EGYETEMI DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS
ELTÉRİ BIOLÓGIAI VISELKEDÉSŐ HUMÁN MELANOMÁK GENETIKAI JELLEMZÉSE IN SITU HIBRIDIZÁCIÓS MÓDSZEREKKEL
TRESZL ANDREA
Témavezetı: Dr. Balázs Margit
DEBRECENI EGYETEM ORVOS- ÉS EGÉSZSÉGTUDOMÁNYI CENTRUM NÉPEGÉSZSÉGÜGYI ISKOLA MEGELİZİ ORVOSTANI INTÉZET
DEBRECEN, 2004.
TARTALOMJEGYZÉK
TARTALOMJEGYZÉK 1.
B E V E Z E T É S ............................................................................4
2. 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5.
IR O D A L MI Á T T E KI N T ÉS .............................................................6 A malignus melano ma ...................................................................6 A melano ma etiológiája és rizikófaktorai.................................................7 A melano ma klinikai altípusai............................................................8 A melano ma T N M-klasszifikációja ......................................................9 Genetikai eltérések malignus melano mában ............................................ 10
3.
C É L KIT Ő Z É S E K ..................................................................... 15
4. A N Y A G O K ÉS M Ó D S Z E R E K ........................................................ 16 4.1. M elano ma szövetminták ............................................................... 16 4.3. Sejttenyésztés.......................................................................... 18 4.4. Fluoreszcencia in situ hibridizáció...................................................... 18 4.4.1. Kro moszó ma- és gén-specifikus D N S-szondák......................................... 18 4.4.2. FIS H hibridizáció...................................................................... 19 4.4.3. Fluoreszcens mikroszkópia ............................................................ 19 4.5. Spektrális kariotipizálás (S K Y-FIS H) .................................................. 20 4.6. K o m paratív geno miális hibridizáció (C G H) ............................................ 21 4.6.1. Kro moszó mális CG H .................................................................. 21 4.6.2. Digitális képanalízis................................................................... 22 4.6.3. Array-C G H ............................................................................ 22 4.7. Statisztikai analízis..................................................................... 24 5. E R E D M É N Y E K ....................................................................... 25 5.1. A c-myc onkogén a mplifikációjának vizsgálata noduláris és felszínen terjedı primer m elano mákban és melano ma metasztázisokban......................................... 25 5.1.1. Primer és metasztatikus melano mák klinikopatológiai jellemzıi........................ 25 5.1.2. Centro méra kópiaszá m változás primer melano mákban ................................ 25 5.1.3. Centro méra kópiaszá m változások primer-metasztázis tumorpárokban.................. 28 5.1.4. A 8-as kro moszó m a és a c-myc gén kópiaszá mának összehasonlítása m elano ma altípusokban ........................................................................... 30 5.1.5. Interfázisos melano ma sejtek c-myc eltéréseinek összehasonlítása CG H adatokkal...... 31 5.1.6. Klinikopatológiai para méterek és a c-myc gén kópiaszá m eltérései közötti kapcsolat vizsgálata.............................................................................. 32 5.3. Primer melano mák és melano ma metasztázisok cDN S alapú array-C G H vizsgálata ..... 45 6. M E G B E S Z É L ÉS ...................................................................... 49 6.1. A c-myc onkogén a mplifikációjának vizsgálata noduláris és felszínen terjedı primer m elano mákban és melano ma metasztázisokban......................................... 49 6.2. Egy új melano ma sejtvonal átfogó citogenetikai jellemzése ............................. 54 6.3. Primer melano mák és melano ma metasztázisok cDN S alapú array-C G H vizsgálata ..... 60 7.
Ö S S Z EF O G L A L Á S ................................................................... 62
8.
IR O D A L O M J E G Y Z É K ............................................................... 64
2
TARTALOMJEGYZÉK
9. 9.1. 9.2. 9.3.
K Ö Z L E M É N Y E K JE G Y Z É K E ........................................................ 71 Az értekezés alapjául szolgáló in extenso közle mények ................................. 71 Egyéb in extenso közle m ények és indézhetı absztraktok................................ 71 Elıadások és poszterek................................................................. 72
10.
K Ö S Z Ö N E T N YÍL V Á NÍT Á S .......................................................... 74
11.
M E L L É K L E T E K ...................................................................... 75
3
BEVEZETÉS
1. BEVEZETÉS A daganatos megbetegedések korai felismerése és az idejében történı beavatkozások jelentıs mértékben növelik a beteg túlélésének és teljes gyógyulásának esélyeit. A daganatkutatás több mint egy évszázados múltra tekint vissza, és bár az utóbbi évtizedben a fejlıdés látványosan felgyorsult és fontos felfedezések láttak napvilágot, melyek haszna m a már a klinikai gyakorlatban is megnyilvánul (pl. erbb2-pozitív invazív e mlıdaganatok kezelése), a metasztázisban szenvedı betegek jelentıs része még mindig ne m szá míthat tartós gyógyulásra. Ez különösen vonatkozik a bır legrosszindulatúbb elváltozására, a m alignus melano mára, ahol minden erıfeszítés ellenére a metasztázisos betegek ötéves túlélése 50 % alatt marad. A melano ma agresszív viselkedésére jellemzı, hogy a tu mor igen korai stádiu mában már m egjelenhetnek áttétek, és akár egy 1 m m vastagságot alig elérı daganat rövid idın belül a beteg halálát okozhatja. A melano ma kialakulásában és progressziójában a daganatra prediszponáló gének alterációi mellett, kie melten fontos szerepet játszanak a környezeti tényezık. A környezeti faktorok közül az ultraibolya sugárzás daganat indukáló hatására utal, hogy az elmúlt 10 évben a
melano ma
incidenciájának ugrásszerő növekedését elsısorban azokban az országokban figyelték meg, m elyekben az elvékonyodott ózonréteg miatti káros U V sugárzás aránya jelentısen m ege melkedett. A biológiai
melano ma kialakulásának és progressziójának klinikai, hisztopatológiai és aspektusai
jól
m echaniz musokkal és a
ismertek,
de
a
folya matban
résztvevı
metasztatikus szóródással összefüggésben
molekuláris
álló
genetikai
m arkerekkel kapcsolatos tudásunk igen korlátozott. A melano ma progresszióját leíró m odellek alapját hosszú ideig kizárólag metasztázisokból elıállított
in vitro sejtvonalak
képezték, csak kis szá m ú primer daganat eltéréseit elemezték. A legismertebb melano maspecifikus géneket fa miliáris eredető daganatok tanulmányozása során fedezték fel. A daganat kialakulásának többlépcsıs folya mata szá mos gén alterációját foglalja magába, ugyanakkor a melano mára már az elsı lépéstıl jellemzı a kro moszó mális instabilitás, a kro moszó mák nagyfokú aneuploidiája és a genetikai heterogenitás. A malignus melano ma klinikopatológiai sze mpontból több altípusra különíthetı el, melyek eltérı biológiai viselkedéssel, és feltételezhetıen eltérı genetikai markerekkel jellemezhetık. Ezeknek a genetikai markereknek a megismerése és klinikai para méterekkel történı összehasonlítása alapvetıen fontos ne m csak a prognózis felállításában, hane m m egtervezésében is.
4
a
hatásos terápia
BEVEZETÉS
A daganatok kialakulásának és progressziójának hátterében álló genetikai eltérések m egis merése éveken át a kro moszó ma eltérések vizsgálatának klasszikus citogenetikán alapuló módszerére korlátozódott, melynek hátrányai közismertek. A 90-es évek elején jelentek meg azok az alternatív, nagyfelbontású m ódszerek, melyekkel a tu morgeno m
in
vitro manipulálása nélkül lehetséges a kro moszó mális eltérések kimutatása. Ezek közül kie melkedı jelentıségő a fluoreszcencia geno miális hibridizáció (comparative sejtekben
szinte
valam ennyi
in situ hibridizáció (FIS H) és az összehasonlító
genomic hybridization: C G H). FIS H -sel interfázisos
kro moszó mális
eltérés
(aneuszó mia,
transzlokáció,
géna mplifikáció és deléció) kimutatható. C G H-el a tu morgeno m gyors és átfogó genetikai analízise valósítható m eg, egyetlen kísérlet során a genetikai elváltozások sorozata deríthetı fel azok elızetes ismerete nélkül. A C G H-el felismert eltérések azokra a kro moszó mális régiókra irányíthatják a figyelmet, melyek egy adott daganattípusra, a daganatprogresszió egyes lépéseire lehetnek specifikusak. Ezek részletes megis merése hozzájárulhat a daganatprogresszió mechaniz musának molekuláris szintő m egértéséhez. Ph.D. értekezése mben a FIS H és C G H
módszerek klasszikus és legm odernebb
m ódszertani megközelítéseit alkalmazva célo m volt a hu mán malignus melano ma két eltérı biológiai viselkedéső altípusában kimutatható kro moszó mális eltérések analízise, a c-myc onkogén a mplifikáció mértékének meghatározása, az eltérések klinikopatológiai para méretekkel történı
korrelációs analízise, primer
és
metasztatikus
melano ma
tumorpárok genetikai eltéréseinek cD N S-alapú array ele mzése, vala mint egy felszínen terjedı melano mából származtatott új sejtvonal kom plex genetikai vizsgálata.
5
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A malignus melanoma A melanociták a bır neuroektodermális eredető pigment-termelı sejtjei. Fejlıdésük során a bırbe vándorolnak és nor mális esetben a bır bazális rétegének sejtjei között véletlenszerően helyezkednek el. Elágazó dentrit-nyúlványaik segítségével kapcsolatot tartanak a bır bazális és felszíni rétegének keratinocitái között. Minden melanocita pig ment-tartalmú
melanoszó mákat küld dendrit-nyúlványain keresztül körülbelül 36
bazális vagy szuprabazális keratinocitának, melyek együttese az ún. epidermális melaninegység. A keratinocitákba így eljuttatott melanin elnyeli és védi a bırt a káros napsugárzástól.
A
melanociták
proliferációját, pig ment-termelését és a
dendritek
növekedését a szo mszédos keratinociták szabályozzák (1). A melano ma kialakulhat meglévı anyajegy talaján, vagy kelezkethet
de novo. A
daganat kialakulása során az alábbi öt, morfológiailag és biológiailag jól elkülönülı fázis különböztethetı meg:
1.) születéskor már meglévı vagy késıbb kialakult szabályos
(típusos) szerkezető névusz, 2.) morfológiailag atipiát mutató ún. diszplasztikus névusz, 3.) radiális-növekedési irányú (radial (vertical
growth phase: R GP), 4.) vertikális-növekedési irányú
growth phase: V G P), 5.) metasztatikus melano ma (1). A de novo melano ma
kialakulásának elsı lépésére a keratinocita-melanocita–egység megbo mlása jellemzı, a mi a melanociták keratinocitákhoz viszonyított arányának megnövekedését vonja maga után. Ezt követi a melanociták hiperpláziája, majd a sejtek diszpláziája és kialakulhatnak az ún. prekurzor léziók, melyek közvetlenül az
in situ m elano ma kialakulásához vezetnek, a mi
elsısorban lapszerint növekszik és az epidermiszen belül marad. Ez a szakasz felel meg az R G P-nek. A daganat vertikális irányú növekedése során a melano ma sejtek a bazális m e m bránt keresztültörve behatolnka a dermiszbe és a bıralatti zsírszövetbe. Feltételezések szerint
a
melano ma
metasztatikus
potenciáljának
és
agresszív
viselkedésének
kialakulásában a radiális-fázis – vertikális-fázis közötti átmenet a döntı lépés. Ennek m egfelelıen a primer m elano ma vastagsága sokáig a prognózis felállításának egyik legfontosabb
para métere
volt (2,3).
Míg
a
radiális
növekedési fázisban
lévı
m elano masejtek viselkedését a környezı sejtek exogén növekedési faktorai befolyásolják és jellemzıjük, hogy im m undeficiens egerekben ne m képeznek daganatot (4), addig a vertikális növekedési fázisú melano masejtek szinte teljesen függetlenednek a környezı keratinocitáktól, fibroblasztoktól, növekedési-faktor- és kihorgonyzás-független (anchor-
6
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
független) növekedésre tesznek szert, im munhiányos egerekben tu mor kialakulását idézik elı, továbbá mind betegekben, mind kísérleti állatmodellekben nagyfokú metasztatizáló hajlam mal rendelkeznek (1).
2.2. A melanoma etiológiája és rizikófaktorai A melano ma malignu m incidenciája a 70-es évek óta a világ vala mennyi országában roha mosan növekszik (5), bár az utóbbi években, elsısorban Ausztráliában és a skandináv országokban, ennek megtorpanását tapasztalták, a mit elsısorban az UV-sugárzás-elleni védele m fontosságának tudatosítása érdekében folytatott ka mpánynak tulajdonítanak (6). Az elmúlt néhány évtizedben a melano ma okozta mortalitás szintén e melkedést mutat a világos bırő populációkban (7). Az e melkedı incidencia és mortalitás ellenére szerencsére a túlélési esélyek javultak, a mi ne m magyarázható a melano ma kezelésében bekövetkezett fejlıdéssel – hiszen ezen a téren jelentıs változás ne m történt –, hane m elsısorban annak köszönhetı, hogy a prim er tu mort gyakrabban ismerik fel korábbi stádiu mban, a mikor a gyógyulási esélyek még sokkal jobbak (7,8). Napjainkig szá mos vizsgálat foglalkozott a melano ma kialakulására hajla mosító kockázati tényezık megismerésével. Ez utóbbiak közül a legfontosabb a nagyszá mú m elanocitás anyajegy (n>50), vagy atípusos anyajegyek megléte, a fa miliáris melano ma elıfordulása, a betegnél korábban már kialakult m elano ma, a túlzott napozás (napégés), és a világos bırtípus. A legfontosabb környezeti tényezınek a napsugárzást tartják, azonban fontos megjegyezni, hogy pusztán U V-sugárzással csak speciális keresztezést követıen elıállított kísérleti állatokban, vagy igen nagy, a természetben ne m elıforduló dózisú U Vsugárzással lehet melanom át indukálni (9,10). A gyakoribb há m eredető bırdaganatokkal sze mben, melyek kialakulásáért az U V A sugárzás tehetı felelıssé, a melano ma kialakulása az intenzív U V B-expozíció következ ménye, a mi elsısorban gyer mekkorban éri az e mbert (11). Epide miológiai vizsgálatok szerint a nagyszá mú anyajeggyel rendelkezı egyéneknek nagyobb esélyük van melano ma kialakulására. A klinikailag atípusos vagy „diszplasztikus” névuszok megléte tovább e meli a melano ma kialakulásának kockázatát, különösen, ha a családban már elıfordult ilyen daganatos megbetegedés. További hajlamosító tényezık a világos bır-, sze m- és hajszín (7). A
malignus
melanom a,
összehasonlítva
m ás
daganatokkal,
kiemelkedı
m etasztázisképzı hajlam m al rendelkezik. A daganat agresszív viselkedésére jellemzı,
7
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
hogy sokszor a kismérető tu morból is megindulhat a metasztázis képzıdésre hajla mos sejtek szóródása. A metasztázisképzés esélyére és ezel a daganat várható kórlefolyására a prognosztikai faktorok alapján következtethetünk. 2001-ben látott napvilágot annak a 13 vezetı m elano ma központnak a véle ménye, m elyben azonos kritérium ok figyele mbevételével több mint 30000 azonos sebészi elvek szerint ellátott, egyeztetett szövettani sze mpontok alapján értékelt, és m egfelelı ideig követett melano más beteg adatait elemezték. A
vizsgálat ered ményei értelmében a
diagnóziskor áttét nélküli primer melano mák klinikopatológiai para méterei közül a túlélést befolyásolja a beteg életkora, ne me és a primer tu mor lokalizációja. Tapasztalataik szerint a fiatalabb korosztályba tartozóknak és a nıknek jobbak a túlélési esélyei, mint a férfiaknak
és az idısebb
betegeknek.
Érdekes
megfigyelés, hogy
a lokalizáció
sze mpontjából a végtagokon elhelyezkedı daganatok a jobb prognózisú csoportba tartoznak. A tu morvastagság és a daganatok kifekélyesedése is kapcsolatot mutat, és azt jelzi, hogy
a
vastagsággal (Breslow
vastagság) párhuza mosan
nı
az
ulceráció
valószínősége is. Fontos prognosztikai para méternek találták a tu morsejtekkel infiltrált nyirokcso mók szá mát és az infiltráció mértékét is. A fenti, a melanom a kórlefolyását alapvetıen
befolyásoló
para méterek
meghatározásán
kívül
a
melano ma
új
stádiu mbeosztására is javaslatot tettek (12).
2.3. A melanoma klinikai altípusai Klinikai megjelenése és viselkedése alapján a melano mákat az alábbi négy csoportba osztjuk: 1.
felszínen terjedı vagy szuperficiális melanoma (superficial spreading melanoma: SS M), a melano mák leggyakoribb altípusa, a test bármely részén kialakulhat, de férfiaknál leggyakrabban a törzsön, nıknél az alsó végtagokon fordul elı. Az SS M gyakran már meglévı névusz talaján keletkezı aszim metrikus, változatos színő és szabálytalan szélő lézió.
2.
noduláris malignus melanoma (nodular malignant melanoma: NMM), a daganat m ásodik leggyakoribb és egyben legagresszívebb viselkedéső formája, mely egyúttal a melano ma legrosszindulatúbb altípusa. A noduláris melano ma többnyire épp bırın m egjeleneı gyorsan növekvı cso mó, mely vérzékeny, gyakran a melanotikus. Mivel a tu mor pig mentáltsága lehet egyenletes, és széle ne m feltétlenül szabálytalan,
8
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
könnyen összetéveszthetı a bazálsejtes karcinó m ával, a szeborreás keratózissal, vagy akár jóindulatú anyajegyekkel. 3.
lentigo maligna melanoma (LMM), a
melano mák
har madik
altípusa,
a
napsugárzásnak kitett bırfelületen, gyakran az arcon, általában idısebb korban jelentkezik. Az elızı két altípustól eltérıen, az L M M kialakulásában egyértelmő összefüggés található az U V-expozícióval. A daganat növekedése lassú, gyakran évekig az epidermiszre korlátozódik és a dermális invázió akár 10-15 év elteltével indul meg. Megjelenésében az SS M-hez áll közel. 4.
akrálisan lokalizált melanoma (ALM), a nem kaukázusi népességben elıforduló leggyakoribb
melano m a
altípus.
A
korábbi
elnevezéssel
(acrolentiginosus
melanoma) sze mben ez az akrálisan lokalizált tu mor ne mcsak lentigo maligna m elano ma lehet, hane m noduláris, illetve felszínen terjedı melano ma is. Általában a tenyéren és a talpon, vagy a körö m alatt, esetleg a genitális vagy az orális nyálkahártyán, pig mentált foltként jelenik meg. A noduláris melano ma m ellett ez a típus a legagresszívebb lefolyású, mivel általában késın kerül felismerésre, és a helyzetébıl fakadó gyakori trau mák szintén kedveznek a metasztázis képzıdésnek.
2.4. A melanoma TNM-klasszifikációja A melano ma kimenetelét befolyásoló klinikai és patológiai para métereket szá mos vizsgálatban tanulmányozták és az ered ményeket figyele mbe véve az
American Joint
Committee on Cancer (AJ C C) a melano ma biológiáját pontosabban leíró, az e mlırák analógiájára kialakított, tumor-nyirokcso mó- metasztázis (T N M) stádiu mbesorolást hozott létre,
melynek
értelmében
az
ırsze mnyirokcso mó-biopszia ered ménye
kritikus
a
m elano ma prognózis felállításában (12). A jelenlegi T N M-klasszifikáció szerint a tu morok besorolásának fı sze m pontjai (1.
táblázat): a) a tu mor m m -ben megadott vastagsága (T1: < 1 m m, T2: 1-2 m m, T3: 2-4 m m, T4: > 4 m m) és a prim er tu mor kifekélyesedése (korábban ne m szerepelt a besorolás kritériu mai között) („T” klasszifikáció); b) a regionális nyirokcso mók érintettsége, a mi statisztikai elemzések szerint a melano ma progressziója sze mpontjából a legfontosabb korai prediktor, ezért a nyirokcso móstátusz patológiai felmérésére bevezették az érintett nyirokcso mók szá mának
meghatározását, illetve az új osztályozás prognosztikailag
elkülöníti a klinikailag felismerhetı ("makro metasztázis") és a csak patológiai vizsgálattal
9
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
kimutatható áttéteket ("mikro metasztázis") („N” klasszifikáció); c) távoli áttétek megléte és azok lokalizációja („M ” klasszifikáció).
1. táblázat A melanoma malignum TNM-klasszifikációja „T” klasszifikáció
„N” klasszifikáció
„M” klasszifikáció
T1: ≤ 1,00 mm
N1: 1 regionális nyirokcsomó a: mikrometasztázis* b: makrometasztázis** N2: 2-3 regionális nyirokcsomó a: mikrometasztázis* b: makrometasztázis** c: in transit/szatellita metasztázis nyirokcsomó-érintettség nélkül N3: 4-nél több nyirokcsomó/ N2c + nyirokcsomómetasztázis
M1: távoli kután-, szubkután-, nyirokcsomó metasztázis
T2: 1,01 – 2,00 mm T3: 2,01 – 4,00 mm T4: > 4,00 mm
M2: tüdımetasztázis M3: egyéb belszervi metasztázis/ M1-M2 + emelkedett LDH-szint
a: kifekélyesedés nélkül b: kifekélyesedéssel * szentinel nyirokcsomó-biopsziával igazolt nyirokcsomóáttét (nem tapintható nyirokcsomó esetén) ** klinikailag észlelhetı és szövettanilag igazolt áttét
2.5. Genetikai eltérések malignus melanomában A
melano mák
mintegy
8-12 %
örökletes, a jelenleg elfogadott m elano ma-
progressziós modellek alapjául is családi halm ozódást mutató esetek szolgálnak. Bár etiológiai, klinikai és hisztológiai sze mpontból a m elano mákat a fentebb ismertetett négy alcsoportba soroljuk (SS M, N M, L M M,
A L M ), ezeket a melanom a genetikájával
foglalkozó irodalo mban eddig alig néhány közle ményben különítették el, azonban a m elano ma altípusok genetikai különbségeinek fontosságát ma már kezdik felismerni (13, 14). A bır melano mája a legagresszívebb hu mán daganatok közé tartozik, ha kezelését elhanyagolják, gyakorlatilag
vala mennyi
melano ma
képessé
válik
metasztázis(ok)
kialakítására. Az elırehaladott vagy dissze minált tumorok adjuváns terápiát igényelnek, ez azonban, az intenzív kutatások ellenére, még mindig messze ne m kielégítı, és a betegek jelentıs többsége a metasztázis következtében hal m eg. A távoli szövetek sikeres kolonizálásához a m etasztatikus sejtnek be kell jutni a vérára mba, túl kell élnie a kiindulási helyéhez képest gyökeresen
megváltozott
körülményeket, és a m egfelelı szövetben ki kell tapadnia, majd osztódnia kell. Ha a
10
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
daganatsejt ezen lépések bármelyikén ne m képes túljutni, metasztázis nem jöhet létre. A m ég ne m
metasztatizált, de már minimális inváziós képességet mutató daganatok
m egállítására az egyetlen biztos mód olyan ágensek alkalmazása lehetne, m elyek magukat a metasztatizálni képes sejteket eliminálják. Ahogy a legtöbb daganatnál, a melano mánál se m áll egyelıre rendelkezésre ilyen terápia. Ennek oka, hogy a daganatprogresszió, különösen a ne m-invazív–invazív határ átlépésének biológiai markereit még pontosan ne m ismerjük. A daganat keletkezésének pontos mechaniz musa máig tisztázatlan, annyi azonban bizonyos, hogy a tu mor kiindulását képezı sejt/sejtek örökítıanyagában olyan változások következnek
be,
melynek
ered ményeként a sejt elveszti kontrollját a sejtciklus
szabályozása felett, megállíthatatlannak tőnı osztódásnak indul, miközben újabb-, és újabb m utációkat szerez, tovább növelve ezzel a geno m instabilitását. Ez az instabilitás a legtöbb szolid tu morban mind kro moszó mális-, mind génszinten megnyilvánul (15). Az
1. ábra a
m elano ma kialakulásának és progressziójának különbözı lépéseiben eddigi ismereteink szerint szerepet játszó kulcsfontosságú kro moszóm ális lókuszokat és géneket foglalja össze (14).
