EKSTRAK DAUN JATl BELANDA (Guazuma ulmifolia Lamk.) MENCEGAH HlPERLlPlDEMlA DAN PERKEMBANGAN ATEROSKLEROSIS EKSPERIMEN PADA KELINCI
Oleh '
YOSIE ANDRlANl HS
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2004
kadar lipid darah belum pernah dilakukan, maka dilakukan studi farmakokinetika konjugat steroid daun Jati Belanda pada hewan coba yang digunakan. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai manfaat ekstrak air, ekstrak etanol dan fraksi aktif steroid daun jati belanda sebagai penurun kadar kolesterol dan jenis senyawa aktii apa yang berperan. Ada tiga tujuan yang ingin dicapai dalam penelitian ini. Pertama, Menguji pengaruh ekstrak air, ekstrak etanol, dan fraksi aktif steroid daun Jati Belanda secara oral pada hewan coba kelinci yang diinduksi menjadi hiperkolesterolemia terhadap kadar kolesterol total, trigliserida, kolesterol LDL dan kolesterol HDL plasma darah. Kedua, Menguji efek ekstrak air, ekstrak etanol dan fraksi aktif steroid daun Jati Belanda terhadap akumulasi kolesterol aorta kelinci. Ketiga, membuktikan adanya fraksi aktif steroid daun Jati Belanda dengan cara menganalisis ada atau tidaknya konjugat fraksi aktif steroid daun jati belanda tersebut dalam urine kelinci. Penelitian ini mengajukan tiga hipotesis. Pertama, Pemberian ekstrak air, ekstrak etanol dan fraksi aktif steroid daun Jati Belanda pada kelinci hiperkolesterolemia dapat menekan kenaikan kadar kolesterol total, kadar trigliserida, kadar kolesterol LDL, dan meningkatkan kadar kolesterol HDL plasma darah kelinci. Kedua, pemberia'n ekstrak air, ekstrak etanol dsn fraksi aktif steroid daun Jati Belanda dapat menghambat akumulasi kolesterol aorta kelinci. Ketiga, pemberian fraksi aktif steroid daun Jati Belanda secara oral menurljukkan hasil yang positif dengan adanya konjugat steroid dalam urine kelinci.
I
*
diinduksi dengan kolesterol memiliki tingkatan lesi yang lebih tinggi dibandingkan dengan kelinci yang diinduksi dengan kasein pada kondisi level total plasma kolesterol yang sama. Pemberian diet kolesterol yang rendah pada kelinci (0,125%
-
0,5%) dalam waktu enam bulan dapat menyebabkan tingkat
perkembangan luka yang sama seperti pada manusia (Daley et a/. 1994). Contoh lainnya adalah penelitian yang telah dilakukan oleh Momuat et al. (2001) yang menggunakan kelinci lokal jantan sebagai hewan model dalam studi aterosklerosis. Kelinci kelompok hiperkdesterolemia ringan (pemberian pakan mengandung 0,1% kolesterol) yang diberi minyak sawit, memilki kadar kolesterol aorta lebih lebih rendah dibandingkan dengan kelompok hiperkolesterolemia berat (pemberian pakan mengandung 0,5% kolesterol). Lipoprotein dan Hiperlipidemia Lipoprotein merupakan kompleks dari protein dan lipid yang terdiri atas trigliserida, fosfolipid, ester kolesterol, dan kolesterol. Klasifikasi lipoprotein berdasarkan densitasnya (Tabel 1) terdiri atas kilomikron, lipoprotein berdensitas sangat rendah (VLDL, Very Low Densdy Lipoproteins), lipoprotein berdensitas sedang (IDL, Intermediet-Densrfy Lipoproteins), lipoprotein berdensitas rendah (LDL) serta lipoprotein berdensitas berat (HDL, High Density Lipoproteins). Tabel 1. Densitas dan ciri lipoprotein plasma
Klasifikasi Lipoprotein
Densitas (glml)
Diameter (nm)
Bobot molekul
-
Kilomikron
<0,95
80-500
10 ~ - 1 0 ' ~
VLDL
0,95-1,006
30-80
5x10'-1
IDL
1,006-1,019
30
(3,5-4,5)x1o6
LDL
1,019-1,063
15-25
(2,o-2,5)x1o6
HDL
1,063-1,21
5-12
(1,9-3,9)x1o5
