Fakultas Kedokteran Universitas Jember Jl. Kalimantan 37 Jember

LAPO� AKHIR PENELITIAN

Potensi Genistein dalam Meningkatkan Kemampuan Diferensiasi dan Proliferasi Mesenchymal Stem Cells

(MSCs) melalui Penghambatan Jalur Apoptosis (Studi pada Kultur MSCs Kondisi Hipoksia)

Nama Penyusun Laporan: Candra Bumi Heni Fatmawati Nindya Shinta

Fakultas Kedokteran Universitas Jember Jl. Kalimantan 37 Jember 2012

i •

t

la: .\lENTLR lA '\ l'.l·:S E H ATA "\'

B \1.> \ ·< l'l "-! j IT, \:-. ll \'\. t '1"1..\tl \1(). \ Sc ·.'\:'-. Ki:'
1

I.

t •);.

,_

I

'.i.l

I' 1n ·--.r:·

• t \�1��---. ·.

• �.�

•

�

i•

.

\ '

'\

I'

l,,!�I'IRioh to(;�f';.JJTllo'��tl fi�Oi,;,.\- e.a.�'lh.!l
PI \• I

l �

·•.:.,.

),'.I:,!

.... ..

--.�. ,t,

,P,

(

JUllll.,� ISE l

''I,

tll,.�\J,�_:::

·.•·.;-._

·

•.: · ,


"

�

..._,._ '00 4 '

,.,, l '· • ·.t��-.-. ,,_�'..1' , •:••\:.ol' --��-· ...;. ......-.,-�.. ..

'..-('<Mo.�I- ·.•·� . ol :· ••� o

, ..

.

-- . �:.; " .....�..;. ;�

.''1.•r. 16o ·, ,-....,_ • ·-:r;y�:

:.._..�-"\�·-.��"• '!>.-.•

.:-·e,�"'·ii . ...,.- !>�_. ,,.__.w.�- �! •.�.· ·:1'1"-1-- t_t'(·.':::oi:.- �,... ..;(,. , ··�-���-·-� "·-·� .• ._l�ll.',-,.� . t1..,;l. I''•'' ;I(,;�o'/(?'-'' \� �· : l · ·,.,jO ,• 1 -�. ... 1.,1�::.:·�-- .;:·�_. ..:;.• ,.·vt- :..... . .... . ,.-

floi., •-·r;\·

. ·.,....� ..

� 't! • �"V'."'

'

. .. �·· .

11 •

.

t

Ill

•

LEMBAR PENGESAHAN PENELITIAN RISBIN IPTEKDOK

1. Judul

: Potensi Genistein dalam Meningkatkan Kemampuan Diferensiasi dan Proliferasi Mesenchymal Stem Cells (MSCs) melalui Penghambatan Jalur Apoptosis (Studi pada Kultur MSCs Kondisi Hipoksia).

2. Ketua Peneliti 2.1 Data Pribadi a. Nama Lengkap b. Jenis Kelamin c. NIP/Golongan d. Srata/Jab. Fungsional e. Jabatan Struktural f. Fakultas/Jurusan g. Bidang Ilmu h. Alamat Kantor i. Telepon/Faks!E-mail J. Alamat Rumah 3. a. b. c.

: dr. Candra Bumi, MSi : Pria : 197406082008011012/IIlb :Kesehatan Masyarakat :Imunologi dan Epidemiologi :Jl. Kalimantan 1193 :0331 7891500/[email protected] :Perum. Taman Gading LL-20 Jember

Jumlah Anggota Peneliti : dr. Heni Fatmawati, Mkes Nama Anggota I :dr. Nindya Shinta, MKed Nama Anggota ll Nama Anggota III

: Laboratorium liD Universitas Unair 4. Lokasi Penelitian 5. Jangka Waktu Penelitian :6 Bulan

Jember, 8 Februari 2012 Ketua Peneliti,

dr. Candra Bumi, MSi NIP.197406082008011012

31 • ,

I<EMENTERIAN PEN DIDIKAN NASIONAL UNIVERSIT A S JEMBE R FAI(ULTAS KEDOKTERAN Jl. Kalimantan 37 Kampus Tegalboto Telp. (0331) 337877 Jember 68121 E-Mail: [email protected]

Surat Pernyataan

Saya yang bertanda tangan di bawah ini: Nama Lengkap

: Candra Bumi

Nomor lnduk Pegawai

:197406082008011012

Asal lnstansi

: Fakultas Kesehatan Masyarakat Universitas Jember

Judul Penelitian

: Potensi Genistein dalam Meningkatkan Kemampuan

Diferensiasi dan Proliferasi Mesenchymal Stem Cefls (MSCs) pada lnfark Miokard melalui Penghambatan

Jalur Apoptosis (Studi pada Kultur MSCs Kondisi Hipoksia) Dengan

ini

menyatakan

'

kesanggupan

penelitian

menyelesaikan

untuk

Riset

Pembinaan llmu Pengetahuan dan Teknologi Kedokteran yang telah dilakukan pada tahun 2011, sesuai dengan Surat Perjanjian Kerjasama yang ditandatangani pada tahun 2011 (penPiitian tahun ke-1) Apabila

dikemudian

hari,

Saya

tidak

dapat

menyelesaikan

penelitian

seperti

ketentuan tersebut di atas, maka segala akibat yang timbul dari penelitian tersebut menjadi tanggung jawab Saya sepenuhnya dan seluruh biaya penelitian yang telah diterima

akan saya

kembalikan

kepada Badan

Penelitian dan

Pengembangan

Kesehatan. Demikian Surat Pernyataan ini Saya buat tanpa ada paksaan dan untuk dapat dipergunakan sebagaimana semestinya.

Jember, 16 Januari 2012 Yang membuat pernyataan,

'\\E.· rr�\J '

I I

0 •

ti, M.Kes 14199903.7()0

�r L

(- 'A.-'.

''*rtj(J

':.�_(

>\. ·;;; · '· ��06}�.� ?----D OEAAF9 �2273& ... l't iJ.!J Ktr n•�H '

((G(OfiD f�.\. \

dr. Candra Bumi, MSi NIP. 197406082008011012

KATA PENGANTAR

Dengan memanjatkan segala puji syukur kepada Allah SWT, atas limpahan rahmat dan hidayah-Nya tim peneliti dapat menyelesaikan penelitian dan laporan hasil penelitian tahap II yang be�udul : Potensi Genistein dalam Meningkatkan Kemampuan Diferensiasi dan Proliferasi Mesenchymal Stem Cells (MSCs) melalui Penghambatan Jalur Apoptosis (Studi pada Kultur MSCs Kondisi Hipoksia). Kami atas nama tim peneliti bemarap mudah - mudahan hasil penelitian berguna dan bermanfaat baik untuk pengembangan ilmu dan teknologi pada umumnya dan khususnya ilmu dan teknologi dalam bidang kedokteran. Kami sadar bahwa penelitian kami masih terdapat kekurangan. Oleh karena itu peneliti mengharapkan melalui laporan penelitian ini, para pembaca dapat memberikan saran yang membangun demi perbaikan penulisan hasil penelitian tersebut.

Jember,

Februari 2012

Ketua Penelitf, dr. Candra Bumi, MSi

•

IV t

DAFTAR lSI

halaman SA MPU L DA LAM

· ................. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . ................. ..........

..

i

SK PENELITI ......................................................... :.......................................... II LEMBAR PENGESAHAN KATA PENGANTAR . ..

DAFTAR 151

....

RINGKASAN

ABSTRAK

. ..

......

. . .. . ..

.

......

. ..

. ..

. . ...

.. . .. .

......... . . . . . . . . . . . . . .

..

..

..

.. .. .

.

.

.

.. .

.

.

. . ..

..

.

.

.

...

...... . . . . . . . . . . . . . . .

DAFTAR GAMBAR . ..

....

DAFTAR LAMPIRAN

.

..... . . . . .

.....

.

.

. . .. ..

..........

..

..

.

...

.....

..

.

..

...

........

.

.

.. .

........

.

.

.

..

.

..........

.

..........

...

. . . ...

.....

.

.

..

...

.

. . . . . .. . . . .. . . . . . . . . . . .

...

. .. .

.

. ... . . . ..

.

. . . . . . . . . . . .. .

..

.

.. ... . .

.......... . . . . . . . . . .

.

.

. . . . . . . . . .. . .

.

. . . . . . . . . .......

DAFTAR ANGGOTA TIM PENELITI DAFTAR TABEL . .

... . . . . . . . . . . . . . . .

. .

........

............. . . . . . . . . . . .........

.

.. . . . . ..

. . ..

.......

..

...

....

.. .

. ..

.

.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

..............

. . ..

. ..

. iii .

.. iv

, ... . . . . . . .. . . ......... v

.. . . . .

.

. . . . . . . . . . . .. . ..

.. .

. ..

.

.....

.......

.....................

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .............. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

.......

....... . . . . . . . . . . . .

.. . .

. . .

..

...

..

.

.

.

.

.............

.....

.

........

. . . ........................

..

....

.

................

..

.

........

............

vii

viii ix x

. xi .

..

xii

I. PENDAHULUAN .......................................................................................... . . 1

1.1 Latar Belakang

.........

1 .2 Rumusan Masalah

.

....

.....

II. TUJUAN PENELITIAN

.

.........

..

........

.. .

..

..... . . . . . . . . . . .

..

..

..

.

.....................

.

.. . . . . . . . . ......

............. . . . . . . . . . . . . . . .

.

.

...

. . ...

.. ....................... . .

.. .

..........

............

.

. ·. . . .

.

.

.......

.....

. .. .

.. .. . .....

.

. ......

.

. . . . . . .. .. .

.

.......

.

..

1

.

.3 .

4

2.1 Tujuan Umum ......................... .................................................................... .4 2.2 Tujuan Khusus

...

.

..............

..

. . . . . . . . . . . . .......... . . . . . . . . . . . . . . .

. .. ...

.

.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

.