9p21
6q, 11q,
braf ?
NMC
?
?
RGP
DP S
pten
VGP
10q
1p36
1p36, 7q
ras
MSZ
pten
VGP
MSZ
6q
1. ábra Melanoma-progresszió modell. NMC: normál melanocita; DP S: feltételezett diszplasztikus prekurzorsejt; RGP: radiális növekedési fázis; VGP: vertikális növekedési fázis; MSZ: metasztatikus szóródás. A melano ma kialakulásával és inváziójával leggyakrabban az 1p, 6q, 7q, 10q és 11q kro moszó makarokon lokalizálódó, jórészt még azonosítatlan tu mor-szuppresszor és m etasztázis-szuppresszor (azaz a tu mor keletkezést ne m, de a metaszázis kialakulását
11
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
gátolni képes) géneket hozták összefüggésbe (16). Ezek közül eddig a 9p21 lókuszon elhelyezkedı
ink4a (cdkn2a) ciklin-dependens-kináz inhibitor gén szerepe tőnik
egyértelmőnek mind sporadikus, mind fa miliáris m elano mában. A 9p21 régió és a 10-es kro moszó ma hosszú karjának elvesztése feltételezhetıen a melano ma-progresszió korai szakaszában játszik szerepet (16). A radiális és vertikális növekedési fázis közötti átmenetben a 6q és a 11q karoknak tulajdonítanak jelentıséget, míg az 1p36 lókuszon m egfigyelt deléció és a 7q karon észlelt amplifikáció a legutolsó szakaszra jellemzı genetikai eltérés (16).
A melanoma-progresszió során bekövetkezı genetikai változások Korai események
N or mál sejtekben a CIK LI N- D1 fehérjével kom plexet képzı C D K 4 és C D K 6 fehérjék foszforilálják a retinoblasztó ma fehérjét (pR B), ezáltal lehetıvé teszik a sejt belépését az S-fázisba. A 9p21 kro moszó ma régión elhelyezkedı INK4a
p16
ink4a gén által kódolt
fehérje ehhez a ko mplexhez kötıdik és inaktiválja azt, aminek ered ményeként a INK4a
sejt ne m képes túljutni a G1 fázison és belépni a szintézis szakaszába. Ha a p16
fehérje hibás, vagy hiányzik, a sejt akkor is belép az S-fázisba, ha a sejt nor mál m őködéséhez szükséges javító mechaniz musok még ne m fejezıdtek be. A melano ma családi halmozódását mutató esetekben talált cdkn2a germinális mutáció – különösen az ink4a kódolásáért felelıs exont érintı – egyértelm ő bizonyítékot szolgáltatott arra, hogy a INKa
p16
fehérje fontos szerepet tölt be a melano m a szuppresssziójában (17,18). A 9p21-es
lókuszon, az
ink4a génnel szoros kapcsolatban helyezkedik el egy másik tu mor-
szuppresszor gén is, az
arf (p14) (mindkettıt a cdkn2a régió kódolja alternatív leolvasási
keretben), mely szintén fontos szerepet játszhat a m elano mák kialakulásában (19). Szá mos
daganatnál
heterozigótaság-vesztés
vizsgálatokkal
(L O H)
gyakran
m egfigyelték a 10q24-qter lókusz delécióját (20-22). A 10-es kro moszó m a hosszúkarjának hiányát a sporadikus m elano ma progressziójával hozták kapcsolatba (23, 24). Ezen a kro moszó ma lókuszon található a
pten/mmac1 gén, melynek transzkripcióját a T G F-β
do wnregulálja. Egy ilyen tenzin-ho mológ régió és foszfatáz do mén ko m bináció, mint a PT E N/ M M A C 1, illetve ennek jelenléte a citoplaz mában, olyan fehérjére utal, mely specifikusan képes az aktin filamentu mokhoz kötıdni a fokális adheziós helyeken, és defoszforilálhatja az integrineket, a fokális adhéziós kinázokat, és a fokális adhéziós
12
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
ko mplexben jelen lévı SR C fehérjét, vagy növekedési faktor receptorokat, ezáltal szerepe lehet a sejtnövekedés, az invázió, az angiogenezis, és a metasztázis szabályozásában (25). A melano ma kialakulásában a
braf onkogén szerepére egyre több kísérletes adat
létezik. A gén mutációit a melano mák és melano ma sejtvonalak 60-70%-ban sikerült kimutatni (26). A mutáció lehetséges szuppressziója siR N S-sel, vala mint a R A F-útvonalat befolyásoló hatóanyagok felfedezésével a terápia új lehetıségét jelentheti.
A radiális és vertikális növekedési fázis közötti átmenetben szerepet játszó kromoszómális régiók A 6-os kro moszó ma hosszúkarjának deléciójáról gyakran szá molnak be vastag primer melano mák és m elano ma metasztázisok analízisét követıen (27). Megfigyelték, hogy a kro moszó madefektust mutató, erısen tu morigén hu mán melano ma sejtvonal sejtjeibe nor mál 6-os kro moszó mát bejuttatva a fenotípus drá maian megváltozik, a transzfektált melano masejtekben helyreáll a kontakt-gátlás, és a sejtek nem képesek többé tumor létrehozására
nude egérben (28). Ennek m agyarázatául szolgálhat, hogy a 6q21
régión lokalizálódik az
aim1 (absent in melanoma 1) gén, melynek term éke hasonló az
aktin-kötı fehérjékhez, ami azt sugallja, hogy hatását a citoszkeletonnal történı interakción keresztül érvényesíti (28). Ugyanennek a krom oszó mának a rövidkarján található egy m ásik lehetséges metasztázis-szuppresszor gén, az mda-6/waf1, mely az univerzális C D KMDA6/WAF1
inhibitor p21
fehérjét kódolja. Az
mda-6 m R N S és fehérje expressziója szá mos
tumornál fordított arányban áll a metasztatizáló képességgel (29). A
regionális
és
a
m ár
szóródott
metasztatikus
melano máknak
mintegy
egyhar madában a 11q23-qter régió delécióját tapasztalták (30). Több kutatócsoport is kapcsolatot figyelt meg a 11-es kro moszó ma hosszúkarjának átrendezıdése és a melano ma rossz prognózisa, illetve a melano ma agyi metasztázis képzése között (31,32). Szintén a 11-es kro moszó ma hosszúkarján található a
tirozináz gén, melynek mőködése kritikus a
m elanociták nor mál funkciójához (33), így majdne m biztosra vehetı, hogy részt vesz a m elano ma progressziójában. Az R G P- V G P átmenetben feltételezhetıen ugyancsak szerepe van a ras onkogénnek, bár
erre
vonatkozóan
ellentétes
véle ményekkel
is
találkozhatunk
(34,35).
napsugárzásnak kitett bırfelületen keletkezett lézióknál gyakran megfigyelték a
A
ras
onkogén mutációját, ami az ultraibolya sugárzás és a gén aberrációja közötti kapcsolatra
13
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
hívja fel a figyelmet (35). Ball és mtsai. invazív melano mák 38 %-ánál
ras mutációt
m utattak ki (36).
A progresszió késıi fázisának genetikai történései A melano ma genetika kutatásának korábbi szakaszában a legelterjedtebb technika a heterozigótaság-vesztés vizsgálat volt, így érthetı, hogy a legtöbb eltérést delécióként tartjuk szá mon. A mplifikációra is akad azonban példa: a melano ma-progresszió késıi ese ményei közé sorolható a 7-es kro moszó m a egészének, vagy bizonyos régióinak m egtöbbszörözıdése, a m i az ezen a kro moszó mán kódolt metasztázis kialakulást elısegítı gén jelenlétére utal (16,37). Ezen a kro moszóm án található legismertebb onkogén az epidermális növekedési faktor-receptor (E GF-r) kódolásáért felelıs gén, m elynek szerepe m elano mákban még ne m pontosan tisztázott. A
melano ma
kialakulásával és progressziójával elsıként kapcsolatba hozott
kro moszó mális régió az 1p36 volt (38), bár az ezt követı vizsgálatoknak ne m minden esetben sikerült ezt alátá masztani. Fluoreszcencia
in situ hibridizációval az 1q32-q41
lókuszra lokalizált kiss-1 génrıl rendelkezésre álló adatok azonban már egyértelmőbbek és arra utalnak, hogy egy melano mában fontos m etasztázis-szuppresszor génnel állunk sze mben (39). Az eddig be mutatott útvonalak és gének a m elano ma fa miliáris és sporadikus eseteinek csupán egy részében játszanak szerepet, jelezve, hogy további gének léteznek, m elyek alapvetı fontosságúak a melano ma kialakulásában és progressziójában.
14
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
3. CÉLKITŐZÉSEK
A Ph.D. dolgozatot megalapozó kísérletes munka célkitőzései: 3.1.
Eltérı biológiai viselkedéső primer melanomák interfázisos FISH analízise kromoszóma centoméra- és c-myc gén-specifikus DNS szondákkal •
K orábbi C G H ered ményeinkre támaszkodva vizsgálataink elsıdleges célja a primer és metasztatikus melano mák jelentıs részében a mplifikációt m utató 8q22-qter régión lokalizálódó c-myc onkogén szerepének részletes vizsgálata felszínen terjedı és noduláris melano ma altípusokban és azok metasztázisaiban.
•
Az aneuploidia, vala mint a c-myc onkogén szá mbeli alterációi és a primer tumorok klinikopatológiai para méteri közötti kapcsolat elemzése.
3.2.
Egy új, metasztázisképzı humán melanoma sejtvonal eltéréseinek komplex genetikai analízise •
Felszínen terjedı melano mából származtatott sejtvonal ( M35/01) és a primer tumor genetikai aberrációinak összehasonlítása kro moszó mális C G H-el.
•
A sejtvonal szá mbeli és strukturális eltéréseinek részletes analízise különbözı felbontású FIS H módszerekkel és array-C G H technikával.
3.3.
Primer melanomák és melanoma metasztázisok cDNS alapú array vizsgálata •
cD N S-alapú array vizsgálatok ugyanabból a betegbıl származó primer és m etasztatikus tu morok genetikai eltéréseinek összehasonlítása.
15
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Melanoma szövetminták A dolgozatban szereplı hu mán melano ma szöveteket a Debreceni Egyete m , Orvos és Egészségtudo mányi Centru m Bırgyógyászati Klinikájáról és az Országos Onkológiai Intézet
Bırgyógyászati
Klinikájáról (Budapest) szereztük
be
az intézetek etikai
bizottságainak jóváhagyását követıen. Minden betegnél biopsziával igazolt diagnózis állt rendelkezésre, melyet a DE O E C Bırgyógyászati Klinika és az Országos Onkológiai Intézet szövettani laboratóriu maiban állapítottak eltávolítása elıtt, egy
meg. A betegek a primer tu mor
kivételtıl eltekintve, ne m
kaptak se m
ke moterápiát, se m
sugárkezelést. A daganatok klinikopatológiai jellem zıit a 2. táblázat ban foglaltuk össze.
2. táblázat Primer melanomák klinikopatológiai paraméterei Noduláris melanomák Minta száma a
1, 1m 2, 2m 3, 3m 4, 4m 5, 5m 6 7 8 9 10 11 12 13, 13m 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23* 24 25 26 27 28
Nem Kor F F F F N N F F F F N N N F F F N F N F F F F F N F N N
60 79 39 40 62 46 76 58 68 63 86 45 23 73 73 51 58 80 40 49 57 32 58 60 85 72 52 50
Lokalizáció
Breslow-vastagság
lábszár csípı hát váll has derék láb mellkas törzs törzs lábszár -b fejbır kar mellkas mellkas lábszár hát kulcscsont váll arc hát kar lábszár térdhajlat csukló
1,50 12,00 13,00 3,00 40,00 8,00 4,00 5,00 8,00 8,00 6,20 7,50 10,00 4,00 3,20 14,00 6,10 6,10 5,00 4,70 4,70 11,00 9,00 11,00 4,00 4,70 2,90 2,00
a: metasztázis; az azonos számok ugyanarra a betegre utalnak. b: nincs adat *: a beteg a primer tumor eltávolítása elıtt DTIC kezelést kapott
16
Clark szint IV IV V III V IV V IV IV V III-IV II IV IV III IV IV III IV IV III IV IV IV IV IV III IV
TNM-besorolás T2aN0M0 T4bN0M0 T4bN0M2 T3aN0M0 T4bN2bM0 T4bN0M0 T3bN0M0 T4bN0M0 T4bN0M3 T4bN0M0 T4bN0M0 T4bN0M0 T4bN2bM0 T3bN0M0 T3aN0M0 T4bN0M0 T4bN1aM0 T4aN2aM0 T4bN?M3 T4aN0M0 T4bN0M0 T4?N0M0 T4bN0M0 T4bN0M0 T3aN0M0 T4aN0M0 T3aN0M0 T2aN0M0
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
2. táblázat Primer melanomák klinikopatológiai paraméterei (folytatás) Felszínen terjedı melanomák Minta száma Nem Kor
Lokalizáció
29, 29m 30, 30m 31, 31m 32, 32m 33, 33m 34, 34m 35 36, 36m 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51, 51m 52 53 54
lábszár has törzs lábujj lábszár lapocka törzs has csípı törzs maxillaris régió váll törzs váll emlıbimbó arc nyak törzs csukló hát fej hát sarok hát talp láb
N F F N F F F F F F F F F N F N N F N N N N N F N N
70 43 59 24 44 58 80 54 28 60 69 51 38 66 48 77 51 39 80 54 72 49 53 55 69 68
Breslow-vastagság Clark szint 2,60 4,00 11,00 1,50 12,00 5,10 6,00 6,00 1,70 2,50 0,40 1,95 1,20 2,70 3,10 1,30 6,00 4,00 3,10 0,70 6,00 0,30 3,60 2,40 2,80 0,50
IV IV IV III IV IV IV IV IV IV II IV III IV III III-IV IV IV IV III V II III IV IV III
TNM-besorolás T3bN0M0 T3bN0M0 T4bN0M0 T2aN0M0 T4bN1aM0 T4bN3bM1 T4aN0M0 T4bN0M0 T2bN0M0 T3bN0M0 T2aN0M0 T2aN0M0 T2aN0M0 T3aN0M0 T3bN0M0 T2bN0M0 T4bN0M0 T3aN0M0 T3bN0M0 T1aN0M0 T4bN0M0 T1aN0M0 T3bN1bM0 T3bN0M0 T3bN0M0 T1aN0M0
a: metasztázis; az azonos számok ugyanarra a betegre utalnak. b: nincs adat
A tu morok stádiu m- és a vastagság-besorolását az új melano ma-T N M klasszifikáció alapján végeztük (12). Mivel az analizált melano mák jelentıs részének eltávolítása 2002 elıtt történt, amikor még ne m szá mított alapkövetelménynek a daganathoz legközelebbi nyirokcso mó státuszának megállapítása, a tu morok egy részénél a T N M-osztályozás ne m teljes, ezt a táblázatban jelöltük. A melano ma szövetek többségét felhasználásig fagyasztófolyadékba (Cryo matrix, Shandon, P A, US A) ágyazva -86ºC-on tároltuk; néhány esetben formalin-fixált, paraffinba ágyazott szövet állt rendlelkezésünkre. A friss vagy fagyasztott tu morokból lenyo matpreparátu mokat vagy sejtszuszpenziót készítettünk; a formalin fixált szövetekbıl standard protokoll alapján nyertük ki a sejteket (40). A hibridizációkhoz minden esetben egészséges donorból származó limfocita kontrollt használtunk. A limfocitákból rövid tenyésztés és
17
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
kolce mid-kezelést követıen az irodalo mban ismertetett protokoll alapján metafázisos és interfázisos magokat egyaránt tartalmazó preparátu mokat készítettünk (41).
4.3. Sejttenyésztés Az
M 35/01 sejtvonalat 10 %
m édiu mban (GIBCO
magzati borjú széru mot tartalmazó RPM I 1640
BRL, Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) tenyésztettük
(37° C, 5 % C O2 ). Az egyrétegben növı sejteket 0,2 %-os tripszin/E D T A oldattal kezeltük (0,53 m M,
Sigma Aldrich Co., Munich, Németország), majd foszfát pufferes fiziológiás
sóoldattal (phosphate buffered saline: PBS) mostuk (pH: 7,2). Ezt követıen a sejtek egy részébıl D N S-t preparáltunk fenol-kloroform-izoa milalkohol (25:24:1) extrakcióval C G H analízishez, a sejtek másik részét hipotóniás kezelést követıen metanol:ecetsav 3:1 arányú keverékével fixáltuk FISH
analízishez. A sejtvonalból standard protokoll alapján
kro moszó ma
készítettünk
preparátum ot
a
kro moszó mafestı
szondákkal
történı
hibridizációhoz (41).
4.4. Fluoreszcencia in situ hibridizáció 4.4.1. Kromoszóma- és gén-specifikus DNS-szondák FIS H
vizsgálatainkhoz
kro moszó mafestı
lókusz-specifikus,
vala mint
teljes
D N S-szondákat alkalmaztunk. A centro méra-specifikus szondákat
részben a Vysis (Vysis preparáltuk a
centro méra-,
Inc., Downers Grove, IL, USA) cégtıl vásároltuk, részben magunk
Bari-i Egyete mtıl kapott baktériu m
klónokból a V-gene (V-gene
Biotechnology Ltd., Hangzhou, Kína), vagy a Qiagene (Qiagen Inc., CA, USA) plaz midpreparáló kitek segítségével. A c-myc (8q24.12-q24.13) lókusz-specifikus szondát a Vysis cégtıl szereztük be. Az M 3 5/01 sejtvonal karakterizálásához alkalmazott szondák (1p36,
egr-1) a Qbiogene (Qbiogene GmbH, Heidelberg, Németország), illetve a Vysis (egf-r, cyclin-D1, 9p21, Rb1) cégtıl származtak. A különbözı kro moszó mák (2, 4-7, 11, 13, 15, 20-22), illetve a 6p21 régió-specifikus szondákat szintén a Qbiogene, vagy a Vysis cégektıl szereztük be. A
D N S-szondák jelzése direkt (Spectru m G reen d U T P
Fluoreszcein d U TP, TexasRed és Spectru m Red d U TP,
és
Vysis Inc.), vagy indirekt jelzett
nukleotidokkal (biotin-dU T P és digoxigenin-dU T P, Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim,
Németország) nick-transzlációval történt a gyártó cég leírásának megfelelıen (BioNick kit, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD, USA). A biotinnal módosított D N S-szondákat Texas
18
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
Red- vagy Fluoreszcein-avidinnel (Vector
Laboratories Ltd., Peterborough, Nagy-
Britannia), a digoxigeninnel módosított D N S-szondákat monoklonális antitestekkel (antidigoxigenin-fluoreszcein vagy antidigoxigenin-rhoda min,
Vector Laboratories Ltd.),
indirekt im mun-fluoreszcenciával tettük láthatóvá az irodalo mban leírtaknak megfelelıen (24).
4.4.2. FISH hibridizáció A FIS H-t az irodalo mban leírt protokoll alapján, kisebb módosítások alkalm azásával végeztük
(24).
Röviden:
a
tárgyle mezen
rögzített,
fixált
sejtmagokat
és
kro moszó mapreparátu mokat denaturáló oldatban (70 % for ma mid/2xSS C, p H: 7,0) 75° Con 2,5-5 percig denaturáltuk, a sejteket e melkedı koncentrációjú (70 %, 85%, 100 %) hideg etanolban
dehidráltuk
(2
perc
külön-külön),
majd
levegın
m egszárítottuk.
A
tumorszövetbıl készült lenyo mat-preparátu mokat a denaturáció elıtt 3 percig 95° C-on 50 %glicerol/0,1 %
SS C
oldatban
elıkezeltük
a
D N S-szondák
penetrációjának
m egkönnyítése érdekében. Centro méra-specifikus szondáknál a hibridizációs elegy mintánként 4-20 ng D N S-szondát és 10 ng jelöletlen hering sperma D N S-t, 10 % dextránszulfátot, 50 % for ma midot és 2xSS C-t (Sigma-Aldrich
Co.) tartalmazott. A hibridizációs
keverék denaturálását 73C ° -on 5 percig végeztük. A hibridizáció nedves ka mrában 37° Con történt egy éjszakán át. A ne m kötıdött D N S-szondák eltávolítására mosóoldatot (50 % forma mid/2XSS C, 45° C, 3x10 perc), majd 2xSS C oldatot (10 perc) használtunk. A hibridizálódott szondákat a 4.4.3. részben leírtaknak megfelelıen detektáltuk. A sejtmagok jelzésére antifade-ben oldott diamino-fenilindolt (D A PI, kék fluoreszcencia), vagy propidiu m-jodidot
(PI,
vörös
fluoreszcencia)
alkalmaztunk
(Vectashield,
Vector
Laboratories Ltd.).
4.4.3. Fluoreszcens mikroszkópia A FIS H ered ményeket Zeiss Axioplan fluoreszcens mikroszkóppal (Carl
Zeiss, Jena,
Németország) értékeltük (100 × nagyítás (N A 1.3) olaj-im merziós objektív). A gerjesztı fény (fényforrás: 100 W teljesítményő higanygız-lámpa) hullámhosszát megfelelı optikai szőrık alkalmazásával választottuk
meg. E missziós szőrınek a Pinkel-féle hár mas
e missziós filterblokkot használtuk, a mi alkalmas a kéken fluoreszkáló, sejtmagot jelzı D A PI, a zölden fluoreszkáló fluoreszcein és Spectru m Green, a vörösen fluoreszkáló
19
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
TexasRed
és
Spectrum Red, vala mint az ugyancsak
fluoreszkáló propidiu m -jodid M etasystems
(Metasystems
magfestést szolgáló
vörösen
megjelenítésére. A fluoreszcens képek rögzítésére a
GMBH, Althlusseim, Németország) által forgalmazott
képanalizáló rendszert alkalmaztuk.
A
fluoreszcens
képek rögzítése
auto matikus
expozíciós idıvel történt. Minden esetben 100-300 sejtmagot, illetve a festı-szondák hibridizációját követıen 20-25 metafázist értékeltünk. A hibridizáció megbízhatóságának ellenırzésére kísérleteinkben kontrollként egészséges egyén perifériás vérébıl preparált limfocitákat alkalmaztunk. A tu mor minták hibridizációját csak akkor értékeltük, ha a kontroll hibridizáció során a diploid sejtek aránya 95 %-nál magasabb volt.
Kromoszóma-index:
A
kro moszó ma-indexet
(összes
szá ma/értékelt sejtmagok szá ma) tekintettük a kro moszó ma
fluoreszcens kópiaszá m
szignál
kvantitatív
m érıszá mának. A kópiaszá m kategóriák az adott mintában legnagyobb arányban (> 50 %), vagy jelentıs arányban (20–50 %) megtalálható sejtpopulációt tükrözik (41). Egy adott mintát akkor tekintettünk poliszó miásnak, ha az értékelt sejtek több mint 15 %-ában több mint két autoszó ma-specifikus szignál volt jelen; monoszómiásnak ha a sejtek több mint 10 %-a egy autoszó ma-specifikus jelettartalmazott.