Sumber: Myant (1990)
XI
0"
karena peningkatan LDL akan meningkatkan resiko menderita PJK. Sebaliknya HDL dianggap sebagai partikel pembawa kolesterol yang 'baik' karena peningkatan kolesterol HDL berkorelasi negatiiterhadap risiko PJK. Hiperlipidemia merupakan suatu keadaan meningkatnya kadar lipid di dalam darah hingga melebihi batas normal. Hiperlipidemia dapat diketahui dengan mengukur kadar kolesterol dalam plasma darah yang berkolerasi positif dengan resiko terbentuknya aterosklerosis, meliputi TPC, trigliserida, LDL dan HDL. Kadar kolesterol normal darah kelinci berkisar antara 80-90 mgldl untuk TPC, 20-35 mgldl untuk LDL, 3045 mgldl untuk HDL, dan 70-115 mgldl untuk trigliserida (Aminah 1992). Peneliti lain melaporkan rerata kadar kolesterol normal darah kelinci berkisar antara 40-80 mgldl untuk TPC, 10-40 mgldl untuk LDL, 10-30 mgldl untuk HDL, dan 60-110 mgldl untuk trigliserida (Momuat 2001). Hiperlipidemia pada hewan coba dapat dibuat dengan menambahkan lemak dan kolesterol dalam pakan aterogeniknya yang disebut dengan induksi eksogen (Amstrong & Heistad 1990). Watts et a/. (1996) menambahkan bahwa makanan dengan kandungan asam lemak jenuh lebih tinggi daripada asam lemak tak jenuh dapat meningkatkan kadar kolesterol plasma (TPC dan LDL) serta mempertinggi risiko menderita PJK. Untuk meningkatkan kadar kolesterol darah, minyak kelapa yang memiliki rasio L.I/LTJ tinggi dapat ditambahkan pada pakan aterogenik (Momuat 2001 ; Monica & Farida 2000). Reseptor LDL
.
Reseptor LDL merupakan regulator keseimbangan profil kolesterol dalam plasma. Reseptor LDL paling banyak terdapat di hati. Kolesterol berperan dalam mengatur regulasi aktivitas reseptor LDL. Sintesis kolesterol akan ditekan saat kolesterol dalam sel meningkat dan kolesterol yang berlebihan dibuang ke empedu, sebaliknya sintesis reseptor LDL akan ditingkatkan saat kolesterol
Bardley rnenyatakan bahwa aterogenesis terjadi melalui tiga tahapan penting Wjaya 1995). Tahap pertarna rnerupakan tahap permulaan yang meliputi infiltrasi partikel lipoprotein ke dalarn intima, oksidasi partikel lipoprotein tersebut, aktivasi sel-sel endotel, perlekatan dan infiltrasi rnonosit, serta rnigrasi sel-sel otot polos dari tunika media kedalarn tunika intirna. Tahap kedua rnerupakan tahap progresi, dan biasanya terjadi selarna puluhan tahun. Tahap'ini rneliputi deposisi lemak serta berkesinarnbungan ke dalam intirna, pernbentukan sel-sel busa oleh rnakrofag, proses oksidasi lipoprotein lebih lanjut, peradangan, dan proliferasi sel-sel otot polos maupun produk-produknya (matriks ektraselular) dalam tunika intirna. Tahap ketiga rnerupakan tahap akhir yang rneliputi komplikasi kalsifikasi, koyaknya lesi, trornbosis yang dapat menirnbulkan rnanifestasi klinik berupa PJK.
/.- ..-. Lipid dalam-I.,_Tr"
lipid ekstrasel
Gambar I.Tingkat kerusakan arteri pada arterosklerosis (Frohlich 1976)
Disfungsi sel endotel atau peningkatan kadar lipoprotein dalam plasma akan rnenyebabkan terjadinya akurnulasi partikel lipoprotein, terutarna LDL dalarn tunika intirna. Partikel LDL ini selanjutnya akan rnengalarni proses oksidasi awal pada daerah sub endotel. Akibatnya partikel tersebut akan rnerangsang sel
endotel untuk rnensekresikan MCP-1 (monocyte-chemofactic protein-1) dan M-CSF (macrophage-colony stimulating factors) yang akan menyebabkan terjadinya pedekatan rnonosit pada endotel dan migrasi monosit ke dalam sub endotel.