.

..

.4

2.3 Manfaat Riset. ...................................... ....................................................... . 4 2.4 Hipotesis Riset ..................., ... . . ................................................................... . 4 III.BAHAN DAN METODE PENEUTIAN

3.1 Bahan

..........

.

..

............

.

...

.

..

.. .

..

. . . . . .. . . . . . . . · .

......

.

. . . . . . . . . ........ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....... . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

.5

5

.

3.2 Variabel Penelitian ................................................... .......................................5

3.3 Metode Penelitian ....................................................................................... .7 3.4 Diagram Allr Penelltlan

..............

IV.HASIL DAN PEMBAHASAN . . . .

4.1 Hasil Penelitian

.....

.

...

..

.

..

.

.

. . .

..................

. . . . . .. . . . . .

.......... . . . . . . . . . . . . .

4.1.1 Morfologi Kultur MSCs

.......

4.1.2 Pembuatan Model Hipoksia 4.1.3 /dentifikasi Sel MSCs

.

.. . . . .

.

.......

............

..............

.

.

..

.

..

.....

. . . . . . . . ..

.. . .

.

..

......

....

.

.

...

.

...

.

. ....

......

.......................

..

.

..... ....

.

. . .. . . .. .

. ... . .

.

.

..

..

.

9

10

.........

10

_. . . . . .

10

. . . . . . . . . ................. . . . . . . . . . . .

12

.. ....

. . .. . .

.

..

.

. .. . . ... . .. .

............

.

...

.

.

.. . .

.

....

.

. . ..

.

. . . . . ...... ...

..............

.........

.

..

. .

.

.. . . . .

..

.......................

.. . . . . . . . .

.

. ..

13

4.1.4 Viabilitas MSCs pada kondisi hipoksia setelah pemberian genistein dengan mengguna�an MTI assay ............................... ............. 13 4.1.5 Efek pemberian genistein terhadap aktivitas p38 MAPK, Caspase-3, dan Caspase-9 pada kultur MSCs hipoksia

v • ·

t

....

.

.. . . . . . . .

.

. . . . . .. . . . .

15

4.1.6 Efek pemberlan genistein terhadap apoptosis sel pad a kultur MSCs hipoksia....................................................................... 16 4.2. Pembahasan . ..

......

. . . .

.

...

.

. . . . . . . . . . . . . . . .......................

V KESIMPULAN DAN SARAN UCAPAN TERIMA KASIH

DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN

.. .

. . . . . . . . . . . . . . . ..... . . . . . . . . . . . . . . . . . .

............... ......................

. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .

.

.

...

....

.

...

..... .

.

.

.

..

.

....

... . .

...

..

.

.

......

.

.

..

....

.

.......

...

. 18

. . 21 .

..

:........................ ............... 22

........... . . . . . . . . . . . . . . .

.. .

. . . . . . . . . . .. . . . . . . . .

.

..........

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . ..... . . . . . .

VI •

. ..

t

23. 25

RINGKASAN

Candra Bumi, Heni Fatmawati, Nindya Shinta, Potensi Genistein dalam Meningkatkan Kemampuan Diferensiasi dan Proliferasi Mesenchymal Stem Cells (MSCs) melalui Penghambatan Jalur Apoptosis (Studi pada Kultur MSCs Kondisi Hipoksia).

Penyebab utama gagal jantung adalah infark miokard akut. Pada infark otot jantung mengalami iskhemia (hipoksia), peningkatan sekresi sitokin, dan terjadi inflamasi. Terapi sel menggunakan mesenchymal stem cells (MSCs) dari bo ne marrow untuk mengatasi infark mlokard akut telah menunjukkan hasii yang sangat menjanjikan akan tetapi minimnya viabilitas dari terapi ini menjadi terbatas. Hal ini disebabkan kondiksi hipoksia pada saat terapi mampu meningkatkan ROS sehingga MSCs menjadi apoptosis. Genistein merupakan isoflavon yang bersifat antioksidan dan pada dosis rendah mampu sebagai antiapoptosis. Sehingga penelitian ini bertujuan untuk mempelajari peranan

genistein terhadap viabilitas dan derajat apoptosis kultur MSCs dengan kondisi hipoksia dan efektivitas genistein terhadap aktivitas p38MAPK, caspase-3 dan caspase-9 pada kultur MSCs dengan kondisi hipoksia. Hasil p en e litia n menuhjukkan terdapat peningkatan viabilitas MSCs kondisi hipoksia dan penurunan derajat apoptosis MSCs seiring dengan peningkatan dosis genistein (p0,05. Hal lnl menunjukkan bahwa genistein dapat meningkatkan vlabllltas MSCs kondlsl hipoksia dan menurunkan derajat apoptosls MSCs kondlsl hlpoksla. Penurunan derajad apoptosis mungkin merupakan akumulasi hambatan jalur apoptosis yang lain seperti caspase-8, caspase-7 yang pada penelitian kali ini belum dilakukandan juga mungkin melalui hambatan ROS. Penurunan kadar p38MAPK, caspase-3, dan caspase-9 yang tidak signifikan mungkin diakibatkan oleh dosis genistein yang kurang besar. Genistein merupakan salah satu isoflavon yang terdapat pada kedelai. Genistein mempunyai banyak efek diantaranya . adalah efek hormonal karena bersifat sebagai fitoestrogen, anti inflamasi, anti oksidan, dan mempengaruhi proliferasi dari sel. Studi pada sel MCF-7 (Huma n breast

cancer cells) menunjukkan efek bifasik dari genistein yaitu pada konsentrasi rendah memicu pertumbuhan sedangkan pada konsentrasi tinggi menghambat pertumbuhan. Mekanisme yang te�adi untuk menjelaskan peristiwa bifasik tersebut belum sepenuhnya jelas. Penelitian pada sel otot genioglossus didapatkan hasil genistein pada konsentrasi rendah (< 10 nM) tidak menunjukkan efek, pada konsentrasi sedang (10 nM- 1 JJM) mampu melindungi sal terhadap apoptosis karena hlpoksia, sedangkan pada konsentrasi tlnggl (> 1 JJM) memlcu terjadlnya apoptosis. Proteksi genistein pada hlpoksla dlduga melalul peningkatan Akt dan ERK, juga efek antioksidannya mampu menghambat ROS, disamping itu genistein juga mempengaruhi rasio Bax/BCI2 menjadi turun Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat mengungkap leblh jelas mekanisme genistein dalam memperbaiki penurunan jumlah dan fungsi MSCs pada kondisi hipoksia pada saat dilakukan terapi sel punca menggunakan MSCs. Disamping itu genistein sebagai antioksidan dapat gunakan sebagai pilihan terapi untuk membantu keberhasilan terapi sel punca.

VII •

t

ABSTRAK

Terapi dengan MSCs telah menunjukkan hasil yang menjanjikan akan tetapi tidak sesuainya lingkungan mikro (hipoksia) mengakibatkan MSCs apoptosis. Genistein sebagai antioksidan dan pada dosis rendah dapat sebagai antiapoptosis diharapkan mampu meningkatkan efektivitas terapi sel punca. Tujuan dari penelitian ini untuk mengkaji efektivitas genistein terhadap viabilitas mesenchymal stem cells (MSCs) khususnya dalam kemampuannya regenerasi melalui penghambatan apoptosis (p38MAPK, caspase-9, caspase-3) pada kondisi hipoksia. Metode yang digunakan pada penelitian ini menggunakan MSCs dari sumsum tulang kelinci New Zealand. Kultur hipoksia dengan menggunakan Anaeropack-an aero (MGC). Viabilitas MSCs, diukur dengan MTT assay, derajat apopto sis dengan fluorescence dye Hoechst 33342, sedangkan p38MAPK dengan ELISA, caspase-9 dan caspase-3 dengan colorimetric. Analisis data dengan menggunakan one way anova. Hasilnya didapatkan vi abll itas MSCs pada kondisi hipo ks ia meningkat secara signifikan (p,O,OS) pada setlap kelompok begltupula dengan derajad apoptosls yang menurun (p,0,05) selrlng dengan menlngkatnya dosls genistein sedan g kan kadar p38MAPK, caspase-9, dan caspase-3 menurun tldak signifikan (p>0,05). Keslmpulannya genistein dapat meningkatkan viabilitas dan menurunkan derajad apoptosis tetapi tidak untuk menurunkan p38MAPK, caspase-9, dan caspase-3.

Vlll ..

t

DAFTARANGGOTA TIM PENELITI

1. dr. Candra Bumi, MSi (Ketua) 2. dr. Heni Fatmawati, MKes (Anggota)

3. dr. Nindya Shinta, MKed (Anggota)

IX •

..

t

• �

DAFTAR TABEL

No 1.

Halaman

Judul

Tabel 4.1. Hasil analisis statistik pengukuran viabilitas MSCs pada kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa dosis 14 genistein Tabel 4.2. Hasil analisis statistik pengukuran aktivitas p38 MAPK pada kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa . . .. . . . . . 15 dosis genistein Tabel 4.3. Hasil analisis statistik pengukuran aktivitas caspase 9 pada kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa dosis genistein . . . . .. 16 Tabel 4.4. Hasil analisis statistik pengukuran aktivitas caspase 3 pada kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa dosis genistein . . :.............................. 16 Tabel4.5. Hasil analisis statistik persen tase jumlah apoptosis pada kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa dosis genistein ... 17 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ............................

2.

. . ..

.

.......

...

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ........... . . . . . .......

3.

...........................

4.

.........

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .........

5.

•

.

.

X t

.

.

...

...........

................

.

....

.....

DAFTAR GAMBAR

No 1. 2.

3.