Génamplifikáció: A kísérleteinkben vizsgált gének a mplifikációjának mértékét Kraehn és mtsai. szerint definiáltuk. Abban az esetben tekintettük e melkedettnek a c-myc gén kópiaszá mát a 8-as kro moszó ma centro mérához (C8) viszonyítva, ha az adott minta sejtjeinek > 25 %-ában extra c-myc kópiát találtunk (42). A 8-as centro mérához viszonyított c-myc extra kópia-tartom ány kiszá mításához az x = c-myc szignálok szá ma/C8 szignálok szá ma (a vizsgált minta összes sejtjében) összefüggést alkalmaztuk. “Ne m -amplifikáltnak" azokat a mintákat tekintettük, ahol ez az arány < 1,5. Azokban a daganatokban, melyeket az “a mplifikált” csoportba soroltunk, a c-myc/C8 arány elérte vagy meghaladta az 1,5-öt; nagyfokúnak tekintettük az amplifikációt, ha az elıbbi arány meghaladta a 3,0-at.
4.5. Spektrális kariotipus analízis (SKY-FISH) A spektrális kariotipizálást az irodalo mban leírtak szerint a Q Biogene M olecular Cytogenetics
(Németország)
közre mőködésével
végeztük:
ára mlási
cito méterrel
szortírozott hu mán krom oszó mákból polimeráz láncreakcióval elıállított kro moszó ma specifikus könyvtárak jelzése közvetlenül 5 különbözı festékkel (FITC, Rhoda mine, Texas Red, Cy5 és Cy5.5) történt, majd mind a 24 krom oszó ma-specifikus szondát egyidejőleg m etafázisokhoz hibridizáltuk. A le mezek mosása után a D N S-tartalo m m egjelenítéséhez
20
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
antifade-ben oldott D A PI-t használtunk. A különbözı spektru mok közötti elkülönítés S D300 spektrális bio-imaging rendszerrel valósult meg (Applied
Spectral Imaging Ltd,
Migdal Ha’emeg, Izrael). A rendszer Sagnac interfero méter segítségével lehetıvé teszi a teljes látható
fényspektru m
pixelenkénti
mérését.
A
felvételeken
a
különbözı
spektru moknál és a hasonló spektrális tulajdonságokkal bíró vala mennyi pixelnél az átmeneti színek elkülönítésére klasszifikációs algoritmust használt. A D A PI kép rögzítése külön történt, a kro m oszó mák azonosításához a D A PI-sávozás szolgált alapul. A kro moszó mákat ezt követıen a rendszer auto matikusan kariotípus táblázatba sorolta (43).
4.6. Komparatív genomiális hibridizáció (CGH) 4.6.1. Kromoszómális CGH A D N S hibridizációt Kallione mi és mtsai. (44) által leírt módon végeztük, kisebb m ódosításokkal, az alábbiak szerint. A tu m orból és egészséges egyén perifériás m ononukleáris sejtjeibıl
származó
nor mál
D N S-t fenol:kloroform:izo-a milalkohol
(26:25:1) oldattal extraháltuk proteináz-K kezelést követıen, standard protokoll alapján. A D N S minták koncentrációját fluoriméterrel határoztuk meg. A tu mor és nor mál D N S-t nick-transzlációval,
Spectru m Green-12-d U TP-vel,
m egjelöltük a gyártó (Vysis
illetve
Spectru m Red-5-d U T P-vel
Inc. Downers Grove, IL USA) protokollja alapján. A kísérleti
körülményeket úgy állítottuk be, hogy a jelzett D N S frag mentu mok hossza 300 és 2000 bázispár között legyen. A 200 ng jelzett tu mor vagy nor mál D N S-t és 20
µ g jelöletlen
hu mán Cot-1 D N S-t (GIBCO) tartalmazó D N S keveréket 1 térfogat 0,3 M nátriu macetáttal (pH: 5,3) és 100 %-os hideg etanollal kicsaptuk. A D N S-t levegın megszárítottuk és 10
µl hibridizációs oldatban (50 % for ma mid, 10 % dextrán-szulfát, és 2xSS C (1xSS C
0.15 M Na Cl, 0.015 Na-citrát, pH: 7.0)) feloldottuk. A hibridizációs elegyet 73° C-on 5 percig denaturáltuk, majd 37° C-on 30 percig állni hagytuk (preannealing lépés). A nor mál kro moszó mákat tartalmazó C G H le mezeket (Vysis
Inc.) 73° C-on 3-5 percig denaturáltuk,
m ajd e melkedı koncentrációjú etanol sorban (70 %, 85 %, 100 %)
dehidráltuk. A
hibridizációs elegyet tárgyle mezre cseppentettük és lég mentesen lezártuk. A hibridizáció 37° C-on 72 órán át nedves ka mrában történt. A hibridizációs le mezekrıl a ne m hibridizálódott D N S-t hibridizáló-mosóoldat segítségével eltávolítottuk (50 % for ma mid, 2xSS C, p H: 7,0), majd kétszer 2xSS C-ben (pH: 7,0, 45° C), ezt követıen egyszer 2xSS Cben, és kétszer P N-pufferben (0,1 M Na H2 P O4, 0,2 M Na2 HP O4, Nonidet P40, pH: 8,0,
21
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
szobahı mérséklet, 10 perc) mostuk, majd a lem ezeket ultratiszta vízben leöblítettük és levegın megszárítottuk. A sejtmagokat antifade-oldatban (Vysis
Inc.) oldott 0,15 µ g/ml
D A PI-val festettük. A C G H ered mények validálásához negatív kontrollként különbözı jelzéső nor mál-nor mál D N S-t, pozitív kontrollként Spectru m Green-d U TP jelzett, az irodalo mban elfogadott, részletesen jellemzett
M P E-600 e mlıtu mor sejtvonalat és
Spectru m Red jelzett norm ál D N S-t használtunk.
4.6.2. Digitális képanalízis A C G H hibridizáció értékelésére Zeiss Axioplan fluoreszcens mikroszkóphoz (Carl
Zeiss, Jena, Németország) kapcsolt szá mítógép-vezérelt kvantitatív képfeldolgozó rendszert alkalmaztunk (ISIS,
Metasystems GmbH). A fluoreszcens képek rögzítése
(mintánként 8-10 metafázis) monokró m C C D kam erával történt (Co mpulog, I M A C-C C D230, 8 bit felbontás,
Metasystems GmbH). Minden metafázisról 3 fluoreszcens képet
rögzítettünk: a kék fluoreszcencia a kro moszó mák azonosítására szolgál (D A PI festés); a zöld fluoreszcencia a hibridizálódott tu mor D N S-tıl, míg a piros fluoreszcencia a hibridizálódott nor mál D N S-tıl származik. Automatikus háttérkorrekciót követıen a D A PI-sávozás alapján m egszerkesztettük a kro m oszó mák kariogra mját. A kro moszó mális eltérések meghatározása a zöld és vörös fluoreszcencia intenzitások aránya alapján történt. Az egyes kro moszó ma-profilokat átlagolva az adott tu morra jellemzı átlag eltérések térképét kaptuk meg. Az irodalo mban leírt definíció szerint D N S többletnek azokat az eltéréseket tekintettük, melyeknél a zöld/vörös fluoreszcencia intenzitásarány >1,15; D N S vesztésnek pedig azokat, melyeknél ez az arány <0,85. Ezeket az ún. diagnosztikai határértékeket nor mál-normál hibridizációk átlagértékeibıl határoztuk meg (44). Mivel a hibridizáció során használt Cot-1 D N S a kro moszó mák centro méra közeli heterokro matin régióját blokkolja, ezeket a kro moszó maszakaszokat a C G H analízisben figyelmen kívül hagytuk.
4.6.3. Array-CGH Az M 35/01 sejtvonal array-C G H vizsgálatát a teljes hu mán geno mot lefedı 2460 B A C (bacterial
artificial chromosome: mesterséges bakteriális krom oszó ma) klónt
tartalmazó kró mle mezen végeztük a Kaliforniai Egyete m Co mprehensive Cancer Center intézetével együttmőködésben (University
of California, San Fransisco, USA). A többi
22
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
array-C G H kísérlethez 12300 c D N S ele met tartalmazó chipet használtunk, ez utóbbi kísérleteket a Bio medicum, Biochip Center intézetében (Helsinki,
Finnország) végeztük el.
A B A C- és a cD N S-alapú array kísérletek kivitelezése megegyezik, röviden: 1 µg teszt és referencia (Promega,
Madison, WI, USA) geno miális D N S-t rando m-priming módszerrel a
Bioprime Labeling Kit (Invitrogen, Cy5-d U TP-vel (Amersham
Carlsbad, CA, USA) segítségével Cy3 d U T P-vel vagy
Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) megjelöltünk a
gyártó használati útmutatóját követve. A be ne m épült nukleotidokat a Qiagen QI Aquick P C R Purification Kit-tel (Qiagen,
Valencia, CA, USA) eltávolítottuk. A jelölt teszt és
referencia D N S-eket Cot-1 D N S (Roche,
Indianapolis, IN, USA) jelenlétében etanollal
kicsaptuk. A kicsapott D N S-t hibridizációs pufferben (50 % for ma mid, 10 % dextránszulfát, 2xSS C, 4 % S D S , és 10µg/µl élesztı tR N S) újra feloldottuk. A próbákat 72ºC-on 10 percig denaturáltuk, m ajd 37ºC-on 1 óráig inkubáltuk a jelölt D N S-ek jobb kötıdése érdekében (preanneling). A hibridizációs keveréket az array-en 48 órán át 37ºC-on hibridizáltuk. A le mezeket ezt követıen 50 % forma mid/2xSS C oldatban 45ºC-on 15 percig, 2xSS C/0,1 % S D S oldatban 45ºC-on 20 percig, végül 0,1 mol/L nátriu m-foszfát puffer és 0,1 % Nonidet P-40 keverékében 10 percig mostuk. A B A C-array-eket D A PI-val jelöltük. A B A C array-C G H felvételeket Cy3, Cy5 és D A PI szőrıvel ellátott CC D ka merával rögzítettük. A kapott képek feldolgozása a SP O T 1.2 és SP R O C 1.1.1 szoftvercso maggal történt. A 0,5 értéknél nagyobb, illetve -0,5 értéknél kisebb Log2 értékeket tekintettük kro moszó mális többletnek, illetve hiánynak (45). A c D N S array-C G H lem ezeken a targetek fluoreszcencia intenzitását konfokális lézer szkennerrel rögzítettük és D E A R R A Y szoftver segítségével elem eztük (Agilent
Technologies, Palo Alto, CA, USA). A háttérkorrekció után minden ele m re a teszt-D N S átlagintenzitását elosztottuk a megfelelı klón kontroll hibridizációs átlagintenzitásával. A génkópiaszá m analízishez a kapott hányadosokat az array-en található összes target kalibrációs hányados-eloszlása alapján nor malizáltuk. A gyenge minıségő hibridizációs jeleket (a 100 fluoreszcens egységnél kisebb referencia intenzitású kópiaszá m adatok) az ele mzésnél figyelmen kívül hagytuk, és ezeket hiányzó adatokként kezeltük. A kópiaszá m e melkedés/csökkenés m eghatározására a fluoreszcens hányadosok eloszlását használtuk. Az 1,2-nél nagyobb értékeket a mplifikációnak, míg a 0,8-nél kisebb értékeket deléciónak tekintettük (46).
23
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
4.7. Statisztikai analízis Az egyes melano ma altípusok közötti átlagos kro moszó ma kópiaszám/sejt közötti eltérést a két-mintás Wilcoxon rank-su m ( Mann-W hitney) teszt segítségével ele meztük. A különbözı altípusba tartozó minták közötti c-myc kópiaszá m eltérések és c-myc/C8 arány összehasonlításához
a
Fisher-féle
egzakt
tesztet
szignifikánsnak a p =0,05 alatti értékeket tekintettük.
24
alkalmaztuk.
Statisztikailag
EREDMÉNYEK
5. EREDMÉNYEK 5.1. A c-myc onkogén amplifikációjának vizsgálata noduláris és felszínen terjedı primer melanomákban és melanoma metasztázisokban Intézetünkben korábban végzett kro moszó mális CG H vizsgálatok ered ményei szerint primer melano mák közel 50 %-ában a 8-as kro moszó ma eltérése 8q22-qter a mplifikációval társul. Mivel ezen a krom oszó maszakaszon lokalizálódik a c-myc onkogén, célunk volt a gén kópiaszá m eloszlásának vizsgálata primer és metasztatikus melanom ák interfázisos sejtjeiben. Ennek az eltérésnek a részletes tanulmányozását indokolta az is, hogy a c-myc gén a mplifikációja szá mos tu mortípusnál rossz prognózissal társul, melanom ára vonatkozó irodalmi adat azonban alig áll rendelkezésre, a géna mplifikáció mértékét kevesebb mint 10 primer tu mornál írták le (42,47). A korábbi vizsgálatok elsısorban a
M Y C fehérje
expresszióját tanulmányozták, és az ered mények ellentmondásos adatokat szolgáltattak.
5.1.1. Primer és metasztatikus melanomák klinikopatológiai jellemzıi Vizsgálataink során 54 primer és 14 melanom a m ódszerrel. A daganatok klinikopatológiai adatait a 2.
metasztázist analizáltunk FIS H
táblázatban tüntettük fel. A noduláris
m elano ma (N M) altípusba 28, a felszínen terjedı m elano ma (SS M) altípusba 26 primer tu mor tartozott. A betegek életkor és ne m szerinti megoszlása, valamint a primer tu morok lokalizációja a két alcsoportban hasonló volt. A daganatok vastagsága az NM altípusnál 1,5– 40,0 m m, az SS M tu moroknál 0,3–12,0 m m között változott. A kifekélyesedett tu morok szá ma a két alcsoportban szintén hasonló volt. A két alcsoport között ne m volt különbség a kialakult nyirokcso mó m etasztázisok szá mában, azonban a noduláris melano mában szenvedı betegeknél közel kétszer több zsigeri metasztázis alakult ki a követési periódus alatt. Tizennégy betegnél a primer tu mor metasztázis párja is rendelkezésre állt a genetikai vizsgálatokhoz.
5.1.2. Centroméra kópiaszám változások primer melanomákban A daganatsejtekben a kro moszó mák szá mbeli eltéréseit interfázisos FIS H analízissel határoztuk meg. Vizsgálatainkhoz hét különbözı centro méra specifikus szondát (1-es, 3-as, 6-os, 7-es, 8-as, 9-es és 10-es kro moszó mák) alkalmaztunk. A 28 noduláris és 26 szuperficiális melano ma, valamint a 14
metasztázis FIS H-ered ményeit a
3. és 4.
táblázatban foglaltuk össze. Mindkét alcsoportban fıként poliszó miás sejtpopulációkat találtunk. Megfigyeléseink szerint minden tu m ornál legkevesebb három
25
kro moszó ma
EREDMÉNYEK
jelentıs szá mbeli eltérést mutatott, a 68 megvizsgált tu morból mindössze egy felszínen terjedı melano ma volt diszó miás.
3. táblázat A noduláris melanomák FISH adatainak összefoglalása Kromoszómákb No. 1 1mf 2 2m 3 3m 4 4m 5 5m 6 7 8 9 10 11 12 13 13m 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Stádiuma T2aN0M0 T4bN0M0 T4bN0M2 T3aN0M0 T4bN2bM0 T4bN0M0 T3bN0M0 T4bN0M0 T4bN0M3 T4bN0M0 T4bN0M0 T4bN0M0 T4bN2bM0 T3bN0M0 T3aN0M0 T4bN0M0 T4bN1aM0 T4aN2aM0 T4bN?gM3 T4aN0M0 T4bN0M0 T4?N0M0 T4bN0M0 T4bN0M0 T3aN0M0 T4aN0M0 T3aN0M0 T2aN0M0
1 m/p p p p p p p p p p m/p p m/p p m/p p d p p p p p p p p m p p p p p m p p
3 6 7 8 p p p p p nd nd p p p p p p p p p p p p p p p p p nd p p p p m p m p p p m/p p p p m p p d m p p p p p p p p p p p p p p p p p p p p p d d p p p p p p p p p p p p m p d d p p p p p p p p p p p p p p p p p d p d m m/p p p p m p d d m/p p p m m p p p m p p p p p d d m d p m/p m/p p d p
a
9 10 m/p m m nd m m p m m m m m m/p m m/p m m p m p d p p p p d d m p p p p d m d p p p d d m d p m m/p p m/p m p d m m p m m m m d p m/p p p d m m m m m
KIc 2,8 3,0 3,2 4,4 2,9 3,9 2,7 1,8 2,5 2,9 2,4 3,6 3,3 3,4 3,3 3,5 1,8 3,0 3,2 2,4 2,3 2,9 3,1 2,7 2,9 1,7 3,2 2,0 2,3 3,1 2,5 1,9 2,0 2,1
DNS-szondák átlagos sejtenkénti kópiaszáma c-myc/ C8 d c-myc C8e 2,2 3,5 1,6 3,1 4,9 1,6 2,2 6,8 3,1 7,4 8,0 1,1 4,0 4,6 1,1 4,6 3,7 0,8 2,4 3,9 1,7 1,1 1,3 1,2 2,1 3,4 1,7 1,2 1,4 1,2 1,6 5,4 3,4 5,7 7,7 1,4 3,4 4,9 1,4 3,7 3,9 1,1 3,8 4,3 1,1 3,5 6,5 1,9 2,2 2,6 1,2 2,5 3,7 1,5 2,7 4,0 1,5 1,2 3,7 3,1 2,4 4,3 1,8 3,0 3,6 1,2 3,2 3,6 1,1 2,7 3,3 1,2 3,0 3,6 1,2 1,9 2,0 1,1 3,0 3,3 1,1 2,0 2,1 1,1 1,7 2,9 1,7 3,5 3,7 1,1 2,2 3,2 1,5 2,0 2,1 1,1 2,1 2,4 1,1 2,3 2,6 1,2
A TNM-klasszifikáció a jelenlegi American Joint Committee on Cancer szerinti stádium-beosztáson alapul. m: monoszómiás-; d: diszómiás-; p: poliszómiás sejtpopuláció. c KI: kromoszóma-index (össz szignálszám/megszámolt sejtmagok száma). d C8: átlagos 8-as centroméra kópiaszám. e c-myc/C8 arány. b
26
EREDMÉNYEK f g
m: metasztázis; az azonos számok ugyanarra a betegre utalnak. nincs adat.
4. táblázat A felszínen terjedı melanomák FISH adatainak összefoglalása Kromoszómák No. Stádiuma 29 T3bN0M0 29mf 30 T3bN0M0 30m 31 T4bN0M0 31m 32 T2aN0M0 32m 33 T4bN1aM0 33m 34 T4bN3bM1 34m 35 T4aN0M0 T4bN0M0 36 36m 37 T2bN0M0 38 T3bN0M0 39 T2aN0M0 40 T2aN0M0 41 T2aN0M0 42 T3aN0M0 43 T3bN0M0 44 T2bN0M0 45 T4bN0M0 46 T3aN0M0 47 T3bN0M0 48 T1aN0M0 49 T4bN0M0 50 T1aN0M0 51 T3bN1bM0 51m 52 T3bN0M0 53 T3bN0M0 54 T1aN0M0
1 pb p m/p p m m m m m m m m p p m p p d p p p d d p p p p p d d p p p d
3 m p p p d d m d m m p p m/p p p p m/p p p m/p m d nd d p p p m m d p nd d d
6 m p m/p p d p d d m m p p m/p p m p m/p p p m/p m d d p p p nd m m d p nd nd nd
7 m/p P d p d p d d p p p p p p p p p p p p p p p p p p p d p nd p p p nd
b
8 m p m/p p m p p m m m m/p p d p p p m/p m/p p p d m p p p p m p m d p d p d
a
9 m/p p m p m m m d m m m m p m/p m m p m p m m m p p m p p p m d m nd m d
10 p d d m/p p p m m m m/p m m p d m m d p p d m m d p d p d m d d p nd m d
KIc 2,4 3,2 2,3 3,6 2,1 2,6 2,1 2,0 1,6 1,9 2,2 2,5 2,4 4,3 2,3 2,0 2,4 2,4 4,1 2,9 2,2 1,8 2,4 3,2 2,2 2,8 2,3 3,5 2,0 2,3 2,9 2,1 2,3 2,0
DNS-szondák átlagos sejtenkénti kópiaszáma c-myc/ C8 d c-myc C8e 2,1 3,0 1,4 2,1 2,8 1,3 2,9 3,3 1,1 4,8 3,9 0,8 1,8 2,0 1,1 1,1 2,4 2,2 2,7 3,2 1,2 0,7 1,9 2,5 1,3 2,3 1,8 0,8 1,1 1,4 2,1 2,1 1,0 1,4 1,6 1,1 2,1 2,7 1,3 5,2 5,6 1,1 3,7 2,7 1,3 2,1 2,4 1,1 4,4 4,6 1,1 2,2 3,1 1,4 3,1 4,4 1,4 3,5 4,4 1,3 2,0 2,2 1,1 1,9 2,4 1,2 2,2 2,6 1,2 3,3 4,1 1,2 2,5 2,8 1,2 2,2 2,5 1,1 2,0 5,1 1,3 4,6 2,2 1,1 2,0 2,2 1,1 2,0 3,0 1,1 2,9 3,4 1,2 2,1 2,2 1,1 2,5 3,8 1,5 2,0 2,0 1,0
A TNM-klasszifikáció a jelenlegi American Joint Committee on Cancer szerinti stádium-beosztáson alapul. m: monoszómiás-; d: diszómiás-; p: poliszómiás sejtpopuláció. c KI: kromoszóma-index (össz szignálszám/megszámolt sejtmagok száma). d C8: átlagos 8-as centroméra kópiaszám. e c-myc/C8 arány. f m: metasztázis; az azonos számok ugyanarra a betegre utalnak. g nincs adat. b
27
EREDMÉNYEK
A
noduláris alcsoportba tartozó
vala mennyi daganatban az összes vizsgált
kro moszó ma eltért a normál sejtekre jellemzı kópiaszá mtól. A táblázatokban az egyes kro moszó mák do mináns populációi mellett feltüntettük a kro moszó ma-indexet (KI), a 8-as kro moszó ma (C8) és a c-myc gén átlagos kópiaszá mát, vala mint a c-myc gén és a 8-as centro méra át-lagának arányát (c-myc/C8). A noduláris melano mákban a KI 1,9 és 3,6 között, míg a felszínen terjedı daganatokban ez az érték 1,6 és 4,3 között változott. Az
egyes altípusokra jellemzı
centro méra
statisztikai elemzését követıen kapott adatokat az
kópiaszá mok
összehasonlításának
5. táblázat ban foglaltuk össze. A
noduláris altípusba tartozó tu moroknál a kro moszó ma kópiaszá m eltérés a daganatok 78– 96 %-ában fordult elı, míg a felszínen terjedı melano máknál a daganatok 56–92 %-át érintette. A 7-es kro moszó ma kivételével a felszínen terjedı melano mákban jelentıs szá mban találtunk
monoszó miás sejteket. Az 1-es, 3-as, 6-os, 7-es és 8-as kro moszó mák
poliszó miája a noduláris altípusban gyakoribb volt. A 6-os kro moszóm a poliszó miáját szignifikánsan több N M-ben mutattuk ki (p=0,01). Az egyik 9-es kro moszó ma elvesztése a szuperficiális altípusnál kifejezettebb volt (SS M: 52 %; N M: 32 %), ugyanakkor a noduláris altípusban a 10-es kro moszó ma egyik centro mérájának delécióját figyeltünk gyakrabban (N M: 52 %
és SS M: 28 %). A noduláris altípusba tartozó
meg
melano mák
ploiditásának mértéke, amit a kro moszó ma-index tükröz, kro moszó mánként nagyobb volt, mint a felszínen terjedı csoportba tartozó lézióké (6.
táblázat), azonban ez a különbség
egyetlen kro moszó mánál sem érte el a statisztikailag szignifikáns mértéket.
5.1.3. Centroméra kópiaszám változások primer-metasztázis tumorpárokban A vizsgált kro moszó mák többségénél a primer tum orokban és metasztázisaikban hasonló kópiaszá m megoszlást figyeltünk meg, azonban a daganatprogresszió során bizonyos mértékő kópiaszá m növekedést észleltünk (3. és 4. táblázat). Tizenegy melano ma m etasztázisban a kro moszó mák átlagos kópiaszám a (kro moszó ma-index) nagyobb volt, mint az ugyanabból a betegbıl származó primer daganaté. Mindössze egy m etasztázisnál (36 m) figyeltünk meg több mint egy kro moszó mánál deléciót, ezek az 1-es, 6-os, 9-es és a 10-es kro moszó mákat érintették. A 9-es kro moszóm a monoszó miáját, ami a primer tumorokban do mináns eltérésnek szá mított, háro m beteg metasztázisában (29 m, 30 m és 32 m) ne m lehetett kimutatni.
