Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem
Fehérje kölcsönhatások vizsgálata immunológiai módszerekkel
DIPLOMAMUNKA
Témavezető: Dr. Vértessy G. Beáta Készítette: Pukáncsik Mária
Budapest 2005.
1
Tartalomjegyzék Köszönetnyílvánítás
3
Rövidítések jegyzéke
4 2
1. Célkitűzések
5
2. Irodalmi áttekintés
7
2. 1. A dUTPáz szerepe az élő szervezetben 2. 2. A dUTPáz, mint új célmolekula gyógyszerszintézisek számára
7 11
2. 3. A dUTPáz fejlődési állapottól függő szabályozása ecetmuslicában. Az apoptózis fejlődésbiológiai jelentősége. A dUTPáz izoformái, lehetséges kölcsönható partnerei
14
2. 4. A dUTPáz enzimcsalád képviselői
17
2. 5. A dUTPáz szerkezete
19
3. A felhasznált módszerek
22
3. 1. A dUTPáz preparálása
22
3. 2. Ioncserés folyadékkromatográfia
24
3. 3. Gélelektroforézis
26
3. 4. Fehérjék tisztítása és elválasztása gélszűréssel
29
3. 5. Fehérjekoncentráció meghatározása Bradford referencia alapján
31
3. 6. Poliklonális antitest nyúlszérumból történő kinyerése
33
3. 6. 1. Immobilizálás
35
3. 6. 2. Immunoaffinitás kromatográfia
36
3. 7. Blottolás Nitrocellulóz illetve PVDF membránra
37
3. 8. Western blot (immunoblot)
39
3. 9. Far Western blot
42
3. 10. Fehérjék detektálása
43
3. 11. S2 sejtvonal fenntartása és a sejtek feltárása
44
3. 12. Különböző fejlődési állapotú Drosophila minták előállítása
45
3. 13. C. elegans fonalas férgek feltárása
46
3. 14. Homológia modellezés
47
4. Eredmények és értékelés
48
4. 1. Immobilizálásra alkalmas tisztaságú Drosophila dUTPáz előállítása
48
4. 2. A dUTPáz immobilizálása
51
4. 3. Antitest izolálása
52
4. 4. A dUTPáz fiziológiás formáinak izolálása S2 extraktból a tisztított antitest felhasználásával.
54
4. 5. A dUTPáz kötő fehérjék kimutatása Drosophila mintákon far Western analízissel
56
4. 6. A dUTPáz expressziós szintjének vizsgálata S2 sejtekben
58
4. 7. Fehérjék detektálása immunobloton blokkoló lépés nélkül
60 3
4. 7. 1. A PVDF membrán szárítása
61
4. 7. 2. Western blot PBS oldattal
62
4. 7. 3. Blokkoló közeg az antitest oldatban
64
4. 7. 4. Far Western blot rövid protokollal
66
4. 7. 5. A western blot módszer végleges formája PVDF membránra
68
4. 8. Fonalas férgekből származó sejtextrakt keresztreakciója Drosophila dUTPáz ellen termelt antiszérummal 4. 9. A C. elegans dUTPáz enzim homológia modellezése
69 71
5. Eredmények összefoglalása
77
Irodalomjegyzék
78
Köszönetnyílvánítás Köszönettel tartozom Dr. Vértessy Beátának, aki lehetővé tette számomra, hogy a kutatócsoportjában dolgozhassam, és mint témavezető megismertetett a téma alapjaival.
4
Továbbá szeretném megköszönni Békési Angélának a gyakorlati munkámban és a felmerülő problémák megoldásában nyújtott segítségét. Köszönöm Dr. Friedrich Péter professzor úrnak, az Enzimológiai Intézet igazgatójának, hogy engedélyezte munkámat az intézetben. Köszönöm belső konzulensemnek, Dr. László Elemér tanár úrnak értékes tanácsait és támogatását. Köszönettel tartozom Erdei Anna professzor asszonynak, aki az ELTE Immunológiai Tanszékén a poliklonális antitest előállításában segítséget nyújtott. Köszönettel tartozom továbbá dr. Vellai Tibornak, az ELTE Genetika Tanszék munkatársának a C.elegans fonalas férgekkel végzett kísérleteinkhez nyújtott segítségéért.
Rövidítések jegyzéke dUTPáz dUMP Ppi dTTP
(dezoxi-uridin-trifoszfát)-nukleotido-hidroláz dezoxi-uridin-monofoszfát anorganikus pirofoszfát dezoxi-timidin-trifoszfát
5
FdUMP dTMP TS DHFR SDS NLS IPTG
fluoro-dezoxi-uridin-monofoszfát dezoxi-timidin-monofoszfát timidilát szintáz dihidrofolát-reduktáz sodium-dodecil szulfát nukleáris lokalizációs szignál izopropil-tio-galaktozid
EDTA
etilén-diamin-N,N,N,,N,,-tetraecetsav
EGTA PMSF DTT SDS-PAGE APS FPLC HPLC HEPES BSA CNBr TEA HRP DAB SFM IgG PVDF
etilénglikol-bisz-(β-aminoetiléter)-N,N,N,,N, -tetraecetsav fenil-metil-szulfonil-fluorid ditio-treitol sodium-dodecil szulfátos poliakril-amid gélelektroforézis ammónium perszulfát Fast Protein Liquid Chromatography High Protein Liquid Chromatography N- (2-hidroxietil)piperazin-N,- (2-etán-szulfonsav) Bovine Serum Albumine Cianogénbromid trietanol- amin Horse Redish Peroxidáz 3,3,-diaminobenzidine szérum mentes tápoldat G immunoglobulin Polivinilidén- fluorid
1. Célkitűzések A DNS-javításban és a programozott sejthalál útvonalak irányításában a fehérje kölcsönhatások alapvető szerepet játszanak. A dolgozatomban a fenti folyamatokban fontos enzimfehérje, a dUTPáz sejtbeli szintjének meghatározására és a vele kölcsönható fehérjék kimutatására összpontosítottam. A dUTPáz
6
enzim ígéretes új célpontja egyes rákellenes terápiáknak, valamint különböző bakteriális, virális és parazita férgek okozta fertőző betegségek elleni kísérletes terápiáknak. A kölcsönhatások kimutatására kiindulásként a szakirodalomban leírt immunoprecipitációs módszert alkalmaztam. Az egyik fő célkitűzésem az volt, hogy a jelenleg leírt módszerekhez képest jelentősen gyorsabb, és szélesebb körű felhasználást lehetővé tevő technikát dolgozzak ki a dUTPáz enzim kölcsönható partnereinek kimutatására. Fontos, hogy a módszer alkalmas legyen a kölcsönható partnerek összetételében bekövetkező bármiféle olyan változás nyomon követésére, melyet a sejt különböző stressz válaszai, fejlődési állapotváltozásai, beteg illetve egészséges jellege okoz. A jelen dolgozatban a következő két módszert igyekeztem kifejleszteni: -az egyik módszer a Far Western blot, amely a sejtextrakt fehérjéinek denaturáló gélen történő szétválasztása után membránon detektálja a fehérjéket. -a másik a ko-immunoprecipitálás módszere, mely során sejtextraktból csapadék formájában nyerjük ki a célfehérjét és kölcsönható partnereit, melyeket ezt követően SDS gélen elválasztva tömegspektrometriás módszerrel azonosítani lehet a megfelelő genomprojekt adatai segítségével. Bizonyított tény, hogy az antitestek számos esetben keresztreakcióra képesek. Ez lehetőséget kínál arra, hogy más szervezetek homológ fehérjéivel reagáljanak. A fentieket kihasználva a dolgozatom másik fő célkitűzése Caenorhabditis elegans és Trichinella spiralis fonalas férgekből Drosophila melanogaster dUTPáz ellen termelt antiszérummal reagáló dUTPázok azonosítása volt. A C. elegans az apoptózis kísérletek egyik legfontosabb modellszervezete. A C. elegans-sal rokon T. spiralis fonalféreg patológiai jelentősége miatt került a vizsgálandó szervezetek közé: ez a fonalféreg felelős a bélcsatorna fertőzések jelentős részéért. A C. elegans ismert genomi szekvenciája alapján tudjuk, hogy a dUTPáz monomerre jellemző szekvencia háromszor egymás után szerepel a génben stop kodon nélkül (policisztronos gén). Ez felveti annak lehetőségét, hogy a dUTPáz enzim nem a szokásos homotrimer, hanem egy kovalens trimer. A T. spiralis genomja azonban nem ismert, sem dUTPáz génjének szekvenciája. A fentieken túlmenően célul tűztük ki a dUTPáz enzim expresszió szintjének sejtciklus-függő vizsgálatát Schneider 2 (S2) Drosophila sejtekben.
7
2. Irodalmi áttekintés 2. 1. A dUTPáz szerepe az élő szervezetben A dezoxiuridin trifoszfát nukleotidhidroláz (dUTPáz) enzim a dUTP pirofoszforolízisét katalizálja az alábbi reakció alapján:
8
dUTP → dUMP + PPi + nH+ A reakcióban a dUTPáz enzim kofaktora a Mg2+ ion. A folyamat a nagyenergiájú foszfát hidrolízise miatt gyakorlatilag irreverzibilis. Ezzel a reakcióval az enzim lecsökkenti a sejtben a dUTP szintet, és közben termeli a dUMP metabolitot, ami a dTTP bioszintézisének alapvető prekurzora (a timidilát szintáz szubsztrátja). A dUTP/dTTP arány dönti el, hogy a DNS polimeráz timint vagy uracilt épít be ugyanarra a helyre az adeninnel szembe. A dUTPáz által katalizált reakció tehát az uracil DNS-ből való kizárása miatt fontos. De miért hiba a timinanalóg uracil a DNS-ben? A DNS szekvenciában számos környezeti hatás mutációt eredményezhet, melyek kiküszöböléséhez a génállomány folyamatos ellenőrzésére és javítására van szükség, amire a DNS-ben több mechanizmus is kialakult (pl. timidin dimerek kivágása, nem komplementer bázispár javítása, stb.). Fiziológiás körülmények között is spontán bekövetkező gyakori folyamat a citozin oxidatív dezaminálása, ami uracilt eredményez (Lindahl, 1993). Ez a módosulás a következő replikáció alkalmával pontmutációt eredményezne, tehát a citozinból átalakult uracil mutagén, aminek eliminálása esszenciális a genetikai információ megőrzése és átörökítése szempontjából. Az eliminálást egy báziskivágáson alapuló javítómechanizmus végzi, amely eltávolítja az uracilt a DNS-ből (1. ábra). A mechanizmus első lépéseként az uracil-DNS glikoziláz elhasítja a dezoxiribóz és az uracil közti glikozidos kötést. Az így bázis nélkül maradt helyen az AP-endonukleáz elhasítja a DNS dezoxiribóz-foszfát gerincét úgy, hogy a 3’OH marad szabadon. Ezután a DNS-polimeráz endogén foszfodiészteráz hatása révén eltávolítja a bázis nélküli dezoxiribózt, és a 3’OH valamint a megfelelő nukleotid-trifoszfát felhasználásával komplementer bázist épít be (Seeberg et al., 1995). Végül pedig a DNS ligáz enzim elvégzi a gerincszál összevarrását.
9
U Uracil-DNS glikozidáz
AP endonukleáz 3’OH
DNS polimeráz endogén foszfodiészteráz aktivitása 3’OH
5’OH
DNS polimeráz
T
5’OH
DNS ligáz
T 1. ábra: Báziskivágáson alapuló javító mechanizmus az uracil DNS-ből történő eltávolítására. A komplementer bázis az ábrán timin (T), ami a timin helyére beépült uracil esetén valós. A citozin oxidatív dezaminálása révén létrejött uracil eltávolítása után citozin lesz a beépítendő komplementer bázis. Az uracil-DNS glikozidáz enzimmel induló mechanizmus védelmet nyújt a citozin kémiai instabilitásával szemben, de nem tud különbséget tenni a citozin oxidatív dezaminálásával keletkezett mutagén, és a DNS szintézisekor esetleg timin helyére beépült, nem mutagén uracil között. Ezért a timin helyére való uracilbeépülést a DNS polimeráz említett aspecifitása miatt a dUTP/dTTP arány visszaszorításával kell a sejtnek kivédenie, amit a dUTPáz enzim kétfelől is biztosít (2. ábra).
10
H H
N
N H
C N
C
C C
N
C N
O N C
C C
C N
H
oxidatív
C1'
dezaminálás
O H
C N
H
C C
C N
H C1'
O
O
H N
H
H
uracil
citozin
H
C1'
guanin
mutagén CH3 H N H
C N C1'
C C
N C N
O
H
H
N C
adenin
C N
C C
C N
H C1'
O
nem mutagén
H timin (5-metil-uracil)
2.ábra: A citozin az ábrán látható módon lezajló spontán kémiai átalakulás (oxidatív dezaminálás) során uracillá alakul, ami a következő DNS-replikációs ciklusban nem guaninnal, hanem adeninnel fog bázispárt képezni. Ezért a citozin dezaminációs reakciója mutagén módosulást okoz. A timint helyettesítő uracil nem változtatja meg az adeninnel való bázispár-képzést (azonos H-hidak alakulnak ki), ezért a timint helyettesítő uracil nem mutagén. dUTPáz hiányában a magas dUTP/dTTP arány a DNS uraciltartalmának jelentős növekedését okozza. Ezáltal aktiválódik az uracil kivágásán alapuló javítómechanizmus (1. ábra). A javítás azonban a továbbra is fennálló magas dUTP/dTTP arány mellett nem lehet sikeres, mert a DNS polimeráz a kivágott uracil helyére újra uracilt épít be. Az így felerősödő hiábavaló ciklus kettősszál-törésekhez, az pedig a kromoszóma fragmentálódásához, majd a sejt halálához vezet. Ezt a jelenséget nevezik timinmentes sejthalálnak (3. ábra) (Traut, 1994).
11
dUMP dUMP
dTTP dTTP
dUTPáz dUTPáz
AAdUMP-nek, dUMP-nek,aa dTTP dTTPprekurzorának prekurzorának termelése termelése AAdUTP dUTPszint szint csökkentése csökkentése
dUTP dUTP
Magas sejtbeli dUTP/dTTP arány DNS polimeráz U
U
U
U C U U U Uracil (U) szubsztituált DNS
dUTPáz hiánya
BER C C DNS kettősszál törések Kromoszóma fragmentálódás
SEJTHALÁL 3. ábra: A dUTPáz szerepe a DNS integritásának megőrzésében.