Monosit
tersebut
kemudian
dirangsang
oleh
M-CSF
untuk
berdiferensiasi rnenjadi makrofag. Makrofag ini akan rnengoksidasi lebih lanjut partikel LDL ,mernbentuk komponen protein LDL (apolipoprotein 8-100) rnenjadi lebih bermuatan negatii, akibatnya LDL teroksidasi maksimal (oxLDL) tidak dikenali oleh reseptor LDL pada makrofage tetapi dikenali oleh reseptor scavenger pada makrofag. Akumulasi kolesterol dalam rnakrofag dapat menyebabkan pembentukan sel busa. Sel busa kemudian mensekresikan faktor tumbuh dan sitokina sehingga merangsang proliferasi sel otot polos (Mahlberg ef a/. 1990)
. Selain itu Vijayagopal dan Glancy (1996) serta Diaz et a/. (1997)
melaporkan bahwa makrofag rnenstimulasi pengambilan LDL teroksidasi oleh sel-sel otot polos melalui kontak antar sel. Tidak terdapatnya pengaturan umpan balik pada sel otot polos menyebabkan proses pengambilan LDL tersebut berlangsung terus dan menyebabkan akumulasi kolesterol ester sehingga tejadi pembentukan sel busa (Gambar 2).
Gambar 2. Teori mekanisme aterogenesis (Diaz et a/. 1997)
Antioksidan melindungi LDL terhadap oksidasi dan pembentukan LDL teroksidasi. Bergabungnya antioksidan ke dalam sel vaskular dapat mengurangi dampak klinik terjadinya penyakit vaskular dan pembentukan plak aterosklerosis melalui reduksi oksidasi LDL sel vaskular dan respon selular untuk mengoksidasi LDL, menghasilkan sedikit adesi monosit, berkurangnya pembentukan sel busa (Diaz et a/. 1997; Sesso 2003). Senyawa flavonoid, tanin dan steroid pada ekstrak daun Jati Belanda pada penelitian ini memungkinkan adanya efek antioksidan ekstrak tersebut terhadap kadar kolesterol plasma dan pengurangan frekuensi plak pada hewan coba yang digunakan.
Gambar 3 . Mekanisme antioksidan (Diaz et a/. 1997)
Jati Belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.)
Guazuma ulmifolia Lamk. adalah tanaman berbentuk semak atau pohon dengan tinggi 10 sampai 20 meter, masih termasuk dalam kelas Dicotyledonae dan dari suku Sterculiaceae. Tanaman ini memiliki nama daerah Orme D'Amerique (prancis), Bartard Cedar (Inggris), Guasima (Meksiko), Jati Belanda (Indonesia), Jati Londa, Jati Landi dan Jatos Landi (Jawa). Tanaman ini memiliki
pangkal daun menjorong membentuk jantung, ujung daun lancip, permukaan atas berbulu jarang, permukaan bagian bawah berbulu rapat, panjang helai daun 4
- 22,5 cm. Bunganya berwama kuning berbintik-bintik merah. Buahnya keras,
beruang lima dan berwama hitam, berbiji banyak dan berwarna kuning kecoklatan, bedendir dan rasanya agak manis. Budidaya tanaman dapat dilakukan dengan biji atau stek tunas berakar. Tanaman ini dapat tumbuh dengan cepat dan biasa digunakan seMgai tanaman pekarangan atau peneduh di tepi jalan (Heyne 1987). Di beberapa negara, bagian dalam kulitnya dipakai sebagai obat untuk rnenyembuhkan penyaki cacing dan kaki gajah atau bengkak kaki, astringens dan diaforetik (Dewi eta/. 