28
EREDMÉNYEK
5. táblázat Kromoszómák számbeli megoszlása noduláris és szuperficiális melanomákban interfázisos FISH módszerrel No.a
Számbeli eltérések jelenléteb
Monoszómiásc
Poliszómiásd
Mono- és poliszómiáse
NM/SSM
NM (%)
SSM (%)
NM (%)
SSM (%)
NM (%)
SSM (%)
NM (%)
SSM (%)
Chr 1
28/26
27 (96)
21 (81)
2 (7)
4 (15)
21 (75)
16 (62)
4 (14)
1 (4)
Chr 3
27/24
26 (96)
18 (75)
4 (15)
6 (25)
19 (70)
9 (38)
3 (11)
3 (13)
Chr 6 f
27/22
25 (92)
17 (77)
0 (0)
5 (23) f
25 (93)
8 (36) f
0 (0)
4 (18)
Chr 7
27/25
21 (78)
21 (84)
0 (0)
0 (0)
21 (78)
20 (80)
0 (0)
1 (4)
Chr 8
28/26
25 (89)
21 (81)
5 (18)
6 (23)
18 (64)
11 (42)
2 (7)
4 (15)
Chr 9
28/25
22 (79)
23 (92)
9 (32)
13 (52)
9 (32)
8 (32)
4 (14)
2 (8)
Chr 10
27/25
23 (85)
14 (56)
14 (52)
7 (28)
8 (41)
7 (28)
1 (4)
0 (0)
a
A vizsgált tumorok száma; NM: noduláris melanoma; SSM: felszínen terjedı melanoma. Számbeli eltérést mutató tumorok száma. c Jelentıs vagy domináns sejtpopuláció 0 vagy 1 szignállal. d Jelentıs vagy domináns sejtpopuláció ≥ 3 sejtenkénti kópiával. e Mind monoszómiás, mind poliszómiás sejtek jelen voltak. f A Fisher-féle egzakt tesztet használva szignifikáns különbség volt kimutatható a két altípus között a 6-os kromoszóma esetén. g p = 0,01 h p = 0,01 b
29
EREDMÉNYEK
5.1.4. A 8-as kromoszóma és a c-myc gén kópiaszámának összehasonlítása melanoma altípusokban A 8-as kro moszó ma interfázisos FIS H analízise a primer melano mák 85 % -ában (25 N M = 89 % és 21 SS M = 81 %), míg a melanom a metasztázisok 100 % -ában szá mbeli eltérést mutatott. A 8-as kro moszó ma poliszó miáját a primer léziók 56 %-ában (19 N M = 68 % és 11 SS M = 42 %), a metasztázisok 79 %-ában detektáltuk (3. és 4. táblázat)
6. táblázat A sejtenkénti átlagos kromoszóma kópiaszám és a c-myc gén kópiaszámának összehasonlítása FISH módszerrel noduláris és szuperficiális melanomákban
na NM/SSMb
SSM KIc ± SD
NM KI ± SD
pd
Chr 1
28/26
2.5 ± 0.7
2.7 ± 0,6
0,28
Chr 3
27/25
2,4 ± 0,7
2,5 ±0,5
0,35
Chr 6
28/22
2,6 ± 1,2
2,7 ±0,8
0,54
Chr 7
28/24
2,7 ± 0,8
3,2 ± 1,0
0,10
Chr 8
28/26
2,5 ± 1,0
2,7 ± 0,8
0,37
Chr 9
28/26
1,9 ± 0,6
2,1 ± 0,4
0,12
Chr 10
28/25
2,1 ± 0,6
2,0 ± 0,5
0,47
c-myc
28/25
2,8 ± 1,0
3,7 ±1,3
0,02
a
Vizsgált tumorok száma. NM: noduláris melanoma; SSM: felszínen terjedı melanoma. c KI: átlagos kromoszóma-index. d p-érték (a két altípus közötti kromoszóma és c-myc kópiaszám összehasonlítására Wilcoxon próbát alkalmaztunk). b
A
c-myc
onkogén látszólagos a mplifikációját (azaz sejtenként kettınél több
fluoreszcens szignált) háro m
kivételével (20, 31 és 54)
minden prim er tu morban
m egfigyeltük. A két melano ma altípus sejtenkénti c-myc kópiaszá mának összehasonlítására – az irodalo mban is alkalmazott – ≥3,5 gén kópiaszá m/sejt küszöbértéket használtunk. N oduláris melano máknál ez 2,0–7,7 között változott, a daganatok 61 %-ában 3,5 vagy annál nagyobb volt (2.
táblázat). A felszínen terjedı melano mák mindössze 27 %-ában detektáltunk
e melkedett c-myc kópiaszá mot. Szignifikáns különbséget figyeltünk meg a sejtenkénti
c-
myc onkogén kópiaszám ban a két altípus között: az N M altípusban a c-myc onkogén
30
EREDMÉNYEK
kópiaszá m e melkedése gyakoribb volt, mint a jobb prognózisú SS M altípusban
(p=0,02)
(6. táblázat). A két melano ma altípusnál ne mcsak a c-myc onkogén kópiaszá mának átlagértéke volt eltérı, hane m a valódi géna mplifikáció mértékét jellemzı c-myc/C8 arány e melkedés is, amit a noduláris melano máknál gyakoribbnak találtunk (p=0,01). A daganatok többségét a mérsékelt fokú géna m plifikáció jellemezte (c-myc/C8
< 1,5). A c-myc/C8 > 1,5 értéket a
noduláris melano mák 36 %-ában, a felszínen terjedı daganatok 8 %-ában mutattunk ki. Nagy mértékő
c-myc géna mplifikációt csak a rosszabb prognózisú noduláris altípusban
találtunk. A metasztázisokban a c-myc a mplifikáció mértéke 6 tu morban közel azonos volt az ugyanabból a betegbıl eltávolított primer tum or géna mplifikációjával. Ezekben a daganatokban az átlagos 8-as kro moszó maszá m a metasztázisokban nagyobb volt, mint a primer tu morokban. Hat tumorpárnál a c-myc gén kópiaszá m csökkenése együtt járt a 8-as kro moszó ma elvesztésével is. A primer tu morhoz viszonyítva 7 metasztázisban (50 %) a c-
myc/C8 arány csökkent. A primer-metasztázis tum orpárok c-myc kópiaszá m eloszlásának vizsgálata szerint a metasztázisok jelentıs részében (8 a 14 tu morból) az átlagos sejtenkénti c-
myc kópiaszá m alacsonyabb volt, mint a primer szövetben, ez az érték 1,1 és 8,1 között változott. Az átlagos sejtenkénti c-myc kópiaszá mhoz hasonlóan, emelkedett c-myc/C8 arányt is ritkán figyeltünk
m eg a
metasztázisoknál. A 8-as kro moszó ma centro mérájához
viszonyított c-myc kópiaszá m növekedést csak 4 m elano ma metasztázisban detektáltunk (1 m, 13 m, 31 m és 32 m). A c-myc/C8 arány relatív em elkedése két esetben (31m és 32 m) a 8-as kro moszó ma teljes vagy részleges elvesztésével társult. A primer tumorhoz viszonyítva 7 m etasztázisnál (50 %) a c-myc/C8 arány csökkent. A géna mplifikációnak ez az „eltőnése” ne m tulajdonítható normál sejtek által okozott kontaminációnak, mivel a tu morok közül egyiket sem jellemezte normál eloszlás a különbözı krom oszó mákra, ami a szövetminták magas tumorsejt-tartalmát bizonyítja.
5.1.5. Interfázisos melanoma sejtek c-myc eltéréseinek összehasonlítása CGH adatokkal Elızetes kro moszó mális C G H vizsgálatainkban 8 primer melano ma (a C G H-el vizsgált tumorok 50 %-a) és 5 m etasztatikus lézió (a C G H-el vizsgálat esetek 42 %-a) a 8q kro moszó ma régión D N S -többletet mutatott. Egy ilyen jellegzetes C G H profilt sze mléltet a
2./A ábra. Annak megválaszolása, hogy a c-myc a mplifikáció mellett milyen más közeli régiók lehetséges a mplifikációja járul hozzá a gyakori 8q22-qter D N S többlethez, lókusz-
31
EREDMÉNYEK
specifikus szondák alkalmazásával lehetséges. A
C G H-el analizált minták közül 8
m elano mánál a 8q22-qter régióra kapott C G H ered ményeket interfázisos FIS H adatokkal hasonlítottuk össze. Hat primer tu morban és 2 m etasztázisban a 8q22-qter amplifikáció m agában foglalta a c-myc onkogén amplifikációját. A
2. ábra egy noduláris melano ma (2. sz. minta) C G H-el felismert 8q22-qter
a mplifikációját mutatja; ugyanebbıl a daganatból származó interfázisos sejtekben a 8-as centro méra két kópiában, a c-myc onkogén 5-10 kópiában volt jelen. A c-myc onkogén (8q24.12-q24.13 régióra specifikus D N S-szonda) FIS H vizsgálata mellett 6 tumornál (3 N M és 3 SS M) elegendı interfázisos minta állt rendelkezésre további hibridizációhoz. Ezeken a tumorlenyo mat preparátum okon a FIS H analízis ered ményei egyértelmően azt mutatták, hogy a C G H-el megfigyelt DN S többlet c-myc a mplifikációtval társult; a 8q telo méra régiójára specifikus szondával nem találtunk extra kópiát egyik mintánál sem. A c-myc génre vonatkozó FIS H-ered ményeink jó összhangban vannak korábbi C G H-ered ményeinkkel.
2. ábra 8q22-qter amplifikáció noduláris melanomában. A) CGH-el felismert 8q22-qter amplifikáció; B) Ugyabból a tumorból származó interfázisos sejtmagok FISH analízise 8-as kromoszóma- (zöld) és c-myc génspecifikus szondákkal.
5.1.6. Klinikopatológiai paraméterek és a c-myc gén kópiaszám eltérései közötti kapcsolat vizsgálata A betegek, valamint a két különbözı alcsoportba tartozó melano mák klinikopatológiai para méterei és a c-myc onkogén eltérései közötti kapcsolatot vizsgálva az alábbiakat állapítottuk meg. A statisztikai analízis ered ményeit a 7. táblázat ban foglaltuk össze.
Betegek életkora. A primer tu morok c-myc alterációjának mértéke és a betegek életkora között ne m találtunk összefüggést. A c-myc kópiaszá m mindkét altípusban az 50
32
EREDMÉNYEK
évesnél idısebb korcsoportban magasabb volt, mint az 50 évesnél fiatalabb korcsoportban, azonban a különbség statisztikailag ne m volt szignifikáns.
Daganatok lokalizációja. A végtagokon, illetve a törzsön vagy a fej-nyaki régión (axialis régió) lokalizálódó tu morok és az extra c-myc kópiával jellemezhetı daganatok között ne m találtunk összefüggést, azonban a c-myc/C8 arány a két alcsoportban jelentısen eltért: 22 olyan noduláris melano m ából, mely a test axiális régióján alakult ki, nyolc tum ornál (36 %) az arány
> 1,5; a szuperficiális daganatoknál egyetlen lézió sem mutatott hasonló értéket.
Szignifikánsan gyakoribb volt viszont a c-myc/C8 arány e melkedése a törzsön, illetve a fejnyaki régión elhelyezkedı noduláris melano mák között (p =0,004).
Daganat vastagsága. Ne m találtunk különbséget a kisebb vastagság-katégóriába tartozó noduláris és szuperficiális alcsoport között (1,01–2,0 m m és 2,01–4,0 m m), se m az extra c-myc kópiaszá m, se m a c-myc a mplifikáció (c-myc/ C8
> 1,5) elemzésekor. A
nagyobb tu morvastagságú alcsoportban (> 4,01 m m) az extra c-myc kópiaszá m közelítette a szignifikánsan eltérı m értéket, de azt ne m érte el (átlagos c-myc kópiaszá m/sejt > 3.5;
p= 0,08). A c-myc/C8 arány ele mzésekor a 4,01 m m-nél vastagabb m elano mák két alcsoportja között szintén ne m találtunk statisztikai különbséget. Fontos azonban m egjegyezni, hogy az SS M csoportba tartozó két primer melano ma közül (33. és 53. sz. minták), melyeknél valódi géna mplifikációt figyeltünk meg, az egyik tu m or vastagsága 12 m m-nél nagyobb volt.
Primer tumorok felszínének kifekélyesedése. A c-myc gén szá mbeli eltérését mind ulcerált,
mind
m elano máknál
ulceraciót az
extra
szignifikánsan nagyobb
ne m
mutató
daganatoknál
c-myc
kópiát
hordozó,
megfigyeltük.
A
noduláris
kifekélyesedett tu morok
volt, mint a felszínen terjedı daganatoknál
szá ma
(p=0,01). A
kifekélyesedett tu morok közül több e melkedett c-myc/C8 aránnyal jellem ezhetı daganat tartozott a noduláris altípusba, mint a szuperficiális altípusba, azonban a különbség statisztikailag ne m volt szignifikáns (8. táblázat).
Metasztázis képzıdés. A nyirokcso mó metasztázist képzı noduláris m elano mák közül szignifikánsan több tu mornál találtunk e melkedett c-myc gén kópiaszá mot, összehasonlítva az ugyanebbe a csoportba tartozó felszínen terjedı daganatokkal (p =0,04); ez a különbség a c-myc/C8 kópiaszá m arányra ne m érte el a statisztikalilag szignifikáns m értéket (p =0,08).
Betegek túlélése. Az e m elkedett c-myc/C8 arány és a rövidebb, tünetmentes túlélési idı között szintén különbséget találtunk az N M és SS M altípusok között. A c-myc gén
33
EREDMÉNYEK
kópiaszá m eltérését jelentısen több noduláris m elano mánál figyeltük m eg azoknál a betegeknél, akik a primer tumor eltávolítását követıen 5 éven belül meghaltak (p =0,02).
7. táblázat A c-myc gén kópiaszám változásának összehasonlítása a betegek klinikopatológiai paramétereivel noduláris és szuperficiális melanomákban Átlagos c-myc kópia/sejt > 3.5
Összes tumor Nem Nı Férfi
c-myc/C8 > 1.5
SSMa (%)
NMa (%)
P
SSM (%)
NM (%)
P
7/26 (27)
17/28 (61)
0,02b
2/26 (8)
11/28 (39)
0,01
3/12 (25) 4/14 (29)
5/10 (50) 12/18 (67)
0,38 0,13
1/12 (8) 1/14 (7)
5/10 (50) 6/18 (33)
0,06 0,20
5/9 (56) 12/19 (63)
0,13 0,13
1/8 (13) 1/8 (13)
3/9 (33) 8/19 (42)
0,58 0,20
5/6 (83) 12/22 (55)
0,08 0,13
2/6 (33) 0/20 (0)
3/6 (50) 8/22 (36)
1,00 0,004
0/0 (0) 1/2 (50) 3/6 (50) 14/20 (70)
0,46 0,33 0,08
0/4 (0) 0/6 (0) 1/9 (11) 1/7 (14)
0/0 (0) 1/2 (50) 4/6 (67) 6/20 (30)
0,09 0,63
3/9 (33) 14/19 (74)
1,00 0,01
0/10 (0) 2/16 (13)
4/9 (44) 7/19 (37)
0,03 0,13
3/9 (33)
1,00
1/11 (9)
3/9 (33)
0,28
5/7 (71
0,04
0/8 (0)
3/7 (43)
0,08
9/12 (75)
0,073
1/7 (14)
5/12 (42)
0,33
11/16 (69)
0,02
1/11 (9
6/16 (38)
0,18
Életkor (évek) 1/8 (13) 20-50 6/18 (33) > 50 Elhelyezkedés 1/6 (17) Végtagok 6/20 (30) Axiális Tumor vastagsága (mm) 2/4 (50) <1,0 1/6 (17) 1,01-2,0 2/9 (22) 2,01-4,0 2/7 (29) >4,01 Ulceráció Nem volt 3/10 (30) Volt 4/16 (25) Metasztázis kialakulása Nem képzett 4/11 (36) metasztázist Nyirokcsomó 1/8 (13) metasztázis Visceralis 2/7 (29) metasztázis Exitus 5 éven 2/11 (18) belüld a
SSM: szuperficialisan terjedı melanoma; NM: noduláris melanoma. Fisher egzakt teszt (kétoldalú p-értékek). c Metasztázis a primer tumor eltávolítását követı 5 éven belül kialakult. d Exitus a primer tumor eltávolítását követı 5 éven belül. b
34
EREDMÉNYEK
5.2. Egy új melanoma sejtvonal átfogó citogenetikai karakterizálása Az új melano ma sejtvonalat egy 69 éves férfibeteg felszínen terjedı, vertikális növekedési fázisban lévı melano májából Dr. Ladányi Andrea (Országos
Onkológiai
Intézet, Tumorprogresszió Osztály, Budapest) hozta létre 2001-ben, a sejtvonal elnevezése: M 3 5/01. A betegben a primer tu mor eltávolítását követıen egy év múlva máj metasztázis alakult ki. Az RP MI 1640 médiu mban tenyésztett sejtvonal több évig tartó folya matos fenntartás után is megtartotta osztódóképességét. A melano ma sejtek im m unszuppresszált 6
(SCID) egerekbe történı subcutan (1-3x10
sejt) beoltását követıen m etasztázis ne m
6
alakult ki, azonban lépbe oltás (2x10 sejt) után máj metasztázis jött létre. Az M 35/01 sejtek intraperitonealis oltását követıen peritoneális szóródás volt megfigyelhetı. Im munhisztoké miai jelöléssel HL A- A2, H L A
II, H M B 45 antigén expressziót
figyeltünk meg, ugyanakkor a M A R T-1 antigén expressziója ne m volt egyértelmő, S100 B antigént pedig ne m tudtuk kimutatni. A fehérje expresszió mértékét ára mlási cito méterrel határoztuk meg (Országos
Onkológiai Intézet).
Az új sejtvonal molekuláris genetikai karakterizálását több módszer (C G H, Gsávozás, S K Y-FIS H, FIS H interfázisos sejtmagokon és kro moszó ma preparátu mokon) együttes alkalmazásával végeztük el.
Az M35/01 sejtvonal összehasonlítása A
és
az
eredeti
primer
genetikai
eltéréseinek
primer daganat és az abból létrehozott sejtvonal genetikai eltéréseinek
összehasonlítására C G H vizsgálatot végeztünk. A az
melanoma
M35/01
sejtvonal
CG H
profilját
3. ábra A) része a primer tu mor, B) része
mutatja
be.
A mint
az
a
CG H
profilok
kro moszó mánkénti összehasonlításából látható, az eredeti tu mor és az M 35/01 sejtvonal szá mos azonos genetikai elváltozást mutat, a mi a közös eredetet jelzi, ugyanakkor olyan eltérések is láthatóak, melyek arra utalnak, hogy a) az eredeti tu mor genetikailag heterogén sejtklónokat tartalmazott, b) az in
vitro tenyésztés során genetikai szinten változások jöttek
létre, illetve az eredeti heterogén tu morban voltak olyan eltérések, melyek a natív sejtekben kisebb százalékban fordulnak elı. A C G H-el megfigyelt legjellemzıbb közös eltérések a 4p, + 6p22-pter, +7q21-qter, -9, -10, -14q32-qter, +15q15-qter, -16q, -17p, -19p12-p13 kro moszó maszakaszokat érintették. A csak a sejtvonalban megjelenı eltérések az 5p14pter, és a 12p12-q13.12 kro moszó maszakaszok és a 18-as kro moszó ma delécióját, illetve a 20-as kro moszó ma többletét jelentetik (3. ábra).
35
EREDMÉNYEK
3. ábra Felszínen terjedı primer melanoma és az abból származtatott melanoma sejtvonal (M35/01) kromoszómális CGH profilja A) Eredeti tumor kromoszómális CGH profilja
B) A fenti tumorból kialakított sejtvonal (M35/01) kromoszómális CGH profilja
36
EREDMÉNYEK
Tekintettel arra, hogy a kro moszó mális C G H maximális felbontása 10 M b, sokszor azonban csak a 20 Mb-nál nagyobb eltéréseket lehet csak kimutatni, vizsgálatainkat 2460, pontosan lokalizált B A C klónt tartalmazó C G H microarray-en is elvégeztük. A részlete a 6-os kro moszóm a array-C G H,
4. ábra A)
B) részlete a sejtvonal kro moszóm ális C G H, míg
C) részlete az eredeti primer melano ma kro moszó mális C G H hibridizációját sze mlélteti. Az ábrán jól látható a kro moszó mális C G H és az array-C G H kro moszó ma profiljainak egyezése. Array-C G H-el több D N S szekvencia am plifikációját figyeltük m eg. Ezek közül a legnagyobb mértékő am plifikációt az alábbi szekvenciák mutatták: 6p24 (Log2 = 0,69), 6p22-p23 (Log2 = 0,59), 6p21 (Log2 = 0,57). A sejtvonalban deléciót a 6-os kro moszó mán array-C G H-el sem találtunk. Az C G H-el
5. ábrán vala mennyi kro moszó ma array-C G H analízise látható. A klasszikus kapott
kro m oszó mális
eltéréseket
az
array-C G H
eredm ényei
ne mcsak
m egerısítették, hane m szá mos egyedi lókusz a m plifikációjára is felhívták a figyelmet. Az array-C G H-el azonosított alterációk sokszor 600-1200 bázispárra terjedtek ki, melyeket kro moszó mális C G H-el ne m lehet kimutatni. Az M35/01-es sejtvonalban a B A C alapú array-C G H technikával több mint 200 D N S szeg ment (pontosan lokalizált D N S klón) a mplifikációját, és 150-nél több lókusz delécióját figyeltük meg.
A melanomáknál gyakran eltéréseket mutató kromoszómák (6, 7, 9 és 10) mellett mindkét CGH módszerrel jelentıs mértékő amplifikációt mutattunk ki a 15-ös és a 20-as kromoszómákon, illetve nagyfokú deléciót a 4-es, 14-es, 16-os, és 18-as kromoszómákon. Az array-CGH lényegesen nagyobb felbontásának köszönhetıen a kromoszómális CGH-el kimutatott eltérések finomabb megkülönböztetése is lehetséges volt. Az array-CGH alapján a legnagyobb mértékő amplifikációt (Log2 > 0,6) a 7q (7q22-q31), 15q (15q21-q25), 20q (20q13) kromoszómakarokon, a legnagyobb mértékő deléciót (Log2 < -0,6) a 4q (4q12, 4q28q31, 4q32-q33), 9p (9p21, 9p23, 9p24), 9q (9q21), 10q (10q23-q25), 12q (24.3), 16q (16q13q21, 16q21, 16q23) 18p (18p11, 18q21-23), 17p (17p12) kromoszóma szakaszokon figyeltünk meg. A sejtvonal array-CGH kísérlethez kontrollként alkalmazott, normál DNS hibridizációját követıen valamennyi kromoszómánál a Log2 érték + 0,2 között maradt, ami azt jelenti, hogy az általunk alkalmazott amplifikációs és deléciós szintek valamennyi eltérésre valódi amplifikációt ill. deléciót jelentettek.
37
EREDMÉNYEK
6-os kromoszóma 2
Log2 középérték Log2 Mean Ave Raw Ratio
A
1,5 1 0,5 0 -0,5 -1 -1,5 -2 0
50000
100000
150000
200000
B
C
4. ábra Melanomában gyakori 6-os kromoszóma-eltérés az M35/01 sejtvonalnál array-CGH-el (A) és kromoszómális CGH-el (B), valamint az eredeti tumoron kromoszómális CGH-el (C). X-tengely: genomiális pozíció; Y-tengely: Log2 középérték.