12
2. 2. A dUTPáz, mint új célmolekula gyógyszerszintézisek számára Az előbbiek alapján a dUTPáz specifikus gátlásával várhatóan sejthalál indukálható, amivel terápiás hatást érhetünk el a rákos vagy egyes fertőző megbetegedések esetén. A dUTPáz antagonizmus hatékony rákterápiás alkalmazhatóságát több előzetes eredmény is indokolja: 1. A dUTPáz gén kifejeződése a sejtciklustól függ (Ladner and Caradonna, 1997). Csak a sejtosztódáskor számottevő az enzim bioszintézise, ezért az enzim gátlása is csak az aktívan osztódó szövetekben okozhat jelentősebb kárt. 2. Két széleskörben alkalmazott kemoterápiás szer, a fluoro-dezoxi-uridin monofoszfát és a methotrexát szintén a timidilát bioszintézist gátolva indukál sejthalált és fejti ki terápiás hatását (4. ábra). 3. Megfigyelték, hogy daganatokban rezisztencia indukálódhat az említett gyógyszerekre, mely rezisztenciával
összefüggésbe
hozták
ezen
sejtvonalakban
kimutatható,
erősen
megnövekedett dUTPáz aktivitást. Ugyanakkor kimutatták, hogy a dUTPáz szint genetikai manipulálással előidézett növelése egyes humán tumoros sejtvonalakban fluorouracilrezisztencia kiváltását okozza (Canman et al., 1994; Pugacheva et al., 2002). 4. Szubsztrátanalóg inhibitorok sejtburjánzás gátló hatását humán rákos sejtvonalakon in vitro is kimutatták (Zalud et al. , 1994). 5. A legfrissebb irodalomban közöltek adatokat arra vonatkozóan is, hogy a timinmentes sejthalál útvonal független a p53 fehérjétől (Munoz-Pinedo et al., 2001; Pugacheva et al., 2002). 6. Trichinella spiralis-t és Caenorhabditis elegans-t tanulmányozva, megfigyelték, hogy nyugvó fonalas férgekben erős a timidilát metabolizmus. Mind a timidilát szintáz, mind a dihidrofolát reduktáz, valamint a dUTPáz aktivitása különösen magas, vagyis olyan, mint az aktívan osztódó szövetekben. Ebből következően azt gondolják, hogy ezeknek a fonalas férgeknek szükségük van ezekre az enzimekre nyugalmi állapotukban is, ezért mindegyikük potenciális terápiás célpont lehet (Rode et al., 2000).
13
dUTPáz antagonista dUTP
DNS dTTP
Fluorouracil (FdUMP)
dTDP
dUMP TS dTMP
THF DHF reduktáz
Methotrexát
dihidrofolát
4. ábra: Kapcsolat a timdilát-szintáz (TS), dihidrofolát-reduktáz (DHFR) és a dUTPáz enzimek által katalizált reakciók között. A rákellenes terápiák során széleskörben alkalmazzák a timidilát bioszintézisért felelős enzimeket gátló gyógyszereket. Ezek közül is legismertebbek a timidilát szintázt blokkoló fluorouracil, valamint a dihidrofolát reduktáz gátlásáért felelős methotrexát, melyek jelentős mértékben növelik a sejtbeli dUTP/dTTP szintet. A rákos sejtek már kialakulásukat is részben annak köszönhetik, hogy bennük az apoptotikus útvonalak jelentős része gátolt. Például a programozott sejthalál előidézésében általában kulcsfontosságú p53 fehérje rosszindulatú sejtekben gyakran olyan mutáció(ka)t mutat, mely(ek) funkciójának teljes, vagy részleges elvesztését okozzák, ezért a p53-függő apoptózis utakon történő terápia hatástalan marad. Ezekben az esetekben a timinmentes sejthalál indukálása mégis a gyógyulás reményével kecsegtethet, különösen, ha ez olyan hatékony módon történik, mint a dTTP bioszintézisének első lépését katalizáló dUTPáz specifikus gátlása. A fluoro-dezoxiuridinre rezisztenssé vált daganatok esetén a dUTPáz antagonizmus szintén ígéretes kiegészítő terápia lehet. Még a retrovírusok is gyakran kódolják genomjukban a saját dUTPáz fehérjéjüket. A virális dUTPáz elsősorban azon vírusok számára fontos, melyek differenciált sejteket támadnak meg, hisz az ilyen gazdasejtben nincs jelen elegendő saját dUTPáz. A virális dUTPáz gének nullmutációja csökkenti a vírus fertőző- és szaporodóképességét a differenciált sejtekben, szövetekben (Lerner et al., 1995; Pyles et al., 1992; Threadgill et al., 1993). Ez reményt nyújt arra, hogy egyes vírusos megbetegedések gyógyításában a virális dUTPáz antagonistái terápiás jelentőséggel bírhatnak. Az enzim tehát ígéretes célpont új gyógyszertervezések számára. Ahhoz, hogy igazán hatékony és specifikus antagonizmust alkalmazhassunk, meg kell ismernünk egyrészt a fehérje – mindenekelőtt az aktív centrum – szerkezetét, működését, de
14
másrészt a dUTPáz funkciót szabályozó mechanizmusokat, valamint az enzim sejtbeli kölcsönható
partnerhálózatát
is.
A
dUTPáz
gátlása
megvalósítható
kismolekulás
szubsztrátanalógokkal – ennek hátránya a csökkent specificitás (mellékhatások), de más specifikusabb utakat is választhatunk. Az Enzimológiai Intézetben ezen célkitűzés alapján humán sejtvonalakon sejthalál indukciós kísérleteket végeznek antiszenz technikák felhasználásával. Ezzel párhuzamosan vizsgálják az enzimmel kölcsönható fehérjéket is, melyek között egy korábbi irodalmi adat alapján feltételezhetően létezik gátló hatású fehérje partner is (Nation et al., 1989). A jelen dolgozat ez utóbbi kutatási irányhoz kapcsolódik.
15
2. 3. A dUTPáz fejlődési állapottól függő szabályozása ecetmuslicában. Az apoptózis fejlődésbiológiai jelentősége. A dUTPáz izoformái, lehetséges kölcsönható partnerei A dUTPáz hiányában indukálódó sejthalálnak nemcsak preventív vagy terápiás haszna van, hanem úgy tűnik, hogy a természetes fejlődési folyamatokban is előfordul. Egy korábbi irodalmi adat a Drosophila dUTPáz egyedfejlődéshez kapcsolt szabályozására utal (Giroir and Deutsch, 1987), amit az Enzimológiai Intézetben végzett jelen kísérletek is alátámasztottak (Békési et al, 2004, J. Biol. Chem.). A lárva állapotok során az enzim expressziója lecsökken, gyakorlatilag nem detektálható Western bloton (5. ábra).
S2
E
1L
2L
3L
P
5. ábra: Western blot a különböző fejlődési állapotú Drosophila mintákon, ahol S2: S2 sejteket, E: embriót, 1L: 1. stádiumban lévő lárvát, P: bábot jelent. A felső bloton dUTPáz izoformákat festettünk, míg az alsón háztartási fehérje tubulint, kontrollként.
A dUTPáz aktivitás hiányában a lárvális szövetekben magas uracil tartalmú DNS halmozódhat fel, ugyanis a Drosophila genomban nincs homológja a fő uracil-DNSglikoziláznak (UNG2), csak a mismatch specifikus enzimeknek (SMUGI, TDG) (Hardeland et al., 2003), így az uracilos DNS sértetlenül megőrződhet mindaddig, míg a 3. lárva stádium végén egy uracil-specifikus endonukleáz el nem kezd termelődni (Deutsch and Spiering, 1982), ami feldarabolja a lárvális szövetek DNS-ét. Ez a folyamat nagyban hozzájárulhat a bábállapotban zajló tömeges sejthalálhoz, melyek elengedhetetlenek a metamorfózishoz. Ezzel a hipotézissel összhangban az Enzimológiai Intézet kutatócsoportjában azt találták, hogy a lárvaállapotban megmaradt minimális dUTPáz mennyiség
16
az imaginális diszkuszokban koncentrálódik (6. ábra) (Békési et al, 2004, JBC). Ezek azok a sejtcsoportok, amelyekből a felnőtt légy (imago) szervei kifejlődnek a metamorfózis során. A felnőtt legyekben a petefészekben lokalizálódik a dUTPáz (7 . ábra).
6. ábra: Lárva szövetek immunhisztokémiai festése dUTPázra. zöld: dUTPáz lokalizációja az imaginális diszkuszban, kék: DNS (DAPI) jelenléte a diszkuszban és az azon kívül eső szövetekben, 3. panel: egymásra vetített ábrázolás.
7. ábra: Felnőtt ováriumok immunhisztokémiai festése dUTPázra. zöld: dUTPáz lokalizációja az ovariumban, kék: DNS (DAPI) jelenléte az ovariumban és az azon kívül eső szövetekben, 3. panel: egymásra vetített ábrázolás. A fejlődési állapottól függő szabályozás mellett a csoport eredményei az enzim több szintű szabályozására derítettek fényt a közelmúltban, ami alapján feltételezhető, hogy a dUTPáznak számos kölcsönható fehérjepartnere lehet Drosophilában (Békési et al., 2004). A dUTPáz enzimnek feltehetőleg több organizmusban is két izoformája létezik. A humán enzim esetén a két izoforma közül az egyik nukleáris, míg a másik mitokondriális lokalizációjú (Ladner and Caradonna, 1997). A Drosophila
dUTPáz esetében ezzel hasonló módon két
izoformát azonosítottak a Vértessy csoportban, az egyik 23 a másik 21 kDa látszólagos
17
molekulatömegű
SDS
gélen
(Békési
et
al.,2004).
Azonosítottak
egy
aminosav
szekvenciarészletet a 23 kDa nagyságú dUTPáz izoforma N-terminálisán, amely közeli homológiát mutat más kísérletesen is igazolt nukleáris lokalizációs szignálokkal (NLS). Emellett azonban meghatározott fiziológiás helyzetekben az enzim képes a szignáltól függetlenül is magi lokalizációt mutatni, amint ezt az immunohisztokémiás festések igazolják. Ez a dUTPáz lokalizációját perturbálni képes kölcsönható fehérjék létére utalhat. A 21 kDa-os izoforma esetében hiányzik ez a feltételezett NLS, ugyanakkor nem tartalmaz egyéb ismert transzport szignált sem. Ez a 21 kDa izoforma egyszerűen a nukleáris izoformának egy csonkított formája, szemben a humán mitokondriális izoformával, amely tartalmaz egy extra N-terminális régiót, ami a mitokondriális target szignált bizosítja. Felmerül az a kérdés is, hogy miként biztosítódik a mitokondriumokon belül zajló folyamatos DNS szintézishez a megfelelő dUTP/dTTP arány, amire szintén választ kaphatunk fehérje-fehérje kölcsönhatásokat feltételezve. A nukleáris izoforma esetén a dUTPáz expresszió sejtciklus függő. Ez felveti a kérdést, miként biztosítódik az enzim funkciójának jelenléte a sejtciklus többi szakaszában, amikor ugyan nem az egész genom replikálódik, de a folyamatos DNS javításban is gyakran hosszú DNS láncok szintetizálódnak újra. A csoportban kialakított munkahipotézis szerint ez az ellentmondás megoldódhat, amennyiben a fennmaradó kis mennyiségű dUTPáz megfelelően lokalizálódik a javítás helyén, azaz jelen van a DNS javító komplexben a sejtciklus során. A Drosophila dUTPáz fejlődési állapottól függő expressziója nem a génexpresszió szintjén szabályozódik, hanem poszttranszkripciós úton. Az előrejelzett inhibitor fehérje mellett a csoportban végzett mérések alátámasztják S2 sejtekben egy dUTPáz aktivitást moduláló hatás meglétét, ami csak a teljes hosszúságú (extra Cterminális régiót is tartalmazó) dUTPáz esetében érvényesül. Feltételezésünk szerint a fehérjének ez a Drosophilára specifikus régiója, ami nem befolyásolja a rekombináns enzim aktivitását (Kovari et al., 2004), de más fehérje faktorok dUTPáz aktivitását szabályozó hatását közvetítheti. Jelen dolgozatban célom volt a dUTPázzal kölcsönható fehérjék létének kísérletes vizsgálata.
18
2. 4. A dUTPáz enzimcsalád képviselői A különböző organizmusokból származó dUTPázok szerkezetüket tekintve különböző mértékben térnek el egymástól. Az aminosav szekvenciában minden dUTPázban fellelhető 5 konzervatív szekvencia motívum (McGeoch, 1990). A dUTPázok két nagy csoportra oszthatók: a herpesztípusú és az ún. EuBaR (az elnevezés a származásukra utal: eukarióta, bakteriális, retrovirális) típusú dUTPázok csoportjára (Vertessy, 1997). A herpesz típusú enzimek monomerek, szemben a többi dUTPázzal, amelyek homotrimer szerkezetűek. A homotrimerben a három alegység három aktív centrumot alakít ki úgy, hogy minden alegység minden centrumban részt vesz (Mol et al., 1996). A monomer dUTPázok kb. 320-380 aminosavat tartalmaznak, szemben a trimer enzimekkel, amelyek peptidlánconként 141-160 aminosavat tartalmaznak csupán (8. ábra).
8. ábra: A homotrimer Drosophila dUTPáz szerkezete. A három alegység polipeptidláncát zöld, kék és sárga szalagmodell mutatja. A három aktív centrumba kötődő szubsztrátanalóg dUDP molekulákat térkitöltő modell mutatja, az atomok standard színkódjának felhasználásával (piros: oxigén, kék: nitrogén, fehér: szén, narancs: foszfor). Megfigyelhető, hogy az aktív centrumokba kötődő dUDP ligandot mindhárom alegység egyes szegmensei koordinálják.
19
Továbbá lényeges különbség az is, hogy a monomer enzimben a konzervatív motívumok más sorrendben és különböző távolságban vannak egymástól, mint a többi dUTPázban (9. ábra). Feltételezhető, hogy a monomer változat egy ősi dUTPáz gén duplikációja kapcsán jelent meg az élővilágban.
N
1
2
3
4
5
C
E u Ba R en zim ek
N
3
1
2
4
5
C
Her p es s im p lex 1
9. ábra: Konzerválódott szekvencia motívumok a dUTPázok két fő csoportjában.
Mi a gyógyszerkutatási szempontból jelentősebb EuBaR típusú dUTPázokkal foglalkozunk részletesen. A gyakorlati gyógyszerkutatási célponton túlmenően ezek a homotrimer fehérjék szerkezeti szempontból is különösen érdekesek. Az EuBaR dUTPázok esetén különbség mutatkozik a pro- ill. eukarióta szervezetekből származó enzimek között a három alegység közti kapcsolatban, mely különbség alapja lehet az eukarióta dUTPázokban feltételezett allosztérikus működésnek (Fiser and Vertessy, 2000). Amennyiben a rákterápia számára akarunk érdemleges alapkutatási eredményekkel szolgálni, érdemes az EuBaR dUTPázok csoportján belül is az eukarióta enzimekre koncentrálni. A kutató csoportban Drosophilát használunk modellszervezetként a humán sejtvonalak mellett. A két enzim nagyfokú szerkezeti hasonlósága mellett a szabályozásuk is hasonlóságot mutat.