2000). Air masakan kulit dapat digunakan sebagai obat untuk menciutkan urat darah (Dharma 1987) Rebusan biji-bijinya )rang sudah di bakar seperti kopi dapat diminum sebagai obat sembelit dan apabila setelah dibakar lalu dilumatkan dengan air dan dibubuhkan setetes minyak adas maka dapat bermanfaat untuk perut kembung dan sesak (Heyne 1987). Selain itu, daun atau buahnya dapat digunakan sebagai obat untuk batuk rejan (Nuratmi 1997). Di Indonesia air masakan daun banyak dipakai untuk melangsingkan tubuh. Akan tetapi dapat mengakibatkan kerusakan usus, apabila takaran daun dan biji berlebih. Hasil pemeriksaan pendahuluan terhadap komposisi kimia daun Jati Belanda menunjukkan adanya kandungan flavonoid, asam fenolat, tanin, steroid, triterpenoid, karotenoid dan kandungan lendir yang cukup tinggi yaitu sebesar 8,08% (Hartanto 1986). Sedangkan Rachmadani (2001) melaporkan bahwa pada daun Jati Belanda terdapat tanin, steroid dan triterpenoid, namun hasil analisis KLT preparatif ekstrak air daun Jati Belanda tidak menunjukkan adanya tanin dan
triterpenoid. Hal ini juga berbeda dengan laporan Lestari dan Muhtadi (1997),
sebagai pembanding (Busby et a/. 2002). Konjugat sulfat dan glukuronat isoflavon yang terdapat dalam plasma dan urin di analisis secara enzimatis dengan p-glukuronidase (EC 3.2.1.31) dan aril sulfatase (EC 3.1.6.1), menggunakan instrumentasi High Performance liquid chromatography (HPLC). Busby et a/. (2002) melaporkan bahwa konsentrasi ko~jugatdiamati setiap jamnya, mulai dari 0 sampai 24 jam setelah pemberian isoflavon. Konsentrasi konjugat maksimum diperoleh pada kisaran waktu 2 sampai 8 jam setelah pemberian isoflavon. Konsentrasi maksimum yang tidak jauh berbeda juga ditemukan oleh Shelnutt et a/. (2002), yaitu berkisar 4 sampai 6 jam.
Jalur Umum Metabolisme Obat dan Senyawa Organik Metabolisme memegang peranan penting dalam eliminasi obat dan senyawa asing lain (xenobiotik) lain dari tubuh. Hampir semua senyawa organik yang masuk ke dalam tubuh relatif larut lipid (lipofilik). Oleh karena itu supaya dapat diabsorbsi, mereka harus melewati membran lipoprotein dinding lumen saluran cerna. Sekali masuk dalam aliran darah, molekul secara difusi pasif melalui membran lain, mencapai berbagai organ sasaran untuk memberikan efek farmakologi. Karena ada usaha-usaha tubuh untuk mengeliminasi senyawa asing, maka sebagian obat atau senyawa organik yang masuk akan mengalami biotransformasi menjadi senyawa konjugat yang bersifat lebih polar dan dapat dikeluarkan melalui urin dan tinja (Siswandono & Soedkarjo 1995). Reaksi metabolisme obat dan senyawa organik secara umum dibagi menjadi dua kategori, yaitu : Fase I (fungsionalisasi) dan fase I1 (konjugasi). Biotransformasi oksidatif, reduktif dan hidrolitik termasuk dalam reaksi fungsionalisasi.
Reaksi fungsionalisasi bertujuan untuk menjadikan senibiotik
punya gugus polar (OH, COOH, NH2, SH), jika reaksi fase I tidak cukup menjadikan hidrofilik atau metabolit inaktif, maka mereka akan cenderung
Kelompok = A
Kelompok B n=5 Kelinci Iokal jantan dewasa
Kelompok C n= 5
\-
1
Pakan kolesterol Pakan kolest.+ ekstrak air
Pakan kolest.+ ekstrak etanol
Pakan koleit.+ fraksi steroid
Gambar 7. Desain Penelitian
Minggu ke ...
pakan standar
pakan standar +
1 Perlakuan : pakan standar + 5% lemak + G,25% kolester~l
Pengukuran peubah (*) :
- Bobot badan, jumlah konsumsi,TPC, Trigliserida, HDL dan LDL Pengukuran peubah (*) :
- Bobot badan, jumlah konsumsi, TPC, Trigliserida, HDL dan LDL - Kolesterol aorta
- Analisis konjugat steroid air seni kelinci Gambar 8. Alokasi waktu penelitian
Selanjutnya, metanol ditambahkan. perlahan-lahan ke dalam tabung tersebut hingga membentuk campuran sefase, lalu dikeringkan dengan gas nitrogen. Setelah kering, lipid dilarutkan dalam 10 ml kloroforrn dengan menggunakan pipet volumetrik.