38
EREDMÉNYEK
5. ábra Az M35/01 sejtvonal kromoszóma profilja az array-CGH alapján
39
EREDMÉNYEK
5. ábra Az M35/01 sejtvonal kromoszóma profilja az array-CGH alapján (folytatás)
40
EREDMÉNYEK
A legnagyobb kro moszóm aszakaszt érintı a mplifikációt a 15-ös kro moszó mán találtuk
6.
ábra). Mindkét módszerrel teljes 4-es, 9-es, és 18-as kro moszó ma vesztést figyeltünk meg. Kro moszó mális C G H-el a 10-es kro moszó ma esetében is teljes kro m oszó mavesztést tapasztaltunk, azonban array-C G H-el olyan nem-deletált klónok is elkülöníthetıekké váltak, melyek hagyo mányos C G H módszerrel nem mutathatóak ki.
15-ös kromoszóma 2
Log2 középérték Log2 Mean Ave Raw Ratio
A
1,5 1 0,5 0 -0,5 -1 -1,5 -2 0
50000
100000
150000
B
C
6. ábra A 15-ös kromszóma eltérései nem tartoznak a gyakori kromszómális elváltozások közé melanomában, az M35/01 sejtvonalnál azonban jelentıs mértékő amplifikációt mutattunk ki mind array-CGH (A), mind kromoszómális CGH technikával (B). Az ábra C) részén az eredeti tumor 15-ös kromoszómájának CGH-képe látható.X-tengely: genomiális pozíció; Y-tengely: Log2 középérték. 41
EREDMÉNYEK
Kromoszómák számbeli eltéréseinek analízise interfázisos sejtekben A 14-es és 19-es krom oszó mákon kívül valam ennyi centro méra hibridizációját elvégeztük, e két kro moszó ma centro méra régióinak azonossága olyan nagyfokú, hogy centro méra-specifikus FISH szondákkal megkülönböztetésük ne m lehetséges. Hasonló problé ma a 13-as és 21-es kro moszó máknál is fennáll, azonban ezen kro moszó mák szá mbeli eltéréseinek analízisére a diagnosztikában ma már általánosan használt 13q14 és 21q22.13-q22.2
szondákat
alkalmaztuk.
FISH
adataink
szerint
a
sejtvonalra
a
kro moszó mák triszó miája vagy tetraszó miája jelle mzı. Az 1-es, 3-as, 4-es, 6-os, 8-as, 10es, 11-es, 16-os és 21-es kro moszó mánál a sejtek több mint 50 %-ában háro m, míg a 2-es, 5-ös, 7-es, 15-ös, 17-es kro moszó mánál négy fluoreszcens szignált figyeltünk meg. A 12es kro moszó ma a sejtek 42 %-ában triszó miás, 48%-ában tetraszó miás volt. Az autoszó m kro moszó mák közül csak a 9-es, a 18-as, és a 20-as volt diszó miás, de a diszó miás sejtek aránya egyedül a 18-as kro moszó mánál haladta meg a 90 %-ot. A 20-as kro moszó ma triszó miája a sejtek 31 %-ára volt jellemzı.
A legheterogénebb eloszlást a 9-es
kro moszó mánál figyeltük meg, ahol a do mináns (2 szignál/sejt) sejtpopuláció mellett m onoszó miás (8 %), triszó miás (16 %), és tetraszómiás (18 %) sejteket is találtunk. A ne mi kro moszó mákra a do mináns sejtpopuláció egyértelmően diszó miás volt (X kro moszó ma 98 %; Y kro moszó ma 94%).
Kromoszómális átrendezıdések vizsgálata: SKY-FISH analízis Az M 35/01 sejtvonal kariotípusának meghatározásához kro moszó ma preparátu mot készítettünk. G-sávozás alapján a kro moszó maszá m 65 és 82 között változott, ami közel triploid kariotípust jelez. Megfigyeltünk szá mos kro moszó mális átrendezıdést is, melyek jelentıs részének eredetét a sávozás gyenge felbontása miatt ne m tudtuk meghatározni.
7. ábra FISH az M35/01 sejtvonalon 2-es kromoszóma centroméra specifikusszondával (piros) és 15-ös kromoszóma specifikus festı szondával.
42
EREDMÉNYEK
A strukturális eltérések kimutatására kro moszó mafestı-szondákat alkalmaztunk, azonban a rendelkezésünkre álló festıszonda ko m binációkkal (Spectru m Green jelzett 2-es, 4-es, 5-ös, 6-os, 7-es, 15-ös, és Spectru m Red jelzett 11-es, 13-as, 20-as, 21-es és 22-es kro moszó ma-specifikus szondák), illetve festı- és centro méra-specifikus szondákkal transzlokációt kevés esetben sikerült egyértelmően azonosítani (7.
ábra). A G-sávozás ma
rendelkezésre álló legm odernebb alternatív m ódszerének alkalmazásával, S K Y-FIS H technikával a kro moszó ma átrendezıdések, transzlokációk és marker kro moszó mák sorozata tárható fel (8. ábra).
A 8. ábra A M35/01 melanoma sejtvonalon elvégzett SKY-FISH analízisrıl készült mikroszkópos felvétel (A), és a sejtvonal színes kariotípusa (B). Centroméra- és festıszondák sorozatával történı hibdirizációk jó egyezést mutattak a SKY-FISH eredményeivel.
B
43
EREDMÉNYEK
A kro moszó mák szá mbeli eltérésein kívül a S K Y-analízis a vizsgált metafázisokban ugyanazokat a többszörös átrendezıdéseket mutatta. Az átrendezıdések 12 kro moszó mát érintettek, és legalább 15 különbözı töréspontot foglaltak magukban. A kro moszó mák ko mplex újrarendezıdését figyeltük meg a 2-es és 15-ös (der(2)t(2;15), a 2-es és 12-es (der(2)t(2;12;2)), a 13-as, 21-es és az
Y
(der(13)t(Y;13;21)), a 6-os és 15-ös
(der(15)t(6;15)), a 7-es és 17-es (der(17)t(7;17), vala mint a 19-es és a 22-es (der(19)t(19;22;19) krom oszó mák között. A metafázisokban megfigyelt eltérések közül a 6-os és a 7-es kro moszó mák többlete, vala mint a 9-es és 10-es kro moszó mák hiánya m elano mákra gyakran leírt elváltozások. Jelen esetben ez utóbbi kro m oszó mák relatív veszteségét tudtuk kimutatni, azaz a míg a kro moszó mák többsége 3, illetve 4 példányban volt jelen, addig a 9-es és a 10-es kro moszó ma csupán két kópiában. Marker kro moszó mát se m sávozással, se m a S K Y-analízissel ne m találtunk. A S K Y-FIS H ered ményeként a sejtvonal kariotípusa a következı: 68, X X Y, 3Xder(2)t(2;15), -4, +5, -9, -10, -11, der(2;12;2),
+der(13)t(Y;13;21),
2Xder(15)t(6;15),
-16,
der(17)t(7;17),
-18,
der(19)t(19;22;19), add(20), +add(20), -21, -22.
Onkogének és tumorszuppresszor gének számbeli eltéréseinek vizsgálata gén- és lókuszspecifikus szondákkal Az onkogének és tu morszuppressszor gének közül a
cyclin-D1 (11q13), c-myc
(8q24.12-q24.13), egr1 (5q31), egf-r (7p12), p16-p14 (9p21) és Rb1(13q14) a mplifikáció, ill. deléció különbözı daganatokban gyakran rossz prognózissal társul. Mivel az M 35/01 sejtvonalban ezeket a géneket tartalmazó kro moszó mák abnor mális szá m ban voltak jelen, m egvizsgáltuk, hogy a gének kópiaszá ma hogyan viszonyul a centro méraszá mhoz. A fenti gének szá mbeli eloszlása hasonló volt a megfelelı kro moszó mák centro méráira kapott értékekhez, a mi azt jelzi, hogy a sejtvonal sejtjeiben ezek a gének sem deléciót, se m a mplifikációt ne m szenvedtek. A teljes kro moszó mafestı szondák
mellett a 6p21-es kro moszó mális régióra
rendelkezésünkre állt un. sávfestı D N S-szonda. Ennek a lókusznak elsısorban a radiális– vertikális fázis közötti átmenetben tulajdonítanak szerepet. Ered ményeink szerint a 6-os kro moszó mán egy töréspont pontosan ezen a lókuszon következett be (9. ábra). A fentiek alapján az M 35/01 sejtvonal alkalmas a felszínen terjedı m elano mák biológiai viselkedésének további vizsgálatára, melyet a
metasztatizáló képességgel
összefüggésben szeretnénk a közeljövıben részletesen tovább folytatni.
44
EREDMÉNYEK
9. ábra Hibridizáció a 6p21 lókuszspecifikus szondával az M35/01 sejtvonal egy metafázisán. A 6-os kromoszómát érintı törés a kromoszóma rövidkarjának 21-es sávjában történt. A fehér színő nyilak egy-egy 6-os kromoszóma "végén" látható 6p21 sávdarabra mutatnak; a sárga nyilak a kisebb transzlokálódott részt jelölik.
5.3. Primer melanomák és melanoma metasztázisok cDNS alapú array-CGH vizsgálata A dolgozat utolsó részében azokról a vizsgálatainkról szeretnék beszá molni, melyek célja a melano ma-progresszióban szerepet játszó onkogének és tu morszuppresszor gének azonosítása, majd ezt követıen azok expressziós szintjének vizsgálata ugyanazon a c D N S chipen. cD N S alapú array-C G H módszerrel eddig 9 melano ma (4 primer, 3 metasztázis, 1 sejtvonal), és 1 eredetileg
melano mának
diagnosztizált fibrosus histiocyto ma
m etasztázisa eltéréseit ele meztünk. A c D N S klinikopatológiai adatait a 9.-es
és
array vizsgálattal analizált daganatok
táblázat ban tüntettük fel.
9. táblázat Array-CGH vizsgálattal analizált daganatok klinikopatológiai jellemzıi Szövetszám
Típus
Nem
280/00 298/00* 114/04 115/04* 873/98
SSM nyirokcsomó ALM nyirokcsomó Fibrosus histiocytoma nyirokcsomó NM nyirokcsomó ALM
Nı
874/98* 244/98 247/98* 141/04
Életkor a diagnóziskor
TNMbesorolás
Lokalizáció
62
Breslow vastagság (mm) 40,0
T4bN2M0
Has
Nı
49
3,6
T4aN1M0
Sarok
Férfi
40
Nı
23
10,0
T4bN2bM0 Fej
Férfi
73
7,0
T4bN1M0
Hát
Sarok
*298/00: a 280/00, a 115/04: a 114/04, számú primer melanoma nyirokcsomó metasztázis párja 874/98:a histiocytoma nyirokcsomó metasztázisa (korábban melanomának karakterizált); 247/98: a 244/98 számú daganat nyirokcsomó metasztázisa
45
EREDMÉNYEK
A
12233
cD N S
ele m ő
chipek (http://www.helsinki.fi/biochipcenter/index.htm,
Biochip Biocenter, Helsinki, Finnország) egyenként 379 rando m elhelyezett ismétlıdı ele met tartalmaztak (46). A belsı kontrollként használt elemekre kapott kalibrációs hányadosok 99,62 %-ban m egegyeztek (a 7 chipen mindössze 6 olyan ele m volt, melynek a hibridizációja
ellentmondásos
ered ményt
adott).
Az
array-C G H
hibiridizáció
ered ményességét jelzi, hogy a több mint 12000 cD N S ele mbıl a minták többségében 9000 fölött volt a sikeresen hibridizálódott elemek szá m a (10. táblázat). A
10. táblázat ban kék színnel e meltük ki a hibridizálódott, pirossal a deletált, és
zölddel az a mplifikált cD N S ele mek szá mát. A cD N S alapú array-C G H hibridizációnál 3 beteg esetében a primer tu mort tekintettük referencia D N S-nek és az array hibridizációt egyszerre végeztük el a m etasztázisból származó D N S-el. Ezekben a mintákban a primer és metasztázis geno mjának nagy mértékő hasonlósága miatt, a többi hibridizációhoz képest, kevesebb eltérést találtunk. A primer tu morban a genetikai eltérések olyan mértékő halmozódása alakult ki, m elyhez kisszá mú újabb eltérés létrejötte is elegendı volt, hogy a m etasztázis makroszkóposan is megfigyelhetıvé váljon.
10. táblázat cDNS array-CGH eredmények összefoglalása Minta száma Sikeresen hibridizálódott klónok száma
280/00 114/04 873/98 141/042 35/012* 244/982 247/982 298/001 115/041 874/981 10 974
9 647
8 250
9 817
10 119
8 197
9 277
Sikeresen hibridizálódott klónok aránya (%)
90
79
67
80
83
67
76
Deletált klónok száma3
344
110
653
705
1216
1123
2151
Deletált klónok aránya (%)
3,1
1,1
7,9
7,2
12,0
13,7
23,2
Amplifikált klónok száma4
184
355
987
683
1220
1209
1918
1,7
3,7
12,0
7,0
12,0
14,7
20,7
4,8
4,8
19,9
14,2
24,0
28,4
43,9
Amplifikált klónok aránya (%) Eltérések aránya összesen (%) 1
az array hibridizáció során a metasztázist közvetlenül a primer daganattal hasonlítottuk össze az array hibridizáció során a referencia DNS normál humán vérbıl származó DNS volt 3 Kalibrációs ráta < 0,8 4 Kalibrációs ráta > 1,2 *metasztatikus potenciállal rendelkezı primer melanoma sejtvonal 2
A
primer tu morok normál D N S-hez történı hibridizációja, a 141/04 szá mú
m elano ma kivételével, jelentıs szá mú genetikai alterációt mutatott. A legtöbb eltérést a
46
EREDMÉNYEK
244/98 primer melanom ában és 247/98 metasztázisában figyeltük m eg. A 23 éves nıbetegbıl származó primer melano ma az agresszív noduláris altípusba tartozott. A m etasztázisban a primer tumorhoz képest közel kétszer több cD N S ele m am plifikációját és delécióját figyeltünk meg. Az értékelhetı ered ményt adó közös ele mek közül 3315 mind a primer daganatban, mind a metasztázisban norm álnak bizonyult (kalibrációs ráta (K R): 0,8–1,2); a primer tu morhoz viszonyítva 1358 elem a metasztázisban deléciót (metasztázis K R <0,8, primer K R >0,8); 1418 ele m pedig a mplifikációt mutatott (metasztázis K R >1,2, primer <1,2). A primer tu morok array-C G H ered ményeinek összehasonlításakor 58 olyan ismert gént mutattunk ki, melyek minden mintában deletálva (31 gén), illetve minden mintában a mplifikálva (27 gén) voltak (11.
és 12. táblázat).
11. táblázat Következetesen deletált gének és kromoszómális lokalizációjuk Deletált Gének RBBP4 ACP6 RAB13 CCT3 EXO1 CPSF3 WNT6 EIF4EL3 MAIL LOC201895 CASP6 FLJ11539 RPS10 SWAP70 PSMA1 RAB6A MGC14839 RICS MGC15416 CHD3 BCL2 VAV1 SNRPD2 GMFG CHAF1B COMT HMG2L1
Kromoszómális lokalizáció 1p34.3 1q21 1q21.2 1q23 1q42-q43 2p25.2 2q35 2q37.1 3p12-q12 4p14 4q25 4q34.1 6p21.31 11p15 11p15.1 11q13.3 11q23.2 11q24-q25 16p13.3 17p13.1 18q21.33 19p13.2 19q13.2 19q13.2 21q22.13 22q11.21-q11.23 22q13.1
35/01 0,7546 0,6988 0,5947 0,4535 0,5732 0,4971 0,7529 0,7625 0,7394 0,6746 0,6924 0,6111 0,7083 0,4486 0,3767 0,7795 0,5333 0,6474 0,5987 0,4613 0,7640 0,3759 0,6078 0,7596 0,5851 0,5985 0,4761
47
Kalibárciós hányados 141/04 244/98 0,6833 0,1095 0,7648 0,7714 0,6933 0,7766 0,6552 0,7501 0,6376 0,6168 0,5779 0,6638 0,6126 0,7493 0,6120 0,7233 0,4616 0,7352 0,7190 0,7516 0,7911 0,6797 0,6486 0,7997 0,5226 0,0737 0,5524 0,5222 0,5949 0,6466 0,7662 0,0831 0,7649 0,7423 0,6329 0,1898 0,6868 0,6814 0,7654 0,6733 0,7432 0,7889 0,6675 0,6762 0,7313 0,1809 0,4959 0,5298 0,5498 0,7905 0,7895 0,6212 0,1600 0,2933
EREDMÉNYEK
12. táblázat Következetesen amplifikált gének és kromoszómális lokalizációjuk Amplifikált Gének
Kromoszómális lokalizáció HHLA3 1p31.2 FLJ20277 1p34.1 KIAA1724 2p24.1 ERCC3 2q21 BZW1 2q33 ENDOGL1 3p21.3 ATP1B3 3q22-q23 KIAA0746 4p15.31 ICF45 5q33.3 ETEA 5q35.3 C6orf110 6p21.1 MRPL2 6p21.3 RNF39 6p21.3 ARHGAP18 6q22.33 LRRN4 7q22 COPG2 7q32 LHX3 9q34.3 CLIC3 9q34.3 DPP3 11q12-q13.1 PFKM 12q13.3 POLE 12q24.3 RNF6 13q12.2 REC14 15q24.1 FLJ12484 15q25.3 CYB5-M 16q22.1 FN3KRP 17q25.3 TH1L 20q13 IL10RB 21q22.1-q22.2 DNMT3L 21q22.3 DKFZp761A052 Xp11.23 RBMX Xq26
35/01 2,5683 1,8054 2,8436 1,9557 2,1193 2,4838 2,5488 2,4598 1,2524 1,2033 1,5712 1,3395 2,2666 2,7943 2,6582 2,2486 1,6064 2,3987 1,3722 1,9021 1,3552 1,5132 1,9918 2,1208 1,7772 1,2914 2,8052 1,2825 1,2280 1,2569 1,8913
48
Kalibrációs hányados 141/04 244/98 1,6784 1,4787 1,2561 1,4065 1,4605 2,1753 1,2513 1,2305 1,2328 1,4125 1,4679 1,3858 1,4002 1,8334 1,2559 1,4586 1,2404 1,2650 1,2595 1,3957 1,2791 1,4955 1,4636 1,4643 1,2630 1,5568 1,3127 1,8425 1,2173 1,6568 1,6820 1,2631 1,2698 1,4366 1,4809 1,5231 1,2115 1,2354 1,2469 1,4257 1,3061 1,2908 1,2559 1,2361 1,3732 1,4114 1,2763 1,4018 1,3558 2,0750 1,2543 1,5178 1,3696 1,2484 1,3212 1,2080 1,2110 1,6271 1,2374 1,2457 1,3216 1,7805
MEGBESZÉLÉS
6. MEGBESZÉLÉS Az elmúlt két évtizedben a melano ma incidenciája világszerte roha mos növekedést m utat. A gyakran agresszív lefolyású, fokozott kiújulási és áttétképzési hajla m mal jellemezhetı daganat ko moly kihívást jelent a kezelıorvosnak. Sajnos a terápiás beavatkozások sok esetben sikertelenek, a metasztázisban szenvedı betegeknél csupán az esetek 15-20 %-ában hoznak átmeneti ered ményt. A hagyo mányos, ko mplex ke mo-, im mun-, és sugárterápiás kezelések mellett egyre jelentısebbek az új, tu morbiológiai ismeretekre épülı kezelési stratégiák, ezek ko mbinálása a kezelés hatásosságát fokozhatja, így pl. metasztatikus m elano mák kezelése során igen hatásos válasz érhetı el az un. bioke moterápia alkalmazásával (48). A melano ma metasztázis kialakulásának megjóslása, és ezzel szükség esetén a korai és/vagy agresszívebb kezelés megkezdése, esélyt jelenthet a tartósabb gyógyulásra, azonban az ilyen jellegő beavatkozások alapját képezı molekuláris biológiai, genetikai m arkerek szá ma igen kevés. Annak ellenére, hogy a melano ma két leggyakoribb típusa (felszínen terjedı és noduláris melano ma) biológiai viselkedés sze mpontjából lényeges különbséget mutat, kevés olyan tanulmány jelent m eg, melyben ennek molekuláris hátterét kutatták (14,49). Tanulmányunk során vizsgáltuk:
6.1.
•
az eltérı biológiai viselkedéső primer melano mák kro moszó mális eltéréseit;
•
korábbi C G H ered ményeinkre támaszkodva a c-myc onkogén a mplifikáció szerepét felszínen terjedı és noduláris melano mákban;
•
egy felszínen terjedı primer melano ma és az abból újonnan származtatott sejtvonal genetikai eltérései közötti azonosságokat és eltéréseket;
•
cD N S alapú array-CG H genetikai eltéréseit.
hibridizációval
primer-metasztázis tu morpárok
A c-myc onkogén amplifikációjának vizsgálata noduláris és felszínen terjedı primer melanomákban és melanoma metasztázisokban H u mán
melano mákban standard citogenetikai módszerekkel a krom oszó mális
eltérések sorozatát derítették fel, ezek közül az 1-es, 6-os, 7-es, 9-es és 10-es kro moszó mák szá mbeli és stukturális eltéréseit írták le leggyakrabban (27,50,51). A klasszikus citogenetikával nyert megfigyeléseket saját és mások C G H adatai sok sze mpontból alátámasztották, de szám os új, sávozásos technikával ne m észlelt eltérést is sikerült kimutatni (24,51). Ezek közül az elváltozások közül sze mbetőnı volt a 8-as kro moszó ma hosszúkarjának a mplifikációja (8q22-qter), amit standard citogenetika
49
módszerekkel
MEGBESZÉLÉS
végzett kísérletekben csak ritkán figyeltek meg. A C G H analízissel felism ert D N S többlet a 8-as kro moszó ma hosszúkarjának disztális szakaszára esett, érintve a 8q22-qter régiót (24). Tekintettel arra, hogy a
c-myc gén a 8q24.12-q24.13-as lókuszon lokalizálódik, és
a mplifikációja szá mos daganattípusnál rossz prognózissal társul, a 8q22-qter eltérések sejtszintő analízisét a c-myc onkogén a mplifikációjának részletes vizsgálatával kezdtük. A géna mplifikáció mértékének részletes tanulmányozását az is indokolta, hogy eddig kevesebb mint 10 primer melano ma c-myc analízisét írták le (42,47). A c-myc onkogén m elano ma-progresszióban betöltött szerepét jelzi, hogy a c- M Y C fehérje expressziójának csökkenését ered ményezı c-myc
antiszensz oligonukleotidokkal a m elano masejtek
növekedése gátolható, a mi arra utal, hogy a génexpresszió blokkolása antiszensz technikával új génterápiás stratégiát jelenthet az elırehaladott stádium ú
melano mák
kezelésében (53). A c-myc onkogénre vonatkozó vizsgálataink fı célja a gén kópiaszá m eloszlásának sejtszintő analízise volt különbözı
biológiai viselkedéső
melano m a altípusokban
(noduláris- és felszínen terjedı melano mák) és m elano ma metasztázisokban. Interfázisos FIS H
analízissel 68
m elano ma
mintát (26
N M,
28
SS M
és 14
metasztázis)
tanulmányoztunk. A prim er melano mák és melano ma metasztázisok krom oszó ma-ploiditás szintjének meghatározásához az 1-es, 3-as, 6-os, 7-es, 9-es és 10-es kro moszó mák sejtenkénti megoszlását is elemeztük centro méra-specifikus D N S-szondákkal. A 68 tu morból mindössze egy felszínen terjedı m elano ma sejtjeiben ne m találtunk a vizsgált kro moszó mákra eltérést; a noduláris alcsoportba tartozó vala mennyi daganatnál legalább háro m kro moszó ma szá mbeli eltérést mutatott. Az 1-es 3-as, 6-os, 7-es és 8-as kro moszó mák poliszó miája a noduláris altípusban gyakoribb volt. Szignifikánsan több N M-ben mutattuk ki a 6-os kro moszó ma poliszómiáját
(p=0,01). Érde mes megjegyezni,
hogy a 6-os kro moszóm a deléciójáról gyakrabban szá moltak be krom oszó masávozást követı analízisekben (54), mint annak többletérıl (55), ugyanakkor C G H vizsgálatok a 6os kro moszó ma a mplifikációját valószínősítik (24,52). Más citogenetikai és FIS H vizsgálatokkal összhangban azt tapasztaltuk, hogy az egyik 9-es kro moszó ma elvesztése a szuperficiális altípusnál, míg a 10-es kro moszó ma egyik centro mérájának deléciója a noduláris melano máknál gyakoribb elváltozás (14,56). Összességében a noduláris altípusba tartozó melano mák ploiditás értéke, a mit a kro moszó ma-index tükröz, nagyobb volt, mint a felszínen terjedı csoportba tartozó lézióké, azonban ez a különbség ne m érte el a statisztikailag szignifikáns mértéket. Szignifikáns különbséget figyeltünk m eg azonban a c-
myc onkogén kópiaszá m eltérésre a két melano ma altípus között. Megállapítottuk, hogy az 50
MEGBESZÉLÉS
agresszívebb biológiai tulajdonságú N M-ben a
c-myc onkogén kópiaszá m e melkedés
szignifikánsan gyakoribb volt, mint a jobb prognózisú SS M-ben. A noduláris melano mák 61 %-ában, míg a felszínen terjedı melano máknak csupán 27 %-ában volt kim utatható extra c-myc szignál
(p=0,02). A c-myc/C8 kópiaszám arány, a mi lehetıvé teszi a valódi
géna mplifikáció és a poliszó mia elkülönítését, szintén gyakoribb volt a noduláris altípusban (p=0,01). A c-myc géna mplifikáció m értéke általában alacsony vagy közepes m értékő volt, viszonylag m agas fokú a mplifikációs szintet (c-myc/C8 kópiaszá m arány
> 3)
csak a noduláris altípusban tudtunk kimutatni. Ered ményeink arra utalnak, hogy az e melkedett c-myc géndózis, más genetikai eltérésekkel társulva, hozzájárulhat az eltérı biológiai viselkedés kialakulásához és az invazív növekedéshez. Tizennégy betegnél a primer melano mákban m egfigyelt c-myc gén kópiaszá m eltéréseket a metasztázisok eltéréseivel is sikerült összehasonlítani, ilyen vizsgálatokra irodalmi adatok szerint m ég ne m került sor. Az ugyanabból a betegbıl származó primerm etasztázis tu morpárok molekuláris eltéréseinek összehasonlítása a daganatprogresszió különösen fontos aspektusaira világíthat rá. A
primer tu morban
m ég ne m, de a
m etasztázisban már meglévı do mináns eltérések a metasztázis kialakulásához vezetı aberrációkra hívják fel a figyelmet (24). Vizsgálatunk során tanulm ányozott melano ma metasztázisok mindössze 21% -ában (14 tumorból 4) sikerült kimutatni alacsony vagy
mérsékelt fokú c-myc a mplifikációt.