20
2. 5. A dUTPáz szerkezete Negyedleges szerkezetük alapján a dUTPáz enzimek három különböző csoportba sorolhatóak: - monomer, - homodimer, - homotrimer. A homotrimer forma a legáltalánosabb, megtalálható a prokariótákban, az eukariótákban és a legtöbb vírusban (Larsson et al.,1996; Prasad et al., 1996; Dauter et al., 1999;). Mindegyik enzimben öt konzervált szekvenciamotívumot azonosítottak, melyek az aktív centrumban vagy annak közelében helyezkednek el. Annak ellenére, hogy ezek a szerkezetek igen különböző fajokból származnak, hasonlóságot mutatnak az aktív centrum felépítésében és magas szubsztrát specifitásában (McGeoch, 1990). Monomer dUTPázt emlős szervezeteket fertőző herpeszvírusok kódolnak az örökítőanyagukban. Tartalmazzák ugyanazokat a konzervált szekvenciamotívumokat, mint a homotrimer forma, de más sorrendben (McGeoch, 1990). A dimer dUTPáz megtalálható protozoákban és Campylobacter jejuni baktériumban (Parkhill et al., 2000). A dimer szerkezetű enzim ellentétben a homotrimer és monomer formákkal nem kódolja az öt konzervált szekvenciamotívumot. Szubsztrátspecifitása alacsonyabb és képes a dUDP hidrolízisére is, amely egyébként kétfajta enzim aktivitását gátolja (Bernier-Villamor et al., 1999). Az E.coli dUTPáz háromdimenziós szerkezetét röntgenkrisztallográfia segítségével határozták meg. Az enzim egy szimmetrikus trimer, amelynek alegységei 152 aminosavból állnak (Cedergren-Zeppezauer et al., 1992). A különböző enzimek alegységeit alkotó peptidláncok hosszúsága különböző lehet, de szerkezetük mégis jól fedésbe hozható egymással, néhány huroktól eltekintve. Annak ellenére, hogy a különböző organizmusokból származó dUTPázok között a korlátozott szekvenciaazonosság a jellemző, mégis minden igazoltan dUTPáz aktivitással rendelkező és dUDP hidrolízist nem katalizáló fehérjében megtalálható ugyanaz az öt konzervált szekvenciamotívum (McGeoch, 1990). A homotrimer dUTPázok alegységeinek a magját β-szálak alkotják (v.ö. 8. ábra). Az egyetlen rövid α-hélix a trimer felületén helyezkedik el. A β-szálak hurokkal kapcsolódnak össze
21
és ún. lekvárostekercsbe szerveződnek (Parkhill et al., 2000). A fehérjeszerkezetben a piskótarétegek az egyes β-szálaknak felelnek meg, az összetartó lekvár, ragasztó szerepét a két βszál közötti hidrogénhidak jelentik (Vértessy, 2000). Az ideális lekvárostekercset alkotó β-szálak antiparalell módon rendeződnek össze (10.ábra A), de a dUTPáz esetében némely β-szálak paralell módon kapcsolódnak (Cedergren-Zeppezauer et al., 1992) (10.ábra B).
10. ábra A : A β-szálak összerendeződése ideális esetben. B : A β-szálak kapcsolódása dUTPázoknál.
A homotrimer harmadlagos és negyedleges szerveződése nem választható el, mert az egyik alegység lekvárostekercsének egyik β-szála a szomszédos alegységből származik (11. ábra B). Ez a szerveződés rendkívül nagy stabilitást biztosít a dUTPáz trimernek (Vértessy, 2000). A dUTPáz centrumának kialakítása tudomásunk (és a kurrens szakirodalom) szerint egyedülálló. A trimer enzimben három szimmetrikusan létrejövő aktív centrum van és mindegyik
A
B
aktív centrum felépítéséhez mind a három alegység és ezen belül is az öt konzervált szekvencia motívumLekvárostekercs hozzájárul (Vértessy, 2000) (11. ábra). szerveződés ideális esetben (A) és dUTPázoknál (B)
22
3 5 2 1
N 1
2
3
4
5
4
C
11. ábra: A humán dUTPáz három alegységes szerkezete (baloldali ábra) és az öt konzervált szekvencia motívum (lila színnel jelölt). A három alegység polipeptidláncát zöld, kék és sárga szalagmodell mutatja. A három aktív centrumba kötődő dUTP szubsztrát molekulákat pálcika modell mutatja, az atomok standard szinkódjának felhasználásával (lásd:8.ábra).
23
3. A felhasznált módszerek 3. 1. A dUTPáz preparálása A dUTPázt E-coli dUTPáz génjét tartalmazó baktériumokkal termeltetjük (a BL21 pLysS E coli baktériumtörzset a pET22b-dut plazmiddal transzformáljuk). A baktéruimtörzs 20%-os glicerin pufferben, folyékony nitrogénben gyorsan lefagyasztva, -80 °C-on tárolható, és a sejtek életképesek maradnak. A baktériumsejteket steril tápoldaton szaporítjuk, amely élesztőkivonatot, triptont és ásványi sót tartalmaz (Luria-Bertani tápoldat). A tápoldathoz antibiotikumot is adagolunk (kloramfenikolt és ampicillint), hogy csak azok a sejtek maradjanak életben, amelyek még tartalmazzák a pLysS és az általunk bevitt pET22b-dut plazmidot, melyeken antibiotikumrezisztenciát kódoló gének is vannak. A sejtkoncentráció változását bizonyos időközönként vett minták optikai denzitásának spektrofotométeres mérésével követjük. A sejteket logaritmikus növekedési fázisuk elején indukáljuk IPTG-vel (izopropil-tiogalaktozid). Az IPTG a lac promoter ellenőrzése alatt álló T7 DNS-függő RNS polimeráz enzimet kódoló génről, amely a baktériumtörzs kromoszómáján található, megindítja a polimeráz expresszióját. Az így termelődött T7 polimeráz tevékenységét a pET22b-dut plazmidra irányítja egy nagyon erős T7specifikus promóter régió, ami a dUTPáz gén előtt helyezkedik el a plazmidon. Így az IPTG hozzáadásával a dUTPáz génről történő expressziót tudjuk beindítani. Mintegy négy óra hosszat termeltetjük az enzimet, majd centrifugálás után feltárjuk a sejteket. A feltárás lényege, hogy megbontsuk a sejtfalat, és a plazmában található, oldható fehérjéket – főleg a dUTPázt – sértetlenül oldatba vigyük. A sejtfal megbontásával azonban bizonyos proteázok működésbe lépnek, és kontrollálatlanul rongálják a fehérjéket, ezért szükséges, hogy ezeket hatástalanítsuk, amit a lízis pufferbe adagolt EDTA-val és EGTA-val (amik a metalloproteázokat gátolják), valamint PMSF-fel érünk el (fenil-metil-szulfonil-fluorid, ami a szerin oldallánccal működő enzimeket – pl. tripszin, kimotripszin – specifikusan gátolja úgy, hogy velük kovalens komplexet képez). Továbbá DTT-t (ditio-treitol) adagolunk még a lízis pufferhez, ami megvédi a szabad SH csoportokat az oxidálódástól úgy, hogy önmaga oxidálódik helyettük. Az utóbbi két anyagot (PMSF, DTT) - lévén bomlékonyak - mindig frissen adjuk a pufferhez. A lízis puffer összetétele: 150 mM NaCl, 50 mM TRIS (pH=8), 1mM EDTA, 2mM DTT, 0,5 mM PMSF. A feltáráshoz a sejteket homogenizáljuk a lízis pufferben, lizozim hozzáadásával a sejtfalat megbontjuk, amit egymás után következő gyors lefagyasztásokkal és
24
felolvasztásokkal teszünk teljessé. Ezután centrifugáljuk az elegyet . A felülúszóban található a dUTPáz számos más fehérjével együtt. A felülúszót dializáljuk a kromatográfiás elválasztáskor használt ˝A˝ pufferrel (25 mM Na-foszfát (pH=7,5), 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF) szemben.
25
3. 2. Ioncserés folyadékkromatográfia Ioncserés folyadékkromatográfia során az állófázis felületén állandó értékű töltés van. Attól függően, hogy pozitív vagy negatív töltésű az állófázis anion- vagy kationcserélőről beszélünk. Az ioncserélők váza szerves polimer vagy módosított szilikagél. A pH változtatásával a visszatartást megszabó, döntően molekuláris kölcsönhatásokat megváltoztathatjuk. Nagy pH értéken az ioncserés jelleg és a töltet apoláris része használható fel elválasztásra. Kis pH értéken a szulfonsav csoport H-híd képzésre való hajlama az alkil és fenil rész apoláris jellege használható elemzési feladatokban. Az ioncserés kromatográfiában az eluens puffertartalmú vízsó-szerves oldószerelegy. A puffer pH-val a vegyület disszociációfokát, a sókoncentrációval az ellenion mennyiségét, a szerves oldószerrel a vegyület oldhatóságát tudjuk a mozgófázisban befolyásolni. Ha a szétválasztandó vegyületek tulajdonságainak különbsége túl nagy, akkor egy adott izokratikus rendszerben vagy a nagyobb megoszlási hányadossal jellemzett komponensek nagy retencióval elválnak, vagy ha az eluenserősséget növeljük, akkor a kevésbé visszatartott komponensek interferálnak- romlik a felbontásuk. Ezekre a problémákra megoldás lehet a gradiens elúció alkalmazása. Lényege az, hogy időben eltérő módon változtathatjuk azt a paramétert, amely csökkenti a visszatartást. Szerves vegyület ioncserés elválasztásánál oldószer, só vagy hőmérséklet gradiensről beszélünk. A dUTPáz ioncserélő kromatográfiás elválasztását Gradifrac készülékben Q-Sepharose anioncserélő gyantán (Pharmacia Biotech Fast Flow) végeztem. A készülék programozható. Az általam megadható paraméterek: az áramlási sebesség, a gradiens ˝B˝ időtartama és jellege, a frakciók szedése ill. nem szedése, valamint az egyes frakciók szedésének ideje. A műszerbe épített, 280 nm-re beállított spektrofotométer detektálja a rajta átfolyó oldat elnyelését, ami arányos a fehérjekoncentrációval. Ezt a jelet rajzolja ki a rekorder. A fehérjeoldat felvitele előtt az oszlopot a kromatográfiás elválasztáskor is használt ˝A˝ pufferrel mostam át. A puffer összetétele: 25 mM Na - foszfát (pH=7,5), 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF. Miután az oszlopot az ˝A˝ pufferrel egyensúlyba hoztam, és felvittem rá a dializált sejtextraktot, először ˝A˝ pufferrel kell mosni, míg az oldatban lévő fehérjék egy része, (amelyek nem tudnak megkötődni a gyantán, mert nincs megfelelő negatív töltésük) kimosódik. Az áteső frakció után 1 ml/min áramlási sebesség mellett 300 ml ˝A˝ és 300 ml ˝B˝-ből kevert gradiens során eluáltam az oszlopon megkötődő fehérjéket. A gradiens alatt 7 ml-enként frakciókat
26
szedtem. ˝B˝ puffer összetétele: 25 mM Na - foszfát (pH=7,5), 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF. A növekvő sókoncentráció következtében fokozatosan távoztak a gyantán megkötődött fehérjék. A dUTPáz 33, 5% ˝B˝-nél egy éles és magas csúcsot adott.
27
3. 3. Gélelektroforézis A poliakrilamid gél elektroforézis (PAGE; SDS-PAGE) A különböző fehérjék egy adott pH-n meghatározott számú pozitív vagy negatív töltést viselnek. Vizes oldatban egyenáram alá helyezve a molekulákat a töltésüknek megfelelő irányba kezdenek el vándorolni. Az egyes fehérjék eltérő relatív töltésük (egységnyi molekulatömegre eső töltések száma) miatt különböző sebességgel mozognak, amely különbség alapján egymástól elválaszthatók. Fehérjék elektroforetikus elválasztására a leginkább elterjedt, rendkívül hatékony módszer a poliakrilamid gélben végzett elektroforézis, illetve ennek számos változata. Az akrilamid vizes oldatban, megfelelő katalizátorok és iniciátorok jelenlétében gyökös polimerizációra képes, és a reakció során nagymólsúlyú lineáris polimer, ún. poliakrilamid keletkezik. Ha megfelelő keresztkötő ágenst is alkalmazunk, a hosszú poliakrilamid láncok között "hidak" képződnek, és térhálós szerkezetű gél jön létre. Az elektroforézis során a fehérjéket ebben a gélben vándoroltatjuk. A gélben a molekulák méret és alak szerint is elválnak egymástól, a gél mintegy molekulaszűrőként viselkedik. Ezt a molekulaszűrő hatást a gél átlagos pórusmérete szabja meg. Ha az elektroforézist nem denaturáló közegben, alacsony hőmérsékleten végezzük, számos enzim megőrzi natív szerkezetét és így enzimaktivitását, ami alapján ezek a gélben specifikusan kimutathatók. A poliakrilamid gélelektroforézis fehérjék alegységszerkezetének, molekulatömeg-eloszlásuknak vizsgálatára használt változata az SDS-PAGE (sodium-dodecil-szulfátos poliakril-amidgélelektroforézis). Az SDS (sodium-dodecyl-sulphate) egy erősen anionos detergens. Ha a fehérje mintát SDS-el és diszulfid hidakat bontani képes redukálószerrel kezeljük magas hőmérsékleten, radikális konformációváltozások következnek be. A fehérjék közötti kölcsönhatások megszűnnek, az alegység szerkezet felbomlik, és a fehérjék denaturálódnak. Az SDS mintegy "kitekeri" a fehérjéket apoláros részével azok belső, hidrofób magját fellazítva. Az SDS, mivel anionos detergens, a fehérjéket negatív töltésekkel látja el, a fehérje saját töltését „maszkírozza”. Az SDS – fehérjekomplexek töltés/tömeg aránya így állandó érték lesz, függetlenül a fehérje eredeti fajlagos töltéssűrűségétől. A kötődött SDS mennyisége egyenesen arányos a lánc hosszával, vagyis a fehérjék molekulatömegével.
