ELISA-VIDITEST pnf-h

RUO 

ELISA-VIDITEST pNF-H OD-078

Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II 365, Vestec, 252 42 Jesenice, tel.: +420 261 090 565, [email protected], www.vidia.cz 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISA-VIDITEST pNF-H – ELISA souprava pro kvantitativní stanovení fosforylovaných těžkých řetězců neurofilamentového tripletu. 2. POUŽITÍ: Souprava ELISA VIDITEST pNF-H je určena pro kvantitativní stanovení fosforylovaných těžkých řetězců neurofilamentového tripletu. Měření je možné provádět ve vzorcích mozkomíšního moku, séra anebo plazmy. Souprava je schopna měřit pouze lidská, porcinní, bovinní a krysí neurofilamenta, nehodí se ke stanovení myších neurofilament. Neurofilamenta jsou proteiny cytoskeletu vyskytující se specificky v neuronálních buňkách. Jsou sestavena ze tří zřetězených a vzájemně provázaných podjednotek označovaných podle své molekulové váhy jako těžká (heavy, NF-H), střední (medium, NF-M) a lehká (light, NF-L) neurofilamenta. Neurofilamentové proteiny mají podobnou doménovou strukturu s centrální alfa-helikální doménou umožňující obtáčení neurofilament kolem sebe a koncovými doménami (N- a C-koncová oblast), které bývají fosforylované. Fosforylace těžkých a středních neurofilament v jejich C- koncové doméně vykazuje topologickou závislost vzhledem k neuronu: v axonech jsou neurofilamenta fosforylovaná, vzájemně provázaná a pravidelně uspořádaná do vláken, zatímco v těle neuronu a v dendritech je stupeň fosforylace nízký (Sternberger et al., 1983), jejich provázanost malá a orientace náhodná (Hirokawa et al., 1984). Fosforylovaná neurofilamenta jsou odolnější vůči proteolytické degradaci a mohou být při poškození nervového systému detekována v mozkomíšním moku nebo periferní krvi (séru anebo plazmě) (Petzold et al, 1993, Shaw et al. 2005). Souprava využívá kombinaci monoklonální protilátky NF01 (Lukas et al., 1993) reagující specificky s epitopem přítomným na fosforylovaných formách NF-H a monoklonální protilátky NF05, která reaguje s NF-H nezávisle na jeho fosforylaci (Porchet et al., 2003). 3. PRINCIP TESTU: ELISA-VIDITEST pNF-H je jednokrokový sendvičový imunoanalytický test, kde na povrchu jamek mikrotitrační destičky je navázána monoklonální protilátka NF01, která specificky váže fosforylované formy těžkých neurofilament. Neurofilamenta z testovaného vzorku se váží na protilátku NF01 a souběžně se na ně vyvazuje enzymem označená monoklonální protilátka NF05. Po odmytí molekul nevyvázaných v takto vytvořených imunokomplexech je přidán chromogenní substrát pro enzym. Enzymatická reakce je provázená barevnou změnou roztoku. Reakce je po dosažení rovnovážného stavu zastavena přidáním kyselého roztoku. Množství neurofilament v testovaném vzorku je přímo úměrné intenzitě zabarvení.

1

4. OBSAH SOUPRAVY: Rámeček s dvojstripy (á 16 jamek) potaženými monoklonální protilátkou NF01(vakuově zatavené s vloženým vysoušedlem) 100 µl Standardu pNF-H (bovinní pNF-H, 1 µg/ml), STANDARD 120 µl NF05-HRP 100x - Detekční protilátka NF05 značená křenovou peroxidázou 100x koncentrovaná CONJ 30 ml TBS pH=7,4, r.t.u. 1), TBS 100 ml Promývací roztok 10x konc. WASH 10x 15 ml Ředicí roztok r.t.u., DIL 13 ml Chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u., TMB-BF 13 ml Stop roztok r.t.u., STOP Adhezivní fólie Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (připraveno k použití = v pracovní koncentraci)