Halaman

Judul

Gambar 4.1. Gambaran sel MSCs pada hari pertama setelah kultur.......................................................................................... 11 Gambar 4.2. Gambaran sel MSCs setelah dilakukan pencucian...........11 Gam bar 4.3. Gambaran sel MSCs masih 30% dengan bentuk spindel 12 Gam bar 4.4. Gambaran sel MSCs yang sudah konfluen 80% . . 12 Gambar 4.5. Gambaran hasil identifikasi sel MSCs .. . . . . . 13 Gambar 4.6. Diagram batang hasil pengukuran viabilitas MSCs dengan menggunakan MTT assay pada kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa dosis genistein . . . . . .. . . . . . . 14 Gam bar 4. 7. Diagram batang hasil pengukuran aktivitas p38 MAPK pada kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa dosis genistein.. . 15 Gambar 4.8. Diagram �atang hasil peng uku ran kadar caspase 9 pada kultur MSCs hlpoksla yang dlpapar beberapa dosls genistein ....... 15 Gambar 4.9. Diagram batang hasil pengukuran kadar caspase 3 pada kultur MSCs hipo ksia yang dipapar beberapa dosis genistein....... 16 Gamba r 4.10. Gambaran apoptosis kultur MSCs menggunakan pewamaan fluorescence dye Hoechst 33342 . . .. . . 17 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..................................

4. 5.

6. 7.

.........

..........

.........

.

..

..

..

.

.

....

..

....

...

.

..

....

.

....

...

.........

.

.

...

8.

9. 10

.

.

..............

xi •

t

...................

.

DAFTAR LAMPIRAN

No

Halaman

Judul

1. Analisis Statistik One Way Anova

................... ........... 24

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .-

xu •

t

I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang

Penyebab

utama

gagal jantung adalah infark miokard yang mengarah pada

kerusakan permanen dari kardiomiosit dan diikuti oleh remodelling patologis dari • ventrikel kiri 1 2. Meskipun pada penelitian terdahulu disebutkan terdapat pembelahan •

kardiomiosit setelah infark pada otot jantung, tetapi kemampuan mit()sis tersebut menjad i sangat terl:iatas untuk menggantikan sel-sel yang hilang setelah infark miokard 1. Terapi sel menggunakan mesenchymal stem cells (MSCs) dari bone marrow dari

telah menunjukkan basil yang sangat menjanjikan dalam hal meregenerasi dan mengembalikan miokardium yang iskemia, mengembalikan fungsinya serta merupakan strategi efektif yang aman untuk terapi gaga! jantung iskemia 3•4•5•6. Namun demikian minimnya

dari transp l an tasi

viabilitas

menyebabkan efikasi

menunjukkan

99%

dari terapi

MSCs

dewasa beige mengalami

yang

pada jantung yang mengalami infark

MSCs

ini menjadi terbatas

diinjeksikan

kematian

setelah

4

ke ventrikel

hari injeksi,

lingkungan mikro iskemi/microenvironment yang tidak kondusif untuk

ketahanan

7•8. Penelitian oleh Geng, th 2003,

iskemi

kiri dari CB17SCID/tikus

hal

ini membuk:tikan bahwa

pada miokardium yang infark

MSCs. Dugaan mekanisme yang mendasari

menurunnya fungsi MSCs adalah sel-sel MSC banyak yang mengalami apoptosis dan kapasitas untuk melekat serta diferensiasi menjadi MSCs

turun.

Dengan demikian

meningkatkan ketahanan dari MSCs yang berimplantasi menjadi hal pen�ing untuk peningkatan efikasi dari terapi stem cells. Tujuan cardiomyop/asty seluler adalah untuk mengganti kardomiosit yang hilang setelah iskemia, menginduksi remodelling

revaskularisasi pada

patologis setelah infark 10•11.

Saat

daerah trauma, dan mencegah ini cardiomyoplasty

seluler

menggunakan MSCs telah menjadi altematif utama sebagai terapi untuk meningkatkan ideal untuk cardiomyoplasty seluler 0• adalah sel yang mempunyai kemampuan berdiferensiasi penuh sebagai otot jantung 1 fungsi pada penyakit otot jantung10. Kandidat yang

12. Populasi sel tersebut dapat ditemukan pada sumsum tulang dewasa. Saat ini telah diketahui bahwa populasi sel adheren 'yang diisolasi dari sumsum tulang dan di ekspansikan

secara

mesenchymal stem

in vitro, merupakan sumber yang potensial dari undifferentiated

ce ll

•

s (MSCs) yang akan menjadi tipe seljaringan penyambung 11.

Pengeluaran MSCs dari bone marrow sebagai res pon terhadap stimulus untuk mobilisasi

merupakan interaksi yang komplek dalam microenvironment pada marro w 1

•

t

setempat. Beberapa faktor yang mungkin berperan sebagai penyebab kematian awal sel

dari

MSC

ketidakberadaan

dipengaruhi

oleh

saat

isolasi

dan

injeksi

sel,

hipoksia,

atau

survival factor. Adanya kondisi hipoksia pada miokardium yang

infark, akan menstimulus respon imun untuk bereaksi dan mengakibatkan terjadinya proses potensi redoks yang menghasilkan peningkatan stress oksidatif pada sel otot

ja ntung

14.

Pen ing ka tan ROS

meny ebab kan modulasi dari molekul proinflamatori

seperti molekul TNF-a yang pada akhirnya mengaktifkan jalur aktivasi mitogen 15 16 activated protein kinase (MAPK) ' . Aktivasi MAPK selanjutnya menyebabkan kondisi patologis yang mengaktifkan kaskade apoptosis

melalui caspase-3

9•16.

Mengingat proses apoptosis menjadi faktor utama dari patogenesis kegagalar) MSCs berimplantasi pada daerah jantung yang infark, maka, penghambatan beberapa molekul yang terlibat pada apoptosis merupakan hal yang tepat untuk meningkatkan efektifitas terapi menggunakan

mesenchymal stem cells (MSCs).

Indonesia sebagai negara tropis mempunyai keragaman flora yang mempunyai p otensi besar untuk dikembangkan dalam dunia pengobatan. Akan tetapi p en eli tia n

tentang hal tersebut masih sangat sedikit, padahal berbagai kandungan zat yang mempunyai khasiat sebagai obat banyak terdapat pada tumbuhan-tumbuhan tersebut. Isoflavon dari ked el ai telah diterima secara luas dan menjadi perhatian selama beberapa tahun karena potensinya dalam mencegah penyakit kronis. Genistein merupakan isoflavon utama yang berasal dari kedelai, bersifat sebagai fitoestrogen dan mempunyai berbagai aktivitas biologi. Sejauh ini antara lain menurunkan

genistein diketahui mempunyai beberapa efek

stress oxidative 17 dan meningkatkan sintesa NO

18 •

Meskipun

beberapa data menujukkan genistein mempunyai peran proteksi pada penyakit jantung, namun mekanisme yang mendasarinya masih belum diketahui, dan penelitian tentang efek genistein pada penyakit jantung masih sangat terbatas.

Genistein

diketahui

mempunyai

efek

menurunkan kolesterol serum dan

menurunkan insiden penyakit ko'roner. Yang lebih menarik, genistein juga mampu menghambat aktivitas sitokin proinflamasi,

menurunkan

apoptosis kardiomiosit,

memperbaiki fungsi endotel dan meningkatkan imunotoleransi setelah transplantasi 18•19

.

Bebcrapa

penelitian

lain

juga

membuktikan

genistein

berperan

scbagai

antiapoptosis pada berbagai sel, diantaranya genistein mampu memperbaiki fungsi jantung pada tikus dan babi dengan stenosis aorta dengan menghambat apoptosis pada kardiomiosit

19.2°.

Meskipun

terdapat beberapa

bukti

bahwa

genistein

sebagai

antiapoptosis, namun peranan genistein dalam melindungi MSCs pada kondisi hipoksia

2 t

masih belum diketahui. Untuk itu pada penelitian ini akan diungkap mekanisme kerja genistein pada MSCs khususnya kemampuannya pada regenerasi sel kardiomiosit melalui

penghambatan

apoptosis

pada

kondisi

hipoksia

in vitro.

Berdasarkan

kemungkinan keterkaitan kemampuan regenerasi MSCs tersebut dengan potensi genistein sebagai antiapoptosis dan antioksidan serta kemudahan untuk didapatkan dan keamanan yang lebih tinggi, maka penelitian ini perlu dilakukan. 1.2 Rumusan Masalah •

Apakah peranan genistein pada viabilitas dan derajat apoptosis pada ku1tur MSCs dengan kon disi hi poks ia?

•

Bagaimana efektivitas

genistein terhadap eks pres i p38MAPK, caspase-3 dan .

caspase-9 pada kultur MSCs dengan kondisi hipoksia?

ll. TUJUAN PENELITIAN

2.1 Tujuan Umum:

Mengkaji efektifitas genistein terhadap ketahanan mesenchymal stem cells (MSCs) khususnya dalam kemampuannya pada regenerasi melaJui penghambatan apoptosis pada kondisi hipoksia in vitro.

2.2 Tujuan Khusus: •

Mempelajari peranan genistein terhadap viabilitas dan derajat apoptosis kultur

MSCs dengan kondisi hipoksia. •

Mempelajari efektivitas genistein terhadap aktivitas p38MAPK, caspase-3 dan caspase-9 pada kultur MSCs dengan kondisi hipoksia.

2.3 Manfaat Riset Dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan bahwa proses apoptosis pada kultur mesenchymal stem cells (MSCs) pada kondisi hipoksia melalui mekanisme yang melibatkanjalur p38 MAPK, caspase-3 dan caspase-9.

2.4 Hipotesis Riset

:

Pemberian genistein mampu meningkatkan viabilitas dan

proliferasi MSC menghambat pro ses apo pto si s pada kultur Mesenchymal stem cells kondisi hipoksia melalui hambatan jalur p38 MAPK, caspase-3, dan caspase-9.

m. BAHAN DAN METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Bahan

Medium Dulbecco's

(IMDM), fet!ll bovine serum (FBS), rabbit polyclonal antibodies,

anti TNFa, anti MAPK (Cell Signal Technology, Beverly, MA), mouse monoclonal antibodies, anti-�-actin (SantaCruz). Horse-radish peroxidase-conjugated secondary antibodies (SantaCruz Biotechnology), Caspase-3 colorimetric assay kit (Biovision Research, CA), Caspase-9 colorimetric assay kit (Biovision Research, CA).