28
A poliakrilamid gél úgy készül, hogy az igény szerinti koncentrációjú akrilamid/metilén-biszakrilamid oldathoz megfelelő pH-jú pufferoldatot keverünk, majd a gyökös polimerizációt egy alkalmas katalizátor és iniciátor hozzáadásával indítjuk el. A katalizátor általában peroxidiszulfát, és a leggyakrabban használt iniciátor a tetrametil-etilén-diamin (TEMED). A katalizátor és az iniciátor koncentrációját úgy választjuk meg, hogy a polimerizáció, így a gélesedés 10-30 perc alatt teljes mértékben végbemenjen. SDS-PAGE esetén két különböző koncentrációjú gélt alkalmaznak. A futtató (más néven szeparáló) gél fölé egy ún. koncentráló gélt polimerizálunk. Ennek akrilamid koncentrációja a futtató gélénél jóval alacsonyabb, olyannyira, hogy itt a molekulaszűrő hatás még nem érvényesül. A kis térfogatú fehérje mintát a koncentráló gél felszínére rétegezzük. Feszültség hatására a fehérje ionok és a tank puffer anionjai belépnek a koncentráló gélbe. A koncentráló gélben a pH 6.5-6.8 között van. Ilyen pH-n a fehérje elektroforetikus mobilitása lecsökken így lokálisan csökken a töltéssel rendelkező molekulák koncentrációja. A fehérjék vékony sávban vándorolnak a futtató gél felszínéig. A futtató, vagy másnéven szeparáló gélben a helyzet megváltozik. Mivel a szeparáló gél pHja 8.8-9.0 között van, a mobilitás megnövekedik. Így a töltéshiányból eredő koncentráló hatás megszűnik, a fehérjék a továbbiakban különböző fajlagos töltésük miatt eltérő sebességgel vándorolnak. Ráadásul a futtató gél akrilamid koncentrációját már úgy választjuk meg, hogy a molekulaszűrő hatás is érvényesüljön, és a gél az elválasztani kívánt fehérjék mérettartományában a lehető legnagyobb mértékben szeparáljon. Festési eljárás: A futtatás után a fehérjéket a gélben láthatóvá kell tennünk. Számos olyan vegyület ismert, melyek nagy hatékonysággal kötődnek fehérjékhez. Ezek használatakor célunk az, hogy lehetőleg az összes fehérjét kimutassuk a gélben. Ilyen festékek közül leggyakrabban a Coomassie Brilliant Blue-t használják. Segítségével a gél keresztmetszetétől és az adott fehérje speciális festődési tulajdonságától függően akár már 0.1µg fehérje is jól detektálható. 12%-os poliakril - amid gél készítése: Az elválasztó oldatot (0,05 ml 10%-os SDS, 1,25 ml elválasztó puffer, 1,5 ml 40%-os poliakril - amid, APS, Temed (frissen betöltés előtt adtam hozzá)) két üveglap közé öntöttem álló helyzetben. Miután az elválasztó gél megkötött rárétegeztem a tömörítő gél oldatát ( 0,025 ml 10%-os SDS, 0,625 ml tömörítő puffer, 0,25 ml 40%-os poliakril-amid, APS, Temed). Ebbe fésűt helyeztem, hogy kiképezze a mintafelvitel számára a helyeket a tömörítő gélben.
29
Gélelektroforézis: A gél megszilárdulása után a fésűt óvatosan kihúztam, és a gélt a futtatókádba tettem. A futtatókádat feltöltöttem futtatópufferrel. A mintákhoz velük azonos mennyiségű mintakoktélt adtam, forralás után óvatosan bepipettáztam őket a gélen lévő zsebekbe, a puffer alá rétegezve. Bekapcsoltam a tápegységet ügyelve a polaritásra. 200 V-tal 30 percig elektrolizáltam. Ezután a gélt desztillált vízben áztattam, majd Bio-Safe Coomassie-val megfestettem.
30
3. 4. Fehérjék tisztítása és elválasztása gélszűréssel Makromolekulák tisztításakor, kihasználva azok eltérő méretét és alakját gyakran alkalmazzuk a gélszűréses kromatográfiát. A molekulaszűrő gél alapanyaga erősen hidrofil, (10-300μm) átmérőjű, oldhatatlan, keresztkötésekkel háromdimenziós hálózattá alakított dextrán poliszacharid. A háló belsejének mérete keresztkötésekkel szabályozható. Így a kromatográfiás oszlopban két folyadéktér alakul ki. Az egyik a gélszemcséken kívüli szabadon mozgó mobil fázis, a másik a gélszemcsék belsejében levő korlátozott mozgású folyadéktér. Ha egy oldat halad keresztül egy ilyen kromatográfiás oszlopon, az oldott molekulák mozgása alapvetően két tényezőtől függ, egyrészt a mozgó folyadékfázis áramlási sebességétől, másrészt a diffúziótól, ami lehetővé teszi, hogy az oldott molekulák, ha méretük engedi átjárják a gélszemcsék belsejét. Így elérhető, hogy a kis molekulájú anyagok számára mind a poliszacharid gél belseje, mind a külső tér elfoglalható. A nagy molekulájú anyagok viszont nem férnek be a gél belső járataiba, a gélszerkezet „szűrőként” működik, számukra csakis a gélszemcséken kívüli tér járható. A poliszacharid dextránból gyárilag gélszemcséket készítenek (Sephadex, Molselect), melyekből vízben történő duzzasztás után kromatografáló oszlopot készíthetünk. Így alkalmassá válik a rendszer különböző molekulatömegű molekulák elkülönítésére, molekulatömeg szerinti elválasztására. Az elválasztás az oszlopon teljes, az eluátumban külön kapjuk meg a fehérjét és a tőle elkülönített kis molekulájú anyagot. A gélfiltrálás eredményét rendszerint elúciós diagram formájában ábrázoljuk. Ezen az eluálódott anyag koncentrációját ábrázoljuk az eluens térfogatának függvényében. A módszer előnye, hogy gyors, viszont számolni kell a fehérje hígulásával. További előny, hogy a módszer több feladat megoldására is felhasználható: - molekulatömeg becslés, - makromolekulák sómentesítése, - molekulatömeg szerinti elválasztás (polimerek, poliszacharidok, nukleinsavak, fehérjék), - egyensúlyi konstans meghatározás (lassú kémiai reakcióknál). A gélszűrést FPLC-készülékben (Pharmacia) végeztem. Az FPLC technika a hagyományos folyadékkromatográfia és a HPLC között foglal helyet mind műszerezettség tekintetében, mind hatékonyságában. A készülék programozható. Az általam megadott paraméterek az áramlási sebesség (0,6 ml/min), a papírsebesség (0,5 mm/min), valamint a nyomás (1,7 mPa).
31
Az elválasztáshoz használt gélszűrő puffer összetétele: 5 mM HEPES (pH=7,5), 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 2 mM benzamidin. A DTT-t, PMSF-et, benzamidint frissen kell az oldathoz adni, mivel bomlékonyak. A puffereket használat előtt 0,2 micronos sterilszűrő membránon szűrtem, hogy az esetleges lebegő szennyeződések ne tömjék el a készüléket. Az oszlopot először gélszűrő pufferrel mostam át kb. 1 órán keresztül, majd a koncentrált dUTPázból 500μl-t injektáltam az oszlopra. A frakciókat kémcsövekbe szedtem manuálisan.
32
3. 5. Fehérjekoncentráció meghatározása Bradford referencia alapján A fehérjék mennyiségi meghatározására leginkább kétféle módszert alkalmaznak: 1. Tiszta fehérje oldatok spektrumából (az elnyelés 280 nm-en történik) az abszorbciós koefficiens ismeretében számolható a fehérjekoncentráció. 2. Fehérje elegyek összfehérje koncentrációját illetve az abszorbciós koefficiens hiányában tiszta fehérje oldat koncentrációját meg lehet határozni többek között a Bradford módszerrel. Az általam alkalmazott módszer színváltozáson alapul. A Bradford reagens Coomassie Brillant festéket tartalmaz, amely a fehérjék peptid kötésével reagálva kék színű terméket hoz létre. Az így kapott vegyület szín intenzitása, abszorbanciája 595 nm-en mérhető. A mérést egyutas spektrofotométerrel végeztem (JASCO V-550 UV/VIS Spektrofotometer). Első lépésként higítási sort készítettem ismert koncentrációjú BSA (marha szérum albumin) oldatból, valamint az ismeretlen koncentrációjú oldatból is, a vak méréshez pedig desztillált vizet használtam. Minden higításhoz és a vakhoz is ¼ térfogatnyi Bradford reagenst adtam, majd Vortex-en összeráztam. A mérés során a műszert minden üres küvettára külön lenulláztam. Minden higításra kiszámoltam a ∆A-t úgy, hogy a mért A-ból levontam a vak oldat abszorbanciáját. Az ismert koncentrációjú BSA oldattal végzett mérések alapján kalibrációs görbét készítettem és meghatároztam a görbe egyenletét (12. ábra). Így az ismeretlen koncentrációjú oldat esetében kapott ∆A-kból számolható a kalibráció során meghatározott egyenlet szerint a higítások koncentrációja. A higításokból visszaszámoltam az eredeti oldat koncentrációját, majd a kapott eredményeket átlagoltam.
∆A / 0,036 = chíg (μg/ml)
33
0.40 0.35 0.30
B=0.0357+/-0.0013 R=0.986
∆A
0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0
2
4
6
8
10
12
c / (µ g/ml)
12. ábra: A kalibrációs görbe és egyenlete.
34
3. 6. Poliklonális antitest nyúlszérumból történő kinyerése A biospecifikus elválasztási módszerek a biokémia és a molekuláris biológia rendkívül specifikus reakcióin alapszanak. Ismeretes az általában erős antitest-antigén kölcsönhatás illetve más makromolekulák közti kölcsönhatás szigorúan specifikus jellege. Ha ezeket a reakciókat elválasztásra tudjuk alkalmazni, akkor az adott anyagra specifikus módszer van a kezünkben, aminek óriási előnye van egyéb kromatográfiás módszerekkel szemben akkor, ha nagy komplexitású híg oldatokból kell kis mennyiségű anyagot izolálni. Mivel az említett reakcióban résztvevő partnerek affinitásuk alapján kapcsolódnak egymáshoz, elterjedt elnevezés az affinitás kromatográfia. Azonban minden kémiai reakció affinitáson alapszik, tehát helyesebb a biospecifikus elválasztás, illetve a kromatográfia szó használata. Az affinkromatográfia előnyei: - az elválasztás viszonylag gyors, mivel csak kis oszloptérfogat szükséges, - igen nagyfokú specifitás. A biospecifikus reakciók felhasználása elválasztásra, vagy frakcionálásra olyan módon oldható meg legegyszerűbben, ha valamelyik reakciópartnert szilárd hordozóhoz rögzítjük. Így oszlopba töltve a kívánt elválasztás kromatográfiás módszerrel valósítható meg, vagy belekeverve az elválasztandó anyagot tartalmazó oldatba, a kívánt kapcsolódás létrejötte után a szilárd fázis fugálással vagy szűréssel könnyen elválasztható, majd arról az anyag visszanyerhető. A vázanyagnak (hordozónak), amely a ligandot köti fizikailag és kémiailag stabilnak kell lennie a kísérlet körülményei között, megfelelő átfolyási tulajdonságokkal kell rendelkeznie, nem szabad nem-specifikus adszorpciós tulajdonságokkal rendelkeznie, amely zavarja a ligandhoz kötődést. Ilyen célokra kiválóan alkalmas anyagok az agaróz, a cellulóz, ill. a nagy duzzadású dextrán gél. Azon esetekben, amikor enzimfehérje-ligand kötődésénél el akarjuk kerülni a sztérikus gátlásokat, szükséges különböző hoszúságú „spacer” molekulákat közbeiktatni a poliszacharid váz és a ligand közé. A szervezetbe bejutó antigén anyagokat az ott képződő antitestek specifikus reakciójuk alapján megkötik, „semlegesítik”. Ez az általában erős antigén-antitest kölcsönhatás alkalmas lehet biospecifikus kinyerésükre is. Ennek megfelelően immunizált állatok vérsavójából az adott antigénre specifikus antitest szintén kinyerhető affinitás kromatográfiás elválasztással.
35
Amennyiben pedig a rendelkezésünkre áll specifikus antitest, azt immobilizálhatjuk szilárd hordozón és az így készített immunoaffinitás oszlopon az antigén nagy komplexitású biológiai mintákból is kinyerhető. Az eddig ismertetett izolálási módszerek a fehérje valamely fizikai vagy kémiai tulajdonságán (molekulaméret, töltés, oldékonyság stb.) alapszanak. Az affinitás kromatográfia az a módszer, mely a fehérjék valamilyen biológiai specifitását használja ki. A módszer alapja az, hogy kovalens kötéssel szilárd hordozóhoz kötnek olyan molekulákat, melyekkel az izolálni kívánt fehérje specifikus kölcsönhatásba lép - enzim esetén ez a szubsztrát vagy egy kompetitív inhibitor, receptor esetében pedig az effektor. A szilárd hordozó lehet a gélszűréshez felhasznált bármely oszloptöltet, leggyakrabban a Sepharose gél. Egy immobilizált szubsztrátot tartalmazó oszlopon megfelelő pH-n és ionerőn csak a szubsztrátot felismerő enzim kötődik meg, a többi fehérje az oszlopról lemosható. A pH és az ionerő alkalmas változtatásával, vagy esetleg oldott szubsztrátnak a hozzáadásával az enzim tiszta állapotban eluálható az oszlopról.
36
3. 6. 1. Immobilizálás A jelen munkában először a rekombináns Drosophila dUTPázzal immunizált nyúl vérsavójából tisztítottam ki az enzimre specifikus antitestet. Ezután ezt immobilizálva ecetmuslica sejtvonalból izoláltam a dUTPáz fiziológiás izoformáit. Rekombináns Drosophila dUTPázt immobilizáltam CNBr aktivált Sepharose-on, amely a fehérjét aminocsoportjánál köti meg. A kapcsolás lúgos közegben megy végbe. A kapcsoló puffer összetétele: 5 mM TEA (pH=8,5), 500 mM KCl, 2,5 mM MgCl. Minden műveletet hidegszobában illetve jégen végeztem. 1 mM-os HCl-ban (pH=3) duzzasztottam a gyantát jégben 10 percig, majd HCl-val, utána pedig kapcsoló pufferrel mostam üvegszűrőn. Lecsöpögésnél ellenőriztem a pH-t. Az üvegszűrőről leszedett gyantát 2-2,5 mg/ml koncentrációjú enzimoldatba helyeztem (5 ml oldat/ 1 g gyanta), és éjszakán át rázattam 4 fokon hideg szobában. Ebben a kísérletben a 30 mg/ml-es dUTPázt tartalmazó oldatot 12x-esen hígítottam kapcsoló pufferben (tömény oldat hiányában dialízist kell alkalmazni). Miután a dUTPáz a gyantára kötődött, a felülúszót leszívtam, 50 ml kapcsoló pufferrel mostam. Ezt követően szükséges az üresen maradt aktív helyeket blokkolni, ezért 1M-os etanolaminban (pH=9) 4 °C-on 2 órán át rázattam a gyantát. A rázatás befejeztével leszívtam az etanolamint a gyantáról, majd a kromatográfiás elválasztáshoz használt pufferben mostam.