6 stripů 2 lahvičky 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička

5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná / deionizovaná voda Přesná pipetovací zařízení (mikropipety a špičky k mikropipetám) Odměrný válec pro ředění promývacího roztoku (1000 ml) Zařízení na promývání stripů Buničitá vata Třepačka mikrotitračních destiček nebo ekvivalent ELISA reader Poznámka: Doporučujeme použití přesného dávkovače např. Multipette Xtream Eppendorf pro pipetování naředěné detekční protilátky. 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ: Všechny složky soupravy nechte před použitím vytemperovat na laboratorní teplotu (~ 20 min), roztoky před použitím důkladně promíchejte. PROMÝVACÍ ROZTOK Pracovní koncentraci promývacího roztoku získáte naředěním koncentrátu 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 100 ml koncentrátu + 900 ml dH2O). Zkontrolujte homogenitu koncentrátu před naředěním. Pokud jsou v koncentrovaném roztoku patrné krystaly soli, zahřejte ho ve vodní lázni na +32°C až +37°C a vyčkejte do rozpuštění krystalů. Před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při teplotě +2°C až +8°C. DETEKČNÍ PROTILÁTKA NF05 S HRP (HRP konjugát) Pro jednu mikrotitrační destičku připravte 7,5 ml roztoku protilátky NF05 značené křenovou peroxidázou. Nařeďte NF05-HRP 100x v ředicím pufru. Pro přípravu menšího množství roztoku HRP-konjugátu použijte doporučené objemy uvedené v tabulce č. 1. Naředěný HRP konjugát neskladujte!

2

Tabulka č. 1: Doporučená ředění NF05-HRP Počet dvojstripů NF05-HRP 100x (µl) 1 13,5 2 25,5 3 37,5 4 49,5 5 63 6 75

Ředicí roztok (ml) 1,35 2,55 3,75 4,95 6,30 7,50

STANDARD pNF-H Standard je dodáván v koncentraci 1 µg/ml. Postupným ředěním koncentrátu získáte sadu standardů pro test. Připravte si do stojánku deset 1,5 ml PP mikrozkumavek a označte je 100 ng, 10 ng, 2000 pg, 1000 pg, 500 pg, 250 pg, 125 pg, 62 pg, 31 pg, 0 pg. Do mikrozkumavek napipetuje postupně 360 µl, 360 µl, 320 µl, 200 µl, 200 µl, 200 µ, 200 µl, 200 µl, 200 µl, 200 µl ředicího roztoku. Promíchejte zásobní koncentrát Standardu na vortexu a napipetujte 40 µl koncentrátu do zkumavky č. 1 (100 ng). Promíchejte obsah, odeberte 40 µl a přidejte do zkumavky č. 2 (10 ng). Promíchejte obsah, odeberte 80 µl a přidejte do zkumavky č. 3 (2000 pg). Dále řeďte dvojkovou řadou 200 + 200 µl, abyste získali celou řadu od 1000 pg/ml až po 31 pg/ml. Do zkumavky s označením 0 pg nic nepřidávejte, nulový standard je samotný ředicí roztok. Měňte špičky po každém ředění, obsah zkumavek vždy dobře promíchejte. Pro snazší pochopení postupu se podívejte níže na obrázek Ředění standardu pNF-H. Obrázek č. 1 Ředění standardu pNF-H

1 µg/ml  STANDARD pNFH

40 µl 40 µl

80 µl 200 µl 200 µl

360 µl

360 µl

100 ng

10 ng

200 µl

200 µl

200 µl 200 µl

320 µl

2000 pg

200 µl

200 µl

200 µl

1000 pg

500 pg

250 pg

200 µl 200 µl 200 µl 200 µl

125 pg

62.5 pg

31.2 pg

0 pg

Ředicí roztok,TMB roztok a STOP roztok neřeďte! Jsou v pracovní koncentraci.

3

VZORKY Vzorky sér, plazmy a mozkomíšního moku uchovávejte při při teplotě –18 °C nebo nižší. Vzorky plazmy rozmrazujte rychle (nejlépe ve vodní lázni při 37°C) - při pomalém rozmrazování mohou plazmatické proteiny precipitovat. Vzorky séra a mozkomíšního moku můžete nechat rozmrazit buď ve vodní lázni při 37°C nebo při při laboratorní teplotě. Připravte si dostatečný objem vzorku (25 µl/jamka), každý vzorek doporučujeme testovat ve dvou paralelách. Vzorky před testem neřeďte. Pokud očekáváte koncentraci vyšší než 2000 pg/ml, nařeďte vzorek ředicím roztokem tak, aby se koncentrace pohybovala v požadovaných mezích (2000-31 pg/ml).

