ÉLELMISZERIPARI BIOTECHNOLÓGIÁK Aromaanyagok biotechnológiai szintézise természetes zsírsavakból Tárgyszavak: aromaanyag; bioszintézis; enzimes észterszintézis; átészterezés. A természetes aromaanyagok továbbra is igen jelentősek Nyugat-Európában és az USA-ban, ahol a törvények világosan meghatározzák, mi tekinthető természetesnek és mi nem. Így pl. az EU aroma irányelvében (1988) a „természetes” kifejezés csak olyan aromaanyagokra alkalmazható, amelyeket „megfelelő fizikai módszerrel (desztillálás, oldószeres extrakció, enzimes vagy mikrobiológiai eljárások) állítanak elő növényi vagy állalti eredetű anyagokból, nyers állapotban vagy emberi fogyasztásra feldolgozva (szárítással, aszalással és fermentálással)”. Ennek alapján ipari eljárásokat dolgoztak ki többé vagy kevésbé komplex természetes keverékekből a meghatározó aromaanyagok izolálására, viszonylag egyszerű fizikai módszerekkel. Így pl. a természetes L-mentolt mentaolajokból állítják elő kristályosítás, a (+)-linaloolt pedig korianderolaj desztillálása útján. A desztillálási és extrahálási lépés kombinálása eredményes lehet zsírsavak oxidatív bomlástermékeinek izolálása és dúsítása céljára. Aromaanyagok biotechnológiája Már 1922-ben leírták egyes baktériumok és gombák aroma- és illatanyagtermelő képességét. Az utóbbi 20 évben jelentős haladás tapasztalható ezen a területen és számos, nagyobb aromatermelő vállalat aktívan részt vesz a kutatásban. Jelenleg – a becslések szerint – mintegy 100–150 egyedi, természetes aromakomponenst állítanak elő különböző biotechnológiai eljárásokkal. Ezek az anyagok a vegyületek igen sok, különböző csoportjába tartoznak. Néhányat 10 t mennyiségben állítanak elő (pl. etil-acetát, n-vajsav, 2-metil-vajsav). A kisebb volumenű kategóriába tartozik a γ-dekalakton és a vanillin, amelyeket évente 5 t mennyiségben gyártanak. Még kisebb mennyiségben gyártott – és így még értékesebb – anyagok a transz-2-hexenal, a fenil-etanol és a nhexanol. Az utóbbiak ára könnyen elérheti az 1000–10 000 USD/kg-ot, a kínálat és kereslet függvényében. Valószínűleg az alifás észterek képezték az aromaanyagok első csoportját, amelyeket behatón vizsgáltak biotechnológiai termelés céljából. Ennek oka, hogy a szükséges alkohol- és savkomponensek hosszú évekig természetes
alakban rendelkezésre álltak, és hogy az észterek kulcskomponensei sok, főleg gyümölcsaromának. Az észterezési folyamatot sok esetben bizonyos lipázokkal végezték, amelyek képesek észtereket szintetizálni savakból és alkoholokból, bizonyos feltételek között. Néhány – kiindulási anyagként szükséges – karbonsav előállítható állati vagy növényi zsírok lipolitikus bontása és desztillálása útján. Más savak pedig kozmaolajból nyert, megfelelő alkoholok fermentatív oxidációjával állíthatók elő (pl. a 2-metil-vajsavat a 2-metil-butanol oxidatív biokonverziójával, Acetobacter jelenlétében termelik). Ha a természetes, aromaaktív γ- és