EGYETEMI DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS
Candida albicans, C. dubliniensis, C. krusei és C. tropicalis fajok paradox növekedése nagy koncentrációjú caspofungin jelenlétében
Dr.Varga István Témavezető: Dr. Majoros László Ph.D.
DEBRECENI EGYETEM GYÓGYSZERÉSZETI TUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA Debrecen, 2011
Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék
1
Fontosabb rövidítések
2
1. Bevezetés
3
2. Irodalmi áttekintés
4
2.1 A Candida fajok és a penészgombák által okozott fertőzések epidemiológiája
4
2.2. Az antifungális szerek csoportosítása
9
2.2.1 Azol típusú antifungális szerek……………………………………………………………………………….
9
2.2.2 Poliének…………………………………………………………………………………………………………
10
2.2.3 Allylaminok……………………………………………………………………………………………………..
11
2.2.4 Echinocandinok………………………………………………………………………………………………...
11
2.2.5 DNS szintézist gátló szerek……………………………………………………………………………………
13
2.2.6 Candida fertőzések kezelésének általános alapelvei………………………………………………………
14
2.3 Az antifungális érzékenység meghatározása sarjadzó gombák esetében
15
2.4 Alternatív módszerek a minimális gátló koncentráció meghatározására
16
2.5 A minimális fungicid koncentráció meghatározása
17
2.6 Az idő-ölés görbék
18
2.7 A rezisztencia és a paradox növekedés
19
3. Célkitűzések
24
4. Anyag és módszer
25
4.1 A sarjadzó gombák eredete
25
4.2 A sarjadzó gombák azonosítása
25
4.3 A minimális gátló koncentráció meghatározása
25
4.4 A minimális fungicid koncentráció meghatározása
26
4.5 Az idő-ölés görbék meghatározása
26
4.6 Az eredmények értékelésének szempontjai
27
5. Eredmények
29
5.1 A minimális gátló koncentráció meghatározása során kapott eredmények
29
5.2 A paradox növekedés vizsgálata során kapott eredmények
30
5.2.1 Paradox növekedés vizsgálata a minimális gátló koncentráció értékeinek alapján…………………..
30
5.2.2 Paradox növekedés vizsgálata a minimális fungicid koncentráció értékeinek alapján………………
31
5.3 Az idő-ölés görbék vizsgálatakor kapott eredmények
32
6. Fontosabb megállapítások, következtetések
44
7. Az eredmények összefoglalása
51
8. Köszönetnyilvánítás
52
9. Mellékletek
53
10. Irodalomjegyzék
55
11. Az értekezésben felhasznált közlemények
71
12. Egyéb közlemények, poszterek
71
1
Fontosabb rövidítések AIDS: Acquired Immune Deficiency Syndrome AM3: antibiotikum médium 3 AMB: amphotericin B ANI: anidulafungin ATCC: American Type Culture Collection AUC: area under the concentracion-time curve (a koncentráció-idő görbe alatti terület) CAS: caspofungin CFU: colony forming unit CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing FLU: flukonazol FU: fluorouracil HIV: Humán Immundeficiencia Vírus Hsp90: hősokk protein 90 MBC: minimális baktericid koncentráció MFC: minimális fungicid koncentráció MIC: minimális gátló koncentráció MIC90: az antifungális szer azon legkissebb koncentrációja, amely az izolátumok 90%-ának növekedését gátolja MICA: mikafungin MICPI: minimális gátló koncentráció, részleges gátlás MICTI: minimális gátló koncentráció, teljes gátlás NCCLS: National Committee for Clinical Laboratory Standards PG: paradoxical growth (paradox növekedés)
2
1. Bevezetés Az utóbbi időben számos antifungális szer került bevezetésre, mint például az újabb generációs azolok és az echinocandinok. Ezekkel a szerekkel jó klinikai eredmények érhetőek el számos olyan esetben is, amelyekben a konvencionális antimikotikus terápia már hatástalannak bizonyult [29, 32, 86]. Mindezek kifejlesztésére azért volt szükség, mert a Candida fajok epidemiológiájában az utóbbi időszakban jelentős változások történtek [70, 74, 102, 109, 111]. Bár a Candida albicans által okozott fertőzések továbbra is túlsúlyban vannak, emellett erőteljesen megnövekedett a nem C. albicans fajok által okozott megbetegedések száma is, és ezekben az