3.2 Variabel Penelitian 3.2.1 Klasifikasi Variabel Penelitian

Dalam penelitian ini melibatkan 3 varia bel: 1.

V ariabel bebas: Genistein

2. Variabel kendali: Kondisi hip oksia kultur MSCs 3.

Variabel Moderator: Kultur MSCs

4. Variabel tergantung: jumlah apoptosis, proliferasi sel, kadar p38MAPK, kadar

caspase-9, kadar caspase-3. 3.2.2 Definisi Operasional Variabel Penelitian

a.

Variabel Bebas:

Genistein: Genistein adalah sediaan fitoestrogen yang dipakai sebagai terapi harmon (Sigma Chemical, St. Louis,MO). Diberikan dalam berbagai dosis yaitu 1 �mol/L, b.

5

�mol/L, 10 �mol/L

Variabel Ke ndal i :

Kondisi hipoksia: kultur MSCs dikondisikan hipoksia dengan konsentrasi 02 0.5%. Kondisi hipoksia dilakukan dengan memberikan Anaeropack Anaero dari MGCA yang

C02 c.

mengandung asam askorbat sehingga dapat mengubah 02 menjadi

a 1 jam.

selam

Variabel Moderator: Kultur MSCs: MSCs diambil dari sumsum tulang kelinci New Zealand jantan, usianya 6 bulan dan berat badan 900 gr. Usia 6 bulan merupakan usia remaja bagi kelinci sehingga diharapkan mendapat BMSCs yang bagus. Sebelum

5 t

diambil kelinci dilakukan pembiusan kemudian dengan menggunakan spuit 10 ml yang sudah ada heparinnya stimsum tulang diambil secara aseptis. Setelah didapat aspirat dari sumsum tulang kemudian aspirat di biakkan dalam medium k:ultur BMSCs. d.

Variabel tergantung. I.

Jumlah Apoptosis: banyaknya BMSCs yang mengalami apoptosis diwarnai dengan fluorescent dye Hoechst dan propidium iodide. Analisis morfologi dilihat dengan mikroskop fase kontras dan mikroskop fluoresens (Olympus).

Inti set yang berpendar biru menunjukkan apoptosis sedangkan nukleus yang berwarna p i n k menunjukkan nekrosis. Junilah sel dihitung dalam 10 lapang pandang ti ap 400 sel yang kemudian hasilnya di rata-rata.

2. Proliferasi sel: banyaknya sel mengalami mitosis yang diukur menggunakan MTT assay berdasarkan aktivitas dehidrogenase. Bila aktivitas meningkat maka wama pada well akan semakin ungu. Besamya intensitas warna diuk:ur dengan menggunakan spektrofotometer. 3.

Kadar p38MAPK: kadar p38 MAPK yang terfosforilasi pada kultur set MSCs yang diukur dengan ELISA (p38 immunoassay kit assay design). Nilai disajikan dalam satuan pg/mL.

4.

Kadar caspase-3: banyak:nya caspase-3 di dalam sel MSCs yang dideteksi dengan Colorimetric assay. Caspase-3 dideteksi berdasarkan hidrolisis dari

peptida asetil-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilid� (pNA) sehingga melepaskan pNA. pNA mempunyai absorbansi tinggi pada 405 nm. Tingginya kadar pNA dapat diukur dengan menggunakan ELISA reader. Nilai satuan disajikan dalam �glml. 5.

Kadar caspase-9: banyaknya caspase-9 di dalam sel MSCs yang dideteksi dengan Colorimetric assay. Caspase-9 dideteksi berdasarkan hidrolisis dari

peptlda asetii-Asp-Giu-Vai-Asp p-nltroanlllde (pNA) sehlngga melepaskan pNA. pNA mempunyai absorbansi tinggi pada 405 nm. Tlngglnya kadar pNA dapat diukur dengan menggunakan ELISA reader. Nilai satuan disajikan dalam �mi.

3.3. Metode Penelitian •

llolall dan

Kultur Kultur MSCs

Isolaai MSCs dilakukan dengan mensambil bone marrow (sumsum tulana) kelinci sehat

secara aseptis. Sel-sel dari marrow yang diperoleh kemudian diletakkan pada kultur disk dengan densitas lxl06 sel/cm2 pada 6 well dengan medium IMDM yang berisi 15% FBS, suplemen stimulator MSC, dan antibiotik (100

U

pe ni cillin/100

° streptomycin) pada suhu 37 C, 5% C0 2 ·dan udara 95%. Sel-sel yang

diganti dengan medium yang baru setelah 72 j am dan se l anjutn ya seti ap

tidak.

J.Lg/mL melekat

4 hari sekali.

Identifikasi sel-sel MSC dilakukan menggunakan flowcytometry (CD 105 dan CD 45). Induksi apoptosis pada MSCs dilakukan dengan kondisi hipoksia yaitu dengan me masukkan flask kultur ke dalam inkubator khusus yang didalamnya diberikan anaeropack dari MGCA 13.

•

Perlakuan Genistein.

Setelah konfluen, sel diinkubasi dengan genistein. Konsentrasi genistein (Sigma) yang digunakan dalam penelitian ini adalah 1, 5, dan 1 OJ.Lmol/L. MSCs diinkubasi dengan beberapa konsentrasi genistein selama 24 jam.

•

Uji MTT Assay Viabilitas sel untuk pengujian proliferasi sel menggunakan metode uji MTT (Cell proliferation kit 1, KPL Diagnostic) dimana garam tetrazolium berwarna kuning dimetabolisme oleh sel viabel menjadi kristal formazan yang berwana ungu. MSCs diinkubasi selama 3 jam dengan larutan MTT (5 mg/ml). Kristal formazan dilarutkan dalam bufer SDS (100/o SDS dalam

O.OIN HCI) semalam dan produk diukur secara

spektrofotometri pada A. 570 run.

•

Kadar p38 MAPK dengan ELISA.

Kadar TNF-n dan MAPK intraseluler pada set MSC dengan beberapa kondisi hipoksia diuku r dengan metode ELISA, prosedur pengukuran dilakukan sesuai dengan petunjuk yang tertera pada label Anti Rat ELISA Kit (Assaydesign).

7 •

t

•

Detekll Sel Apoptosis dan

Nekrosis.

Untuk mengidentifikasi set apoptosis dan nekrosis, kondensasi kromosom diwamai denga n

fluorescent dye

(Jankow ska et a/,

Hoechst 33342 (Sigma) dan propidium iodide (Sigma)

1997). Sel-sel difiksasi pada suhu ruang

PBS yang mengandung 1% glutaraldehyde dicuci 2 kali ,

dipaparkan pada 5 �g/ml Hoechst

33342 dalam

selama 30 me nit dalam

dengan

PBS selama

30

PBS selanjutnya

menit suhu ruang.

Analisis morfologi dilihat dengan mikroskop fase k.ontras dan mikrosk.op fluoresens (Olympus). Inti sel yang berpendar biru menunjukkan apoptosis sedangkan nukleus yang berwama pink menunjukkan nekrosis.

•

Kadar caspase-9 dengao

Kadar Caspase·3

Colorimetric Assay.

dan caspase·9 pada MSCs yang sudah dipapar dengan beberapa

konsentrasi Genistein diukur dengan

•

Colorimetric Assay.

Analisis Data

Data hasil pe ngukuran ditampilkan dalam mean± SD. Data dianalisis dengan

menggunakan

one-way ANOVA

(analisis ragam) dilanjutk.an dengan uji Tukey untuk

melihat perbedaan masing-masing variabel. Analisis data dilakukan dengan komputerisasi menggunakan metode SPSS versi 11.

8 I

3.4 Diagram Alir Penelitian

ldentifikasi CD 105

Pl + Genistein

r: . .

t.:·

lj.tmoi/L

·

;+

Pl

aenlstelh

. =: :.s���ll:�:.

Metade

9 t

IV. BASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Basil Penelitian 4.1.1 Morfologi Kultur MSCs Penelitian ini

telah

m enggunakan

sa.mpel dari sumsum tulang kelinci, Penelitian ini

diajukan pada komisi etik Lembaga Penelitian Universitas Airlangga. Kriteria

donortikus

adalah de ngan berat 150 gram dengan usi� 1,5 bulan.

Isolasi MNCs dilakukan dengan mengambil sumsum tulang kelinci sehat secara aseptis dan diaspirasi ke dalam spuit yang telah diberi heparin 1000 unit. Pengambilan aspirat sumsum tulang tikus dari daerah krista iliaka. Sebelumnya tikus dibius dengan injeksi ketamin (untuk induksi) 20 mg!kgBB dan Xylasin (untuk sedasi) Pada daerah pengambilan didisinfeksi

yang

3

mglkgBB.

kemudian ditutup doek steril.

pengambilan pertama didapatkan kurang dari 1 ml

sumsum tulang.

Kemudian

Pada

MNCs

dipisahk:an dengan menggunakan Ficoll-paque (1077;Sigma). Setelah disentrifus 1600 rpm selama 15 menit maka Buffy coat yang terbentuk diambil dengan menggunakan pipet pasteur secara perlahan.

Kemudian sel MNCs

dibilas dengan PBS

lx dan

disentrifus 1600 rpm

selama

10

menit. Pelet yang terbentuk diresuspensi dengan medium kultur yang komplit yang berisi o.-MEM, FBS 20%, 1-Glutamin 2mM, dan antibiotik (100 U penicillin/100 j.lg/mL streptomycin). Hasil resuspensi diletakkan ke beberapa plate dengan volume masing­ masing plate

5

mi. Kemudian sel diamati pertumbuhannya setiap hari dan setiap tiga

hari medium dig anti.

