ÉLELMISZERIPARI BIOTECHNOLÓGIÁK Biofenolok az olajfa termésében és az olívaolajban – hatások molekuláris, celluláris és élettani szinten Tárgyszavak: olívaolaj; mediterrán étkezési kultúra; biofenolok. A biofenolok előfordulása, molekulaszerkezete A természetes alapanyagból kivont olajok és zsírok két, összesen 98%-ot kitevő fő alkotóik, a triacilgliceridek és poláros lipidek mellett kis mennyiségben értékes, ún. biomolekulákat: – szterineket, – tokoferolokat, – terpéneket és – biofenolokat tartalmaznak, utóbbiakat – egyszerű (simple biophenols, sBP) és – észterezett (secoiridoid biophenols, secoBP) formában.
OH
CH2-CH2-OH
1. ábra A legegyszerűbb biofenol: 2(4-hidroxi-fenil)etanol
OH(OMe)
OH OH(H;OMe)
(MeO) H
R1
Rs 3-12 OH 1; 2
RO
O COOR2
O OGlu A 13; 14; 17; 18
1. tirozol, R1 = H 8. szinapinsav Me, 2. hidroxi-tirozol, R1 = 0H 9. o-kumarinsav 3. kávésav 10. protokatechinsav 4. homovanillinsav 11. p-hidroxi-benzoesav 5. sziringinsav 12. vanillinsav 6. p-kumarinsav 13. oleuropein, R =1, R2 = Me 7 ferulinsav 14 ligsztrozid R = 2 R2 = Me
O
RO
COOR2
O
H O
Me B 15; 16; 19
15. hidroxi-tirozil-elenolát, R = 1, R2 = 16. tirozil-elenolát, R = 2; R2 = Me 17. oleozid 11-metilészter, R = H, R2 = Me 18. oleozid, R = H, R2 = H, 19. elenolsav, R = H, R2 = Me
2. ábra Az olajfa termésében található fő biofenolok szerkezete A secoPB-k terpénvázas vagy hidroxiaromás szekunder növényi anyagcseretermékek, amelyekben egy vagy több OH-gyök fenolfunkcióra utal. „Polifenol” elnevezésük hibás, mivel speciális, maximálisan 614-es molekulasúlyú polimerizált molekulákat képeznek, kémiai szerkezetük a legegyszerűbb 2(4-hidroxi-fenil)etanoltól (1. ábra) a polimerizált tanninig terjed (2. ábra). Gyakran kapcsolódnak cukormolekulához, többnyire glükózhoz labilis hemiacetál-kötéssel glükozidot formálva. Biofenolok előfordulnak számos növényben: nagy mennyiségben citrusfélékben, egyes gyógynövényekben, borban és az olajfa (Olea europaea) kü-
lönböző részeiben, főként csonthéjas, belül bogyókat rejtő olajos termésében. Kitűnnek szerkezeti változatosságukkal, az aromás gyűrűhöz kapsolódó OH-, alkohol-, karboxil-alkén- stb. gyök helyettesítésével. Az olíva-biofenolok egyedüli sajátja a fenolos jelleg. Jellemző még rájuk a primer metabolitokhoz: fehérjékhez, szénhidrátokhoz való kötődési hajlam, amely biztosítja jó biológiai hozzáférhetőségüket. Az olajfa olaja: az olívaolaj A világ olajfaültetvényeinek 98%-a földközi-tengeri országokban található. A fa termésének olaja a növényi olajok közt egyedül készül gyümölcsből (nem olajos magból), mégpedig helyi és kiterjedtebb regionális igényekhez és ízlésekhez szabott eljárásokkal, továbbá – ugyancsak kizárólagosan jellemző módon – finomítás nélkül. Az olajfa terméséből a termékek két fő csoportját állítják elő, részben évezredes hagyományokra támaszkodva: – étolajat, különböző érettségi fokú vagy szárított bogyókból, esetleg fehérítéssel kiegészítve és – „különlegesen friss („szűz”) olajat” (extra virgin olive oil) a legrégibb hagyomány vagy új technológia szerint a mezokarpiumból, vagyis a középső maghéjból. Az olívaolaj-gyártás ma használatos technológiái a termés érettségi állapotában különböznek: – zöld termés feldolgozására 54%, – feketére érettére 34%, – vörösre 21% jut. Három közül két esetben használnak lúgos kezelést a biofenolok egy nagy tömegarányt képviselő csoportjának hidrolíziséhez, a keserű íz megszüntetése céljából. Az olajfa termésének feldolgozására szolgáló egyik ősi módszer szerint a feketére érett termést fehérítik, sózzák és megszárítva préselik. Használták már a Kr. e. 2. évezred végén, később az egykori Magna Graeciához, vagyis a görög gyarmatbirodalomhoz tartozó Oinotria vidékén, a mai Calabriában, ahol ma is élő gyakorlat. Terméke az „aszalt Oinotria étolaj” (wised Oinotria table oil). A szárításhoz a régiek feltehetően a napot hívták segítségül, a modern ipari eljárás kemencéket használ. Egymást követő műveletei – a levelek eltávolítása, osztályozás minőség és méret szerint, – hidegvizes mosás, – fehérítés porlasztott forró vízzel, részben fehérítés, részben a keserű íz elvétele céljából, – hűtés hideg vízzel, – sózás és szárítás több napon át, tartósítás céljából.