δ-laktonok gyártása a cél, akkor a zsírsavak is alkalmazhatók szubsztrátként. Így a közepes lánchosszúságú zsírsavak helyspecifikus hidroxilálása Monilia fructicola vagy Mucor circinelloides gombák alkalmazásával megfelelő γ- és/vagy δ-laktonok képződését eredményezi. Bizonyos élesztők képesek átalakítani természetben előforduló hidroxi-zsírsavakat – pl. ricinolsav – többszörös β-oxidációs lépéseken át γ-dekalaktonná. Más enzimrendszerek telítetlen zsírsavakat (pl. linol- és linolénsav) alakítanak át C6-aldehidekké és ezek alkoholjaivá, amelyek igen értékes aromaanyagok. A transz-2-hexenal és a cisz-3-hexenol előállítható linolénsavból, lipoxigenáz és hidroperoxidáz-liáz hatására. Észterszintézis enzimes átészterezéssel A természetes zsírok szokatlan zsírsavak forrásai is lehetnek, amelyek érdekes aromasajátosságokat mutathatnak vagy értékes érzékszervi tulajdonságokkal rendelkező származékok előállítására alkalmasak. A transz-2,cisz-4-dekadiénsav viszonylag ritkán fordul elő, amelynek eltilésztere közismerten a körte jellegzetes aromáját biztosítja. Az analitikai vizsgálatok szerint számos rokon észter vesz részt a nemes körte általános aromájának kialakulásában. Legtöbb estben ezeknek az észtereknek a savrésze tíz szénatomot és két-három szén–szén kettőskötést tartalmaz. Az indiai duriánfa gyümölcse is tartalmaz ilyen szokatlan C10-észtereket, amelyek jelentősen hozzájárulnak a szokatlan aroma gyümölcsös jellegéhez. Az irodalmi adatok szerint a Stillingia-olaj – amely újra kapható a kereskedelemben – a transz-2,cisz-4-dekadiénsav jó forrása lehet. Ezt az olajat a Sapium sebiferum cserje magjából nyerik és kb. 5% ilyen zsírsavat tartalmaz vegyes trigliceridek alakjában. A dekadiénsav felszabadítására irányuló első kísérletek – csak fizikai módszerek alkalmazásával – nem jártak sikerrel. A triglicerideket többé-kevésbé teljesen sikerült felbontani, de a sav nagy reakcióképessége meggátolta elegendő mennyiségben való izolálását. A nyers termék gázkromatográfiás vizsgálata azt mutatta, hogy a dekadiénsav max. 0,2%-ban van jelen. A trigliceridkötések hidrolizálása észterázokkal vagy lipázokkal nem volt tökéletes vagy csak nagyon kevés savat eredményezett, mivel az enzimek specificitása a dekadiénsavra vonatkozólag igen kisfokú volt. Elméletileg a célvegyület előállítható a Stillingia-olaj enzimes átészterezésével, etanol jelenlétében. A vizsgált lipázok és észterázok zöme azonban nem
volt eredményes és csak kisfokú specificitást mutatott. Így a Mucor, Pseudomonas és Candida elterjedt lipázai – amelyek észterszintézisre képesek – nem tudtak etil-dekadienátot termelni átészterezéssel. Az 1. táblázat mutatja, hogy ezek az enzimek aktívak az adott viszonyok között, egyébként a linolénsav etilésztere nem képződött volna. 1. táblázat Az általában használt lipázok és észterázok etil-transz-2,cisz-4-dekadienoát-termelő képessége Stillingia-olajból a)
Etilészter képzése