Hasonlóan kismértékő géna mplifikációt találtak 32 melano ma metasztázis interfázisos c-
myc FIS H analízise során Kraehn és mtsai. Ered ményeik szerint a c-myc/C8 arány a m elano ma metasztázisokban 0,9 és 2,9 között változott, és mindössze a metasztázisok 10 %-ánál volt >1,5, a mi mérsékelt a mplifikációs szintet jelent (42). A prim er melano mák és metasztázisaik között fennálló ilyen típusú genetikai divergencia oka lehet az a nagyfokú kro moszó mális heterogenitás, a mi a primer melano mák már viszonylag korai stádiu mára is jellemzı (57). Ha a metasztatikus tu morsejtek a daganatprogresszió viszonylag korai szakaszában elhagyják a primer daganatot, elıfordulhat, hogy a primer tumorban
meglévı heterogén sejtpopulációk közül az, a melyik a daganat lokális
inváziójáért felelıs, ne m feltétlenül egyezik meg azzal a klónnal, amelyik a metasztázis kialakulásában játszik szerepet. Ez azt a lehetıséget is felveti, hogy a daganat m etasztatizáló képessége már a primer tu mor igen korai stádiu mában eldıl. Primer daganatok és metasztázisaik ellentmondásos c-myc a mplifikációs mintázatáról e mlı-, tüdıés hasnyálmirigy daganatoknál is beszá moltak (58,59). Ezen vizsgálatok szerint a m etasztázisokban a c-myc onkogén extra kópiaszá mának elıfordulási gyakorisága, a
51
MEGBESZÉLÉS
m egfelelı primer lézióhoz viszonyítva, alacsonyabb, vagy egyáltalán nincs c-myc a mplifikáció. Ez azt jelzi, hogy a c-myc gén a mplifikációja elsıdlegesen ne m a m etasztatikus folya matban, hane m az invazív potenciál kialakulásában játszhat szerepet (58).
Az
c-myc
extra
m echaniz musok
kópia
állhatnak: i.)
kialakulásának származhat
a
hátterében gént
különbözı
hordozó
egész
molekuláris kro moszó ma
m egtöbbszörözıdésébıl; ii.) ered ménye lehet a 8-as kro moszó ma hibás szétválásának; iii.) létrejöhet izokro moszóm a
kialakulása révén; és iv.) kialakulhat intra- és extra-
kro moszó mális a mplifikációt követıen (42). Az a mplifikált szekvencia m aradhat eredeti kro moszó mális pozíciójában, azonban transzlokálódhat másik kro moszó mára is. Az a mplifikáció helye és mechaniz musa ne m határozható meg interfázisos citogenetikával. Ha a daganat progressziója során épp a c-myc gént tartalmazó kro moszó ma vagy kro moszó ma szeg mens szenved deléciót, a gén kópiaszá ma és az a mplifikáció mértéke csökkenni fog. Elképzelhetı
azonban
az
is,
hogy
a
8-as
kro moszó ma
centro méra-régiójának
m egtöbbszörözıdése nincs lineáris kapcsolatban a c-myc gén megtöbbszörözıdésével, a mi a c-myc/C8 kópiaszá m arány csökkenését, vagy akár e melkedését vonhatja maga után. A vizsgált melano ma
metasztázisok közül 6 daganatban c-myc kópiaszá m e melkedést
tapasztaltunk a primer tu morhoz képest, ami az átlagos 8-as kro moszó ma centro méra régióra specifikus szignálszá m kro moszó ma
vesztést c-myc
növekedésével társult. Hat
kópiaszá m
metasztázisnál a
8-as
csökkenés kísérte, jelezve a c-myc
gén
feltételezhetı intra-krom oszó mális lokalizációját. A
c-myc
gén
m egoszlása szinte
vala mennyi mintában heterogén volt, ami azt sugallja, hogy a daganatsejtek eltérı növekedési potenciállal rendelkeztek (56). A c-myc a mplifikáció jelenségét noduláris melano mában Greulich és mtsai. írták le elıször, munkájuk során egyetlen primer melano ma C G H és FIS H eltéréseit ele mezték (47). Ebben a primer m elano mában a 8q kro moszó makar megtöbbszörözıdését a c-myc onkogén kópiaszá m növekedésével hozták kapcsolatba (47). Ez az eset különlegesnek szá mított abból a sze mpontból, hogy a tu mor 5,25 m m vastagsága rossz prognózisra utalt, azonban a daganat eltávolítását követı 3 éven belül a betegnél ne m alakult ki metasztázis. A
Kraehn és mtsai. 33 melano ma
metasztázist, és mindössze 8 prim er daganatot
analizáltak FIS H módszerrel (42). A primer tu morok közül négynél a 8-as centro mérához viszonyítva extra c-myc kópiát találtak. Fontos megjegyezni, hogy mind a négy lézió noduláris melano ma volt, ami alátámasztja azt a feltételezésünket, hogy a c-myc onkogén fokozott jelenléte melano mákban invazív potenciállal társulhat. Az e mlített tanulmányban a c-myc gén a mplifikációja (c-myc/C8 arány) az általunk megfigyelthez hasonló mértékő
52
MEGBESZÉLÉS
volt (42). A
metasztázisok közül egyik mintában se m figyeltek m eg nagy mértékő
a mplifikációt. A c-myc/C8 arány 3,0 alatt maradt, bár két metasztázis, melyek primer tumorpárjainak vastagsága 0,74 illetve 1,13 m m volt, emelkedett c-myc/ C8 arányt mutatott. A szerzık arra a következtetésre jutottak, hogy ezeknek a daganatoknak a klasszikus besorolás alapján ne m várt, gyors progressziója az e melkedett c-myc kópiaszá m mal is kapcsolatban állhat (42). A primer tu morokra vonatkozó FIS H adatokat a szerzık ne m közölték. Az általunk analizált metasztázisokban a leg magasabb c-myc/C8 arány 2,5-nek adódott. Hasonlóan a Kraehn és mtsai. által leírtakhoz, ennek a betegnek a primer daganata is viszonylag vékony (1,5 m m), felszínen terjedı m elano ma volt, és a metasztázist a primer tumor diagnózisát követıen 3 hónap múlva észlelték, a mi további példája annak, hogy a 8as centro mérához viszonyított c-myc gén kópiaszá m e melkedés rossz prognózissal társul, m ég akkor is, ha a primer lézió klinikopatológiai para méterei alapján a betegség kedvezıbb lefolyása lenne várható (42). K orábbi vizsgálatok arra utaltak, hogy a c-myc onkogén overexpressziója jobb prognosztikus marker lehet, mint a korábban használt klinikopatológiai faktorok (Breslowvastagság és nodális státusz) (60,61). Felvetették, hogy a c-myc kópiaszám aberráció cM Y C fehérje overexpresszióval társulhat, és a c-myc gén az elırehaladott stádiu mú bır melano mákban nagyobb szá mban lehet jelen (61). Ezzel ellentétben Boni és mtsai. a cMYC
fehérje expresszió
kialakulásától függetlennek
mértékét a
metasztatikus potenciáltól és a
találták, így
azt a
következtetést vonták
metasztázis le,
hogy
bır melano mánál ne m használható prognosztikus im m unhisztoké miai markerként (62). Interfázios FIS H ered ményeink statisztikai analízise ne m mutatott összefüggést a két primer melano ma altípus összehasonlításakor se m a betegek életkora, se m azok ne me és a c-myc génalteráció mértéke között. A primer daganat lokalizációja és a c-myc eltérések között azonban összefüggést figyeltünk meg. M egállapítottuk, hogy a c-myc/C8 arány szignifikánsan gyakoribb volt a törzsön, vagy a fej-nyaki región kialakult noduláris m elano máknál (56). Kismértékő összefüggést a tu mor vastagsága és a c-myc gén kópiaszá mának változása között is felfedeztünk, ez azonban ne m érte el a statisztikailag szignifikáns mértéket a különbözı vastagság-kategóriák között. Az e melkedett c-myc/C8 kópiaszá m mal jellemezhetı daganatok arányában azonban szignifikáns eltérést tapasztaltunk, ha a két daganat altípust kifekélyesedett és kifekélyesedést ne m mutató alcsoportokba soroltuk. Ered ményeink szerint az ulcerált noduláris melano máknál az e melkedett c-myc/C8 arány szignifikánsan eltért. Az e melkedett c-myc/C8 arány és a csökkent tünetmentes túlélési
53
MEGBESZÉLÉS
idı között szintén összefüggést találtunk. Ross és mtsai. hasonló adatokat közöltek a fehérjeexpresszió szintjén primer melano mák vizsgálatát követıen (60). A géna mplifikáció és az e melkedett gén és/vagy fehérjeexpresszió m elano maprogresszióban betöltött szerepének pontos megállapításához további vizsgálatokra van szükség. A c-myc/C8 kópiaszá m arány kritikus elemzése, más markereket is figyele mbe véve,
segítheti
kiemelni
a
betegek
metasztázisképzés
sze mpontjából
különösen
veszélyeztetett csoportját. Ered ményeink arra utalnak, hogy a felszínen terjedı és a noduláris
melano mák
daganatsejtjeinek
különbözı
biológiai
viselkedése,
más
kro moszó mális eltérések mellett, kapcsolatba hozható a c-myc onkogén eltérı kópiaszá m mintázatával, azonban ennek végleges tisztázásához további, részletesebb, a gén-, és fehérjeexpressziót is magában foglaló vizsgálatokra van szükség.
6.2.
Egy új melanoma sejtvonal átfogó citogenetikai jellemzése A daganatok eltérı biológiai viselkedésének hátterében álló molekuláris eltérések
m egis merésében a sejtvonalak fontos szerepet töltenek be, sok esetben a legkönnyebben hozzáférhetı és legolcsóbb
modellt jelentik a kutatásokhoz. Az
M3 5/01 sejtvonal
karakterizálásával célunk egy genetikailag részletesen analizált melano ma sejtvonal leírása volt, az alkalmazott m olekuláris genetikai m ódszerek sokfélesége azonban arra is rávilágított, hogy a genetikai eltérések pontosabb meghatározása szá m os módszertani m egközelítés egyidejő alkalmazását követeli meg. A kro moszó masávozás, kro moszó mális és array-C G H, interfázisos FIS H, vala mint S K Y-FIS H módszerekkel az M35/01 sejtvonal szá mos, melano mákra jellemzı eltérései m ellett olyan alterációkra is felfigyeltünk, melyeket eddig ne m közöltek. Vizsgálataink szerint a sejtvonal ko mplex kariotípussal jellemezhetı, a kro moszó mák szá mbeli eltérései m ellet szá mos strukturális elváltozás is megfigyelhetı. A teljes tu morgenom ban fellelhetı genetikai aberrációk elem zésére két, eltérı felbontású C G H módszert alkalmaztunk. Kro moszó mális C G H technikával az eredeti tu morból származó D N S C G H-profilját a sejtvonal C G H-profiljával összehasonlítva szá mos azonos eltérést figyeltünk meg, azonban találtunk csak a sejtvonalra jellemzı alterációkat is. Mind a primer tu morban, mind a sejtvonalban DN S többletet detektáltunk a 6p22-pter, 7q21-qter, 15q15-qter lókuszokon, D N S hiányt m utattunk ki a 9, 10, 14q32-qter, 16q, 17p szakaszokon. A csak a sejtvonalban megjelenı eltérés a 12p12-q13.12 szakasz és a 18-as kro moszó ma deléciója, vala mint a 20-as kro m oszó ma többlete volt. A primer tu morban a 4-es és a 16-os
54
MEGBESZÉLÉS
kro moszó mán
megfigyelt eltérések a sejtvonalban a kro moszó mák teljes hosszára
kiterjedtek. A primer tumor és a sejtvonal genetikai eltérései közötti különbség m agyarázható egyrészt azzal, hogy az eredeti tu morban azok a sejtklónok, melyek az eltéréseket tartalmazták, kisebb százalékban voltak jelen, másrészt összefüggésben lehet azzal, hogy az eredeti daganatban meglévı normál sejtek konta minációja csökkenti a genetikai eltérések kimutathatóságát, így egy genetikailag heterogén tu m orban a kevésbé do mináns eltéréseket elfedi (63). Ter mészetesen ne m zárható ki az sem, hogy a csak sejtvonalban észlelt eltérések az in
vitro tenyésztés ered ményeként jöttek létre. A sejtvonal
kro moszó mális és array-C G H ered ményei nagyon jó korrelációt mutattak. A két módszer között az alapvetı, és igen lényeges különbség, a (kro moszó mális C G H
módszerek felbontása
mellett
> 20 Mb, array-C G H ≅ 600bp-1 M b), hogy array-C G H-el az
a mplifikált D N S szakaszok poziciója, illetve az am plifikált vagy deletált gének, pontosan m eghatározhatók (64). Ezzel függ össze az is, hogy array-C G H-el lényegesen több geno miális eltérést találtunk, mint kro moszó mális C G H-el (array-C G H-el az a mplifikált klónok szá ma meghaladta a 200-at, míg a deletált klónok szá ma több mint 150 volt). Mind a primer tu morban, mind a sejtvonalban jelentıs a mplifikációt figyeltünk meg a 6-os kro moszó ma rövidkarján, a mi hagyo mányos kariotípus analízissel és C G H-el is az egyik leggyakoribb krom oszó mális eltérés melano mákban (24,51,52). Array-C G H-el a 6p kro moszó ma karon 47 klónból 9 a mplifikációt mutatott, ezek közül 5 klón lokalizációja a 6p22-es, 2 a 6p22-p23-as, 1 a 6p24-es, és 1 a 6p24-p25-ös szekvenciára esett. Ebben a régióban deléciót egyik
módszerrel se m sikerült kimutatni. Ezeken a lókuszokon
m elano ma-specifikus géneket még ne m írtak le. A teljes geno mban C G H -el felismert 6p a mplifikáció kro moszó m ális szinten a 6-os kro m oszó ma rövidkarjának többszörös törését és transzlokációját jelentette. A 6p21 sáv-specifikus szondával sikerült egy a 6p21 lókusz proximális régióját érintı töréspontot azonosítani. Ezen a kro moszóm ális szakaszon helyezkedik el a
ciklin-D1 és ciklin-D2 protoonkogénekkel ho mológiát m utató ciklin-D3
(CC N D 3) fehérjét kódoló gén. Ki mutatták, hogy U V besugárzást követıen a C C N D 3-hoz kapcsolódó C D K 4 aktivitása szükséges ahhoz, hogy a sejtciklus túljusson a G2 fázison és így
megkezdıdhessen
a
mitózis.
A
legújabb
megfigyelések
szerint a
CC N D3
expressziójának mértéke fontos szerepet játszik különbözı daganatok kialakulásában (65,66), továbbá egyes adatok arra utalnak, hogy fontos faktor lehet a felszínen terjedı m elano mák klinikai viselkedésének megjóslásában (67). A 7-es kro moszó ma eltérései malignus melano mában eddigi ismerteink szerint rossz prognózissal társulnak, és
mivel szá mos
55
eltéréssel asszociálódva jelennek
meg
MEGBESZÉLÉS
feltételezhetı, hogy a daganatprogresszió késıi szakaszára jellemzıek (32). Array-C G H vizsgálataink szerint jelentıs szá mú a mplifikálódott D N S szekvencia található a 7-es kro moszó mán, melyek leggyakrabban a 7q31-q36 közötti D N S szakaszok alterációit foglalják magukban. Napjainkban ismerték fel, hogy az ezen a szakaszon lokalizálódó
braf
onkogén mutációja, a mi gyakran a gén kismértékő a mplifikációját jelenti, a melano mák kétharmadában kimutatható, ugyanakkor a mutáció a sze m pig mentsejtes daganatában ne m detektálható (68). A sejtvonalban a 7-es kro moszóm a eltérése ne mcsak szám beli eltérést és D N S többletet, hane m strukturális eltérést is jelent. SK Y-FIS H-sel a 7-es és 17-es kro moszó mák
között transzlokációt figyeltünk
meg,
mindkét 17-es
kro moszó ma
rövidkarjára a 7-es kro m oszó máról egy-egy D N S -darab transzlokálódott. A transzlokáció érinthette a 7q34-es szakaszt is, hiszen mind az eredeti, mind a sejtvonal C G H analízise a 7q22-qter
régión
jelentıs
mértékő
D N S-többletet
mutatott.
Ennek
sávspecifikus D N S-szondával oldható meg. A 7p12 lókuszon lokalizálódó
bizonyítása
egf-r gén,
m elyrıl feltételezik, hogy fontos szerepe van a m elano ma metasztázisok kialakulásában, az általunk alkalmazott módszerekkel a sejtvonalban ne m mutatott eltérést (24). A melano mák progressziójában valószínőleg szerepet játszó lókuszok közül a 9p21 a legintenzívebben tanulmányozott. Ezen a lókuszon lokalizálódik a ciklin-dependens kináz inhibitor 2A (p16/cdkn2/ink4/mts1) és 2B gén (ink4b/mts2/p15), melyek szerepe fa miliáris m elano mákban már régóta ismert (69). A sejtvonalban a kro moszó mális C G H adatok szerint a 9-es kro moszóm a jelentıs része deléciót mutatott, ugyanakkor az array-C G H szerint a deléció a 9q szakaszra nagyobb mértékben terjedt ki. FIS H-sel 9p21 lókuszspecifikus szondával 2 szignált találtunk, a mi a cento méra szá mhoz képest a lókuszon deléciót jelent. A 9p21-es lókusz alterációja, a mi m elano mákban legtöbbször a p16-os gén aberrációját jelenti, sok esetben a gén pontmutációját, vagy kisebb D N S-szekvenciák elvesztését, ill. pro móter metilációt foglal magában. Primer melano mák C G H analízisét követıen teljes 9-es kro moszó mavesztésrıl Bastian és mtsai. is beszá moltak, és a tumorigenezis korai lépéseivel hozták kapcsolatba (52). Ez utóbbit olyan vizsgálatok is alátámasztották, melyek diszplasztikus névuszokban mutatták ki nagy gyakorisággal a 9-es kro moszó ma vesztést (70). További, melano mákra jellemzı kro moszó mális eltérésnek szá mít a 10-es kro moszó ma deléciója, a mi feltételezhetıen a 9-es kro moszó mához hasonlóan a progresszió korai szakaszában következik be. L O H vizsgálatokkal primer melano mák 30-50 %-ában találtak 10q deléciót, fıként vékony tu morokban (14). A 10q23.3 régió mutációját szá mos daganatban kimutatták, késıbb kiderült, hogy ezen a lókuszon helyezkedik el a Co wden
56
MEGBESZÉLÉS
betegségben kialakuló különféle daganatok progressziójában szerepet játszó
pten/mmac1
tumorszuppresszor gén (71). Melano ma sejtvonalak több mint 40 %-ában a gént vagy ne m tudták kimutatni, vagy a génben mutációt detektáltak (71). A a szintén crista
pten/mmac1 hibás mőködése
neuralis eredető glio mákban is megfigyelhetı (72,73).