Az olívaolajnak mint étrendi komponensnek a szív és a keringési rendszer mutatóira gyakorolt kedvező hatása és jó íze, aromája mellett biofenoltartalmával összefüggésben még egy jelentős effektus érdemel figyelmet: az olaszországi halálozási statisztika szerint az ország déli régióiban kb. fele anynyian halnak meg emésztőszervi rákban, mint az északi és középső országrészekben. Nyilvánvaló az összefüggés az étkezési szokásokkal: a zsír és gyakorlatilag hús nélküli, helyettük növényi olajokat és halakat, tengeri állatokat tartalmazó, tipikus mediterrán étrend csak Olaszország déli tartományaira (Szicília, Apulia, Calabria és a kis szigetek, valamint Szardínia) jellemző. Franciaországban is meggyőző a nyelőcső, a vastagbél és a végbél halálos kimenetelű rákjának gyakorisága közti különbség észak (Rajna-vidék), ill. dél (a Földközi tengeri partvidéke) vonatkozásában. Az olaj minősége az összetevőit meghatározó termesztési gyakorlattól a termés érettségétől és fertőzöttségétől, valamint a termés feldolgozásának műveleteitől (zúzás, keverés, extrahálás, tárolás, a keserű ízt eltüntető kezelés) függ. Mindezek lényegesen befolyásolják a növényi termékek tulajdonságait, ízüktől, zamatuktól kezdve funkcionalitásukon át a mikrobiális hatásokkal szembeni viselkedésükig. Az olívatermékek érzékszervi és funkcionális értékei elsősorban a különféle o-dihidroaromás és a monoterpén-származékok változataihoz köthetők. A biomolekulákra, köztük biofenolokra vonatkozó részletes ismeretek, a még jobb minőség érdekében javíthatják a mediterrán étrendben, de mind inkább más vidékek, országok étkezési kultúrájában is jelentős szerepet játszó olívaolaj kinyerési műveleteinek műszaki színvonalát, valamint az olajfa termesztési és nemesítő szelektálási gyakorlatát. Kedvező élettani hatások és azok biomechanizmusa Molekuláris-biológiai szinten a jelentős mennyiségben jelenlevő biofenolok két alapvető hatását kell kiemelni: – az emberi szervezetben az antioxidáció, – növényekben a mikrobiális kórokozók, valamint rovar- és egyéb kártevők elleni védelmet; figyelmet érdemel még – a biofenolok részvétele kereszthidak létesítésében a növényi sejtfal poliszacharid-láncai között. Az olíva-biofenolok szabad gyökök inaktiválása és fémkelátképzés útján fejtenek ki igen nagy fiziológiás jelentőségű antioxidáns hatást. Az egészséges szervezetben egyensúlyban van a reaktív oxigéntartalmú vegyületekből kiinduló szabadgyökképződés és az ártalmaiktól védő antioxidánsok termelődése. Ha megbomlik az egyensúly, csökken a védekezőképesség és/vagy fokozódik az oxidáló anyagok képződése, s a sejtekben oxidatív stressz lép fel, amely hozzájárul egyes krónikus állapotok, így rendellenes lipidoxidáció és gyulladások okozta degeneratív érrendszeri és ízületi
betegségek kialakulásához. Ezek megelőzésében, ill. bizonyos szinten tartásában fontos szerepük van a szervezetbe kívülről juttatott antioxidánsoknak, így az étrenddel bőven fogyasztott biofenoloknak. Egyes BP-k laboratóriumi kísérletben, majd gyakorlati sugárvédelemként alkalmazva is helyi antioxidáns hatást is kifejtettek, amennyiben megelőzték UI-sugárzás és NO-gyök okozta fotooxidatív bőrreakció megjelenését. Az erős antioxidáns hatású BP-k új alkalmazási lehetőségét kínálják azok az olívaolaj-technológiák, amelyek az alapanyag átgyúrásához vizet használnák. Ez a víz, amelyet a művelet végén elöntenek, sok BP-t tartalmaz, amely kinyerhető és önállóan szolgálhatja a prevenciót. Az olajfa kórokozók elleni védelme secoBP-knek köszönhető, amelyek elindítják fitoalexin szintézisét és a fertőzés helyén való felhalmozódását, továbbá sejtfalak módosulását és hiperérzékeny sejtek elhalását. Az olajültetvények legismertebb kártevője az olívalégy (Bactrocera oleae) csökkenti a terméshozamot és az olaj miőségét is rontja. A B. oleaenek