7. PRACOVNÍ POSTUP: a. Nechte všechny složky soupravy vytemperovat na laboratorní teplotu (~ 20 min). b. Připravte pracovní koncentrace (potřebný objem) promývacího roztoku a NF05-HRP (CONJ). c. Nařeďte si standard pNF-H na koncentrace 2000, 1000, 500, 250, 125, 63, 31 a 0 pg/ml. d. Vyjměte mikrotitrační destičku z obalu, oddělte potřebný počet dvojstripů. Nepoužité dvojstripy spolu s vysoušedlem vložte do igelitového sáčku, uzavřete a skladujte při 4°C. e. Napipetujte à 100 µl TBS do jamek a ponechte stát 10 minut (± 2 min). f. Vyklepněte obsah jamek do výlevky a kapalinu zbylou v jamkách vyklepněte na vrstvu buničiny. g. Napipetujte à 25 µl standardů (2000-0 pg/ml) a vzorků do jamek (viz Obr. č. 2). h. Napipetujte bez prodlení à 75 µl NF05-HRP do jamek. i. Přelepte destičku adhezivní folií. Překrytí jamiček omezuje odpařování vody během inkubace. j. Vložte ELISA destičku do třepačky a promíchejte obsah jamek třepáním 10-20 sec při 1000 rpm. k. Inkubujte za stálého třepání (~600 rpm ) 4 hodiny při laboratorní teplotě (18-28 ºC). l. Vyklepněte obsah jamek do sběrné nádoby obsahující desinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Napipetujte do jamek á 250-400 μl promývacího roztoku a obsah vyklepněte do sběrné nádoby. Obraťte destičku a odstraňte zbytky kapaliny z jamek vyklepnutím na vrstvu buničiny. Opakujte promývací krok ještě 4x (celkem promytí 5x). m. Napipetujte do jamek à 100 μl TMB roztoku. n. Inkubujte v temnu 20 minut (± 1 min). o. Napipetujte do jamek à 100 μl STOP roztoku. p. Poklepejte zlehka na destičku, abyste zajistili promíchání STOP roztoku s roztokem TMB. q. Odečtěte absorbanci při 450 nm, doporučujeme použít referenční filtr v rozsahu 620690 nm.

4

Obrázek č. 2 Schéma aplikace vzorků (S=standard, V=vzorek): 1 2 3 4 5 6 7 8 A

S0

S0

V1

V1

B

S31

S31

V2

V2

C

S62

S62

V3

V3

D

S125

S125

V4

V4

E

S250

S250

...

...

F

S500

S500

G

S1000 S1000

H

S2000 S2000

9

10

11

12

8. ZPRACOVÁNÍ DAT: a. Odečtěte absorbance při referenční vlnové délce od absorbance při 450 nm (většina ELISA readerů provádí automaticky). b. Vypočítejte průměry absorbancí sousedních jamek v dvojstripech. c. Odečtěte od všech spočítaných průměrů hodnotu průměru Standardu 0 (Blank Difference). d. Sestrojte graf závislosti absorbance (osa Y) na koncentraci pNF-H v ng/ml (osa X). Proložte přímku mezi body (můžete použít např. aplikaci Microsoft Excel). e. Vypočtěte koncentrace pNF-H v testovaných sérech z rovnice regresní křivky. 9. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ: Vzorky s koncentrací nižší než 31,25 pg/ml (nejnižší standard) nejsou hodnotitelné jinak než, že obsahují méně než 31,25 pg/ml pNF-H. Vzorky s koncentrací vyšší než 2000 pg/ml můžete hodnotit buď jako vzorky s koncentrací vyšší než 2000 pg/ml nebo je nařeďte v ředicím pufru a otestujte znovu zředěné, např. 2x a 4x (naměřenou koncentraci potom vynásobte ředěním). 10. CHARAKTERISTIKY TESTU: Obrázek č. 3 Příklad standardní křivky pNF-H Standard pNF‐H

OD 450/620 nm Blank Diff

3 2,5 2

y = 1,2123x R2 = 0,9912

1,5 1 0,5 0 0,01

0,1

1 pNF‐H ng/ml

5

10

10.1. Platnost testu a. Hodnoty absorbance 450/620 nm standardu 0 nesmí být vyšší než 0,250. b. Hodnoty absorbance nejvyššího standardu (2000 pg/ml) musí být vyšší než 1,250. c. Rozdíl absorbance nejnižšího standardu (31,25 pg/ml) a absorbance nulového standardu musí být větší nebo roven 0,010 (450/620 nm). 10.2. Opakovatelnost (intraassay) (N = počet jamek na téže destičce): N Vzorek 32 Standard 2000