Pada pengambilan yang pertama

terjadi

kegagalan

Pertumbuhan sel sangat lambat sehingga sel akhirnya mati.

pertumbuban

MSCs.

Hal ini diakibatkan karena

kontak antar sel (cell signaling) terhambat sehingga tidak segera terbentuk koloni sel. Ketika diulang isolasi yang ke dua pada saat pengambilan aspirat terdapat kesulia t n dan

hasil aspirat kurang

dari 1

ml. Set el ah sel MNCs ditanam ke plate maka setelah diamati

pertumbuhannya lambat dan terjadi kontaminasi. Keberhasilan isolasi MSC dari sumsum tulang sangat bergantung dari cara pengambilan dan jumlah aspirat yang djdapat. Jika jumlah sel yang didapat sedikit maka komunikasi antar sel juga terganggu. Cara pengambilan yang sulit mengakibatkan kemungkinan terjadinya kontaminasi juga tinggi.

10 •

I

Dengan pertimbangan di atas maka diambil keputusan untuk mencoba donor sumsum tulang berasal dari kelinci. Berat badan kelinci yang digunakan adalah

900

gr

dengan usia 6 bulan. Setelah aspirat didapatkan dan set MNCs dipisahkan dengan Ficoll-hipaque

maka sel tersebut dibiakkan kedalam plate dan ditambahkan medium kultur yang komplit. Pada hari pertama tampak sel masih berbentuk bulat dan belum menempel ke dasar plate.

Gambar 4.1. Gambaran sel MSCs pada hari pertama setelah kultur. Tampak sel yan g masih berbentuk bulat-bulat.

Pada 3

x

24 jam

sel harus dicuci untuk memisahkan antara MSC dengan

sel

hemopoeitik. MSC akan melekat pada dasar plate sedangkan set hemopoeitik tidak: melekat pada dasar plate.

Gambar4.2. Gambaran sel MSCs setelah dilakukan pencucian. Sel dengan bentuk poligonal yarig telah adheren.

11 •

I

Pada hari ke enam medium kultur perlu diganti dan tampak MSCs hari ke enam (Gambar 4.3.).

Dari gambar di atas tampak sel sudah berbentuk �pindel dengan adanya koloni yang terbentuk. Koloni tersebut mengadakan komunikasi antar sel sehingga sel dapat berproliferasi dengan baik. Pertumbuhan sel masih 30% sehingga belum dapat di

pasase. Pada hari

ke

10 tampak sel

sudah memenuhi plate sebanyak 60%. Dengan

pertumbuhan sel seperti spiral (Gambar 4.4.)

Gambar 4.4. Gambaran sel MSCs yang sudah konflue·n 80%. Sel ini siap untuk diberi kondisi hipoksia dan pemberian genistein.

4.1.2 Pembuatan model hipoksia Pembuatan model hipoksia dengan menggunakan anaeropack Anaero. Alat ini mengandung asam askorbat yang dapat menyerap Oksigen dan mengubahnya menjadi

12 •

I

C02. Bila telah terjadi kondisi hipoksia maka bahan ini akan berubah warna menjadi ungu. Hipoksia yang dihasilkan oleh alat ini bisa mencapai kadar 02 0,5% dalam 1 jam. Pada kultur MSC normal menunjukk:an gambaran sel yang normal, yang mempunyai ciri-ciri bentuk sel poligonal dengan jarak antar sel yang teratur dan rapat, permukaan sel rata ditandai dengan penampakan inti, membran plasma, sitoplasma

serta

matriks ekstraseluler). Sedangkan pada MSC hipoksia menunjukkan ga.mbaran sel yang mengalami apoptosis. Hal ini ditandai dengan MSC yang mengalami sel membran menggelembung

shrinkage,

(blebbing), inti sel fragmentasi.

4.1.3. ldentifikasi Sel MSC Dari hasil identifikasi dengan menggunakan CD 1 05/endoglin didapatkan bahwa

sel yang di cat dengan FITC

mampu berpendar

hijau. Hal ini menunjukkan sel tersebut

mengekspresikan CD105. Seperti diketahui CD1 05+

merupakan marker bagi sel MSCs.

Gambar 4.5. Gambaran hasil identifikasi sel MSCs. A. Merupakan sel MSCs yang belum diidentifikasi. B. Sel MSCs yang yang telah diidentifikasi dengan menggunakan CD1 05/endoglin dengan pengecatan FITC. Dengan menggunakan mikroskop elektron tampak sel berpendar hijau.

4.1.4 Viabilitas MSCs pada kondisi bipoksia setelab pemberian genistein dengan menggunakan MTT assay. Setelah terbentuk

MNC, sel kemudian diinkubasi dengan genistein pada

konsentrasi 1, 5, 10 J.UllOl/L selama 1 jam dengan kondisi hipoksia. Pada pengamatan terhadap viabilitas kondisi hipoksia terjadi peningkatan viabilitas MSCs seiring dengan peningkatan dosis genistein. Terdapat perbedaan yang signifikan (p
13 •

I

sedangkan dosis 5 J.unoVL dan dosis 10 J.Lmoi/L tak terdapat perbedaan yang signif"'tkan (p>0,05) (gambar 4.6 dan tabel 4. 1). \

140

·.: co ,

0 ... Qi � ....

--1

80

"

60

c

�j

40

.

20

:s

IV

·s

0

... . .. �.

..

.

..... .

''''

)

,

j i I

·

Hipoksia

. .... .. . .....

' �--� ,__ ,. _..,,..,,..,, .

120

. ....

100

*' �

.. . .

. ....

·-·� ··- --� .

..

-� .,

Hlpoksia+Gen 1 �o�mol/l

Hipoksia+Gen 5 Hipoksia+Gen 10 j..lmoi/L j..lmoi/L

Kelompok perlakuan '

.,.

,,

,,

''"

-� o '''

•�

... .... . ...

O O··�••M••<-'.. ,,,.,,,,�, "��"�"'"' """.

.

... ... .v. . •

.. -..- .. ....... ...

.. .... . .....�

-.,.••

..,...

!

t

....,·-�_..,.,..,..,,,....,,_

Gambar 4.6. Diagram batang hasil pengukuran viabilitas MSCs dengan menggunakan MTI assay pada kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa do sis genistein . Tabel 4.1. Hasil analisis statistik pengukuran viabilitas MSCs pada kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa dosis genistein Mean±SD

Per1akuan •

Hlpoksla Hipoksia+Gen 1 !Jmoi/L Hipoksia+Gen 5 !JmOIIL

66,9::t:10,63b

Hipoksia+Gen 10 j.Jmoi/L

99 8:1:20 86°

32,0::1:19,788 88,7::t:9,01bo

Keterangan : notasi yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata

4.1.5 Efek pemberiao genistein terhadap aktivitas p38

(p>0,05)

MAPK, Caspase-3, dan

Caspase-9 pada kultur MSCs hipoksia Setelah terbentuk MNC, sel kemudian diinkubasi dengan genistein pada konsentrasi 1,

5,

10 )llllOIIL selama 1 jam dengan kondisi hipoksia. Pada pengamatan

terhadap aktivitas p38

MAPK,

kondisi hipoksia

menyebabkan peningkatan pada

MAPK.

Pemberian genistein beberapa dosis pada kultur menunjukkan · teljadi penurunan p ada aktivitas p38 MAPK dengan penurunan tertinggi terjadi pada aktivitas p38

pemberian genistein dosis 10 !lmoi/L (gambar 4.7 dan tabel 4.2).

14 I

·

..

. .

. .. ...

..�---··�--

··--··

. . . . . . ·-----

- ·.. ·

...... -·

--

.

.

..

" ... �·--·

.........

.

. ...

.....�

... ;••··-···--·�-----�..---.��--·--·····"''

. ...

<

!

r

e !

......

I

�

Q.

1,2

1 0,8 0,6 . 0,4 0,2

I

0

Hipoksia

Hipoksia+Gen 1

v.moi/L

Hipoksia+Gen 5

�-tmoi/L

Hipoksia+Gen lo

llmoi/L

,

Perlakuan

.

l.·! ·

!

.

..... .

.

I

".

... J

Gambar 4.7. Diagram batang hasil pengukuran aktivitas p38 MAPK pada kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa dosis genistein.

Perlakuan Hlpoksla Hipoksia+Gen 1 �moi/L Hipoksia+Gen 5 �moi/L Hi oksia+Gen 10 moi/L

0,9:t0, 14• 0,8:t0,3111 0,6:t0,12• 0,5±0,2411

Keterangan : notasi yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata

(p>O,OS)

Hal yang serupa ditunjukkan pada aktivitas caspase-9 dan caspase 3 yaitu teljadi

penurunan tetapi tidak signifikan pada kelompok yang diberi genistein dibandingkan dengan kelompok hipoksia, penurunan paling nyata pada kelompok genistein konsentrasi 5 �ol/L. .... . ...

�

-

.z. c

01

�

a.

.,

40

,

2

�

·1

J

60 "!!

rJ

�

! I

'l

1 40 1 120 00 1 80

..

I

1

·

0 i 1' 0 .. ;

.

Hipoksia

Hipoksia+Gen 1 Hipoksia+Gen 5 Hipoksia+Gen 10 1Jmoi/L

�mol/l

�oi/L

Perlakuan < L--·----·····-------------------·

.. ..... ..... .......

.

.

. .. ..... . . . ... . ..... .. .. . ..._, . .

----·······-·-·

...

< '

i

(

i

!

; ! !

--·-----·----J

Gambar 4.8. Diagram batang hasil pengukuran kadar caspase 9 pada kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa dosis genistein. 15

Tabel 4.3. Hasil analisis statistik pengukuran aktivitas caspase 9 pada kultur MSCs hipok sia vane dipapar beberaoa dosis aenistein Caspase 9 Mean±SD

Perlakuan

Hipoksia

100±3,7528

Hipoksia+Gen 1 �moi/L

91,1±18,448

Hipoksia+Gen 5 �moi/L

88,3±27,858

Hipoksia+Gen 10 �moi/L

88,9±19,438

Keterangan : notasi yang sama menunJukkan tldak ada perbedaan yang nyata (p>0,05)

I l

I

!