ellenálló olajfákban gyorsabb BP-felhalmozódást és fitoalexin-szintézist mutattak ki. Az olajfa termésében a biofenol-molekulák monoterpén oldalán lejátszódó glükozilálás (glükozidképződés) gondoskodik arról a lekötésről, amely a szerkezet más részeiben végbemenő biológiai aktivitásokhoz szükséges átalakulások feltétele. A glükozilálásnak tulajdoníthtó a lipofil/hidrofil-átalakulás is. Ugyanakkor a secoBP-glükozidok hidrolízise elengedhetetlen az olajfa kártevőkkel szembeni ellenállásához. Az olajfa sztereoszelektív β-glükozidázának hatására különböző fitoalexinok képződnek, amelyek védenek mikrobiális fertőzés, rovarok és növényevők kártevése ellen. A natív β-glükozidáz hatását felhasználja az olajfinomító ipar is mint aromatermelő és a keserű ízt csökkentő reakciósort. Trigliceridek mennyiségi meghatározása olajban Az olajfa korával változik termésének fiziológiai állapota, amelynek egyik meghatározó tényezője a kinyert olajban a trigliceridek és a biofenolok súlyaránya. Az élelmiszer-minőségű végtermékek biofenol-koncentrációja a termesztett változat, a gyümölcs érettségi foka, a környezeti tényezők és a feldolgozási műveletek közötti bonyolult kölcsönhatások eredményeként alakul ki. A termelőnek a triglicerid-hozam és a biofenol-tartalom közötti érzékeny mérleg szerint kell optimálnia a szüretelés időpontját (3. ábra). A gyümölcs növekedése a mezokarpium erőteljes megvastagodásával, és közben lipidek bioszintézisével és felhalmozódásával indul. A gyümölcs olajtartalmát régebben szárított gyümölcspép Soxhlet készülékben való extrahálása útján mérték, ma leggyakrabban ugyancsak oldósze-
res extrakció után gázkromatográfiásan határozzák meg. Valamennyi módszer néhány g-os szárított mintát igényel és igen lassú. I. időszak
II. időszak
III. időszak
IV. időszak
300
BP, mg/l
250 200 150 100 50 0
I. ültetvény
II. ültetvény
III. ültetvény
IV. ültetvény
3. ábra „Különlegesen friss olaj” összes biofenol-tartalma különböző ültetvényekben Az 1980-as években kifejlesztett differenciál letapogató kolorimetria (differential scanning colorimetry, DSC) pontos és érzékeny, alkalmazásának csak az a feltétele, hogy a vizsgálati anyag egyéb halmazállapot-változásai (víz) ne „keresztezzék” a trigliceridek kristályosodási tartományát. A vizsgálat 3 órát vett igénybe. Ezzel a módszerrel 100 mg-osnál kisebb mintákon akár naponta lehet ellenőrizni az ültetvények termésének triglicerid- és víztartalmát a gyümölcsszedés legkedvezőbb idejének kijelölése céljából. Olívaolaj biofenoljainak laboratóriumi vizsgálata Az olaszországi Calabria egyetemén működő Mediterrán Élelmiszerkutató Intézetben alapvető fizikai–kémiai és biokémiai jellemzőik alapján az olajfa termésének és a belőle nyert olívaolajnak a biofenoljait az – oldható, – oldható észterezett és – oldhatatlan, sejtfalhoz kötött fő csoportokba sorolták. Az osztályozást megelőző analitikai munkához az olajtermelés számára is jelentős mezokarpiumból indultak ki. A minták elsődleges kezelésére és a biofenol-csoportokhoz való besorolására alkalmazott módszerek: – savas hidrolízis egyszerű terpénbifenolokhoz, – lúgos hidrolízis oldható, észterezett bifenolok kinyerésére, – diklór-etános extrahálás citoplazma BP-k azonosításához, valamint
– oldott észterezett és oldhatatlan kötésű BP-k kivonása metanol/acetoneleggyel. Az osztályozáshoz szükséges további analitikai munka során kidolgozták – az összes biofenolok, – az oldható és oldható észterezett biofenolok mennyiségi meghatározására, – a citoplazmában oldódó, valamint – a különféle glükozidos, észterezett és sejtfalhoz kötött biofenolok minőségi meghatározására szolgáló oszlopkromatográfiás (CC), nagy feloldóképességű folyadékkromatográfiás (HPLC) és magrezonanciás (NMR) módszereket – különböző területekről származó, – érettségi fokú és – különbözőképpen nyert