esetekben a beteg túlélési esélyei is rosszabbnak bizonyultak [71, 73]. A magas morbiditás és mortalitás okai egyrészt abban keresendők, hogy a jelenlegi laboratóriumi módszerekkel egyelőre nehezen állítható fel a mikózisok korai diagnózisa, másrészt az alkalmazott szerek korlátozott hatásspektrummal, és magas toxicitással is rendelkezhetnek [123]. Az echinocandin csoportba tartozó caspofungin (CAS) a mukozális és szisztémás candidiasis kezelésére is felhasználható [34, 125]. Alkalmazásával kapcsolatosan azonban olyan megfigyelésekről is beszámoltak a nemzetközi szakirodalomban, amelyek megkérdőjelezték, hogy magasabb gyógyszerkoncentrációk esetében a caspofungin hatékonysága is növekszik. Ez
a
jelenség
az
úgynevezett
paradox
növekedés,
amely
szerint
bizonyos
gyógyszerkoncentráció felett, minél nagyobb a gyógyszer dózisa, annál kisebb lehet a hatékonysága [22, 136, 144]. Ezt a baktériumoknál már ismert hatást Eagle-effektnek nevezik, és különböző Candida fajoknál is igazolták az echinocandinok csoportjába tartozó antimikotikumok esetében. Munkám kezdetén a nemzetközi szakirodalomban még viszonylag kevés adat állt rendelkezésre a caspofungin jelenlétében kialakuló paradox növekedés vizsgálatáról. Ezért kutatásaim során a Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségügyi Centrum Orvosi Mikrobiológiai Intézetében izolált sarjadzó gombák in vitro érzékenységi vizsgálatát végeztem el (minimális gátló koncentráció és a minimális fungicid koncentráció meghatározása, valamint az idő-ölés görbék vizsgálata), melyek során a paradox növekedés felismerésének a lehetőségeit is vizsgáltam. Végezetül választ kerestem arra a kérdésre is, hogy a kapott in vitro eredményeknek milyen klinikai vonatkozásai lehetnek.
3
2. Irodalmi áttekintés 2.1 A Candida fajok és a penészgombák által okozott fertőzések epidemiológiája A szuperficiális és a szisztémás gombás fertőzések száma világszerte emelkedő tendenciát mutat [109]. A szuperficiális fertőzések közé sorolhatóak a bőrön, a nyálkahártyákon, a körmökön megjelenő formák, valamint a ritka, de annál veszélyesebb krónikus mukokutan candidiasis is [125]. Az ide tartozó, és fogorvosi szempontból nagy jelentőséggel bíró oralis candidiasis kialakulásában számos hajlamosító tényező játszhat szerepet. Ezek között szerepelhetnek egyszerű helyi tényezők, illetve súlyos általános betegségek is (1. táblázat) [81, 125, 133]. Az orális tünetek jelentkezhetnek száj és nyelvégés formájában, ízérzészavarban, étvágytalanságban valamint fájdalomban is [2, 16, 125]. 1. táblázat: Az orális candidiasis kialakulásában szerepet játszó legfontosabb tényezők [125].
Élettani folyamatokkal összefüggő változások
Időskor, újszülöttkor, terhesség
Helyi traumás hatások
Nyálkahártya irritáció, rossz szájhigénia
Antibiotikumok
Hosszantartó széles spektrumú antibiotikumterápia
Kortikoszteroidok
Szisztémás szteroid terápia, inhalátorok használata
Táplálkozással összefüggő hiányállapotok
Vas, folsav, B12 vitamin hiánya
Endokrin megbetegedések
Hypothyreosis, Addison-kór
Rosszindulatú megbetegedések
Vérképzőszervi megbetegedések (akut leukémiák, agranulocitózis)
Immunhiányos állapotok
HIV fertőzés, AIDS
Szájszáradás
Irradiáció, gyógyszermellékhatás, Sjögren szindróma
A nyálkahártyán jelenlévő elváltozások általában nem specifikusak a kiváltó okokra, megjelenésüket tekintve mind vörös, mind fehér lézió formájában előfordulhatnak. Az oralis candidiasist két nagyobb csoportba lehet sorolni. Megkülönböztetjük a primer oralis formát, amelyről akkor beszélünk, amikor a fertőzés csak az orális és a periorális területekre korlátozódik [125], és a szekunder formát, mely esetében a szájüregi folyamat csupán a szisztémás Candida infekció részjelensége (2. táblázat) [38, 125].
4
2. táblázat: Az oralis candidiasisok felosztása [125].