37
3. 6. 2. Immunoaffinitás kromatográfia A gyanta elkészítése után antitestet pucoltam antiszérumból. 3 ml antiszérumhoz 9 ml TBS/TWEEN puffert, valamint 1mM EDTA-t és 1000x híg proteázgátló mixet (Sigma) adtam, majd az elegybe helyeztem a fent említett módon elkészített gyantát. Az elegyet 25 °C-on 2 órán át rázattam. Ezután a gyantás szuszpenziót oszlopba önttem, majd átmostam 5 oszloptérfogatnyi mosó pufferrel, ugyanennyi pH=8 TBS/ TRITON pufferrel valamint pH=9 TBS/TRITON pufferrel. Az egyre lúgosabb közeg azt a célt szolgálta, hogy az esetleg aspecifikusan kitapadó fehérjék folyamatosan eluálódjanak és ne szennyezzék az antitest frakciót. Az eluálás során az oszlopra kitapadt antitestet lemostam erősen lúgos oldattal, és folyamatos keverés mellett kissé savas, erős pufferbe csepegtettem. Az oszlopot 5 oszloptérfogatnyi TEA pufferrel (pH=11,5) mostam. Az áteső elegyet 1M-os TRIS HCl-be (pH=6,7) csepegtettem, ezzel biztosítottam azt a fiziológiás körülményt, amelyben az antitest újra aktív lesz. 1 oszloptérfogatot 0,2 oszloptérfogatnyi TRIS HCl-be csepegtettem, majd kevergetéssel homogenizáltam. Az oszlopot végül 5 oszloptérfogatnyi TSA oldattal mostam. Az oszlopra végül TSA puffert öntöttem, amely nátrium-azidot tartalmaz, melynek baktériumölő hatása révén az oszlopot hosszú ideig tárolni lehet anélkül, hogy a rákötött fehérje degradálódna. A kromatográfia során használt pufferek összetétele: - MOSÓ puffer (0,01 M TRIS HCl(pH=8), 0,14 M NaCl, 0,025% Nátrium-azid, 0,5% TRITON, 0,5% Nátrium-dezoxycholát) - TBS/TRITON (50 mM TRIS HCl (pH=8 és pH=9), 0,1 % TRITON, 0,5 M NaCl) -TRIS HCl (6M, pH=6,7) -TEA (50 mM TEA (pH= 11,5), 0,1 % TRITON, 150 mM NaCl) -TSA puffer (10 mM TRIS HCl (pH=8), 140 mM NaCl, 0,025% Nátrium-azid).
38
3. 7. Blottolás Nitrocellulóz illetve PVDF membránra
A fehérjéket először SDS gélelektroforézissel elválasztjuk egymástól. A gélre szorosan ráillesztünk egy membránt, majd a gél síkjára merőleges irányban egy újabb elektroforézist végzünk egy erre a célra kialakított készülékben. A gélből feszültség hatására a töltött fehérjék (töltésüknek megfelelően) a membrán-felszínére vihetők, így a fehérjéket a gélben kialakult mintázatot megőrizve rögzítjük a membránon. Leggyakrabban nitrocellulóz vagy hidrofób felszínű PVDF membránt használunk. A gélt alaposan kiáztatva SDS – mentesítjük. Az SDS molekulák más ionokkal együtt transzfertálódhatnak a gélről, majd a membránhoz kötődve vízzel kölcsönhatásba kerülhenek és a PVDF membrán nedvesedését okozhatják. A nedvesedés következménye, hogy az így létrejövő háttérfestődés rontja a detekció szelektivitását. Az SDS - mentesítés azt is jelenti, hogy a fehérjéknek már nem egységesen negatív töltésük lesz, hanem részben visszatekeredve natív formában az izoelektromos pontjuknak megfelelő saját töltésük. A puffert és a pH-t, amiben a blottolást végrehajtjuk, a blottolandó fehérjék izoelektromos pontjának megfelelően választjuk. 10% metanol általában segíti a transzfert. A hagyományosabbnak tekinthető nitrocellulóz membrán előnye, hogy gond nélkül nedvesíthető vizes oldatokkal. Hátránya lehet azonban, hogy – ellentétben a PVDF membránnal - lyukacsos, ezért túl hosszú blottolás során a kisméretű fehérjék esetleg átjuthatnak rajta. A PVDF membrán műanyaghordozóra felvitt hidrofób felszíne a fehérjéket nem engedi át. Ezen túl pedig az alapos kiszárítással visszaállított hidrofób karakterű felszín lehetőséget ad a blottolást követő immunfestés során a blokkolási és mosási lépések lerövidítésére, hiszen a hidrofób felszín az oldatok számára kvázi láthatatlan – nem jelent aspecifikus kötőhelyeket az oldott antitestek stb. számára.
A blottolás lépései: 1. Gélelekroforézis után a gélt desztillált vízbe áztatjuk (SDS -t kioldjuk belőle). 2. Szűrőpapírokat, szivacsot CAPS-ba (10 mM CAPS, 10% metanol, pH=12) áztatjuk, a membránt pedig metanolba merítjük mielőtt a gélre helyezzük, hogy az egyébként hidrofób felszín nedvesíthetővé váljon. (Ezért vigyázni kell arra, hogy az összerakás során se száradjon ki a membrán, mert úgy újra elveszítené nedvesíthetőségét.)
39
3. A blot összerakásánál fontos a gél és a membrán egymáshoz viszonyított sorrendje: a CAPS-ban (pH=12) a fehérjék negatív töltésűek lesznek, így a pozitív elektród felé fognak vándorolni az elektroforézis során. 4. Az elektroforézist 4 °C- on kevertetés közben állandó áramerősségen 350 mA-en végezzük 90 percen keresztül. 5. Végül a gélt Coomassie-val (ezzel ellenőrizve, hogy mennyi fehérje maradt a gélben), a membránt pedig Ponceau-val festjük, amely reverzibilis aspecifikus fehérjefesték. Így láthatóvá válnak a blotra átkerült fehérje csíkok. 6. Fotózás után megkezdhetjük a Western blot fejlesztését, vagy hagyjuk kiszáradni a membránt, végül szárazon el is tehetjük másnapra. (Az alapos kiszárítás lényeges a rövid protokoll végzésénél, ugyanis ha nem szárad ki eléggé, akkor az immunfestési eljárás során nedvesedni fog a membrán, lehet, hogy csak foltokban, ami a rövid protokoll során elhagyott blokkolás és mosás miatt nagy háttérfestődést eredményez.)
40
3. 8. Western blot (immunoblot) Ha rendelkezünk a kimutatandó fehérjével szemben specifikus ellenanyaggal, a következő módon járhatunk el: Az immunotechnika (13. ábra) alkalmazása során a membránra blottolt fehérjét először az adott fehérjét felismerő antitesttel reagáltatjuk, így szelektíven megjelöljük a kimutatandó fehérjét. A jelölést leggyakrabban úgy tesszük láthatóvá, hogy a membránt egy második ellenanyag oldatában inkubáljuk. Erre a második ellenanyagra, mely specifikusan felismeri az első ellenanyag konstans régióját, még a felhasználás előtt kovalensen egy enzimet, leggyakrabban peroxidázt kötnek. Az inkubálás alatt lejátszódó enzimreakció után a fehérje detektálhatóvá válik. A Western blot eljárás menete: Hosszú protokoll lépései:
1. 2.
3.
4.
5.
Nitrocellulóz membrán A membránt 0,1 % TWEEN-t is tartalmazó TBS blokkoló pufferben 1órán keresztül rázattam. A membránt a 100 000x-sen higított elsődleges ellenanyaggal 2 órán át inkubáltam, 0,1 % TWEEN-t is tartalmazó TBS blokkoló pufferben. 3x mostam a blotot TBS oldattal. 2x20 percig rázattam a blotot TBS/TWEEN pufferben. 3x mostam a blotot TBS oldattal. A membránt 2500x-san higított másodlagos ellenanyaggal inkubáltam TBS blokkoló pufferben 1 órán keresztül. Megismételtem a 3. pontban leírt mosási eljárást.
1. 2.
3.
4.
5.
PVDF membrán A membránt 0,025 % TWEEN-t is tartalmazó PBS blokkoló pufferben 1órán keresztül rázattam. A membránt a 100 000x-sen higított elsődleges ellenanyaggal 2 órán át inkubáltam, 0,025 % TWEEN-t is tartalmazó PBS blokkoló pufferben. 3x mostam a blotot PBS oldattal. 2x20 percig rázattam a blotot PBS oldatban. 3 x mostam a blotot PBS oldattal. A membránt 2500x-san higított másodlagos ellenanyaggal inkubáltam PBS blokkoló pufferben 1 órán keresztül. Megismételtem a 3. pontban leírt mosási eljárást.
6. A membránt desztillált vízzel öblítettem.
6. A membránt desztillált vízzel öblítettem.
7. Előhívtam (lásd.:3.10.fejezet).
7. Előhívtam (lásd.:3.10.fejezet).
41
Rövid protokoll lépései:
PVDF membrán 1. A membránt a 100 000x-sen higított elsődleges ellenanyaggal 1 órán át inkubáltam 0,025 % TWEEN-t is tartalmazó PBS blokkoló pufferben. 2. 2 x 10 sec öblítettem PBS oldattal. 3. A membránt 2500x-san higított másodlagos ellenanyaggal inkubáltam PBS blokkoló pufferben 30 percen keresztül. 4. 2 x 10 sec öblítettem PBS oldattal. 5. Előhívtam (lásd.:3.10.fejezet).
A fent leírt lépések mindegyikét szobahőmérsékleten végezzük. A 100 000x-es hígítású elsődleges ellenanyag Drosophila dUTPáz ellen termeltett antiszérum. A humán dUTPáz elleni antitestet 160 000x-res hígításban alkalmazzuk. A másodlagos ellenanyag az anti-nyúlszérum Igt felismerő HRP (Horse Redish Peroxidáz) konjugált antitest, amely a dUTPázra specifikus elsődleges antitesthez kötődik. A felhasznált pufferek: TBS (20 mM TRIS (pH=7,5), 150 mM NaCl) PBS (10 mM NaPO4, 0,9 % NaCl (pH=7,2)) Blokkoló puffer: (TBS+5V/V% (5g/100 ml) sovány tejpor) ill. (PBS+2V/V% (2g/100 ml) sovány tejpor) TBS/TWEEN (TBS blokkoló puffer + 0,1% TWEEN) PBS/TWEEN (PBS blokkoló puffer + 0,025% TWEEN)
42
antigén (dUTPáz)
kölönböző celluláris fehérjék
elsődleges ellenanyag dUTPázra specifikus antitest nyúlszérumból
másodlagos ellenanyag, ami a nyúl Ig-it (antitestjeit) ismeri fel + HRP enzim, ami a másodlagos antitesthez kovalensen van kötve
13. ábra: Az antigén és az elsődleges illetve a másodlagos antitest közötti kölcsönhatás vázlata Western blot esetén.
43
3. 9. Far Western blot A far Western blot (14. ábra) a Western blot-hoz képest nemcsak az antigént, hanem az antigénnel kölcsönható más celluláris fehérjét is ki tud mutatni. A módszer korlátai: - a részlegesen natív formájú fehérjék nem biztos, hogy megőrizték a dUTPázt kötő tulajdonságukat, - a fehérjék alegységeikre válhatnak szét, - gyenge és érzékeny kölcsönhatás várható az antigén és a fehérjék között. Az eljárás során ezért mielőtt a blotokat az elsődleges ellenanyaggal reagáltattam, éjszakán át inkubáltam őket hosszú protokol esetén 30 μg/ml-es, rövid protokol során pedig 25 μg/ml dUTPázzal. A további lépések és a fehérjék detektálása ugyanúgy zajlott, mint ahogy a Western blot technikánál leírtam. Az eredmények analízisénél Western blotot használtam kontrollként.
dUTPázt kötő celluláris fehérje
antigén (dUTPáz)
kölönböző celluláris fehérjék
elsődleges ellenanyag dUTPázra specifikus antitest nyúlszérumból
másodlagos ellenanyag, ami a nyúl Ig-it (antitestjeit) ismeri fel + HRP enzim, ami a másodlagos antitesthez kovalensen van kötve
14. ábra: Az antigént (dUTPázt) kötő fehérjék, az antigén, az elsődleges illetve a másodlagos antitest közötti kölcsönhatás vázlata far Western blot esetén
44
3. 10. Fehérjék detektálása Kétféle módszert alkalmaztam: Az első módszer: a HRP szubsztrátjaként DAB-ot (Diaminobenzamidin) használtam, ami barna színreakciót eredményezett. 5 mg/ml-es DAB törzsoldatot 0,1M Tris-ben (pH=7,5) oldottam fel, majd 0,3%-os H O oldatot készítettem. 450 µl PBS-hez (137 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 2 2 10,14 mM NaHPO4, 1,76 KH2PO4), amely 0,2%-ban tartalmazott TRITON-t, 50 µl DAB törzsoldatot töltöttem. Az elegyet öt percig rázattam, majd 5 µl H O törzsoldatot öntöttem 2 2 hozzá. Az elkészült oldatot ráöntöttem a blotra, és vártam a szín megjelenéséig. A blotot végül leöblítettem desztillált vízzel, majd hagytam megszáradni. A másik módszer: ECL (Pharmacia) reagenseket használtam, amelyek kemilumineszcens jelet adnak, melyet röntgenfilmen detektáltam. A blotokat 1 percig rázattam ECL reagensek 1:1 arányú elegyében. Szűrőpapíron hagytam a blotokat megszáradni. Majd sötétszobában a blotokra ráhelyeztem a röntgenfilmet, rövid ideig exponáltam. Ezután a filmet előhívtam és hagytam megszáradni
45
3. 11. S2 sejtvonal fenntartása és a sejtek feltárása Az S2 sejteket 22 ˚C-os Drosophila SFM tápoldatban tartottam fenn, ami tartalmazott még Lglutamint és penicillin, illetve streptomicin antibiotikumokat. A táplálék 20 ml-ébe 1 ml S2-t oltottam át. Az átoltást mindig steril körülmények között végeztem. A sejteket logaritmikus növekedési fázisban szüreteltem, úgy, hogy Falcon csövekbe gyűjtöttem őket, majd 10 percig 700 rpm-en lecentrifugáltam. A felülúszót leöntöttem, mivel a sejtek alul ülepedtek ki. A sejteket PBS-ben visszaoldottam, s az előbbi paraméterek melett lecentrifugáltam. Végül PBS-be oldottam vissza a sejteket. A sejtszámlálást Bürker kamra segítségével végeztem. A feltárás során 20 ml-ben felnőtt S2-t 2 ml lízis pufferben felszuszpendáltam, majd potterben homogenizáltam a szuszpenziót. Jégbe ágyazva 3x1 percig szonikáltam utána pedig 4 C –on 13000 rpm-en centrifugáltam. Az így kapott extraktból immunoaffinitás kromatográfiával
˚
dUTPázt izoláltam. A lízis puffer összetétele: 10 mM TRIS HCl (pH= 7,1), 150 mM KCl, 10% glycerin, valamint frissen adtam még hozzá 1 mM DTT-t, 2 mM benzamidint, 1 mM EGTA-t, és 500x híg proteázgátló mixet.