Észterképződés (GC %) gázkromatográfiásan enzim 1b)
Transz-2,cisz-4-dekadiénsav Linolénsav
0,4 65,8
c)
d)
enzim 2
enzim 3
0,05
0,10
57,5
65,2
a)
Tipikus reakciókörülmények: 10 g Stillingia-olaj, 1 g etanol, 1 g enzim, 20 °C, 3 nap. 1. enzim: észteráz 30 000 Mucor mihei-ből (Gist Brocades). c) 2. enzim: lipáz PS Pseudomonas fajból (Amano). d) 3. enzim: lipáz B Candida cylindracea-ból (Biocatalysts). b)
2. táblázat Lipázok Stillingia-olajból való etil-transz-2,cisz-4-dekadienoát-termelő képességének szűrővizsgálata Lipáz (név vagy forrás)
Gyártó cég
Etil-transz-2,cisz-4-dekadienoát (GC-sáv %) 3 nap után
7 nap után
1. SP 523
Novo
0,35
1,15
2. SP 524
Novo
0,10
0,10
3. SP 525
Novo
5,60
5,55
4. Candida cylindracea
Biocatalysts
0,15
0,10
5. Mucor miehei
Biocatalysts
–
–
6. Pankreatin
Biocatalysts
–
–
7. Pesudomonas fluorescens
Biocatalysts
0,20
0,45
8. Chromobacterium viscosum
Biocatalysts
0,05
0,05
9. Novozym 435
Novo
6,50
8,00
További vizsgálatokat végeztek alkalmasabb enzimek keresése céljából (2. táblázat). A lipázok zöme ismét igen kis aktivitást mutatott dekadiénsavval szemben. Jó eredményt csak az SP525 és Novozym 435 lipázokkal értek el. Utóbbi rögzített, míg az előbbi szabad lipáz B (Candida antarctica-ból). Ez azt
mutatja, hogy etil-dekadiénoát előállítása Stillingia-olajból átészterezéssel lipázokkal inkább kivételnek, mint szabálynak tekinthető. Lipolitikus átészterezés optimálása A 2. táblázat mutatja, hogy a rögzített Novozym 435 lipáz volt a legjobb a két Candida-lipáz közül. A további optimálási kísérletek eredményeit a 3. táblázat tartalmazza. A kiindulási, standard viszonyok között az átészterezéshez 2 napi 45 °C-os hőmérséklet bizonyult optimálisnak. A mért, tipikus maximum 4,5% etil-transz-2,cisz-4-dekadienoát körül volt, amely – a hozzáadott etanol által eredményezett 20%-os hígulás folytán – kb. 5,0–5,5% savkoncentrációnak felel meg az eredeti olajban. 3. táblázat Novozym 435-tel katalizált átészeterezés optimális feltételei Paraméter/komponens Hőmérsékleta) a)
Reakcióidő
Optimális érték 45 °C 2 nap
Etanol
20 g
Novozym 435
20 g
a)
Tipikus reakcióelegy: 100 g Stillingia-olaj, 20 g etanol, 20 g Novozym 435 nirtogén alatt rázva.
Megállapították, hogy az eredetileg választott etanolmennyiség valóban optimális. Az átészterezési reakció sebessége nagymértékben függ az enzimkoncentrációtól (1. ábra). Ezért elhatározták, hogy továbbra is 20%-os enzimkoncentrációt alkalmaznak valamennyi kísérlet során. Az enzim üzemi viszonyok között várható, hosszú távú stabilitásának meghatározása céljából az átészterezést több ciklusban megismételték, miközben a rögzített enzimet ismételten felhasználták újabb kezelés nélkül. A 4. táblázat mutatja, hogy az enzim igen sok cikluson át használható, jelentős aktivitáscsökkenés nélkül. Elhatározták ezután az inkubálási időszak 1–3 nap közötti változtatását, hogy igazolják az egyetlen ciklusra vonatkozó eredményeket.
