxinja). Az ötödik, és legnehezebb réteg az, hogy a közvéleményt, a politikusokat meg kell győzni arról, hogy egyrészt az általunk ismert természeti törvények miatt igen kicsi a valószínűsége a katasztrófának, másrészt arról, hogy az ilyen tevékenységet felelősségteljes emberek végzik. Jelenleg az a szakértők véleménye, hogy hacsak nem más a kísérletek célja, akkor a génmanipulációval előállított szervezetek veszélyességét alapjában a befogadó szervezet eredeti veszélyességi foka határozza meg. Az is lényeges szempont, hogy milyen méretekben végzem a kísérleti munkát, hiszen nem mindegy hogy mikrotiter plate-n végzem a kísérleteket, vagy 1m3-es fermentorban, mivel az utóbbira már igen szigorú építészeti, gépészeti utasítások vonatkoznak. A közvéleményt az is befolyásolja, hogy milyen célokra használják a génsebészeti módszereket (fehér pisztráng, kocka-paradicsom, stb.)
21