46
3. 12. Különböző fejlődési állapotú Drosophila minták előállítása Petéztetés: OREGON R vadtípusú Drosophila törzset tartottam fenn élesztőt tartalmazó táptalajon üvegekben. A legyeket petéztető táptalajra helyeztem át és egy éjszakán át petéztettem. Az előző táptalajról ecsettel eltávolítottam az embriókat és -80 ˚C tároltam őket. Ha a kísérletekhez lárvákra volt szükségem, akkor az embriókat hagytam nőni még egy napig az első lárvaállapot eléréséig. A lárvákat PBS-sel mostam le a táptalajról.
Lárvák és embriók feltárása Western blothoz: A -80 °C-on tárolt embriókat és a begyűjtött lárvákat 1-1 ml PBS/Tween-ben felszuszpendáltam és vízfürdőn 5 percig forraltam őket. 3 perces szonikálást követően újra forraltam őket 5 percig, majd ismét 3 percig szonikáltam. Ezt követően azonos arányban mintakoktélt adtam hozzájuk és forró vízfürdőre helyeztem őket. Mielőtt gélre vittem őket a visszamaradó aggregátumok miatt centrifugáltam őket.
47
3. 13. C. elegans fonalas férgek feltárása Az N2 vad típusú C.elegans törzset szobahőmérsékleten NGM táptalajon Petri-csészében tartottam fenn. A férgek életciklusa rövid, laboratóriumi körülmények között három és fél nap. Feltáráskor a felnőtt állatokat a Petri-csészékből desztillált vízzel Falcon csőbe mostam át. A férgeket feltáró pufferben (50mM NaPO4, pH=7,5, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 500x híg proteázgátló
mix)
felszuszpendáltam,
majd
a
szuszpenziót
homogenizáltam.
A
homogenizáláshoz dörzsmozsarat és üveggyöngyöt használtam. Ezt követően 2-3 percig 1300 rpm-en centrifugáltam őket, majd a felülúszót, amely a férgeket tartalmazza, elválasztottam az üledéktől. Az így kapott sejtextrakthoz azonos mennyiségű mintakoktélt adva forralás után a mintáim gélrevihetők voltak.
48
3. 14. Homológia modellezés A C.elegans dUTPáz fehérje háromdimenziós szerkezeti modelljét homológia modellezéssel határoztam meg. Ehhez a nagyfokú szekvenciális hasonlóságot mutató humán enzim kísérletesen meghatározott kristályszerkezetéből indultam ki. A számításokat a SwissModel ingyenesen elérhető, felhasználóbarát programcsomag segítségével végeztem. Ez a program először a szekvenciákat illeszti egymásra, majd a megfelelő illesztés elérése után az ismeretlen szerkezetű fehérje egyes atomjait az ismert szerkezetű fehérje megfelelő atomjainak térbeli helyére állítja. Két azonos szekvencia esetén természetesen minden atomnak megvan a maga azonos párja egy ilyen illesztés során, így két azonos fehérjeszerkezetet fogunk kapni. Amennyiben nem teljes az azonosság a két szekvencia között, de a hasonlóság számottevő, akkor a fehérje peptidláncának atomjai között továbbra is egyértelműen létrehozható a megfeleltetés, csak az oldalláncok eltérő volta miatt néhány oldallánc helyzete nem lesz egyértelműen meghatározható. Ezen oldallánc atomokra a program a megfelelő flexibilitási kritériumok, kötésszögek és kötéstávolságok figyelembevételével rotációs izomereket definiál, melyekre rendre energiaszámításokat végez. Végül a legalacsonyabb energiájú modellt fogadja el a program (Guex, N. and Peitsch, M.C., 1997).
49
4. Eredmények és értékelés 4. 1. Immobilizálásra alkalmas tisztaságú Drosophila dUTPáz előállítása Az ioncserés kromatográfia után kapott kromatogramot (15. ábra) megvizsgálva a dUTPáz 33,5% ˝B˝ gradiensnél határozott csúcsot ad. A többi nagy intenzitású csúcsért az extrakt DNS tartalma a felelős.
**
15. ábra: Az ioncserés kromatográfiával kapott kromatogram, ahol a dUTPáz 33,5%-nál ad csúcsot (*). A kromatogram alapján kiválasztottam 24-től 49-ig azokat a frakciókat amelyekben nagy valószínűséggel található dUTPáz, és poliakril-amid gélen elektrolizáltam. Az 16. ábrán látható eredményt kaptam. Az egyes frakciókból vett mintákat összevetve az LD referenciával, jól látható, hogy a 24-32 frakciók tartalmazzák a dUTPázt, azonban jelentős mennyiségű szennyező fehérjét is tartalmaznak. Ezért a preparátum további tisztítására volt szükség. Így a kiválasztott frakciókat Amicon Ultra (10000 MwCO) centrifugális szűrőben töményítettem.
50
24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 ref.
16. ábra: Korábban tisztított rekombináns dUTPázt használtam referenciaként (ref), a kromatográfiás frakciókat számmal jelöltem. A töményített oldatot tovább tisztítottam gélszűréssel FPLC készülékben. A kromatogramon (17. ábra) kirajzolódott két csúcs közül meg kellett állapítanom, hogy melyik a dUTPázt tartalmazó, ezért mindkettőből poliakril-amid gélre mintát vittem. A kapott eredmény (18. ábra) alapján látható, hogy az 1-es csúcs tartalmazta a dUTPázt.
1 2
17. ábra: A gélszűréssel kapott kromatogramon kirajzolódott két csúcs.
51
2-es 1-es
18. ábra: A gélelektroforézis után kapott eredmény, ahol az 1-es csúcsban található a dUTPáz. A 2. csúcs csak csekély mennyiségű fehérjét tartalmaz, nagy fényelnyeléséért valószínűleg a gélfestés során nem detektált DNS tartalom a felelős. Végeredményül a kétlépcsős kromatográfia során hozzávetőlegesen 95%-osan tiszta dUTPázt sikerült előállítani, ami megítélésem szerint alkalmas a további munkára.
52
4. 2. A dUTPáz immobilizálása Az 1-es csúcshoz (18. ábra) tartozó frakciókat töményítettem. Meghatároztam a koncentrációját Bradford módszerrel: 30 mg/ml. Ebből 0,5ml-t 12-szeresére hígítottam kapcsoló pufferrel, amely ebben az esetben megfelelőnek bizonyult a dialízis helyett. A felhasznált módszerek című fejezetben részletesen bemutatott módszert követve sikerült a dUTPáz enzimet Sepharose-on immobilizálni, amint ezt a 19. ábrán prezentált gél is alátámasztja. A dUTPáz-konjugált gyantát a továbbiakban specifikus antitest nyúl szérumból történő izolálására használtam.
Immob. Immob. után előtt
19. ábra: A dUTPáz gyantára kötése. A fehérje nagy része immobilizálásra került, egy kevés enzim maradt az immob. után felirattal jelölt oldatban.
53
4. 3. Antitest izolálása Drosophila dUTPázzal immunizált nyulakból kinyert antiszérumból antitestet tisztítottam affinitás kromatográfiával, felhasználva az előzőleg Sepharose gyantához kötött dUTPázt. Az eluálás során szedett frakciókból mintákat vettem az antitest aktivitásának ellenőrzése céljából. Nitrocellulóz membránra felcseppentettem a Drosophila dUTPáz két rekombináns izoformáját, és ezeken végeztem el a Western blot eljárást úgy, hogy a mintákat használtam elsődleges ellenanyagként megfelelő higításban. Az IgG elválasztásakor szedett frakciókat elsődleges ellenanyagként adtam a cseppblothoz. A blotokat DAB-bal hívtam elő.
20. ábra: Antitest aktivitásának ellenőrzése cseppblotal, ahol az antiszérum, az áteső oldat, a mosó oldat, a TBS/TRITON (pH=8 és pH=9) puffer, és az eluálás alatt szedett öt frakció látható (E1-E5) a festés befejezte után. Az ábrán jól látható, hogy IgG az eluálás alatt szedett 5 frakcióból a 2-4-ben található, míg az átesőben, a mosóban, a TBS/TRITON pH=8 és pH=9-ben, valamint az eluálás 1-ben (E1) nem láttam színreakciót, tehát ezalatt nem jött le jelentős mennyiségű dUTPázra specifikus IgG (20. ábra).
54
Az IgG-t tartalmazó frakciókat töményítettem, és gélre vittem belőle, hogy ellenőrizzem a tisztaságát (21. ábra ).
dUTPáz ref.
IgG
MM
21. ábra: A tisztított IgG SDS gélen. Az ábrán látszik, hogy a tömény IgG nem teljesen tiszta, dUTPáz-tól származó keskeny sáv is látható benne. Ezt azzal magyarázhatjuk, hogy a lúgos elúció alatt a dUTPáz is részlegesen kitekeredhet, így – amennyiben a trimerből nem minden alegység van a gyantához kovalensen konjugálva – az enzim is eluálódhat az oszlopról. A kinyert antitest koncentrációja 6 mg/ml lett, Bradford-os módszerrel határoztam meg. Az antitest preparátumot további kísérletekre alkalmasnak találtam, de figyelemmel kell lenni az antigénnel (dUTPáz) való szennyezettségére.
55
4. 4. A dUTPáz fiziológiás formáinak izolálása S2 extraktból a tisztított antitest felhasználásával A továbbiakban S2 sejtekből szerettem volna a dUTPáz két – a korábbiakban bemutatott (lásd az Irodalmi áttekintés című fejezetben 5. ábra) - izoformáját izolálni immunaffinitás kromatográfiával. Ezért 1,5 mg tisztított IgG-t immobilizáltam CNBr aktivált Sepharose-on. Az immobilizálás sikerét mutatja a 22. ábrán látható, a gyantára kikötődött IgG.
Immob. Immob. MM előtt után
22. ábra: Az immobilizálás előtti és utáni IgG a második ellenanyagos eljárás befejeztével. A gyantát S2 extrakttal inkubáltam 2 órán át szobahőmérsékleten, majd oszlopba töltöttem. Az eluálás során frakciókat szedtem az S2 átesőből, a mosó pufferből, a TBS-ből (pH=8 és pH=9), valamint a TEA pufferből. Az átesőből és az eredeti extraktból Western blotot készítettem, hogy ellenőrizzem a dUTPáz kötődését az immunoaffinitás oszlophoz (23. ábra).
56
IgG IgG imm.e imm.u
S2 áteső
S2 extr.
23. ábra: A Western blot során az S2 sejtextraktból a dUTPáz kikötődött az antitesthez, így az S2 áteső frakcióban már nem látható dUTPáz csík. Az ábrán látható még az immobilizálás előtti és utáni IgG. Az eluált frakciókat illékony pufferben ammónium-acetátban dializáltam 1,5 órán át. Ezután a dializált mintákat –20 °C-on lefagyasztottam, liofilizáltam, hogy utána gélre vihessem őket. A 23. ábrán látható, hogy az IgG oszlopon sikerült a dUTPáz mindkét izoformáját kvantitatív módon megkötni, ugyanis ezek nem jelennek meg az áteső frakcióban. Nem sikerült viszont a megkötött dUTPázt az IgG oszlopról eluálni, hiába alkalmaztam különböző mosási eljárásokat. Így ezzel az eljárással nem tudtam tömegspektrometriás fehérje azonosításhoz alkalmas mintákat preparálni. A kudarc oka feltehetőleg az S2 extrakt alacsony dUTPáz tartalma volt. A kísérlet esetleges későbbi megismétlésénél nagyobb mennyiségű dUTPázt tartalmazó sejtextrakttal kell majd dolgozni.
57
4. 5. A dUTPáz kötő fehérjék kimutatása Drosophila mintákon far Western analízissel A felhasznált módszerek fejezetben részletesen leírtam a far Western technikák elméleti hátterét és korlátait is. A laborban végzett előzetes kutatás a dUTPáznak több sejtbeli fehérjepartnerét is előrejelezte, melyek azonosítása jelenleg is folyik. Szükség van azonban egy olyan módszer kidolgozására, amivel könnyen és gyorsan detektálhatók ezen fehérjék a különböző fejlődési ill. fiziológiás állapotot képviselő kis mennyiségű Drosophila és később humán mintákban. Ezért igyekeztem minél inkább legyőzni a módszer korlátait. A módszer beállítása során mérlegeltem a tisztított antitest lehetséges előnyeit ill. hátrányait az antiszérumhoz képest: A tisztított antitest specifikusabb, de kevésbé reaktív, mint az antiszérum. Sajnos az általam affinitás tisztított antitest szennyezett az antigénnel, ami azt eredményezheti, hogy a negatív kontrollként alkalmazott Western bloton is megjelenhetnek a dUTPáz kötő fehérjéktől származó csíkok. Ezért először mindkét ellenanyagot kipróbáltam párhuzamosan ugyanazokon a mintákon. A tisztított antitest erősen csökkent reaktivitása miatt bizonyult kevésbé hatékonynak. Ezért az antiszérum mellett döntöttem, aminek kisebb specificitása miatt esetleg megjelenő aspecifikus jelek kiszűrhetők, ha minden esetben végzek Western blotot is ugyanazokon a mintákon kontrollként. Továbbá fontos tapasztalat, hogy a membránokat nem szabad kiszáradni hagyni. A kiszáradás az antigén dUTPáz detektálását nem veszélyezteti, de a kötődő partnerekét igen. Arról is meggyőződtem, hogy szükséges az érzékenyebb kemilumineszcens detektálási módot alkalmazni ahhoz, hogy a blottolás körülményei közt részben kitekeredett, ezért a dUTPázhoz csökkent affinitással kötődő fehérjéket ki tudjak mutatni. A 24. ábrán látható, hogy far Western előhívással kapott képen az embrió és lárva mintájánál egy, a dUTPázzal nem egyező helyen jelentkező intenzív csík (nyíllal jelzett) is megfigyelhető. Ez arra utal, hogy sikerült mind embrió és lárva fejlődési stádiumban lévő sejtextraktokban legalább egy olyan fehérjét detektálni, amely a dUTPázhoz kapcsolódik és a far Western bloton dUTPáz kötése révén azonosítható. Érdekes megjegyezni, hogy ez az azonosított fehérje 60 kDa körül jelentkezik SDS gélen, ami megegyezik a korábban Drosophilában dUTPáz inhibitorként
58
kimutatott fehérje látszólagos molekulatömegével, amiről azt is állították, hogy expressziója az első lárva stádium elején kapcsolódik be (Nation et al., 1989). Továbbá több kevésbé intenzív, de egyértelműen specifikus jel is látszik az embrionális extraktban (fekete ponttal jelzettek). Azt is jól láthatjuk, hogy fejlődési állapottól is függ a kölcsönható fehérjék mintázata, ami a továbbiakban megalapozza egyrészt más fejlődési stádiumú, másrészt különböző behatásoknak kitett ill. kezelt mintákon tervezett kísérleteimet is.