Bastian és mtsai. melanom a altípusok genetikai eltéréseit hasonlították össze C G H-el és megfigyelték, hogy a felszínen terjedı és a lentigo maligna melanom a altípusoknál, m elyek a krónikus napsugárzásnak kitett testfelületeken gyakrabban alakulnak ki, a 13q és 17p régió eltérései sokkal gyakoribbak (74). A 17p deléció mind a primer melano mában, mind
az
M35/01
sejtvonalban
C G H-el a közös
eltérések
között szerepelt, és
összefüggésben állhat a 17p lókuszon elhelyezkedı, a D N S-hibajavításban alapvetı szerepet játszó
p53 gén mutációjával. S K Y-FISH-sel a 13-as kro moszóm án többszörös
transzlokációt figyeltünk meg, a mi a 21-es és az Y kro moszó mát is érintette. Schulten és mtsai. többszínő-FIS H-sel és sávozással hét melano ma sejtvonalból négynél a 13-as kro moszó mát is érintı összetett átrendezıdést m utattak ki (75). A 13-as kro moszó ma transzlokációja mind a négy sejtvonalnál más-m ás kro moszó mát érintett, ami a 13-as kro moszó ma magas transzlokációs hajlamára hívja fel a figyelmet. Az eredeti tu morban és a sejtvonalban a legnagyobb mértékő a mplifikációt a 15-ös kro moszó mán figyeltük m eg mind kro moszó mális, mind array-C G H-el. Interfázios FIS Hsel a sejtvonal sejtjeinek 81 %-a a 15-ös kro moszó mára tetraszó miás volt. A kro moszó ma szá mbeli eltérése strukturális átrendezıdéssel is társult, a transzlokációban a 2-es és 6-os kro moszó ma is részt vett. Az array-C G H adatok alapján figyeltünk fel a 15q15 szekvencia a mplifikációjára. Ezen
a lókuszon
már több
gént azonosítottak, de
melano ma-
progresszióhoz rendelhetı elváltozást viszonylag keveset írtak le. Hasonlóan az M 35/01 sejtvonalhoz, többen a 15-ös kro moszó ma strukturális eltérését figyelték meg, érdekes m ódon Guan és mtsai. ugyancsak a 6-os 15-ös kro moszó mák transzlokációját találták (76). A 15q15-ös lókuszon lokalizálódó gének közül részletesen elemezték a
trombospodin-1
(tsp1) gént, melynek term éke az extracelluláris m átrixhoz kapcsolódik és szá mos biológiai folya mat szabályozásában játszik szerepet. A melano mákban változatos expressziót mutató
tsp1 fokozott stró mális expressziója rossz prognózissal társul (77). Fontos szerepe lehet m ég a 15q15-q21 lokalizációjú fibroblaszt növekedési faktor 7 (fgf7: keratinocyte
growth
factor) génalterációjának is, azonban a gén melano ma-progresszióban betöltött szerepe ma m ég ismeretlen (78). Mind a primer tu morban, mind a sejtvonalban m egfigyeltük a 16-os kro moszó ma eltéréseit, aminek jelentıségét az ezen a kro moszó mán lokalizálódó E-cadherint kódoló
57
MEGBESZÉLÉS
gén (16q22) adja. Norm ál hu mán bırben az E-cadherin vala mennyi epidermális sejt (keratinociták, melanociták, Langerhans-sejtek) felszínén expresszálódik, a P-cadherin csak a bazális réteg keratinocitáin, az N-cadherin pedig fibroblasztok és endotél sejtek felszínen fejezıdik ki. Herlyn és mtsai. a melano ma kialakulása során a cadherinexpresszió megváltozására hívták fel a figyelmet (4). Ki mutatták, hogy a keratinociták közvetlen sejt-sejt interakción keresztül szabályozzák a melanociták ploriferációját. A szabályzás sze mpontjából az E-cadherin mediált adhézió kritikusnak tőnt a két sejttípus között. Ezzel ellentétben a keratinociták növekedésgátlása a melano masejtekre ne m volt hatással, feltételezhetıen a kontakt-mediált szabályozás elvesztése miatt. Egy másik
in
vitro modellben az E-cadherin sejtfelszíni expressziója meggátolta a m elano masejtek invázióját a dermiszbe a folya matban fontos szerepet játszó adhéziós receptorok, a MelC A M és a β3 integrin alegység, do wn-regulációja által (79). Ezek az ered mények arra utalnak, hogy a melanociták kiszabadulása a keratinociták E-cadherin-regulált kontrollja alól fontos ese mény lehet a melano magenezisben. A 19-es kro moszó ma SK Y-FIS H-sel kimutatott strukturális átrendezıdése mellett, mind kro moszó mális, mind array-C G H-el ezen a kro moszó mán D N S többletet mutattunk ki. A strukturális átrendezıdés a 19-es kro moszó ma rövidkarjának cento méra közeli régióját érintette, ahova a 22-es kro moszó ma egy szakasza épült be. A 22-es kro moszó ma transzlokációja a 19p13-as lókusz közelében az ott elhelyezkedı gének (mint pl. a nukleáris stabilitás és a kro matin struktúra fenntartásában, vala mint a génexpresszió szabályozásában résztvevı la min B2 (19p13) gén) nor mál funkcióját megzavarhatja, és így hozzájárulhat a sejtmag szerkezetének destabilizálódásához és a kro matin szerkezet m egbo mlásához. A
19-es kro moszó mához hasonlóan a 20-as kro moszó mán is D N S többletet
detektáltunk C G H-el, ez a S K Y-FIS H alapján négy 20-as kro moszóm át jelentett: két, feltételezhetıen izokro moszó mális
nor mál
20-as
átrendezıdés
kro moszó ma ered ményeként
mellett,
két
létrejött
további
20-as
valószínőleg
kro moszó mát
is
m egfigyeltünk. Extra 20-as kro moszó ma melano ma sejtvonalakban és natív tu morok geno mjában ne m ritka jelenség. A 20q a mplifikációt Barks és mtsai. több melano ma sejtvonalban megfigyelték C G H-el (80). A 20-as kro moszó mán kódolt gének közül a nor mál fiziológiás folyam atokban, például az em brionális fejlıdés, a reprodukció, vagy a szövetek újjáépülése során, az extracelluláris mátrix lebontásában szerepet játszó mátrix m etalloproteináz protein ( M M P) családhoz tartozó gén szerepe vetıdik fel ( M M P-9, 20q11-q13). Melano máknál különbözı M M P-k em elkedett expresszóját figyelték meg az
58
MEGBESZÉLÉS
invazív fenotípussal összefüggésben. Elırehaladott stádiu mú melano ma sejtvonalakban kimutatták az
M M P-9 expresszióját, míg korai stádiu mú daganatokból létrehozott
sejtvonalaknál ez ne m volt lehetséges (81). A jelentıs M M P-9 expressziót mutató hu mán m elano ma sejtvonal egerekbe oltva tüdı metasztázis kialakulásához vezetett. M elano mák genetikai eltéréseinek ele mzése során gyakran felfigyeltek teljes kro moszó mák, kro moszó ma szeg mensek, és tu morszuppresszor gének elvesztésésére (14,24,74). Az új melano ma sejtvonal FIS H és S K Y-FIS H analízisének ered ményei arra utalnak, hogy az M35/01 sejtvonal geno mjára a relatív kro moszó mavesztések jellemzıek. Feltételezésünk szerint a primer daganatsejtekben a tu morprogresszió korai stádiu mában a teljes geno m
megtöbbszörözıdése következett be, majd az így kialakult tetraploid
sejtvonalból elıször teljes kro moszó mák vesztek el, mely a 9-es, 10-es, 16-os és 18-as kro moszó mákat érintette, ezekbıl a kro moszó mákból a sejtvonalban FIS H m ódszerrel csak két-két kópiát tudtunk kimutatni. C G H-el az e mlített kro moszó mák
mellett más
kro moszó maszakaszok hiányát is megfigyeltük. A
kro moszó ma
szintő
eltérésekkel sze mben
azokra
a
génekre, m elyekrıl
feltételeztük, hogy génszintő eltéréseik hozzájárulnak a melano ma progresszióhoz, FIS Hsel ne m találtunk a centro mérához viszonyított eltérést. Mindez arra utal, hogy a primer tumor progressziója során a kro moszó mák megtöbbszörözıdése (aneuploidia) a korai elváltozások közé tartozott. A daganatok kialakulásában szerepet játszó genetikai mutációk szerepére Tyzzer már 1916-ban utalt (82), azonban még ma se m egyértelmő, hogy a tumorigenezisben
a
nagyobb
geno mszakaszok
aneuploidiájának,
azaz
a
kro moszó maegyensúly felborulásnak, vagy a gén mutációk létrejöttének van-e elsıdleges szerepe. Az aneuploidia-hipotézis szerint a daganatkeletkezésnek háro m fı lépése van, az elsı lépésben a karcinogének a kro moszó mák m egtöbbszörözıdését eredm ényezik, a mi a geno m destabilizációjához vezet, ezt követıen preneoplasztikus, majd végül neoplasztikus kariotípus alakul ki (83). Mivel annak valószínősége, hogy egy újonnan keletkezı aneuploid sejt életképesebb legyen, mint egy diploid sejt, igen alacsony, a neoplasztikus sejtek evolúciója lassú és klonális folya mat. A daganatra jellemzı genetikai eltérések, a daganatok túlnyo mó többségénél, az egyedi daganatsejtek szintjén m eglévı szá mos géna mplifikácót és deléciót tükrözik. Gyakorlatilag ez a rendkívüli heterogenitás akadályozza meg a sikeres daganatellenes terápiát is (83). Az M 35/01 melano ma sejtvonalban felismert genetikai eltérések szá mos, a felszínen terjedı altípusra jellemzı, irodalo mban is közölt eltérést foglalnak magukban, így az új sejtvonal alkalmas ennek a daganattípusnak különbözı körülmények közötti
59
in vitro
MEGBESZÉLÉS
tanulmányozására is. A sejtvonal jelentıségét tovább e meli, hogy kro moszó mális C G H-el sikerült kimutatni, hogy az
in vitro körülmények között fenntartott sejtek eltéréseinek
jelentıs része már a primer tumorban is jelen volt.
6.3 Primer melanomák és melanoma metasztázisok cDNS alapú array-CGH vizsgálata A c D N S alapú array analízissel célunk annak tanulmányozása, hogy a génszinten felismert eltérések milyen génexpressziós szint változásokkal társulnak. Dolgozato mban azokról a vizsgálatokról szá molok be, melyek célja a cD N S alapú array-CG H hibridizáció m elano mákra történı adaptálása volt. Vizsgálatainkat a jövıben expressziós array analízisekkel tervezzük kiterjeszteni. A c D N S-frag menteket tartalmazó chipek elınye, hogy a m R N S-ként megjelenı D N S szekvenciák eltéréseit jelenítik meg (84). Bár a cD N S-chipen alapuló C G H- módszer a kismérető, génen belüli m utációk felismerésére ne m alkalmas, mégis új megoldást jelent a nor málsejt konta mináció zavaró hatásának kiküszöbölésére,
mivel mindössze egy
génkópiányi változás kim utatását is lehetıvé teszi olyan mintából, melynek akár 60 %-át is nor mál sejtek alkotják (85). A jelentıs mennyiségő információt tartalmazó adatbázisok segítségével a kísérletekben azonosított gének kro moszo mális elhelyezkedése könnyen m eghatározható. cD N S alapú array-C G H
módszerrel eddig 9 daganat (4 betegbıl a primer és
m etasztatikus tu mor ugyanabból a betegbıl származott) hibridizációját és analízisét végeztük el sikeresen. Az alkalmazott chip több mint 12000 cD N S frag m entet tartalmazott. Mivel a primer tu mor és a metasztázisa közötti genetikai különbségek megállapítására igen hatékony módszer, ha referencia D N S-nek a primer tu mor geno mját tekintjük, ezért 3 mintapárnál ezt a kísérleti megközelítést alkalmaztuk. Megfigyeléseink szerint azoknak a cD N S ele meknek a szá ma, melyek csak a m etasztázisokban a mplifikálódnak vagy deletálódnak, az eddig vizsgált 3 betegnél eltérıek. A legkevesebb eltérést annál a tumorpárnál találtuk, a melyiknél a
primer tumor
a
TN M
besorolás alapján
a
legelırehaladottabb stádiumú volt (T4b N2 M 0). Ennek az lehet a magyarázata, hogy a primer tu morban a genetikai eltérések olyan mértékő halmozódása alakult ki, melyhez már kisszá mú új eltérés létrejötte is elegendı volt, hogy a metasztázis makroszkóposan is m egfigyelhetıvé váljon (86). Abban az esetben, ha referens D N S-ként nor mál D N S-t használtunk, a primer tum orban több mint hatszáz cD N S ele men a mplifkácót, és hasonló szá mú
ele men
deléciót figyeltünk
meg.
60
Az
ugyanebbıl
a
betegbıl
szár mazó
MEGBESZÉLÉS
m etasztázisban mind a deletált, mind az a m plifikált cD N S-frag mentek szá ma közel m egduplázódott. Ezek a daganatok egy fiatal betegbıl származtak, és a primer tu mor a T N M beosztás alapján elırehaladott stádiu mú volt. Ezek a megfigyelések is alátá masztják azokat a kro moszó mális C G H-el kapott eredm ényeinket, melyek szerint a genetikai aberrációk
fokozatos
akku mulációja
összefügg,
illetve
arányos
a
melano ma
agresszivitásával (24). A primer tu morok cD N S alapú array-C G H ered m ényeinek összehasonlítása során 58 olyan ismert gént találtunk, melyek minden mintában deletálva (31 gén), illetve minden mintában a mplifikálva (27 gén) voltak. Érde mes kie melni a Rho családba tartozó „Rho
GTPase-activating protein” gént, melyrıl kiderült, hogy csökkent mértékő kifejezıdése összhangban állhat a gén részleges, vagy teljes deléciójával (87). Irodalmi adatok szerint a Rho fehérjék fontos szerepet játszanak a daganatok kialakulásában és a család különbözı tagjai a tu morprogresszió különbözı szakaszaiban, így a metasztázis képzésben is közre mőködnek. Melanom a sejtvonalak metasztázisképzı tulajdonságának sziszte matikus analízise során Clark és mtsai. figyeltek fel arra, hogy a Rho
C gén alterációja megnöveli a
m elano ma sejtek motilitását és a kevésbé metasztatikus sejtek invazív tulajdonságát (88). A c D N S alapú array-C G H vizsgálataink ezt a megfigyelést alátámasztják. cD N S alapú array-C G H vizsgálatot melano mákon eddig még ne m végeztek, B A C alapú array-C G H ered ményeket melano mán pedig egyedül Harvell és mtsai. közöltek (89). Ez
utóbbi
munkában
a
tapasztalt
bırgyógyász-onkológus
szá m ára
is
nehezen
m egkülönböztethetı Spitz névuszt és a melanom át hasonlították össze formalin fixált, parafinba ágyazott szövetekbıl származó D N S- m inták segítségével, és kim utatták, hogy a kro moszó mális C G H-nél érzékenyebb array-CG H-el a Spitz névusz elkülöníthetı a m elano mától.
Dolgozatomban megpróbáltam rávilágítani a melanomákban kialakuló rendkívüli mértékő genetikai heterogenitás jelenségére, a heterogenitás feltérképezéséhez szükséges többféle módszer együttes használatának fontosságára, és arra, hogy még számos, eddig még nem, vagy csak kevéssé vizsgált potenciális onkogén és tumorszuppresszor gén melanoma-progresszióban betöltött szerepének tanulmányozása a jövıbeli kutatások célja lehet.
61
ÖSSZEFOGLALÁS
7. ÖSSZEFOGLALÁS A
dolgozatban szereplı vizsgálatok fı célja a különbözı biológiai viselkedéső
m alignus
melano ma altípusok progressziójában szerepet játszó genetikai eltérések
tanulmányozása volt in situ hibridizációs módszerek segítségével.
1. Interfázisos FIS H analízissel kimutattuk, hogy primer melano mák és melano ma m etasztázisok genetikailag heterogén sejtpopulációkat tartalmaznak. 2. A biológiai viselkedés sze mpontjából elkülönülı noduláris és felszínen terjedı m elano mák között az alábbi kro moszó ma eltéréseket figyeltük meg:
• A 7-es kromoszóma kivételével, a felszínen terjedı melanomákban jelentıs számban fordult elı monoszómiás sejtpopuláció. • Az 1-es, 3-as, 6-os, 7-es és 8-as kromoszómák poliszómiája a noduláris altípusban gyakoribb volt. • A 6-os kromoszóma poliszómiáját szignifikánsan több noduláris melanomában mutattuk ki. • A 9-es kromoszóma vesztést a szuperficiális altípusban, a 10-es kromoszóma egyik centromérájának delécióját a noduláris altípusban figyeltük meg gyakrabban. 3. M egállapítottuk, hogy a C G H-el korábban felismert 8q22-qter D N S többlet összefügg a c-myc onkogén kópiaszá mának növekedésével. Jelentıs mértékő c-myc am plifikációt csak a rosszabb prognózisú noduláris melano mákban tudtunk kimutatni. 4. A c-myc gén a mplifikációja és a daganatok klinikopatológiai para méterei között az alábbi összefüggéseket találtuk:
• A törzsön, illetve a fej-nyaki régión elhelyezkedı daganatok közül szignifikánsan több noduláris melanománál mutattunk ki c-myc a mplifikációt, mint a végtagokon elhelyezkedı lézió knál (p =0,004). noduláris melanom ák között az extra c-myc kópiát tartalm azó kifekélyesedett tu morok szá ma szignifikánsan nagyobb volt, mint a felszínen terjedı daganatoknál (p =0,01).
• A
• A nyirokcso mó metasztázist képzı noduláris melano mák között szignifikánsan több daganat mutatott c-myc gén kópiaszá m em elkedést, összehasonlítva az ugyanebbe a csoportba tartozó felszínen terjedı daganatokkal (p =0,04). • Azoknál a betegeknél, akik a primer tu mor eltávolítását követıen 5 éven belül m eghaltak, a c-myc gén kópiaszá m e melkedés gyakoribb volt a noduláris m elano mákban, összehasonlítva az ugyanebbe a csoportba tartozó felszínen terjedı daganatokkal (p =0,02).
62
ÖSSZEFOGLALÁS
5.
A felszínen terjedı melano mából származtatott új sejtvonal genetikai elem zése során m egállapítottuk:
• A sejtvonal és az eredeti tu mor eltéréseinek többsége a C G H profilok alapján m egegyezett, ami arra utal, hogy a sejtvonal genetikai elváltozásai do mináltak az eredeti tumorban is.
• Az M 35/01 sejtvonal kariotípusa ko mplex, a krom oszó mák szá mbeli eltérései m ellett szá mos strukturális eltérés is jellemezte.
• A sejtvonal analízise centro méra- és gén-specifikus szondákkal felveti az aneuploidia szerepének fokozott fontosságát a daganatprogresszió során a géna mplifikációval/delécióval sze mben.
• Az új melano ma sejtvonal genetikai elemzése bizonyítja, hogy a különbözı szintő genetikai eltérések felismerése több módszer párhuza mos alkalmazását igényli. 6.
A B A C (geno miális DN S szekvencia) és cDN S array alapú ko mparatív geno m hibridizációs módszerekkel a kro moszó mális C G H-hez képest pontosabban m eghatározható az a mplifikált és deletált szekvenciák lokalizációja. cDN S array-el lehetıvé válik a genetikai eltérések és a génexpresszió párhuza mos analízise ugyanazon a chipen.
• Az array-C G H alapján a sejtvonalban a legnagyobb mértékő a mplifikációt (Log2 > 0,6) a 7q (7q22-q31), 15q (15q21-q25), 20q (20q13) kro moszó makarokon, a legnagyobb mértékő deléciót (Log2 < -0,6) a 4q (4q12, 4q28-q31, 4q32-q33), 9p (9p21, 9p23, 9p24), 9q (9q21), 10q (10q23-q25), 12q (24.3), 16q (16q13-q21, 16q21, 16q23) 18p (18p11, 18q21-23), 17p (17p12) kro moszó maszakaszokon figyeltük meg.
• A primer tu morok array-C G H ered ményeinek összehasonlításakor 58 olyan ismert gént találtunk, m elyek minden mintában deletálva (31 gén), illetve minden mintában a mplifikálva (27 gén) voltak.
63
IRODALOMJEGYZÉK
8. IRODALOMJEGYZÉK 1. M ancianti M L, Herlyn M. Tu mor progression in melano ma: the biology of epidermal melanocytes in vitro. Carcinog Co mpr Surv. 1989;11:369-386. 2. Allen A C, Spitz S. Malignant melano ma; a clinicopathological analysis of the criteria for diagnosis and prognosis. Cancer. 1953;6(1):1-45. 3. Gershen wald JE, Buzaid A C, Ross MI. Classification and staging of melano ma. Clin Lab Med. 2000;20(4):785-815. 4. Herlyn M, Berking C, Li G, Satya moorthy K. Lessons fro m m elanocyte develop ment for understanding the biological events in naevus and m elano ma formation. Melano ma Res. 2000;10(4):303-312. 5. Tucker M A, Goldstein A M. 2003;22(20):3042-3052.
Melano ma etiology: where are we? O ncogene.
6. de Vries E, Bray FI, Coebergh J W, Parkin D M. Changing epide miology of m alignant cutaneous melano ma in Europe 1953-1997: rising trends in incidence and mortality but recent stabilizations in western Europe and decreases in Scandinavia. Int J Cancer. 2003;107(1):119-126. 7. Lens M B, Da wes M. Global perspectives of contemporary epide miological trends of cutaneous malignant m elano ma. B J Der matol. 2004;150:179:185. 8. Cutler SJ, Young JL Jr. Third National Cancer Survey: Incidence Data Natl Canc Inst, Monogr 1995;41. 9. Setlow R B, W oodhead A D, Grist E. Ani mal model for ultraviolet radiation-induced m elano ma: platyfish-swordtail hybrid. Proc Natl Acad Sci US A. 1989; 86:89228926. 10. Ley R D, Applegate LA, Padilla RS, Stuart T D. Ultraviolet radiation-induced m alignant melano ma in Monodelphis do mestica. Photoche m Photobiol. 1989; 50(1):1-5. 11. Langley R B, Sober AJ. A clinical review of the evidence for the role of ultraviolet radiation in the etiology of cutaneous melano ma. Cancer Invest. 1997;15:561-567. 12. Balch C M, Buzaid A C, Soong SJ, Atkins M B, Cascinelli N, Coit D G, Fleming ID, Gershen wald JE, Houghton A Jr, Kirkwood JM, Mc M asters K M, M ih m M F, M orton D L, Reintgen DS, Ross MI, Sober A, Tho mpson JA, Tho mpson JF. Final version of the A merican Joint Co m mittee on Cancer staging system for cutaneous m elano ma. J Clin Oncol. 2001;19(16):3635-3648. 13. Kelly J W, Cha mberlain AJ, Staples M P, Mc Avoy B. Nodular melano ma. N o longer as simple as A B C. Aust Fa m Physician. 2003;32(9):706-709. 14. Poetsch M, Dittberner T, Woenckhaus C. Can different genetic changes characterize histogenetic subtypes and biologic behavior in sporadic m alignant m elano ma of the skin? Cell Mol Life Sci. 2003;60(9):1923-1932.
64
IRODALOMJEGYZÉK
15. V ogelstein B, Fearon ER, Ha milton SR, Kern SE, Preisinger A C, Leppert M, Naka mura Y, W hite R, S mits A M M, Bos JL: Genetic alterations during colorectal tumor develop ment. N Engl J Med. 1990;319:525-532. 16. W elch D R, Goldberg SF. Molecular mechanisms controlling hu man m elano ma progression and metastasis. Pathobiol. 1997;65:311-330. 17. Liu L, Dilworth D, Gao L, Monzon J, Su m mers A, Lassa m N, Hogg D. M utation of the C D K N 2 A 5' UT R creates an aberrant initiation codon and predisposes to m elano ma. Nature Genet. 1999;21:128-132. 18. K u mar R, S meds J, Berggren P, Strau me O, Rozell BL, Akslen L A, He m minki K. A single nucleotide polym orphism in the 3' untranslated region of the CD K N 2 A gene is co m m on in sporadic primary melano mas but mutations in the CD K N 2 B, C D K N 2 C, C D K4 and p53 genes are rare. Int J Cancer. 2001;95:388-393. 19. Ruas M, Peters G. The p16IN K4a/C D K N 2 A tum or suppressor and its relatives. Biochim Biophys Acta. 1998;1378:F115-F177. 20. M atsuya ma H, Pan Y, Yoshihiro S, Kudren D, Naito K, Bergerheim US, Ek man P. Clinical significance of chro moso me 8p, 10q, and 16q deletions in prostate cancer. Prostate. 2003;54(2):103-11. 21. Si mon M, von Deimling A, Larson JJ, Wellenreuther R, Kaskel P, W a ha A, W arnick RE, Te w J M Jr, Menon A G. Allelic losses on chro moso mes 14, 10, and 1 in atypical and malignant meningio mas: a genetic model of meningio ma progression.Cancer Res. 1995;55(20):4696-4701. 22. Rasheed B K, McLendon RE, Fried man HS, Friedm an A H, Fuchs H E, Bigner D D, Bigner S H. Chro mosom e 10 deletion mapping in hu man glio mas: a co m m on deletion region in 10q25. Oncogene. 1995;10(11):2243-2246. 23. Pollock P M, Trent J M. The genetics of cutaneous melano ma. Clin Lab Med. 2000;20(4):667-690. 24. Balázs M, Ádá m Z, Treszl A, Bégány Á, Hunyadi J, Ádány R. (2001): Chro moso mal imbalances in primary and metastatic melano mas revealed by co mparative geno mic hybridization. Cyto metry. 2001;46(4):222-232. 25. Attwell S, Mills J, Troussard A, W u C, Dedhar S. Integration of cell attach ment, cytoskeletal localization, and signaling by integrin-linked kinase (ILK), C HIL K B P, and the tu mor suppressor PTE N. Mol Biol Cell. 2003;14(12):4813-4825. 26. Brose M S, Volpe P, Feldman M, Ku mar et. Al. BR A F and R A S mutations in hu man lung cancer and m elano ma.Cancer Res. 2002;62(23):6997-7000. 27. Saida T. Recent advances in melano ma research. J Der matol Sci. 2001;26(1):1-13. 28. Trent J M, Stanbridge EJ, Mc Bride H L, Meese E U, Casey G, Aranjo D E, W itko wski C M, Nagle R B. Tu morigenicity in hu man melano ma cell lines controlled by introduction of hu man chor moso me 6. Science. 1990;247:568-571.