Metode Penyabunan dan Reaksi 0-Ftaldehida (Rude1 & Moms 1973). Pereaksi dibuat dengan melarutkan 50 mg orto-ftaldehida dalam 100 ml asam asetat glasial, dengan menggunakan labu takar tertutup lembaran alumunium. Pada metode penyabunan, diambil sebanyak 10 ml larutan yang diperoleh dari tahap ekstraksi kolesterol, lalu dikeringkan dengan gas N1. Kemudian ditambahkan 0,3 ml KOH 33% dan 3,O ml etanol 95%, lalu dikocok. Tabung tersebut ditutup dan diinkubasi pada suhu 60°C selama 25 menit. Hal yang saina dilakukan untuk standar dan blanko. Sebanyak 0,025; 0,1; 0,25; 0,5; 1,O dan 2,O ml larutan standar kolesterol 1 mglml dalam etanol 95%, masing-masing dimasukkan dalam tabung penyabunan. Ke dalam tiap tabung ditambahkan 0,3 ml KOH 33% dan diikuti penambahan etanol 95% hingga volume akhir sebesar 3,3 ml. Setiap tabung ditutup dan diinkubasi pada suhu 60°C selama 25 menit. Setelah mencapai suhu ruang, 10 ml heksana ditambahkan dalam setiap tabung dan dilanjutkan penambahan 3 ml air bebas ion. Jika larutan standar kolesterol yang ditambahkna lebih besaidari 0,1 ml maka digunakan volume air bebas ion sebesar tiga dikurangi volume contoh yang disabunkan. Tabung ditutup rapat dan djkocok kuat selama satu menit. Fase heksana akan terdapat pada bagian atas dan fase etanot-air berada di bagian bawah. Pada tahap reaksi 0-Ftaldehida (pernbentukan warna), diambil sebanyak 0,1 ml fase heksana dari standar kolesterol, blanko, dan sampel aorta dipindahkan ke tabung berukuran 16 x 100 mm, lhlu dikeringkan dengan gas nitrogen, dan langsung dihomogenkan dengan vorteks. Setelah 10 menit, sebanyak 1 ml asam sulfat pekat ditambahkan secara perlahan-lahan melalui
dilaporkan bahwa pemberian kolesterol dengan kadar 1%dan 5 % yang disertai penambahan 5% minyak kelapa alama tiga minggu mampu menginduksi kelinci rnenjadi hiperkolestembmia ringan (212,95 mgldl) dan hiperkolesterdemia berat (635,15 mgldl). Monica & Farida (2000) juga meningkatkan kadar kolsaerol total serum kelinci (232,08 mgldl) dengan penambahan kdesterol 2% dan minyak kdapa 4 mVkg BB selama 29 hari masa perlakuan.
a
4
5
B
7
Mnggu ke-
Gambar 9. Rerata Kadar kdesterol dan trigliserida darah setelah pakan standar ditambah 0,2596 kolegterol den 5% mlnyak kelapa. Pdakuan kontrol (*), perlakuan ekstrak air (m),
perlakuan ekstrak etand (A) dan
perlakuan frakd aktif stemid (x). Kadar koksterol TPC semua peiiakuan cenderung meningkat setelah satu minggu kelinci diberi pakan mengandung 0,25% kdastarol dan 5% minyak kelapa, walaupun demikian kadar kolesterol perlakuan ekstrak air, ekstrak etanol
,;
cil
\
(SI Kt
\
s o (D
ci' (D
Ul
0
u u Ln IC
a '3 I
Q,
LO
' -
VI I-? .-l
I Cj
(d). Urin kelinci perlakuan fraksi aktif steroid
CH.
1 C.S
5 .99 A T T
1
5
OFF5
4
@@/@@/49
No
RT
AREA
Konsentrasi
1
0,51
169161
87,819
4
1,28
3221
1,765
6
2,24
6153
8,851
14
4,08
3974
1,565
182509
100,000
Total
CH. I
C.S
5.00
ATT
5
OFF5
9
QB/88/96
No
RT
AREA
Konsentrasi
1
0,54
297140
88,66
2
0.69
2042
0,629
12
2,25
19672
6,062
15
4,18
5658
4,649
324512
100,000
Total