5
etil-dekadienoát
4
3
5 % enzim 2 10 % enzim 1
20 % enzim
0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
inkubációs idő (napok)
1. ábra Enzimkoncentráció hatása az etil-dekadienoát képződési sebességére Stillingia-olaj átészterezése során 4. táblázat Ismételten felhasznált Novozym 435 hatása az etil-dekadienoát hozamára Ciklus 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inkubációs idő (nap)
Etil-dekadienoát-tartalom (%)
1 1 1 2 2 2 2 3 3 1 1 3
4,5 4,2 4,2 4,6 4,2 4,3 4,5 4,4 4,0 4,1 4,2 4,8
A tisztított, természetes etil-dekadienoát tulajdonságai Az így termelt etil-dekadienoát érzékszervi tulajdonságainak értékelése céljából az arányokat 50-szeresre növelték és a terméket tisztították. Így a tipikus adag 5 kg Stillingia-olajból, 1 kg etanolból és 1 kg Novozym 435-ből állt, amelyet mechanikusan kevertek zárt, termosztált üvegedényben 45 °C-on, nitrogéngázköpeny alatt. Utóbbira azért volt szükség, hogy megelőzzék a telítetlen zsírsavak nemkívánatos oxidációját. A reakció időtartamát szándékosan meghosszabbították ciklusonként 3–5 napra, a megfelelő reakciósebesség biztosítására. Az 5. táblázat mutatja, hogy erre a óvintézkedésre nem volt szükség, valamint azt is, hogy preparatív viszonyok között az enzim ismételten felhasználható szignifikáns aktivitáscsökkenés nélkül. Azonban minden 5. ciklus után el kellett távolítani az enzimet az edényből, ezenkívül el kellett különíteni kb. 2 kg nehéz, főleg szerves fázist, amely szorosan kapcsolódott a rögzített enzimmel. Ez a fázis kb. 90% glicerinből és 10% vízből állt. 5. táblázat Preparatív viszonyok között végzett enzimes átészterezés hatékonysága Ciklus 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Reakcióperiódus (nap)
Etil-dekadienoát koncentrációja (%)
4 3 5 5 3 3 4 4 4 4 3 3
4,18 3,57 3,47 3,98 4,06 4,08 4,11 4,33 4,35 4,22 4,43 4,18
Összesen a)
a)
Hozam (kg) 5,3 5,4 5,2 4,6 5,2 5,4 5,7 5,3 5,5 5,5 5,4 5,5 ~64
Folyékony, szerves fázis szűrés után.
Az így kapott nyers terméket desztillálással tisztították, miközben egy – az alkalmazott mennyiség kb. 10%-át képező – viszonylag alacsony forráspontú frakciót izoláltak. Ez a frakció kb. 40% etil-dekadienoátot tartalmazott és az észterkinyerés kb. 95% volt. A frakciót ezután szakaszosan lepárolták és a kb. 90% – vagy több – etil-dekadienoátot tartalmazó frakciókat egyesítették.
Az izolált anyag tipikus összetételét a 6. táblázat mutatja, amely arra utal, hogy további vegyületek – izomer savak vagy hasonló triénsavak etil-észterei – is vannak jelen, amelyek a Stillingia-olajban is voltak, és szintén hozzájárulnak a körte aromájához. Az érzékszervi vizsgálat szerint a kombinált frakciók valóban rendelkeznek a vilmoskörte tipikus aromájával és ízben egyenértékűek a természetazonos anyaggal. 6. táblázat Stillingia-olajból termelt természetes etil-dekadienoát összetétele enzimes átészterezés után Alábbi savak etilésztere
GC-analízis Retenciós index
Terület (%)
cisz-3,transz-5-dekadiénsav
1835
≤5
transz-2,cisz-4-dekadiénsav
1848
≥90
cisz-2,transz-4-dekadiénsav
1860
≤0,5
transz-2,cisz-4,cisz-7-dekatriénsav
1895
≤5
transz-2,transz-4-dekadiénsav
1918
≤1,0
cisz-3,transz-5,cisz-7-dekadiénsav
2011
≤0,5
A természetazonos etil-dekadienoát szintézise bonyolult és viszonylag drága (600 USD/kg). A kidolgozott enzimes eljárás könnyen kivitelezhető és – bár a dekadiénsav koncentrációja a Stillingia-olajban igen kicsi – olyan termék keletkezik, amely meglepően versenyképes – költség szempontjából – a természetes anyaggal. Ez eléggé szokatlan, mivel a biotechnológiai módszerrel készült, természetes ízanyagok nagy többsége sokszor többe kerül, mint ezek természetazonos megfelelője. (Dr. Pálfi Ágnes) Gatfield, I. L.: Hilmer, J.-M.; Bertram, H.-J.: The use of natural fatty acids for the biotechnological production of natural flavour compounds: application to ethyl trans-2,cis-4decadienoate. = Chimia, 55. k. 5. sz. 2001. p. 397–400. Gautschi, M.; Bajgrowicz, J. A.; Kraft, P.: Fragrance chemistry – milestones and perspectives. = Chimia, 55. k. 5. sz. 2001. p. 379–387. Rossiter, K.: The design and synthesis of novel muguet fragrance ingredients: the discovery of a series of 3-alkylcycloalkanols. = Chimia, 55. k. 5. sz. 2001. p. 388–396.