I

: : i

l

i

i '

-

! � c:

2. ""

�

ftl Q. "'

a .. ftl

I

1: --1.1 120 140 60 40 20

0

·-1

I

!

.1

'l '

l I

-

"tJ tV :111::

Hipoksia

Hipoksia+Gen lHipoksia+Gen 5 Hipoksia+Gen 10 �moi/L �moi/L �moi/L

t •

Perla kuan

Gambar 4.9. Diagram batang hasil pengukuran kadar caspase 3 pada kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa dosis ge n istei n. Tampak penurunan kadar caspase 3 seiring dengan peningkatan dosis genistei n .

Perlakuan Hipoksia Hipoksia+Gen 1 tJmoi/L Hipoksia+Gen 5 �moi/L

1 00±9,368 94,4±16,678

Hi oksia+Gen 10

85,8±36,988

moi/L

87 ,6±38,458

Keterangan : notasi yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata (p>0,05)

Paparan kondisi hipoksia meningkatkan aktivitas caspase-3 pada kelompok ·

tanpa genistein (100 ± 9,364) dibandingkan dengan kelomj:>Ok yang diberi genistein meskipun tidak signifikan.

4.1.6 Efek pemberian genistein terbadap apoptosis sel pada kultur MSCs hipoksia. Gambaran apoptosis pada kultur MSCs beberapa kelompok menggunakan pewarnaan fluorescence

dye Hoechst 33342 (Sigm a) dan propidium iodide (Sigma),

16 •

I

menunjukkan adanya gambaran apoptosis pada sel yang berwarna biru. Gambaran sel apoptosis,

ditandai

dengan

MSCs

yang

mengalami

sel

shrinkage,

membran

menggelembung (b/ebbing), dan inti set fragmentasi (gambar 4.8). Hasil analisis statistik persentase jumlah apoptosis MSCs pada kultur MSCs kondisi hipoksia yang dipapar beberapa dosis genistein menunjukkan terdapat persentase jumlah sel apoptosis yang lebih tinggi pada kelompok tanpa diberi genistein (45,6±4,560)

secara

nyata (p<0.05). Pemberian genistein menurunkan jumlah sel

apoptosis pada dosis 1 �mol/L tetapi tidak. berbeda nyata dengan hipoksia. Penurunan yang signifikan terjadi pada dosis 5 Jlmol/L (1 8,4±6,066) dan 10 J.UnOIIL (22,4±3,578) dibandingkan dengan tanpa pemberian genistein., namun pada dosislO J.UnOl!L terjadi kenaikan kembali jumlah set apoptosis walaupun tidak berbeda nyata dengan kelompok dosis 5 f.UllOVL. Tabel 4.5. Hasil analisis statistik persentase jumlah apoptosis pada kultur MSCs hipoksia yang dipapar bebera pa dosis genistein Persentase apoptosis Pertakuan Mean±SD Hipoksia 45,6±4,568 Hipo ksia+Gen 1 �moi/L 37,6±7,278 ' 18 ,4±6,07 b Hipoksia+Gen 5 1Jmoi/L Hipoksia+Gen 1 0 IJmOVL 22,4±3,58b Keterangan : notas1 yang sama menunJukkan tldak ada perbedaan yang nyata (p>0,05)

Gambar 4.10. Gambaran apoptosis kultur MSCs menggunakan pewamaan nuorescence dye Hoechst 33342. Oengan menggunakan mikroskop fluoresent tampak inti sel yang berpendar biru seperti yang ditunjukkan panah.

17 •

I

4.1

Pembahasan Hasil penelitian menunjukkan kondisi hipoksia,

menghambat kemampuan

MSCs dalam membentuk koloni dan menurunkan aktivitas proliferasi. Kemungkinan hipoksia menginduksi terjadinya ROS yang akan menginduksi tetjadinya apoptosis pada kultur sel MSCs. Genistein merupakan salah satu isoflavon yang terdapat pada kedelai. Genistein •

mempunyai banyak efek diantaranya adalah efek hormonal karena bersifat sebagai fitoestrogen, anti inflamasi, anti oksidan, dan mempengaruhi proliferasi dari sel. Studi pada sel MCF-7 (Human breast cancer cells) menunjukkan efek bifasik dari genistein yaitu pada konsentrasi rendah memicu pertumbuhan sedangkan pada konsentrasi tinggi menghambat pertumbuhan 2 1. Mekanisme yang terjadi untuk menjelaskan peristiwa bifasik tersebut belum sepenuhnya jelas. Penelitian pada set otot genioglossus didapatkan basil genistein pada konsentrasi rendah (< 10 nM) tidak menunjuk:kan efek, pada konsentrasi sedang ( 10 nM

-

1 f.1M)

mampu

melindungi sel terhadap · apoptosis

karena hipoksia, sedangkan pada konsentrasi tinggi (> 1 f.1M) memicu terjadinya

apoptosis. Proteksi genistein pada hipoksia diduga me lalui peni ngkatan Akt dan ERK, juga efek antioksidannya mampu menghambat ROS, disamping itu genistein juga mempengaruhi rasio Bax/BCI2 menjadi turon

22.

Hasil pengukuran kadar p38 MAPK menunjukkan pada kondisi hipoksia menyebabkan peningkatan aktivitas p38 MAPK. Pemberian genistein beberapa dosis pada kultur menunjukkan terjadi penurunan pada aktivitas p38 MARK dengan penurunan tertinggi terjad i pada pemberian genistein dosis 10 �ol/L. Hal in i menunjukkan bahwa hipoksia pada sel kutur MSCs merupakan hal yang potensial untuk terbentuk radikal bebas yang akan menginduksi kematian sel apoptosis melalui induksi jalur p38 MAPK. Peningkatan aktivitas p38 MAPK pada sel akan menginduksi

apoptosis melalui fosforilasi faktor transkripsi p5328. Pengakiifan p53 selanjutnya akan mengaktifkan bax sebagai proapoptosis yang akan menginduksi pengeluaran

cytochrome

c

dari mitokondria

29•30.

MAPK secara nyata pada dosislO

Pemberian genistein menurunkan aktivitas p38

�, menunjukkan genistein sebagai antioksidan

berperan menghambat pada jalur sinyal apoptosis ini. Hasil pengamatan terhadap aktivitas caspase-3 pada penelitian ini menunjukkan hipoksia meningkatkan aktivitas caspase-3

pada kelompok kontrol (0,9±0, 139)

(p>0.05). Pemberian genistein bebetapa dosis mampu menurunkan kadar caspase-3 tetapi tidak berbeda nyata dibandingk:an kontrol. Hal serupa juga terjadi pada aktivitas

18

oatpate-9. Hipoktia merupakan kondisi yang potensial dalam

monalndukli terjadinya

stress oksidasi melalui peningkatan produk reactive oxygen species (ROS) dan

perubahan fungsi sel MSCs.1.s ROS berperan penting pada proses apoptosis yang diinduksi oleh hipoksia, hal ini juga menunjukkan bahwa hipoksia, melalui peningkatan aktivitas caspase-9 dan caspase-3 dapat menginduksi terjadinya apoptosis sel MSCs. Antioksidan genistein berperan pada penghambatan apoptosis sel, diduga genistein mencegah caspase-9 dan caspase-3 memecah sitoskeleton maupun protein lain. Pengamatan sel apoptosis menggunakan pewarnaan fluorescence

dye Hoechst

33342 menunjukkan terdapat peningkatan persentase jumlah sel apoptosis pada kelompok kontrol (45,6±4,560) dan perlakuan genistein dosis 1 �mol/L secara nyata (p
(membrane

blebbing).

Inti sel tampak mengalami fragmentasi atau

kondensasi nukleus (Gambar 4.5B). Berdasarkan basil pengamatan morfologi tersebut diatas, dapat disimpulkan bahwa terjadi apoptosis pada MSCs. Menurut Robbins, et a/. (1996), terdapat dua bentuk kematian sel yang masing-masing mempunyai ciri-ciri 32 morfologi yang berbeda, yaitu apoptosis dan nekrosis . Pada apoptosis terjadi kematian sel yang terprogram, yakni fragmentasi kromatin, inti sel menjadi padat, ukuran sel mengecil

dan

badan

sel

mengkerut.

Sedangkan

pada

nekrosis,

sel

nampak

menggelembung (swelling), kromatin menggumpal, hilangnya integritas organel set dan membran plasma, yang pada akhimya sel menjadi pecah (membran damage). .

Perubahan morfologis dasar pada apoptosis dan nekrosis disebabkan teijadinya denaturasi protein dan pencemaan enzimatik organel dan sitosol. Hal ini menunjukkan adanya proses stress oksidatif akibat kondisi hipoksia yang menyebabkan gangguan proses replik.asi sel sekaligus menginduksi terjadinya apoptosis. Patomekanisme terjadinya kematian sel disebabkan oleh jejas pada sel, salah satunya akibat jejas kimiawi, yang menyebabkan meningkatnya produksi radikal bebas ataupun senyawa oksigen reaktif (ROS) di dalam sel yang berasal dari reaksi oksidatif metabolik yang berlebihan di dalam sel 27•33•34. Pemberian genistein menurunkan jumlah sel apoptosis pada dosis 1 �mol/L tetapi tidak berbeda nyata dengan kontrol. Penurunan yang signiflkan terjadi pada dosis 5 �moi!L (18,4±6,066) dan 10 !J.ffiO I!L (22,4±3,578) dibandingkan dengar1 kontrol. Penurunan gambaran

apoptosis sel

setelah

pemberian

genistein menggunakan

pengecatan Hoechst 33342 ini sejalan dengan basil yang diperoleh pada pengukuran 19 •

aktivitas p38, caspase-9, dan caspase-3, men unj ukkan melalui

jalur

bahwa

proses apoptosis terjadi

yang melibatkan p38, caspase-9, dan caspase-3. Diduga genistein

menurunkan apoptosis melalui penurunan aktivitas p38 atau ketiganya,

p38

spa se-9,

ca

dan caspase-3 . Peningkatan aktivitas p38 akan memicu sinyal apoptosis melalui peningkat an fosforilasi faktor transkripsi p53

sehingga akan

meningkatkan aktivitas bax sebagai

proapotosis yang akan meningkatkan pengeluaran cytochrome Cytochrome

c

c

dari mitokondria.

akan berikatan dengan protein Apaf 1 sehingga akan menarik caspase-9

untuk membentuk apoptosome 30•36. Apoptosome selanjutnya akan mengaktifka.n caspase-3 sehingga akan memecah protein lain dan terjadi apoptosis (Gambar 4.9). Penurunan persentase gambaran sei apoptosis setelah pemberian genistein menunjukkan

terdapat peran antioksidan dalam menekan apoptos is melalui jalur p38 dan

caspase-3.

