Fehérje nanogépezetek
A fehérjék alapvető biológiai funkciói ¾ Molekulafelismerés és megkötés ¾ Kémiai reakciók irányítása (katalízis) ¾ Konformációs átkapcsolások (jelfeldolgozás, szabályozás) ¾ Dinamikus szerkezetépítés (vázrendszerek, sejtmozgások) Mindezen funkciók hátterében meghatározó szerepet játszik a fehérjék specifikus molekulafelismerési képessége.
Molekulafelismerés és megkötés Fehérje - ligandum EGF-receptor
• Kötőhelyek felépítése, elhelyezkedése • Specificitás (komplementaritás) • Nemkovalens kölcsönhatások (reverzibilitás) • Flexibilitás (indukált illeszkedés)
Speciális felismerő molekulák • Antitestek • Receptorok • Enzimek
Az IgG molekula szerkezete ¾ 2-2 nehéz és könnyűlánc ¾ kontans és variábilis domének ¾ szimmetrikus szerkezet ¾ az antigénkötő helye a VH és VL domének együtt alakítják ki
IgG génátrendeződés
Antigén-antitest kölcsönhatás epitópok
Poliklonális és monoklonális ellenanyagok
Monoklonális ellenanyagok előállítása
IgG alkalmazások Immun-analitikai eljárások
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
ELISA
Bioszenzorok Rezgőnyelves bioszenzor:
<1 ng tömegű NEMS rezonátor: mérhető: 10-6X saját tömeg → attogram Egyetlen baktérium tömegének meghatározása:
(Craighead és mts., Cornell University)
Enzimek
Az enzimek jellemzői ¾ specifikus biokatalizátorok
¾ kémiai reakciók végbemenetelét gyorsítják fel ¾ a reakció egyensúlyi állandója nem változik ¾ rendkívül hatékonyak ¾ környezeti körülményekre (pH, T) érzékenyek ¾ működésük szabályozott
Az enzimkatalízis mechanizmusa Az enzimek a kémiai reakciók sebességét azáltal gyorsítják fel, hogy a szubsztrát átmeneti állapotbeli konformációját kötik a legerősebben. (Pauling 1946) Hogyan csökkenti az energiagátat? • funkcionális csoportok precíz térbeli elhelyezkedése • szubsztrát megfelelő orientáltságú kötése • átmeneti állapot preferált kötése
Enzimműködés energetikája
Enzimkinetika Michaelis-Menten: E + S
ES
E+P
Enzimek mérete • Funkcionális csoportok megfelelő térbeli orientációjának biztosítása • Szubsztrát hatékony begyűjtése • Kötődés más struktúrákhoz • Szabályozhatóság • Szupramolekuáris enzimkomplexumok
Enzimek általános jellemzése a) Kofaktorok, koenzimek használata Apo- és holoenzim
Kofaktorok: ¾ biológiailag aktív konformáció fenntartása ¾ részvétel a katalitikus folyamatban Æ megszabhatják a folyamat jellegét ¾ szorosan vagy lazán kapcsolódás
Enzimek általános jellemzése
b) Aktív centrum A fehérjemolekula viszonylag kis része, ahol a katalitikus lépések lejátszódnak. Általában domének közti árokban, zsebben helyezkedik el. Funkcionálisan különböző részek: ¾ kötőhely(ek) ¾ katalitikus hely A kötőhely határozza meg a specificitást. Szubsztrátkötés → indukált illeszkedés E-S kölcsönhatás általában számos gyenge kötés révén alakul ki; ritkán kovalens kapcsolat
Enzimek általános jellemzése Katalitikus hely ( → reakció típusa): meghatározó a távoli oldalláncok megfelelő orientációja és elhelyezkedése ill. mozgékonysága Az oldalláncok egymással való kölcsönhatása, mikrokörnyezete nagymértékben meghatározza azok reaktivitását. Aktív centrum feltérképezése: •
röntgendiffrakciós szerkezet
•
kémiai módosítások
•
irányított evolúció A lizozim aktív centruma
Cytochrome P-450 aktív centrum
Enzimek általános jellemzése
c) Dinamikus szerkezet • Ligand hozzáférhetőség szabályozása • Alkalmazkodás a változó szubsztrátszerkezethez • Kötődések erősségének szabályozása
Relatív doménmozgás (PGK)
Enzimek általános jellemzése
d) Enzimműködés szabályozása Reakcióhálózatok → visszacsatolások Serkentők és inhibítorok Enzimek gátlása (serkentése): Kötődés módja szerint: • irreverzibilis • reverzibilis Kötődés típusa szerint: • kovalens (pl. foszforilálás) • nemkovalens (kompetitív vs. nemkompetitív) Kötődés helye szerint: • kötődés az aktív centrumba • allosztérikus szabályozás
Allosztérikus enzimek Effektorok: a katalizált reakcióval nincsenek közvetlen kapcsolatban (pl. egy reakciósor késői terméke szabályoz) Általában a több alegységből felépülő enzimek kooperatív sajátossága.