ORSZÁGOS MŰSZAKI INFORMÁCIÓS KÖZPONT ÉS KÖNYVTÁR
M B E
BUDAPESTI MŰSZAKI ÉS GAZDASÁGTUDOMÁNYI EGYETEM 2002-ben az OMIKK továbbra is megjelenteti a
KÖRNYEZETVÉDELMI FÜZETEK című gyűjteményes kiadványát. A kiadványhoz egyenként 2–4 szerzői ív – 40–70 oldal – terjedelmű szakirodalmi tanulmányok készülnek. A tanulmánycímeket a jegyzék ismerteti. (Felhívjuk szíves figyelmüket, hogy a tanulmányok sorrendje nem jelenti a megjelenés sorrendjét.) A füzetek megrendelhetők egyenként, tetszőleges válogatásban és teljes gyűjteményként is. Az egyes füzetek ára – terjedelemtől függően – 1500–2500 Ft + ÁFA. A teljes gyűjtemény ára a füzetszámból adódó teljes vételár 80%-a. Az elektronikus forma (MS Word dokumentum) ára az aktuális füzetár 90%-a.
A Környezetvédelmi Füzetek 2002. évi tanulmányai 2201 2202 2203 2204 2205 2206 2207 2208 2209
Az EU regionális és strukturális támogatásaiban érvényesülő környezeti szempontok A perspektivikus energiatakarékos technológiák és a kockázati tőke befektetései A vegyipar „responsible care” (felelős gondoskodás) programja Több közegben megjelenő szennyezők kockázatelemzése Környezetvédelem gépipari üzemekben A környezeti felelősség és privatizáció Közép- és Kelet-Európában Városi autóbuszok alternatív üzemanyagai Klímaváltozás és a vízkészletek kapcsolata Szennyvíziszap felhasználásának előnyei és veszélyei
2210 2211 2212 2213 2214 2215 2216 2217 2218
A MTBE (metil-tercier butil-éter) és a talajvíz A kommunális hulladékkezelés energia- és emissziómérlege Szelektív hulladékkezelés és a gazdaságosság Mosószerek, ill. alkotóik a környezetben Szelén a környezetben Arzén a környezetben A faj-, ill. tájdiverzitás fenntartásának támogatása Kadmium a környezetben Gyógyszermaradék a kommunális hulladékban, a megelőzés lehetőségei
Bővebb információ, megrendelés: BME–OMIKK – Műszaki–Gazdasági Kiadványok Osztálya 1011 Budapest, Gyorskocsi u. 5–7. tel.: 457-5322 tel./fax: 457-5323 e-mail:
[email protected] –– – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – –
MEGRENDELÉS Alulírott megrendelem a Környezetvédelmi Füzetek teljes sorozatát (2002) vagy ………………………………………………………………………………….………….…számait. Megrendelő neve: ……………………………………………………… Tel./Fax: .……………………… Címe: ………………….…………………………………………………………………………………… A megrendelés száma: ………………………………………………….. Ügyintézője: …………..……… A megrendelő pénzforgalmi jelzőszáma: …………………………………………………………..……… Kelt: ..………………………………………………………………………………………………………. (cégszerű aláírás, bélyegző) Szállítási feltételek: legkésőbb a tárgyévet követő év vége.