Dengan demikian pada penel itian ini dapat disimpulkan bahwa ti ngg inya proses stress

oksidasi pada kondisi hipoksia menyebabkan meningkatnya apoptosis sel . Peningkatan apoptosis set terjadi melalui jalur yang melibatkan p38 MAPK, caspase-9, dan caspase3.

Genistein sebagai antioksidan mampu menghambat peningkatan apoptosis dengan

dosis optimum 10 �-

20 •

I

V. KES�PULAN DAN SARAN V.l. Kesimpulan

Dari basil penelitian dapat disimpulkan bahwa genistein dapat meningkatkan

viabilitas MSCs secara signiflkan dan menurunkan derajad apoptosis MSCs

secara

signiflkan pada kondisi hipoksia seiring dengan meningkatnya dosis genistein. Terjadi penurunan kadar p38MAPK, caspase-3" dan caspase-9 tetapi tidak signifikan. Hal tersebut menunjukkan bahwa genistein sampai dengan do sis 10 �mol/L belurn efektif menghambat p38MAPK, caspase-3 dan caspase-9. V.2. Saran Pcrlu

dilakukan penelitian yang lebih lanjut dengan menambah atau memperluas

variasi dosis genistein dan jalur lain yang menyebabkan apoptosis pada MSCs kondisi hipokasia. Disamping perlu juga diketahui

efek

penggunaan genistein pada terapi sel

punca MSCs secara invivo.

21 •

I

UCAPAN TERIMA KASm

Peneliti mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :

1.

.

Kepala beserta

Staf Badan Penelitian

dan Pengembangan Kesehatan

Kementrian · Kesehatan Republik Indonesia melalui program Risbin Iptekdok yang telah menyediakan dana penelitian. 2.

Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Jember yang telah memberikan ijin dan kemudahan dalam pelaksanaan penelitian.

3.

Prof Dr. Fedik Abdul Rantam, drh., yang telah memberikan saran untuk perbaikan penelitian.

4.

Direktur lTD

Unair

atas

fasilitasnya

sehingga

penelitian

1m

dapat

dilaksanakan. 5.

Tim panel gizi atas berbagai saran dan masukan demi perbaikan penelitian.

6.

Semua pihak yang telah membantu terselesaikannya penelitian ini, yang tidak dapat kami sebutkan satu persatu.

•

22

DAFTAR PUSTAKA

1.

2. 3.

4.

Beltrami AP, Urbanek K, Kajstura J, Yan SM, Finato N, Bussani R, Nadal-Ginard

B, Silvestri F, Leri A. Beltrami CA. Anversa P. 2001. Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction. N Engl J Med 344: 1750-1757. Braunwald E, Bristow M. 2000. Congestive heart failure: fifty years of progress. Circulation; 102: IV 14-IV23 . Stamm C, Westphal B, Kleine HD, Petzsch M., Kittner C, Klinge H, Schumichen C, Nienaber CA. Freund M., Steinhoff G. 2003. Autologous bone-marrow stem-cell transplantation formyocardial regeneration. Lancet 361: 45-46. Katritsis DG, Sotiropoulou PA, Karvouni E, Ka�abinos I, Korovesis S, Perez SA, Voridis EM,

apamichailM. 2005. Transcoronary transplantation of autologous

mesenchymal stem cells and endothelial progenitors into infracted human myocardium. Catheter Cardiovasc Interv. 65:32 1-329.

5.

Mark FB, Adam JE, Woo YJ, Timothy JP, Lawrence TB, Vasant J, Kevin JM,

6.

after myocardial infarction improves myocardial compliance. Am J Physiol Heart Circ Physiol 290:H2196-H2203. Miyahara Y, Nagaya N, Kataoka M, Yanagawa B, Tanaka K, Hao H, Ishino K,

Timothy JG, Dennis ED, Sweeney HL. 2006. Mesenchymal stem cell injection

Ishida H., Shimizu T, Kangawa K, Sano S, Okano T, Kitamura S, Mori H. 2006. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial

12:459-465. Kenichiro H, Noritoshi N, Takashi I, Itoh T, Murakami S, Shimizu Y, Taki W, infarction. Nat Med

7.

Miyatake K, Kangawa K. 2005. Adrenomedullin enhances therapeutic potency of 8.

mesenchymal stem cells after experimental stroke in rats. Stroke 36:853-858. Tang YL, Zhang YC, Qian, Shen LP, Phil li ps MI. 2005. Improved graft

mesenchymal stem cell survival in ischemic heart with a hypoxia-regulated hemeoxygenase-1 vector. J Am Coli Cardiol 46: 1339-1350.

Geng YJ.

2003. Molecular mechanisms for cardiovascular stem cell apoptosis and the hearts with atherosclerotic coronary disease and ischemic heart failure. Science, Ann NY Acad 1010:687-697. 10. Hamano K, Li TS, Kobayashi T, Hirata K, Yano M., Kohno M, Matsuzaki M. 2002. Therapeutic angiogenesis induced by local autologous bone marrow cell implantation. Ann Thorac Surg 73:1210-1215. 1 1 . Toma C, Pittenger MF, Cahill KS, Byrne BJ, Kessler PD. 2002. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult

9.

growth

in

murine heart. Circulation 105: 93-98.

12. Wang J S, Shum-Tim D, Galipeau J, et al. Marrow stromal cells for cellular -

cardiomyoplasty: feasibility and potential clinical advantages. J Thorac Cardiovasc Surg. 2000; 120:999-1006.

13. Keira SM, Ferreira LM, Gragnani A, Campaner AB. 2004. Experimental model for establishment of hypoxia in 75 cm2 culture flasks. Acta Cir Bras, Vol 1 9 Special Edition, http://wvvw.scielo. br/acb . 23

t

14.

15.

Zhu WQ, Chen JH, Cong XF, Hu SS, Chen X. 2006. Hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis in mesenchymal stem cells. Stem Cells 24:416-425. .. Maack C, Kartes T, Kilter H, Scha fers HJ, Nickenig G, Bo "hm M, Lauf s U. 2003. Oxygen free radical release in human failing myocardium la aaaociated with

increased activity of rac l-GTPase and represents a target for statin treatment. Circulation 108:1 567-1574. 16. Xie J, Qian J, Yang J, Wang S, Freeman ME, lli, Yi Q. 2005. Critical roles of

Raf7MEK/ERK and PI3K/AKT signaling and inactivation of p38 MAP kinase in

the differentiation and survival of monocyte-derived immature dendritic cells. Exp Hematol 33:564-572. 17. Wei H, Bowen R, Cai Q, et al, 1 995 . Antioxidant and antipromotional effects of the soybean isoflavone genistein. Proc Soc Exp BioiMed. 1995; 208:124-130. 18. Liu D, Homan L, Dillon J. 2004. Genistein Acutely Stimulates Nitric Oxide Synthesis in Vascular Endothelial Cells by a Cyclic Adenosine 5'-Monophosphate­ Dependent Mechanism . Endocrinology Vol. 145, No. 12 5532-5539. 19. Min JY, Liao H, Wang JF, Sullivan MF, Ito T, and Morgan JP. 2002. Genistein Attenuates Myofilament

Postischemic Ca2+

Depressed

Sensitivity

in

Myocardial

Rat

Function

Myocardium.

Exp

by Bioi

Increasing Med

Vol.

227{8):632-638.

20. Si H and Liu D.

2008.

Genistein, Upregulates the Expression of Human

Endothelial Nitric Oxide Synthase and Lowers Blood Pressure in Spontaneously

Hypertensive Rats.J. Nutrition. 138: 297-304. 2 1 . Ren, MQ., Kuhn, G., Wegner, J., Chen, J. 2001. Isoflavones, substances with multi-biological and clinical properties. Eur J Nutr 40 : 13 5-146. 22. Ding, W., and Liu, Y. 201 1. Genistein protects genioglossus myocyte against hypoxia-induced injury through PBK-Akt and ERK MAPK pathways. J Cell Biochem. doi: 10.1002/jcb .23190

LAMPIRAN

Oneway derajad apoptosis Descriptives Persen tase A , po

95% Confidence Interval for Mean

Std.

N

Deviation

Mean

Std. Error

Lower Bound

Upper Bound

Minimum

Maximum

1

5

45.6000

4.56070

2 .03961

39.9371

51 .2629

40.00

52.00

2

5

37.6000

7.26636

3.24962

28. 5776

46.6224

28.00

48.00

3

(5

18.4000

6.061S30

2.712Q3

10.8677

25.i323

12.00

28.00

4

5

22.4000

3.57771

1.60000

1 7.9577

26.8423

20.00

28.00

20

31.0000

12.43933

2.78152

25.1 782

36.8218

12.00

52.00

F

Slg.