S2 E 1L
S2 E 1L
Western
far Western
24. ábra: Western és far Western blot S2 sejt-, embrionális valamint 1. lárva extraktokon.
59
4. 6. A dUTPáz expressziós szintjének vizsgálata S2 sejtekben A dUTPáz DNS replikációhoz kötött expresszióját a humán enzim nukleáris izoformája esetén igazolták (Ladner and Caradonna, 1997). Az S2 sejtvonal heterogén volta megnehezíti a sejtciklus állapotainak elkülönítését, ezért csak két alapvető sejtállapotban, logaritmikus fejlődési szakaszban lévő sejteken, illetve túlnőtt sejtpopuláción folytattam vizsgálatokat.
M
d UTPá z G1
G2
G0
S
25. ábra: A sejtciklus, ahol G0 nyugalmi fázist, G1 és G2 növekedő stádiumot, S a szintézis (DNS replikáció), M pedig a mitózis fázisát jelöli. A külső körív a dUTPáz feltételezett megjelenését jelöli. A logaritmikus osztódási fázisban lévő sejtek a 25. ábrán vázolt körben forognak, de ha a táptalaj kimerül, akkor a sejtek kilépnek a ciklusból az úgynevezett G0 fázisba. Mikroszkópos vizsgálatokban az ilyen túlnőtt sejtpopulációban jelentős mennyiségű apoptotizáló sejt is detektálható.
60
A kísérlet során aktívan osztódó és túlnőtt S2 sejteket szüreteltem. Mindkét esetben végeztem sejtszámlálást, így összehasonlítható mennyiségű fehérje tartalmú mintát tudtam gélre vinni, és blottolni. A mintákon végzett Western blot (26. ábra) egyértelműen mutatja, hogy míg az aktívan osztódó, ciklusban forgó sejtek dUTPáz tartalma jelentős, addig a túlnőtt apoptotizáló sejtekben dUTPáz alig illetve nem található. Megállapítottam, hogy a dUTPáz enzim mindkét izoformája egyaránt sejtciklus-függő szabályozás alatt áll. Ez a megfigyelés éles ellentétben van a humán enzimnél tapasztaltakkal, ahol csak a nukleáris dUTPáz izoforma expressziója sejtciklus-függő, a mitokondriális izoforma konstitutív jelenlétet mutat (Ladner and Caradonna, 1997). Ez az ellentét nagy valószínűséggel összefügg azzal, hogy a Drosophila dUTPáz izoformák közül egyik sem mutat mitokondriális lokalizációs szignált. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az ecetmuslicában nincs konstitutív jelenléttel jellemezhető, a mitokondriális DNS replikáció sejtciklus-független volta által igényelt mitokondriális dUTPáz izoforma.
1
2
26. ábra:Western blot szaporodó (1) és túlnőtt (2) S2 sejtek esetén.
61
4. 7. Fehérjék detektálása immunobloton blokkoló lépés nélkül Immunkölcsönhatáson alapuló fehérje detekciót leíró protokollokban az első lépés a membrán blokkolása, mellyel a nem specifikus antitestek kötődését akadályozzák meg, valamint maximalizálják a jel-zaj arányt. Az általános blokkoló periódus 1 órától az egész éjszakán keresztül tartó tartományon belül váltakozhat. A blokkolásra sokféle közeg alkalmas, úgymint BSA, zsírszegény tej, preimmun szérum, ionmentes detergensek stb (Stott, D. I., 1989). Kihasználva a PVDF membrán hidrofób felszínét, egy új immundetekciós eljárást dolgoztak ki, amely kiküszöböli a blokkoló lépést, valamint az immunreagensek feleslegének az eltávolításához szükséges mosások számát és időtartamát. Az új eljárás azon alapul, hogy a blottolás után a membrán azon területei ahova nem kötődtek fehérjék (antigének) hidrofób állapotban maradnak, megakadályozva ezzel, hogy a víztartalmú antitest oldatok, reagensek a membrán mikropórusaiba bejussanak. Így az antigénekkel kölcsönhatást nem kialakító antitestek oldata egyszerűbben és gyorsabban eltávolítható a membrán felszínéről. Nitrocellulóz membránon ez a gyors eljárás azért nem működik, mert a membrán gyártásához használt felületaktív anyagok lehetővé teszik víztartalmú pufferek behatolását a membrán pórusaiba. Mivel a szakirodalomban leírt protokoll humán fehérje detektálására vonatkozik, így szükséges volt a módszer lehetőségeit megvizsgálni ecetmuslica sejtvonalon, -majd a következtetéseket levonva-, fonalas férgek vad típusain. A továbbiakban az egyes lépések optimalizálása érdekében végzett kísérleteimet írom le.
62
4. 7. 1. A PVDF membrán szárítása A gélről a PVDF membránra végrehajtott elektrotranszfer után a blotot Ponceau reagenssel kezelve a megkötődött fehérjék láthatóvá válnak. Mielőtt azonban a membránt antitestekkel inkubálnánk, hagynunk kell alaposan kiszáradni. Ez azért szükséges, hogy az összes folyadék elpárologjon a membrán pórusaiból. Ha nedves marad a blot, akkor folyadék reked a pórusokban és az inkubálások során a membrán átnedvesedik, az pedig megnöveli a háttérfestődést. A protokoll a következő lehetőségeket kínálja a blot szárítására: 1. Merítsük a blotot 100%-os metanolba 10 másodpercig, majd várjunk 15 percet amíg a pórusokból a folyadék a metanollal együtt elpárolog. 2. Helyezzük a blotot vákuumkamrába és tartsuk ott 30 percen keresztül. 3. Inkubáljuk a blotot 1 órán keresztül 37 °C-on. 4. Helyezzük a blotot egy laborasztalra és hagyjuk ott 2 órán keresztül szobahőmérsékleten megszáradni. A második esetet vákuumkamra hiányában nem tanulmányoztam. Az első és az utolsó eljárás alkalmazása során pedig egyszer sem sikerült a membránt maradéktalanul folyadékmentesíteni. Így az inkubálások során a membrán mindannyiszor átnedvesedett, ezért röntgenfilmen nem sikerült értékelhető eredményt rögzítenem. A második módszer megfelelőnek bizonyult, de még ennél is gyorsabb volt, ha egyszerűen hajszárítóval (alacsony fokozaton) megszárítottam a blotot. Gyakran jártam el oly módon is, hogy hagytam szobahőmérsékleten éjszakán át kiszáradni a blotot és csak másnap végeztem el az immunreakciókat illetve a detektálást. A fehérjék nem károsodtak, sőt a kiszárított membrán több napon át 4 °C-os hűtőben tárolható és utána is elvégezhető az immunodetektálás.
63
4. 7. 2. Western blot PBS oldattal Kiindulási esetben a nitrocellulóz membránnal végzett kísérletek során az ellenanyagokkal történő inkubálásokat TBS blokkoló pufferben és 0,1% TWEEN-t tartalmazó TBS/TWEEN oldatban hajtottam végre. PVDF membrán esetén az irodalomban PBS blokkoló puffer illetve 0,05% TWEEN-tartalmú PBS/TWEEN oldatokat használtak. Ezzel a detergens koncentrációval érték el a legjobb szenzitivitást. Azt tapasztalták, hogy a 0,01%-nál kisebb koncentráció csökkentette a szenzitivitást, míg a 0,05%-nál nagyobb koncentráció a membrán átnedvesedését okozta (Millipore-Technical Library, 2004). Az általam végzett kísérlet - a fentieket figyelembe véve - abból állt, hogy az immunreakcókat elvégeztem TBS/TWEEN illetve a PBS/TWEEN oldatban is, 0,05% valamint 0,025% TWEEN koncentrációk mellett.
64
LD LD dUTPáz dUTPáz 0,05% 0,025%
A
LD LD dUTPáz dUTPáz 0,025% 0,05%
B
27. ábra:Western blot Drosophila dUTPáz hosszú izoformája(LD dUTP) esetén,ahol MM: molekula marker. A: 0,05% és 0,025% TWEEN-t tartalmazó PBS oldattal detektált fehérjék. B: 0,05% és 0,025% TWEEN-t tartalmazó TBS oldattal detektált fehérjék.
Az eredményen látható, hogy a PBS/TWEEN oldattal végzett előhívásnál jóval kisebb a háttérfestődés, mint TBS/TWEEN esetén, illetve a jelek intenzitása erősebb (27. ábra). A dUTPáz alatti sok csík valószínűleg degradált termék, ezért azokon a helyeken a festődés nem jelenti a specificitás csökkenését. A detergens koncenrációját illetően az ábra is mutatja, hogy a 0,025%-os TWEEN koncentráció is elegendő az inkubálásokhoz, mivel a szenzitivitás nem csökkent a 0,05%-os koncentrációéhoz képest. PBS puffernél 0,025% TWEEN esetén a háttérfestődés is kisebb, így a további kísérletekben PBS oldatot használtam 0,025%-os TWEEN koncentrációval.
65
4. 7. 3. Blokkoló közeg az antitest oldatban Annak ellenére, hogy a blokkoló lépést kihagyjuk, a Western blot eljárásból az inkubálások során használt oldat mégis tartalmaz blokkoló közeget. Ha nem adunk blokkkoló közeget az antitestet tartalmazó oldathoz, akkor túl nagy lesz a háttérfestődés az eredményen. Sokfajta blokkoló közeg létezik, amint már A felhasznált módszerek című fejezetben is említettem. A nitrocellulóz membránnal végzett Western blothoz BSA-t (Bovine Serum Albumine) illetve sovány tejport egyaránt használtam 5%-os koncentrációban. PVDF membrán esetén minimum 1% BSA jelenlétét írja elő a protokoll.
E 1L Sovány tejpor
E
1L BSA 66
28. ábra: Western blot különböző fejlődési állapotú Drosophila mintákon, ahol E: embriót, 1L: 1. stádiumban lévő lárvát jelent. A bal oldali ábra a sovány tejporral, a jobb oldali a BSA-val végzett Western blot eredménye. Embrió és lárva stádiumban lévő Drosophila mintákon teszteltem, hogy mennyi az a legkisebb sovány tejpor valamint BSA koncentráció, amely a Western blot érzékenységét nem befolyásolja negatívan, és nem okoz nagy hátteret az előhívásnál. Az ábra is azt mutatja, hogy a 2%-os koncentráció esetén a dUTPáz enzim izoformái jól láthatóak, így ez bizonyult a legkisebb, de a detektálás szenzitivitását még nem zavaró blokkoló közeg koncentrációnak (28. ábra). Az is jól látható, hogy a sovány tejporral kapott eredmény kisebb háttérfestődést mutat, ezért a továbbiakban - a gazdaságosságot is szem előtt tartva – tejport használtam.
67
4. 7. 4. Far Western blot rövid protokollal Az eddig elvégzett kísérletek azt bizonyították, hogy a Western blot eljárás sikeres blokkoló lépés nélkül is. Ez fontos, hiszen az antigénnel kölcsönható fehérjék detektálásánál a Western blot kontrollként használható. A következő lépésben így megvizsgáltam, hogy alkalmazható-e a rövid protokoll far Western eljárásnál is. A kísérlet során a blotokat – a blokkoló lépést elhagyva- 1 órán át inkubáltam dUTPázzal. A mintákat kétféle koncentrációban vizsgáltam, azaz 25 μg/ml-es és 50 μg/ml-es dUTPáz oldatokkal is végrehajtottam az inkubálásokat. Azt feltételeztem, ha nagyobb koncentrációban van jelen a dUTPáz, akkor nagyobb valószínűséggel jön létre komplexképzõdés a vele kölcsönható fehérjékkel.
68
Eúj Erégi Eúj Erégi Eúj Erégi 25 μg/ml 50 μg/ml W
29. ábra: FarWestern blot 25 és 50 μg/ml-es dUTPázzal inkubált Drosophila mintákon,valamint a kontrollként használt Western blot. Eúj: frissen feltárt embrió extrakt, Erégi: korábban feltárt embrió extrakt, W: Western blotot jelent. Az ábrán látható, hogy nem különbözik egymástól az előhívás után kapott két far Western eredmény, annak ellenére, hogy az egyik esetben nagyobb koncentrációjú antigén oldatot használtam (29. ábra). Az is leolvasható az ábráról, hogy a Western blot-hoz képest a dUTPáztól eltérő fehérjétől származó specifikus jel sem látható az embrionális mintákban, jóllehet ezt korábbi kísérleteim alapján elvártam.
69
1L E FW 25 μg/ml
1L E FW 50 μg/ml
1L
E W
30. ábra: FarWestern blot 25 és 50 μg/ml-es dUTPázzal inkubált különböző fejlődési állapotú Drosophila mintákon, valamint a kontrollként használt Western blot. 1L: 1. stádiumban lévő lárva extraktot, E: embrió extraktot, FW: far Western blotot W: Western blotot jelent. A korábban azonosított, a dUTPázzal nem egyező, 60 kDA körül jelentkező fehérjecsík egyáltalán nem azonosítható a fenti eredményen, és egyéb jel sem látható, sem a lárva, sem az embrió extraktban (30. ábra). A kontrollon előhívott jelek láthatók csak a far Western mintákban is. Összességében megállapítható tehát, hogy far Western analízisre a rövid protokoll nem alkalmas Drosophila minták esetében. Az immunblot elveszíti érzékenységét, hiszen a túl rövid ideig tartó mosások illetve a blokkoló lépés elhagyása túl nagy hátteret eredményeznek, így a kölcsönható fehérjéktől származó nem túl erős, specifikus jelek valószínűleg beleolvadnak a nagy háttérbe.