Ø A450/620 2,348

10.3. Reprodukovatelnost (interassay) (N= počet opakovaných testování) N Vzorek Ø koncentrace pg/ml 5 sérum A 53 5 sérum B 88

SD 0,088

CV (%) 3,7

SD 6 11

CV (%) 13 20

10.4. Detekční limit Detekční limit byl stanoven jako koncentrace pNF-H odpovídající třem směrodatným odchylkám průměru nulového standardu z 10 opakovaných měření. Detekční limit testu je 24 pg/ml. 11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Testy musí provádět kvalifikovaní a proškolení pracovníci. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. Předměty, které přišly do styku se vzorky (byly potřísněny), autoklávujte 1 hodinu při 121°C, nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin) v koncentraci doporučené výrobcem. Tekuté odpady obsahující STOP roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Stop roztok obsahuje 0,9 M roztok kyseliny sírové, pracujte s ním opatrně. Při potřísnění kůže nebo sliznice, opláchněte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. 12. UPOZORNĚNÍ: Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. Pracujte tak, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci reagencií, reagencie po použití pečlivě uzavírejte. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci. TMB roztok nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. Dodržujte pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména:

6

- nedostatečným vytemperováním a promícháním reagencií před použitím - nepřesným pipetováním. - potřísněním okrajů jamek vzorky nebo NF05-HRP - použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů 13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: a. Soupravu a její složky skladujte při teplotě +2°C až +10°C. b. Složky nezmrazujte, chraňte je před přímým slunečním zářením. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku nalepeném na krabici k soupravě, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. c. Nespotřebované stripy dobře uzavřete do plastikového sáčku společně s vysoušedlem. Takto uložené stripy jsou stabilní po dobu 4 týdnů. d. Po použití pečlivě uzavřete všechny lahvičky reagencií. e. Naředěný nespotřebovaný Promývací roztok je stabilní po dobu 1 týdne, pokud je uchováván při teplotě +2°C až +8°C. f. Soupravy se přepravují chlazené. g. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. 14. TESTOVACÍ SCHÉMA: Připravte si pracovní koncentrace reagencií a Standardů ↓ Napipetujte 100 μl TBS do každé jamky ↓ Inkubujte 10 min při laboratorní teplotě ↓ Vyklepněte TBS z jamek ↓ Napipetujte 2x25 μl Standardů a vzorků Přidejte 75 μl NF05-HRP do každé jamky ↓ Inkubujte 4 hodiny/ 600rpm ↓ 5x promyjte (250-400 μl/jamku) ↓ Napipetujte 100 μl TMB do každé jamky ↓ Inkubujte 20 minut ↓ Napipetujte 100 μl STOP roztoku do každé jamky ↓ Změřte absorbanci při 450 nm s referencí při 620-690 nm

7

Doporučená literatura: Sternberger LA, Sternberger NH. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983 Oct;80(19):6126-30. Hirokawa, N., Glicksman, M. A. and Willard, M. B. (1984). Organization of mammalian neurofilament polypeptides within the neuronal cytoskeleton. J.Cell Biol. 98, 1523-1536 Petzold A, Keir G, Green AJ, Giovannoni G, Thompson EJ. A specific ELISA for measuring neurofilament heavy chain phosphoforms. J Immunol Methods. 2003. Jul;278(1-2):179-90. Shaw G, Yang C, Ellis R, Anderson K, Parker Mickle J, Scheff S, Pike B,Anderson DK, Howland DR. Hyperphosphorylated neurofilament NF-H is a serum biomarker of axonal injury. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Nov 4;336(4):1268-77. Lukas Z, Draber P, Bucek J, Draberova E, Viklicky V, Dolezel S: Expression of phosphorylated high molecular weight neurofilament protein (NF-H) and vimentin in human developing dorsal root ganglia and spinal cord. Histochemistry. 1993 Dec; 100(6):495-502. Porchet R, Probst A, Draberova E, Draber P, Riederer IM, Riederer BM.: Differential subcellular localization of phosphorylated neurofilament and tau proteins in degenerating neurons of the human entorhinal cortex. Neuroreport. 2003 May 23;14(7):929-33.

Souprava byla vyvinuta za finanční podpory ze státních prostředků poskytnutých prostřednictvím Akademie věd ČR KAN 200520701. Datum poslední revize tohoto návodu: 2014/03

8