Total

Test

of Homogeneity of Variances

PersentaseApo Levene Statistic

df1

16 .687

3

.501

Sig.

df2

ANOVA �po persen ase A

Sum ofSquares Between

Groups

Wtttlln Groups Total

df

Mean

Square

2447.200

3

815.733

492.800

16

30.800

2940.000

19

26.485

.000

Post Hoc Tests Homogeneous Subsets Persen Apo Tukey8

I

Per1akuan

Subset for alpha = 0.05 1

N

-

2

3

5

18,4000

4

5

22,4000

2

5

37,6000

1

5

45,6000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5,000.

25

Oneway MTT Assay Descriptive& MIT 95% Confidence Interval for Mean M"n

N

Lower Bound

Std. Error

Std. Oeviatlon

Upper Bound

Minimum

Maximum

1

15

31 .9600

19.77038

8.84158

7.4118

66.6082

12.60

59.40

2

5

66.8600

10.62888

4.75338

53.6625

80.0575

50.70

77.20

3

5

88.7200

8.98566

4.01851

77.5628

99.8772

75 50

97.90

4

5

1 00.0000

20.85869

9.32829

74. 1005

125.8995

69.30

120.60

20

71.8850

30.38724

6.79479

57.6633

86.1067

12.60

120.60

Total

.

Test of Homogeneity of Variances MTI Levene Statistic

df1

Sig.

df2

3

2.688

16 .081

ANOVA MTT

Sum of Squaret> Between Groups Within Groups Total

Mean Square

df

F

13465.634

3

4488.545

4078.672

16

254.917

17544.306

19

Slg.

17.608 .000

Post Hoc Tests Multiple Comparisons MIT Tukey HSD (I) Per1akuan

(J) Per1akuan

1 -

-

-

Lower Bound

Upper Bound

,01 5

�3.7902

-8,0098

·56,76000

10,09786

,000

.85,6502

·27,8698

..sa 04ooo·

10,09786

000

·96 9302 ,

·39 1498

34,90000'

10,09786

,

01 5

6,0098

63,7902

·21,86000

10,09786

,175

·50,7502

7,0302

10,09786

,022

.S2,0302

-4,2498

10,09786

,000

27,8698

85,6502

3 4

3

Slg.

Std. Error 1 0,09786

·34,90000' '

4 3

Difference (I..J)

2

1

2

4

95% Confidence Interval

Mean

.

.

·33,14000

.

1

56,76000

2

21,86000

10,09786

, 1 75

-7,0302

50,7502

4

·11 ,28000

10,09786

,685

-40 1702

17,6102

1

68,04000'

10,09786

,000

39,1498

96,9302

•

26 •

•.

2

33,14000"

10,09786

,022

4,2488

62,0302

3

1 1 ,28000

10,09786

685

-17,6102

40 1702 ,

The mean difference is significant at the 0.05 level.

Homogeneous Subsets MTT u ey Subset for alpha = 0.05

Perlakuan 1

N

-

2

3

31,9600

1

5

2

5

66,8600

3

5

88,7200

4

5

88,7200 100,0000

Sig.

1 ,000

,

1 75

685

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5,000.

Oneway p38MAPK Oescriptlves

p;38MAPK

95% Confidence Interval for

N

Mean

Std.

Std.

Deviation

Error

Mean Lower Bound

Upper Bound

Minimum

Maximum

1.0726 .73

1.06

.28

1.06

1

5 .9000

. 13903

.

062 1 8

.7274

2

5 .8100

.31174

. 1 3941

.4229

3

5 .5620

. 1 1520

.05152

.4190

.7050

.43

.7-4

4

5 .5440

.23759

. 1 0625

.2490

.8390

.25

.82

.7040

.25361

.05671

.5853

.8227

.25

Total

20

.

1 . 1 971

1.06

Test of Homogeneity of Variances

p;38MAPK Levene Statistic 1 . 386

df1

df2 3

Sig. 16 .283

27 •

I

ANOVA p38MAPK

Between Groups

.477

3 . 1 59

Within Groups

.745

1 6 .047 1 . 222

Total

F

Mean Square

df

Sum of Squares

Sig.

3.416 .043

19

Post Hoc Tests Multiple Comparisons p38MAPK

Tukey HSD

(I) Per1akuan

(J) Perlakuan

(1-J) 1 -

2 -

-

-

4 -

Std. Error

Sig.

Lower Bound

Upper Bound

2

,09000

, 1 3647

,911

-,3004

,4804

3

,33800

, 1 3647

, 1 02

-,0524

,7284

4

,35600

' 1 3647

080

7464

1

-,09000

, 1 3647

,911

- 0344 ,

3

,24800

, 1 3647

4

26600

13647

-

, 33800

, 1 3647

2

-,24800

,13647

4

01800

1

1

3

95% Confidence Interval

Mean Difference

-,4804

,3004

,302

-,1424

,6384

248

- 1244

6564

1 02

-,7284

,302

-,6384

, 1 424

,

,

0524

1 3647

999

-,3724

,4084

-,35600

' 1 3647

,080

-,7464

,0344

2

-,26600

' 1 3647

,248

-,6564

, 1 244

3

-,01800

, 1 3647

,999

-,4084

,3724

,

28

•

I

Homogeneous Subsets p38MAPK Tukey HSD� Subset for alpha

Perlakuan

=

1

N

-

0.05

4

5

,5440

3

5

,5620

2

5

,8100

1

5

,9000

Sg i .

,080

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5,000.

Oneway Caspase-9 Descriptives

casp9 95% Confidence Interval for Mean

Std. N

Mean

Deviation

Upper Bound

Lower Bound

std. Error

Minimum

Maximum

1

5

100.0000

3.74987

1 .67699

95.3439

1 04.6561

96.72

106.02

2

5

91.0880

1 8.43815

8.24579

68.1940

1 13.9820

73.95

120.71

3

5

88.3440

27.84650

12. 45333

53.7680

122.9200

49.22

121.20

4

5

88.8840

19.43293

8.69067

64.7548

1 1 3.0132

68.81

1 1 8.51

20

92.0790

18.45020

4.12559

83.4440

1 00.7140

49.22

121.20

Total

Test of Homogeneity of Variance•

casp9 Levene Statistic

2.074

df1

df2

3

.

Slg. 16

.144

ANOVA casp9 Sum of Squares

df

439.413

3

146.471

Wtthin Groups

6028.372

16

376.773

Total

6467.785

19

Between Groups

F

Mean SQuare

.389

Sig. .763

29

•

t

Post Hoc Testa Multiple Comparisons casp9 Tuke y HSD ( I) Per1akuan

(J) Per1akuan

(I,J)

1

Std. Error

2

8,91200

12,27637

3

1 1 ,65600

4

Sig.

Lower Bound

Upper Bound

,885

-26,2109

44,0349

12,27637

,779

-23 4669

46,7789

1 1 ' 1 1 600

12,27637

,

802

-240069

46 2389

1

-8,91200

12,27637

,885

-44,0349

26,2109

3

2,74400

12,27637

,996

-32,3789

37,8669

4

2,20400

12,27637

998

-32 9189

37 3269

1

- 1 1 ,65600

12,27637

.77�

-46,7789

23,4669

2

-2,74400

12,27637

-37,8669

32,3789

4

-,54000

1 2,27637

,996 1,00

-35,6629

34,5829

-

2 -

3 -

-

95% Confidence Interval

Mean Difference

,

0 1 1 , 1 1 600

12,27637

, 802

-46,2389

24,0069

2

-2,20400

12,27637

,998

-37,3269

32,9189

3

,54000

12,27637

1,00

-34,5829

35,6629

1

4

-

-

0

Homogeneous Subsets casp9 Tuke y HSD• Perlal
Subset for alpha = 0.05

N

-

1

3

5

88,3440

4

5

88,8840

2

5

91 ,0880

1

5

100,0000

Sig.

,779

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5,000.

30 •

t

Oneway Caspase-3 Descriptives cas 3 :

p

95% Confidence Interval for Mean

Std.

N

Std. Error

Lower Bound

Upper Bound

Minimum

Maximum

1 6.67 1 54

3.72467

89.6567

1 1 0.3393

7.45574

73.7435

1 1 5.1445

87.6200

38.44561

17.19340

39.8835

135.3565

22.21

85.8220

36.97343

16.53502

39.9134

1 31 7306

23.1 5

1 1 0.90

91.9710

26.56281

5.93962

79.5392

104.4028

22.21

1 1 8.01

1

5

2

5

94.4440

3

5

4

5 20

Total

Deviation

Mean 99.9980

8.32862

94.26

1 14.48

7 1 .70

.

1 1 8.01

1 17.30

ANOVA casp3 Sum of Squares 636.449

3

Within Groups

12769.620

16

Total

13406.070

19

Between Groups

F

Mean Square

df

212.150 .266

Slg. .849

798. 101

Post Hoc Tests Multiple Comparisons casp3

Tu key HSD

(I) Per1akuan

(J) Perlakuan

_11-Jl

1 -

2 -

-

3 -

4 -

•

95% Con11dence Interval

IVJean Difference

Std. Error

Sig.

Lower Bound

UJ>J>er Bound

2

5,55400

17,86730

, 989

-45,5647

56,6727

3

12,37800

17,86730

,898

-38,7407

63,4967

4

14 17600

17,86730

,856

-36,9427

65,2947

1

-5,55400

17,86730

,989

-56,6727

45,5647

6,82400

17,86730

,980

57,9427

4

8 62200

1 7 86730

962

-44,2947 -424967

59 7407

1

-12,37800

17,86730

,898

-83,4987

38,7407

2

-e,82400

17,86730

,980

-57,9427

44,2947

4

1 79800

17,86730

1,000

-49,3207

52 9167

1

-14,17600

17,86730

,856

-65,2947

36,9427

2

-8,62200

17,86730

,962

-59,7407

42,4967

3

-1,79800

17,86730

1,000

-52,9167

49,3207

3

31

Homogeneous Subsets •

Tuke yHSO

Subset for alpha

Perlakuan

=

1

N

-

0.05

4

5

85,8220

3

5

87,6200

2

5

94,4440

1

5

99,9980

Sig.

,856 ···-··

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5,000.

32 •