Hemoglobin
Allosztérikus szabályozás
Proteázok A polipeptidláncot hasító enzimek (hidrolázok). Az aktív centrum meghatározó funkcionális csoportja szerint: ¾ szerin proteázok (pl. tripszin) ¾ cisztein proteázok ¾ aszpartát proteázok ¾ metalloproteázok
Szerin proteázok Katalitikus triád: Asp – His - Ser Eltérő specificitás: • Kimotripszin: nagy méretű, apoláros oldalláncok után hasit • Tripszin: Lys, Arg után hasít • Trombin: Arg-Gly között hasít • Elasztáz: kis méretű, töltetlen oldalláncok után hasít • Szubtilizin: nem specifikus
Szubtilizin konvergens evolúciója.
Szerin proteázok hatásmechanizmusa I.
1. A szubsztrát C1 atomja és az aktív szerin OH csoportja között kovalens kötés alakul ki → negatívan töltött tetrahedrális acilenzim intermedier 2. A peptidkötés elhasadása után az egyik peptidtermék diffúzióval gyorsan távozik.
Szerin proteázok hatásmechanizmusa II.
3. Az acilenzim komplex egy vízmolekula segítségével töltött tetrahedrális állapoton keresztül hidrolizál (deacilálás). 4. Az enzim eredeti állapota visszaáll.
A katalízis szerkezeti háttere ¾ A katalitikus triád His oldallánca általános bázisként egy protont vesz át a szerintől ¾ Oxianion lyuk: stabilizálja a tetraéderes átmeneti állapotot az O atommal létesített H-híd révén ¾ Szubsztrátkötés: H-hidak a polipeptidváz főlánc atomjaival (tág specificitás; átmeneti állapot stabilizáció) ¾ Specificitási zseb: ez biztosítja a specifikus hasítóhely felismerést
Szerin proteáz aktív centrum
Szubsztrátkötő zseb
A fehérjék, mint molekuláris kapcsolók ¾ Szabályozás (pl. allosztéria, génexpresszió) ¾ Jelátvitel (pl. receptorok) ¾ Energiaátalakítás (pl. molekuláris motorok)
miozin
Jelátviteli folyamatok Receptorok: transzmembrán fehérjék, valamilyen külső stimulust (fény, kémiai jelek) érzékelnek 3 fő csoportba oszthatók: • Ioncsatorna-kapcsolt receptorok • G-fehérje csatolt receptorok • Enzimkapcsolt receptorok
G-fehérjék Több száz féle G-fehérje létezik. Molekuláris erősítők: • GTP aktiválja őket • 3 alegységből állnak α (45 kDa) GTPáz aktivitást mutat β (35 kDa) és γ (8 kDa) heterodimert képez α és γ lipidtoldalékkal membránhoz kötöttek • α-GTP monomer • α-GDP βγ-val a receptor citoplazmatikus doménjéhez kötődő komplexet képez • RGS fehérje szabályozza a GTP hidrolízist
G fehérjék működése
Enzimcsatolt receptorok Intracelluláris enzimtikus aktivitással rendelkeznek vagy enzimhez kapcsoltak. A receptor-tirozin kinázok felépítése: • N-terminális extracelluláris ligandkötő domén • Egyetlen transzmembrán α-hélix • Citoplazmatikus C-terminális domén tirozin-kináz aktivitással
A receptor–tirozin kinázok működése
Dimerizáció és autofoszforiláció Enzimaktivitás növelése, kötőhelyek kialakítása
Intracelluláris jeltovábbítás Célfehérjék: • foszforilálása • enzimatikus aktivitásának növelése • kölcsönhatások kialakítása