4. 7. 5. A Western blot módszer végleges formája PVDF membránra
70
Az elvégzett kísérletek azt támasztották alá tehát, hogy a blokkoló lépés elhagyása és az antitest oldatok feleslegének eltávolítására szolgáló mosások lényeges lecsökkentése zavarja a Western és főként a far Western módszer szenzitivitását. Így nem sikerült az eddig alkalmazott eljárásnál gyorsabbat találnom. A PVDF membrán hidrofóbicitását tekintve azonban alkalmasabbnak tűnt az immunblotra, mint a nitrocellulóz membrán, ezért a korábbi módszert – amely blokkoló lépést is tartalmazott kipróbáltam PVDF membránon is. Annyit azonban változtattam, hogy a sovány tejpor (blokkoló közeg) és a TWEEN (detergens) koncentrációját a rövid protokollnál bevált értékre csökkentettem, valamint TBS helyett PBS oldattal dolgoztam. A rövid eljárás után kapott blotokon olyan nagy volt a háttérfestődés, hogy az egyes mintákból származó fehérje csíkok teljesen összemosódtak, a mintákat alig lehetett elkülöníteni egymástól. A másik módszerrel a detektált fehérjéket és a dUTPáz enzimet jól meg lehetett különböztetni, illetve az eredmények könnyen elemezhetők voltak. Elmondhatjuk tehát, hogy maga a PVDF membrán alkalmas immunreakciók detektálására, de a blokkoló lépés nem hagyható ki az eljárásból. A továbbiakban a hosszú protokollt alkalmaztam (lásd. A felhasznált módszerek című fejezet Western blot-ról szóló részében) a PVDF membránra vonatkozó változásokkal.
4. 8. Fonalas férgekből származó sejtextrakt keresztreakciója Drosophila dUTPáz ellen termelt antiszérummal
71
A mintául használt Trichinella spiralis és Caenorhabditis elegans fonalas férgek dUTPáza terápiás és szerkezeti szempontból is rendkívül érdekes. A C. elegans az apoptózis kísérletek egyik legfontosabb modellszervezete. A C. elegans-sal rokon T. spiralis fonalféreg patológiai jelentősége miatt került a vizsgálandó szervezetek közé: ez a fonalféreg felelős a bélcsatorna fertőzések jelentős részéért. Az állatok nyugalmi állapotában is magas a timidilát metabolizmus, ami azt jelenti, hogy a dUTPáz enzim aktivitása is igen magas (Rode et al., 2000). Így dUTPázuk célpont lehet a timidilát bioszintézis út specifikus gátlásában (lásd. Irodalmi áttekintés című fejezet 4. ábra). A férgekben a dUTPáz nem egy korábbi fejezetben bemutatott Drosophila, E. coli, és humán enzimhez hasonló homotrimer szerkezetű fehérje. A C. elegans ismert genomi szekvenciája alapján tudjuk, hogy a dUTPáz monomerre jellemző szekvencia háromszor egymás után szerepel a génben stop kodon nélkül, vagyis a C. elegans genomban a dut gén policisztronos gén. Ez alapján két lehetőséget valószínűsíthetünk: az enzimfehérje kovalens trimer vagy poszttranszlációs proteolízissel létrejövő trimer. A kovalens trimer esetleg kínálhat olyan fehérjefelszíni különbségeket, melyeket a férgeknél specifikusan támadhatunk dUTPázra irányított terápiával. Western bloton sikerült Drosophila dUTPáz ellen termelt antiszérummal a trimer molekulatömegnél fehérjét detektálnom mind a C.elegans, mind a T. spiralis esetében (31. ábra). Ez az eredmény arra utal, hogy mindkét fonalféreg dUTPáz enzime egyetlen polipeptid láncból áll. Ez a polipeptid lánc a C.elegans esetén ismert policisztronos gén átírását követően jön létre, háromszorosan ismétlődve tartalmazza a monomer dUTPázokra jellemző szekvenciát.
72
66 kDa 45 kDa
20,1 kDa
CE
TS
SD dUTP
31. ábra: Western blot fonalas féreg sejtextrakton és Drosophila dUTPázon , ahol CE:Caenorhabditis elegans, TS: Trichinella spiralis, SD dUTP: Drossophila dUTPáz rövid izoformája.
4. 9. A C. elegans dUTPáz enzim homológia modellezése 73
A C. elegans és a humán dUTPáz szekvenciák között nagyfokú a hasonlóság (v. ö. alább összerendezett fehérjeszekvenciák). Ezt kihasználva, a humán enzim kristályszerkezetének ismeretében megkíséreltem a C. Elegans dUTPáz homológia modellezését. A modellezéshez a Swiss-PdbViewer program szoftverét használtam (Guex, N. and Peitsch, M.C., 1997). A C. elegans ismert genomja alapján a várható szekvencia a következő: >C. elegans genomiális dUTPáz szekvencia MTLTVAAPCVQTVTEPSKMEMQAESTSHITIRFTEMVGDAQKPTYGSISSAGADLYSAEDVVVPANGKLCV STGLQIELPIGYYGRVAPRSGLAAKHFIDVGAGVIDSDYRGEVKVLLFNFNTTAFEVKTGDRIAKLICEQIGN GTYEEVKSLPSTNRGAGGFGSTGESTMNSETANPATNLERITVRFTQLNENAQTPTYGSEEAAGADLYSAE DITVPAHGKCCVSTGIQMELPFGYYGRVAPRSGLAAKHFIDVGAGVIDSDYRGEVKVLLFNFTDNAFEVKK GDRIAQLICEKIGHCVYEAASELENTDRGAGGFGSTGQNTMEAEPALKKSKTEQIKTSATSVTIQITKSNDN AQMPTYGSAEAAGADLYSAEDVTVPARGKLCVSTGIQMALPIGYYGRVAPRSGLAAKHFIDVGAGVIDSD YRGEVKVLLFNFGENDFEVKKGDRIAQLVCEQIALCTYSKVESLEVTERGAGGFGSTGQYITL
A humán dUTPáz szekvencia: >humán dUTPáz szekvencia konzervált része (3X ismételve) EVGGMQLRFARLSEHATAPTRGSARAAGYDLYSAYDYTIPPMEKAVVKTDIQIALPSGCYGRVAPRSGLAA KHFIDVGAGVIDEDYRGNVGVVLFNFGKEKFEVKKGDRIAQLICERIFYPEIEEVQALDDTERGSGGFGSTG KN EVGGMQLRFARLSEHATAPTRGSARAAGYDLYSAYDYTIPPMEKAVVKTDIQIALPSGCYGRVAPRSGLAA KHFIDVGAGVIDEDYRGNVGVVLFNFGKEKFEVKKGDRIAQLICERIFYPEIEEVQALDDTERGSGGFGSTG KN EVGGMQLRFARLSEHATAPTRGSARAAGYDLYSAYDYTIPPMEKAVVKTDIQIALPSGCYGRVAPRSGLAA KHFIDVGAGVIDEDYRGNVGVVLFNFGKEKFEVKKGDRIAQLICERIFYPEIEEVQALDDTERGSGGFGSTG KN
A két szekvenciát a ClustalW szoftver (Higgins et al., 1994) segítségével rendeztem össze.
74
C. human
MTLTVAAPCVQTVTEPSKMEMQAESTSHITIRFTEMVGDAQKPTYGSISSAGADLYSAED 60 ------------------------EVGGMQLRFARLSEHATAPTRGSARAAGYDLYSAYD 36 ... : :**:.: .* ** ** :** ***** *
C. human
VVVPANGKLCVSTGLQIELPIGYYGRVAPRSGLAAKHFIDVGAGVIDSDYRGEVKVLLFN 120 YTIPPMEKAVVKTDIQIALPSGCYGRVAPRSGLAAKHFIDVGAGVIDEDYRGNVGVVLFN 96 .:*. * ..:** ** * ************************.****:* *:***
C. human
FNTTAFEVKTGDRIAKLICEQIGNGTYEEVKSLPSTNRGAGGFGSTGESTMNSETANPAT 180 FGKEKFEVKKGDRIAQLICERIFYPEIEEVQALDDTERGSGGFGSTGKNEVG-------- 148 *.. ****.*****:****:* ***::* .*:**:*******:. :.
C. human
NLERITVRFTQLNENAQTPTYGSEEAAGADLYSAEDITVPAHGKCCVSTGIQMELPFGYY 240 ---GMQLRFARLSEHATAPTRGSARAAGYDLYSAYDYTIPPMEKAVVKTDIQIALPSGCY 205 : :**::*.*:* :** ** .*** ***** * :. *. ..**: ** * *
C. human
GRVAPRSGLAAKHFIDVGAGVIDSDYRGEVKVLLFNFTDNAFEVKKGDRIAQLICEKIGH 300 GRVAPRSGLAAKHFIDVGAGVIDEDYRGNVGVVLFNFGKEKFEVKKGDRIAQLICERIFY 265 ***********************.****:* *:**** .: ***************:* :
C. human •
CVYEAASELENTDRGAGGFGSTGQNTMEAEPALKKSKTEQIKTSATSVTIQITKSNDNAQ 360 PEIEEVQALDDTERGSGGFGSTGKN------------------EVGGMQLRFARLSEHAT 307 .. :::**:*******:* .. .: ::::: .::*
C. human
MPTYGSAEAAGADLYSAEDVTVPARGKLCVSTGIQMALPIGYYGRVAPRSGLAAKHFIDV 420 APTRGSARAAGYDLYSAYDYTIPPMEKAVVKTDIQIALPSGCYGRVAPRSGLAAKHFIDV 367 ** ***.*** ***** * :. * ..**:*** * ******************
C. human
GAGVIDSDYRGEVKVLLFNFGENDFEVKKGDRIAQLVCEQIALCTYSKVESLEVTERGAG 480 GAGVIDEDYRGNVGVVLFNFGKEKFEVKKGDRIAQLICERIFYPEIEEVQALDDTERGSG 427 ******.****:* *:*****::.************:**:* .:*::*: ****:*
C. human
GFGSTGQYITL 491 GFGSTGKN--- 435 ******:
Az összerendezett szekvenciákban a sárgán kiemelt peptidek a C. elegans dUTPáz háromszor ismétlődő konzervált szegmensei közötti összekötő kapocs régiók. Kék színnel emeltem ki a konzervált dUTPáz szegmensek 1. ill. 5. konzervált motívumait, melyeket a C. elegans esetén a sárga kapocs régiók kötnek össze. Kapocs 1: ESTMNSETANPATNLER 17 aa Kapocs 2: TMEAEPALKKSKTEQIKTSATS 21 aa A modellezésnél a humán dUTPáz már korábban meghatározott 3D szerkezetéből indultam ki (32. ábra).
75
32. ábra: A humán dUTPáz 3D-s modellje, ahol az aminosavakat az egyes alegységek színe szerint ( piros szín: A monomer, kék szín: B monomer, sárga szín: C monomer ) jelöltem.
76
33. ábra: Baloldali részábrák: A humán dUTPáz A,B és C monomerjének (piros, kék, sárga 3D-s modellje, és a C.elegans genomi szekvenciája alapján beolvasott, fizikai realitást nem mutató α-helixek ( sárga, lila, piros). Jobboldali részábrák: A homológia modellezés eredménye. Látható, hogy a két színnel ábrázolt fehérjeszegmensek peptidláncai jól fedésbe hozhatók (az ábrákon ezért szinte csak az egyik szín jelenik meg ), csak egy-egy oldallánc konformációja tér el.
77
A bal oldali ábrákon a C.elegans dUTPáz aminosav sorrendjének a beolvasása után kapott αhelixek (a program által kiindulásként használt, fizikai realitást nem tükröző állapot), valamint a humán dUTPáz A, B és C monomerjeinek 3D-s szerkezetei láthatók (33.ábra). A program segítségével egymásra illesztettem a C. elegans és a humán szekvenciákat. Ezután homológia modellezéssel a jobb oldali ábrákon található térszerkezeteket kaptam. Az általam kapott alacsony rms értékek jól jellemzik a közeli illeszkedést. Ezek az rms (root-mean-square) értékek azt adják meg, hogy mi az egyes atomi pozíciók eltérése (távolságok négyzeteinek összege). Ez azt jelenti, hogy a humán dUTPáz térszerkezetét és a szekvenciák közötti nagyfokú homológiát kihasználva, megkaptuk a C. elegans 3D-s szerkezeti modelljét. .
34. ábra: A C.elegans dUTPáz 3D-s szerkezeti modellje.
78
A 34. ábrán már a C.elegans dUTPázának a 3D-s modellje látható, de a három humán monomernek megfelelően színeztem az egyes alegységeket, ezzel is jelezve, hogy melyik humán monomer térszerkezete alapján készült. A modellből a kapocs régiók hiányoznak, ezekre nézve nem kaphattam semmilyen szerkezetet a humán enzimből kiindulva, hiszen ezek a humán enzimből hiányoznak. A megfelelő amino-és karboxiterminálisok közötti távolság az első és a második ismétlődés esetén: 27,51 angström, a második és a harmadik ismetlődő szekvencia esetén: 21,59. Ezen távolság áthidalására a kapocs régiókban rendelkezésre álló 17 ill. 21 aminosav elegendő hosszúságú peptidszegmenst tud biztosítani.
79
5. Eredmények összefoglalása
1. Drosophila embriókban és lárvákban dUTPáz enzimmel kölcsönható fehérjepartnereket sikerült kimutatnom far Western módszer alkalmazásával.
2. A különböző fejlődési stádiumokban (embrió és lárva) a dUTPázzal kölcsönható fehérjék mintázata eltérő.
3. Megállapítottam, hogy a dUTPáz expressziója Drosophilában is sejtciklustól függő.
4. Antiszérumból sikerült dUTPázzal specifikus reakciót mutató antitestet kinyernem, és ezt további vizsgálatokban felhasználnom.
5. Meghatároztam a PVDF membrán használatának optimális blottolási paramétereit.
6. Kimutattam, hogy a C.elegans és T.spiralis fonalférgek dUTPázai a kovalens trimernek megfelelő hosszúságú polipeptid lánccal rendelkeznek. Nem találtam poszttranszlációs sejtbeli proteolízisükre utaló jelet. 7. Homológia modellezéssel alátámasztottam a kovalens trimer feltekeredésének lehetőségét.
80
Irodalomjegyzék: Bernier-Villamor, A., Camacho, A., González-Pacanowska, D., Cedergren-Zeppezauer, E., Antson, A., Wilson, K. S.(1999) Crystallisation and preliminary X-ray diffraction of Trypanosoma cruzi dUTPase. Acta Crystallogr., D55, 528-530.
81