65
IRODALOMJEGYZÉK
29. Jiang H, Lin J, Su ZZ, Herlyn M, Kerbel RS, Weissman B E, Welch D R, Fisher PB. The melano ma differentiation-associated gene m da-6, which encodes the cyclindependent kinase inhibitor p21, is differentially expressed during gro wth, differentiation and progression in hu man melano ma cells. O ncogene. 1995;4;10(9):1855-1864. 30. To mlinson IP, Beck N E, Bod mer W F. Allele loss on chro moso me 11q and microsatellite instability in malignant m elano ma. Eur J Cancer. 1996;32 A(10):1797-1802. 31. Herbst R A, Larson A, W eiss J, Cavenee W K, Ham pton G M, Arden K C. A defined region of loss of heterozygosity at 11q23 in cutaneous malignant melano ma. Cancer Res. 1995;55(12):2494-2496. 32. Trent J M, Meyskens FL, Salmon SE, Ryschon K, Leong SPL, Davis JR, Mc Gee D L. Relation of cytogenetic abnor malities and clinical outco me in m etastatic m elano ma. N Eng J Med. 1990;322:1508-1511. 33. Eisen T G. The control of gene expression in melanocytes and melano mas. M elano ma Res. 1996;6(4):277-284. 34. Albino AP, Nanus D M , Mentle IR, Cordon-Cardo C, Mc Nutt NS, Bressler J, A ndreeff M. Analysis of ras oncogenes in malignant melano ma and precursor lesions: correlation of point mutations with differentiation phenotype. Oncogene. 1989;4(11):1363-1374. 35. van 't Veer LJ, Burgering B M, Versteeg R, Boot AJ, Ruiter DJ, Osanto S, Schrier PI, Bos JL. N-ras mutations in hu man cutaneous m elano ma fro m sun-exposed body sites. Mol Cell Biol. 1989;9(7):3114-3116. 36. Ball NJ, Yohn JJ, Morelli JG, Norris D A, Golitz L E, Hoeffler JP. Ras mutations in hu man melano ma: a m arker of malignant progression. J Invest Der matol. 1994;102(3):285-290. 37. Rodeck U, Herlyn M. Gro wth factors in melano ma. Cancer Metastasis Rev. 1991;10(2):89-101. 38. Bale SJ, Dracopoli N C, Tucker M A, Clark W H Jr, Fraser M C, Stanger BZ, Green P, Donis-Keller H, Housman D E, Greene M H. M apping the gene for hereditary cutaneous malignant melano ma-dysplastic nevus to chro moso me 1p. N Engl J Med. 1989;320(21):1367-1372. 39. Lee JH, Miele M E, Hicks DJ, Phillips K K, Trent J M, Weissman B E, W elch D R. KiSS-1, a novel hu man malignant melano ma m etastasis-suppressor gene. J Natl Cancer Inst. 1996;88(23):1731-1737. 40. W ol man S R, Wald man F M, Balazs M. Co m ple mentarity of interphase and m etaphase chro moso me analysis in hu man renal tu mors. Genes Chrom oso mes Cancer. 1993;6(1):17-23.
66
IRODALOMJEGYZÉK
41. Balázs M, Matsu mura K, Moore D, Pinkel D, Gray J W, Wald man F. Karyotypic heterogeneity and its relation to labeling index in interphase breast tu m or cells. Cyto metry. 1995;20:62-73. 42. Kraehn G M, Utikal J, Udart M, Greulich K M, Bezold G, Kaskel P, Leiter U, Peter R U. Extra c-myc oncogene copies in high-risk cutaneous malignant melano ma and m elano ma metastases. Br J Cancer. 2001;84:72-79. 43. Schrock E, du Manoir S, Veld man T, Schoell, W ienberg J, Ferguson-Smith M A, Ning Y, Ledbetter D H, Bar-A m I, Soenksen D, Garini Y, Ried T. M ulticolor Spectral Karyotyping of H u man chro moso mes. Science. 1996;273:494-497. 44. Kallionie mi A, Kallioniemi OP, Sudar D, Rutovitz D, Gray J W, Wald man F, Pinkel D. Co mparative geno mic hybridization for molecular analysis of solid tu mors. Science. 1992;258:818-821. 45. Pinkel D, Segraves R, Sudar D, Clark S, Poole I, Ko wbel D, Collins C, K uo W L, Chen C, Zhai Y, Dairkee S H, Ljung B M, Gray JW , Albertson D G. High resolution analysis of D N A copy nu mber variation using com parative geno mic hybridization to microarrays. Nat Genet. 1998;20(2):207-11. 46. M o nni O, Hy man E, Mousses S, Barlund M, Kallionie mi A, Kallionie mi O P. Fro m chro moso mal alterations to target genes for therapy: integrating cytogenetic and functional geno mic views of the breast cancer geno me. Se min Cancer Biol. 2001;11(5):395-401. 47. Greulich K M, Utikal J, Peter R U, Krahn G. c-myc and nodular m alignant m elano ma. A case report. Cancer. 2000;89:97-103. 48. Legha SS, Ring S, Eton O, Bedikian A, Buzaid A C, Plager C, Papadopoulos N. Develop ment of a bioche motherapy regimen with concurrent ad ministration of cisplatin, vinblastine, dacarbazine, interferon alfa, and interleukin-2 for patients with metastatic melano m a. J Clin Oncol. 1998;16(5):1752-1759. 49. Kageshita T, Ha mby C V, Hirai S, Ki mura T, Ono T, Ferrone S. Differential clinical significance of alpha(v)Beta(3) expression in primary lesions of acral lentiginous m elano ma and of other m elano ma histotypes. Int J Cancer. 2000;89(2):153-159. 50. Healy E, Reh man I, Angus B, Rees JL. Loss of heterozygosity in sporadic primary cutaneous melano ma. Genes Chro moso mes Cancer. 1995;12:152-156. 51. Tho mpson F H, E merson J, Olson S, Weinstein R, Leavitt S A, Leong SP, E merson S, Trent J M, Nelason M A, Salmon SE. Cytogenetics of 158 patients with regional or disse minated melanom a: subset analysis of near-diploid and simple karyotypes. Cancer Genet Cytogenet. 1995;83:93-104. 52. Bastian B C, LeBoit PE, Ha m m H, Brocker EB, Pinkel D. Chro moso mal gains and losses in primary cutaneous melano mas detected by co mparative geno mic hybridization. Cancer Res. 1998;58(10):2170-2175.
67
IRODALOMJEGYZÉK
53. Chana JS, Grover R, Tulley P, Lohrer H, Sanders R, Grobbelaar A O, Wilson G D. The c-myc oncogene: use of a biological prognostic marker as a potential target for gene therapy in melano m a. Br J Plast Surg. 2002;55(8):623-627. 54. Millikin D, Meese E, Vogelstein B, Witko wski C, Trent J. Loss of heterozygosity for loci on the long arm of chro moso me 6 in hum an malignant melano m a. Cancer Res. 1991;51(20):5449-5453. 55. W elch D R, Chen P, Miele M E, Mc Gary CT, Bower J M, Stanbridge EJ, W eiss man B E. Microcell-mediated transfer of chro moso me 6 into metastatic hu man C8161 m elano ma cells suppresses metastasis but does not inhibit tu morigenicity. O ncogene. 1994;9(1):255-262. 56. Treszl A, Ádány R, Rákosy Zs, Kardos L, Bégány Á, Gilde K, Balázs M. Extra copies of c-myc are more pronounced in nodular melano mas than in superficial spreading melano ma sas revealed by fluorescence in situ hybridisation. Cytometry. 2004;60B(1):37-46. 57. Bastian B C. Understanding the progression of melanocytic neoplasia using geno mic analysis: fro m fields to cancer. Oncogene. 2003;22(20):3081-3086. 58. Driouch K, Cha mpe me M H, Beuzelin M, Bieche I, Lidereau R. Classical gene a mplifications in hu man breast cancer are not associated with distant solid m etastases. Br J Cancer. 1997;76:784-787. 59. W atson P H, Safneck JR, Le K, Dubik D, Shiu RP. Relationship of c-myc a mplification to progression of breast cancer from in situ to invasive tum our and lymph node metastasis. J Natl Cancer Inst. 1993;85:902-907. 60. Ross D A, Wilson G D. Expression of c-myc oncoprotein represents a ne w prognostic marker in cutaneous melano ma. Br J Surg. 1998;85:46-51. 61. Grover R, Ross D A, Wilson G D, Sanders R. M easure ment of c-myc oncoprotein provides an independent prognostic marker for regional metastatic melanom a. Br J Plast Surg. 1997;50:478-482. 62. Boni R, Bantschapp O, Muller B, Burg G. c-m yc is not useful as prognostic im munohistoche mical marker in cutaneous melano ma. Dermatology. 1998;196:288-291. 63. Isola J, De Vries S, Chu L, Ghazvini S, Wald man F.Analysis of changes in D N A sequence copy nu mber by co mparative geno mic hybridization in archival paraffine mbedded tu mor sa mples. A m J Pathol. 1994;145(6):1301-1308. 64. Snijders A M, Pinkel D, Albertson D G. Current status and future prospects of arraybased co mparative geno mic hybridisation. Brief Funct Geno mic Proteo mic. 2003;2(1):37-45. 65. W o ng S C, Chan JK, Lee K C, Hsiao W L. Differential expression of p16/p21/p27 and cyclin D1/D3, and their relationships to cell proliferation, apoptosis, and tumour progression in invasive ductal carcino ma of the breast. J Pathol. 2001;194(1):35-42.
68
IRODALOMJEGYZÉK
66. Y u J, Miehlke S, Ebert M P, Szokodi D, Wehvnignh B, Malfertheiner P, Ehninger G, Bayerdoerffer E. Expression of cyclin genes in hu man gastric cancer and in first degree relatives. Chin M ed J (Engl). 2002;115(5):710-715. 67. Vivi Ann Florenes, Ragnar S. Faye, Gunhild M. M ælands mo, Jahn M. Nesland and Ruth Hol m. Levels of Cyclin D1 and D3 in M alignant Melano ma: Deregulated Cyclin D3 Expression Is Associated with Poor Clinical Outco me in Superficial M elano ma Clinical Cancer Research. 2000;6:3614-3620. 68. Ed munds SC, Cree IA, Di Nicolantonio F, Hungerford JL, Hurren JS, Kelsell DP. A bsence of B R A F gene mutations in uveal melano mas in contrast to cutaneous m elano mas. Brit. J. Cancer. 2003;88:1403-1405. 69. Petty E M, Bolognia JL, Bale A E, Yang-Feng T. Cutaneous malignant m elano ma and atypical moles associated with a constitutional rearrange ment of chrom oso mes 5 and 9. A m. J. Med. Genet. 1993;45:77-80. 70. Co wan J M, Halaban R, Francke U. Cytogenetic analysis of melanocytes fro m pre malignant nevi and melano mas. J Natl Cancer Inst. 1988;80(14):1159-64. 71. G uldberg P, Straten P, Brick A, Ahrenkiel V, Kirkin AF, Zenthen J. Disruption of the M M A C 1/PTE N gene by deletion or mutation is a frequent event in m alignant m elano ma. Cancer Res. 1997;57:3660-3663. 72. Zhou Y H, Tan F, Hess K R, Yung W K. The expression of P A X6, PTE N, vascular endothelial growth factor, and epidermal growth factor receptor in glio mas: relationship to tu mor grade and survival. Clin Cancer Res. 2003;9(9):3369-75. 73. Tada K, Shiraishi S, Kamiryo T, Naka mura H, Hirano H, Kuratsu J, Kochi M, Saya H, Ushio Y. Analysis of loss of heterozygosity on chro moso me 10 in patients with m alignant astrocytic tu m ors: correlation with patient age and survival. J Neurosurg. 2001;95(4):651-659. 74. Bastian B C, Olshen AB, LeBoit PE, Pinkel D Classifying melanocytic tu mors based on D N A copy nu m ber changes. A m J Pathol. 2003;163(5):1765-1770. 75. Schulten HJ, Guna wan B, Otto F, Hass mann R, Hallermann C, Noebel A, Fuzesi L. Cytogenetic characterization of co mplex karyotypes in seven established m elano ma cell lines by multiplex fluorescence in situ hybridization and D A PI banding. Cancer Genet Cytogenet. 2002;133(2):134-141. 76. G uan X Y, Zhang H E, Zhou H, Sha m JS, Fung J M , Trent J M. Characterization of a co mplex chro moso me rearrange ment involving 6q in a melano ma cell line by chro moso me microdissection. Cancer Genet Cytogenet. 2002;134(1):65-70. 77. Trotter MJ, Colwell R, Tron V A. Thro mbospondin-1 and cutaneous melano ma. J Cutan Med Surg. 2003;7(2):136-41. 78. W etner S, S mola H, Liao X, Longaker M T, Krieg, Hofschneider P H, Willia ms LT. The function of K G F in morphogenesis of epitheliu m and reepithelialization of w ounds. Science. 1994;266:819-822.
69
IRODALOMJEGYZÉK
79. Hsu M Y, Shih D T, Meier FE, Van Belle P, Hsu JY, Elder DE, Buck CA, Herlyn M. Adenoviral gene transfer of beta3 integrin subunit induces conversion fro m radial to vertical grow th phase in primary hu man melano ma.A m J Pathol. 1998;153(5):1435-42. 80. Barks JH, Tho mpson FH, Taetle R, Yang J M, Stone JF, Wy mer JA, Khavari R, G uan X Y, Trent J M, Pinkel D, Nelson M A. Increased chro moso me 20 copy nu mber detected by fluorescence in situ hybridization (FIS H) in m alignant m elano ma. Genes Chro m oso mes Cancer. 1997;19(4):278-85. 81. M ac Dougall JR, Bani M R, Lin Y, Rak J, Kerbel RS. The 92-k D gelatinase B is expressed by advanced stage melano ma cells: suppression by so matic cell hybridization with early stage melano ma cells. Cancer Res. 1995;55:4174-4181. 82. Tyzzer EEJ. Tu mor im m unity. J Cancer Res. 1916;1:125-155. 83. D uesberg P, Rasnick D. Aneuploidy, the so matic mutation that makes cancer a species of its own. Cell M otility and the Cytoskeleton. 2000;47:81-107. 84. Pollack JR, Sorlie T, Perou C M, Rees C A, Jeffrey SS, Lonning PE, Tibshirani R, Botstein D, Borresen-Dale A L, Bro wn P O. Microarray analysis reveals a major direct role of D N A copy nu mber alteration in the transcriptional progra m of hu man breast tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(20):12963-12968. 85. H odgson G, Hager JH, Volik S, et al. Geno me scanning with array C G H delineates regional alterations in mouse islet carcino mas. Nat Genet. 2001;29(4):459-464. 86. K uukasjarvi T, Karhu R, Tanner M, Kahkonen M, Schaffer A, Nupponen N, Pennanen S, Kallionie m i A, Kallionie mi OP, Isola J. Genetic heterogeneity and clonal evolution underlying develop ment of asynchronous metastasis in hu man breast cancer. Cancer Res. 1997;57(8):1597-1604. 87. W a ng L, Yang L, Luo Y, Zheng Y. A novel strategy for specifically do wnregulating individual Rho G TPase activity in tu mor cells. J Biol Che m. 2003;278(45):44617-44625. 88. Clark E A, Golub T R, Lander ES, Hynes R O. Geno mic analysis of m etastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 2000;406(6795):532-535. 89. Harvell JD, Kohler S, Zhu S, Hernandez-Boussard T, Pollack JR, van de Rijn M. High-resolution array-based co mparative geno mic hybridization for distinguishing paraffin-e mbedded Spitz nevi and melano mas. Diagn Mol Pathol. 2004;13(1):22-5.
70
KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
9. KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE 9.1. Az értekezés alapjául szolgáló in extenso közlemények Balázs M., Ádá m Z., Treszl A., Bégány Á., Hunyadi J., Ádány R.: Chro moso mal imbalances in primary and metastatic melanom as revealed by co mparative geno mic hybridization. Cytometry. 2001;46(4):222-32. IF: 2,557
Treszl A., Ádány R., Rákosy Zs., Kardos L., Bégány Á., Gilde K., Balázs M.: Extra copies of c-myc are more pronounced in nodular melano mas than in superficial spreading m elano ma sas revealed by fluorescence in situ hybridisation. Cytometry. 2004;60B(1):3746. IF: 2,095
Treszl A., Rákosy Zs., Ladányi A., Ádány R., Balázs M.: Co mplex cytogenetic analysis of a new metastatic melanom a cell line. (közlésre elküldve)
9.2. Egyéb in extenso közlemények és indézhetı absztraktok Toida M., Balázs M., Treszl A., Rákosy Zs., Kato K., Ya mazaki Y., Matsui T., Su wa T., Hatakeya ma D., Makita H., Mori S., Ya mashita T., Shibata T., Ádány R.: Analyses of A m eloblasto mas by Co mparative Geno mic H ybridization and Fluorescence in situ H ybridization. Cancer Genetics and Cytogenetics. 2004 (közlésre elfogadva) IF: 1,542 M éhes L., Balázs M., Treszl A., Rejtı L., Telek B., Kiss A., Udvardy M.: Cytogenetic aberrations in fa milial chronic ly mphotic leukaemia: a report of two siblings. (közlésre elküldve) Balázs M., Ádá m Zs., Bégány Á., Treszl A., Hunyadi J., Ádány R.: Chro moso mal copy nu mber changes in prim ary and metastatic melano mas detected by C G H and FIS H. Proceedings of the American Association for Cancer Research. 2000. No. 2670. p420. Balázs M., Treszl A., Bégány Á., Ádány R.: Frequent a mplification of c-m yc oncogene in nodular malignant melano mas detected by fluorescence in situ hybridization. Onkologi.a 4. Suppl. 1. 2002. Balázs M., Treszl A., Á dány R.: Application of fluorescence in situ hybridisation in tumour diagnostics. Cytometry. 2003;56 A:121-122. Barok M., Szincsák N., Treszl A., Balázs, M. Vereb Gy. Szöllısi J.: Analysis of a ® Herceptin resistant breast cancer cell line in SCID mice. Cytometry. 2003;56A:127.
71
KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Balázs M., Rákosy Zs., Treszl A., Bégány Á., Á dány R.: Interphase cytogenetic analysis sho ws frequent he mizygous and ho mozygous deletions of p16/M T S 1/C D K N 2 A tumorsuppressor gene in sporadic primary melanom as. Cytometry. 2004;59A:69.
9.3. Elıadások és poszterek Treszl A. (1999): Primer és metasztatikus melano mák interfázisos analízise. Országos Tudo mányos Diáktalálkozó, Kossuth Lajos Tudom ányegyete m, Debrecen Balázs M., Ádá m Zs., Bégány Á., Treszl A., Hunyadi J., Ádány R. (2000): Chro moso mal copy nu mber changes in primary and metastatic m elano mas detected by C G H and FIS H. Conference of the A merican Association for Cancer Research, San Francisco, U S A
Treszl A., Balázs M., Bégány Á., Ádány R. (2000): Frequent chro moso m e 8 copy nu mber alterations in malignant m elano mas detected by FIS H. X VI Conference of the European Association for Cancer Research, Halkidiki, Görögország
Treszl A. (2001): A 8-as kro moszó ma karakterizálása primer és metasztatikus hu man m elano mákban. Országos Tudo mányos Diáktalálkozó, Pécsi Tudo mányegyetem, Orvos- és Egészségtudo mányi Centru m, Pécs, 1. helyezés Balázs M., Treszl A., Ádány R. (2002): A fluoreszcencia in situ hibridizáció alkalmazási lehetıségei a tumor diagnosztikában. III. Magyar Sejtanalitikai Konferencia, Budapes Barok M., Szincsák N., Treszl A., Balázs M ., Vereb Gy., Szöllısi J. (2002): Egy Herceptin-rezisztens emlıdaganat-sejtvonal analízise. III. Magyar Sejtanalitikai K onferencia, Budapest Balázs M., Treszl A., Bégány, Á., Ádány, R. (2002): Frequent a mplification of c- myc oncogene in nodular malignant melano mas detected by fluorescence in situ hybridisation. X VII Conference of the European Association for Cancer Research, Granada, Spanyolország
Treszl A., Ladányi A., Rákosy Zs., Buczkó Zs., Ádány R., Balázs M. (2003): Establish ment and cytogenetic characterization of a new melano ma cell line by C G H and rd FIS H. 3 E U R O S KI N Conference, Stockholm, Svédország Rákosy Zs., Treszl A., Bégány Á., Ádány R., Balázs M. (2004): Az EG F R gén (7p12) a mplifikáció szerepének tanulmányozása primer melano mák metasztázisképzésében. IV. Sejtanalitikai Konferencia, Budapest Barok M., Juhász I., Treszl A., Balázs M., Park J. W., Isola J., Fazekas Zs., Vereb Gy., ® Szöllısi J. (2004): Mikro metasztázisok kimutatása Herceptin rezisztens és érzékeny e mlırák xenograftokban. IV. Sejtanalitikai Konferencia, Budapest Balázs M., Rákosy Zs., Treszl A., Bégány Á., Á dány R. (2004): Interphase cytogenetic analysis sho ws frequent he mizygous and ho mozygous deletions of p16/M T S 1/C D K N 2 A tumorsuppressor gene in sporadic primary melanom as. X XII International Congress of the International Society for A nalytical Cytology (ISA C), Montpellier, Franciaország
72
KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
Treszl A., Rákosy Zs., Ladányi A., Ádány R., Balázs M. (2004): Co mparative analysis of m elano ma cell lines. X V III Conference of the European Association for Cancer Research, Innsbruch, Ausztria Barok M., Juhász I., Treszl A., Balázs M., Park J. W., Isola J., Fazekas Zs., Vereb Gy., ® Szöllısi J. (2004): Detection of circulating microm etastasis in Herceptin resistnat breast cancer xenograft. X VIII Conference of the European Association for Cancer Research, Innsbruch, Ausztria M olnár Zs., Treszl A., K ovács T., Jakab A. (2004): Aneuploid spermium ok elıfordulása, kimutatása és reprodukciós jelentısége. Magyar Urológusok Társasága Andrológiai Szekciójának 28. Tudo mányos Ülése, Szeged
73
KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS
KÖSZÖNET
Köszönettel tartozom mindenekelıtt témavezetımnek, Dr. Balázs Margitnak, aki bevezetett a daganatkutatás és a fluoreszcencia in situ hibridizációs módszerek csodálatos világába, mindvégig irányította és segítette kutatómunkámat. Köszönöm Ádány Róza professzornınek, hogy lehetıvé tette, hogy intézetében dolgozhassam. Köszönöm Dr. Bégány Ágnesnek a melanoma szövettanának és klinikumának k megismerésében nyújtott segítséget. Köszönöm a Népegészségügyi Iskola Megelızı Orvostani Intézete minden munkatársának, hogy munkámat segítették. Külön köszönettel tartozom Kovács Györgynének asszisztensi segítségéért. Szeretnék köszönetet mondani valamennyi TDK-hallgatónknak és külön köszönöm Rákosy Zsuzsa Ph.D. hallgatónk áldozatos munkáját. Köszönöm férjem és családom támogatását és türelmét.
74
MELLÉKLETEK
11. MELLÉKLETEK
A DOLGOZAT ÖSSZEFOGLALÓ TÉZISEIT MEGALAPOZÓ KÖZLEMÉNYEK
75