mintákban. Az olajfa változatainak megkülönböztetésére alkalmat ad még az aktív szénen való adszorpció és deszorpció megoszlása különböző érettségi fokú – zöld, vörös és fekete – mintákban. A fekete extraktumokban az NMR-vizsgálat már nem mutatott ki BP-szerkezetet. Glükozidokat a legtöbb Olea europaea mintában nagy mennyiségben, de a növénycsalád (Oleaceae) más fajtáiban is találtak. Biofenolok lokalizálása sejtekben A biofenolok megjelenését különböző szövetekben és a sejtek részeiben a termés hosszanti vágású szeleteiben vizsgálták különböző festéssel. A biofenolok vörös színe jól elkülönült a sejtfal kékjétől. A sejtvakuolák (sejtüregek) BP-zárványainak száma és mérete szövetenként és anatómiai zónánként változott. Az epidermiszben keveset, a mezokarpiumban, maghéjban igen sokat találtak, nagyrészt a sejtfalnál tömörülve. A rovarbehatolások közelében sűrűn egymás mellett levő cseppszerű zárványok láthatók, igen nagy BP-koncentrációra utaló színnel. A festés megkülönböztette a gyümölcs érettsége szerint eltérő színű mintákat. A fekete termésmintákban több és nagyobb (µm2 méretű) volt a zárvány, mint a zöldekben. Az éretlen mezokarpiumban amorf, egymástól elkülönült, a fekete mintában gyakran egymással összefolyó nagy méretű zárványokat találtak. A biofenolok az érés folyamán leginkább a gyümölcs külső részein gyűlnek össze. Ezt a felhalmozódást valószínűleg a biotikus és abiotikus stresszhatásokkal szembeni citoplazmás védekező mechanizmus irányítja. A sejteken belül enzimaktivitást a mezokarpium-sejtek vakuoláiban mutatták ki. A natív β-glükozidáz természetes szubsztrátuma, a secoBP-k egyik csoportja egy szövetmintában teljes hidrolízist szenvedett, miközben egy szin-
tetikus glükozidkészítmény érintetlenül maradt, ami az enzim szelektivitását igazolja. Az elemzési eredményeket befolyásolta a kiindulási anyag állapota és kezelése, ti. a fagyasztás folyékony nitrogénnel, ép vagy megtört bogyók fagyasztásos szárítása. Összehasonlítások alapján az ép bogyók fagyasztásos szárítása mellett döntöttek. Az is kiderült, hogy a minták molekula-összetétele megváltozott a tárolás közben, még –80 °C-on is. A natív enzimtevékenység tehát ha kisebb intenzitással is, folytatódik a termés leszedése után mint szekunder metabolizmus. (Dr. Boros Tiborné) Uccella, N.: Olive biophenols: biomolecular characterization, distribution and phytoalexin histochemical localization in the drupes. = Trends in Food Science and Technology, 11. k. 9– 10. sz. 2001. p. 315–327. Saija, A.; Uccella, N.: Olive biophenols: functional effects on human wellbeing. = Trends in Food Science and Technology, 11. k. 9–10. sz. 2001. p. 357–363. Uccella, N.: Olive biophenols: novel ethnic and technological approach. = Trends in Food Science and Technology, 11. k. 9–10. sz. 2001. p. 328–339.
EGYÉB IRODALOM Zastoff, M.: Antimicrobial peptides of multicellular organisms. (Többsejtű szervezetek antimikrobiális peptidjei.) = Nature, 415. k. 6870. sz. 2002. jan. 24. p. 389–395. Kozma-Bognár K.; Nagy F.: Biológiai ritmusok, molekuláris órák. = Természet Világa, 133. k. 1. sz. 2002. p. 12–16. Szabó M.; Bátki Zs.: A genetikailag módosított organizmusokra vonatkozó Európai Uniós és hazai jogi szabályozás változásai II. r. = Élelmezési Ipar, 55. k. 12. sz. 2001. p. 357–363. Hantos G.; Kováts T. stb.: A biotechnológia szerepe a Richter Gedeon Rt. történetében. = Magyar Kémikusok Lapja, 56. k. 12. sz. 2001. Kobolák J.: Hogyan kerül a pókselyem a kecsketejbe? = Természet Világa, 132. k. 12. sz. 2001. p. 547–548. Frigyesi V.; Nyeste L.: A biotechnológia fejlődésének „történelme” és hatásai. = Valóság, 44. k. 11. sz. 2001. p. 68–83. Die biologische Betriebskontrolle in der Brauerei (Teil 3). (Biológiai üzemellenőrzés a söriparban. 3. r.) = Brauerei Forum, 16. k. 11. sz. 2001. nov. 12. p. 310–311.