Primer oralis candidiasis
Szekunder oralis candidiasis
Akut formák Álhártyás Eritémás Krónikus formák Hiperplasztikus Nodularis Plakk forma Eritémás
A krónikus mukokutan candidiasis oralis manifesztációi, amelyek különböző általános betegségek miatt jöhetnek létre (pl. candidaendocrinopathia szindróma)
Candida fertőzéssel összefüggő léziók Fogsor stomatitis Cheilitis angularis Glossitis rombica mediana Linealis gingivalis eritéma
Az oralis fertőzéseket leginkább a Candida albicans okozza, mely normál körülmények között kis csíraszámban része lehet a szájflórának. Patogénné válását elősegíti, hogy számos virulenciafaktorral rendelkezik [132]. Ilyenek például a csíratömlő képzés, növekedés 37 °Con, az epitheliális sejtekhez való kötődési képesség, valamint a jól ismert szekretoros enzimaktivitás, mint például az aszpartil-proteináz, a foszfolipáz és a lipáz termelés [69, 80]. Az elmúlt időszakban azonban számos vizsgálat igazolta a nem C. albicans fajok jelenlétét és patogén szerepüket a szájüregben [3, 81]. Ezek közül talán a legtöbbet vizsgált oralis patogén a C. albicans-hoz fenotípusosan hasonló C. dubliniensis [122], amelyet HIV fertőzött betegek orális léziójából sikerült először izolálni [24, 48, 74]. Ez a szájüregi elváltozás a lineális gingivalis eritéma, amely az ínyszél lefutását követő, vörös csík a feszes gingiván. Egyes szerzők ezt az elváltozást nem tartják tisztán gombás eredetűnek, hanem egy kevert bakteriális-fungális opportunista fertőzést feltételeznek, mely hátterében generalizált immundeficiencia állhat [125]. C. dubliniensis fertőzésnél más szerzők súlyos extraorális kórképek kialakulását (candidemia, meningitis) is leírtak [138, 143]. A Candida fajok mellett számos egyéb, jóval ritkábban megjelenő gombafajok is okozhatnak szájüregi fertőzéseket, igaz a szisztémás mikózisok részjelenségeként (3. táblázat).
5
3. táblázat: A szájüreg gombás fertőzései, és a főbb etiológiai faktorok [125].
Betegség Candidiasis Aspergillosis Blastomycosis Coccidioidomycosis Cryptococcosis Fusariosis Geotrichosis Histoplasmosis Mucormycosis Paracoccidiomycosis Penicilliosis Sporotrichosis
Fajok C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. dubliniensis, C. krusei, C. parapsilosis (leggyakoribbak) Aspergillus fumigatus Blastomyces dermatitidis Coccidioides immitis Cryptococcus neoformans Fusarium moniliforme Geotrichum candidum Histoplasma capsulatum Mucoralesek rendje Paracoccidioides brasiliensis Penicillium marneffei Sporothrix schenckii
Az aspergillosis a candidiasis után a leggyakoribb opportunista gombás fertőzés [33]. A leginkább pathogén faj az Aspergillus fumigatus, de ritkábban az A. flavus, A. glaucis, A. terrus és az A. niger is okozhat fertőzést. Az aspergillosis különböző klinikai formában jelentkezhet: lehet csupán szuperficiális infekció, de kialakulhat allergiás típusú, illetve invazív formája is. Az orofaciális aspergillosis során gyakran érintett lehet a sinus maxilláris, az orr- és szájnyálkahártya, illetve az arc bőrének ennek megfelelő területei. Az A. fumigatus gyakran okozhat sinus aspergillosist, különösen immunszupprimált betegeknél [125]. Az invazív mikózisok gyakori kísérői a súlyos általános betegségeknek, és gyakran halálos szövődményekhez vezethetnek [63]. Prevalenciájuk már évek óta növekvő tendenciát mutat, az Egyesült Államokban például több mint kétszeres növekedést tudtak kimutatni 1979 és 2000 közötti időszakban [109]. Európában is folyamatosan emelkedik a candidémiák incidenciája, egy felmérés például 1,2%-ról 4,6%-ra történő növekedést mutatott ki Franciaországban az 1995 és 1997 között [70]. A sarjadzógomba fertőzések több mint 90%-át Candida fajok okozzák, és az ugyancsak emelkedő tendenciát mutató penészgomba fertőzésekért az Aspergillus fajok tehetők felelőssé hasonló arányban [63, 100, 109]. Az invazív mikózisok kialakulásában a legfontosabb prediszponáló tényező az immunszupresszív terápia, diabetes mellitus, malignus folyamatok, a túl magas vagy túl alacsony életkor, sebészeti beavatkozások és az AIDS (4. táblázat) [109, 123].
6
4. táblázat: Az opportunista mikózisok kialakulásáért felelőssé tehető legfontosabb faktorok (egyszerűsített táblázat) [109].
A fertőzés kialakulásáért felelőssé tehető faktorok
A fertőzést okozó patogének
Nyálkahártya / bőr folytonosságának károsodása Neutrofil granulocita működési zavar (kvantitatív vagy kvalitatív eltérés)
Candida, Trichosporon, Aspergillus fajok és egyéb penészgombák
A celluláris immunválasz károsodása
Cryptococcus fajok, endémiás mikózisok
Metabolikus zavarok
Zygomycetes és Candida fajok
Életkorbeli sajátosságok (< 1 év, > 70 év)
Candida fajok
Candida és Aspergillus fajok
A lehetséges okok közé sorolható még az is hogy a kiterjedt antifungális profilaxis alkalmazása, és a kezelési protokollok megváltozása során előtérbe kerültek a nem Candida albicans okozta fertőzések. Az invazív mikózisok kialakulásával több mint 17-féle különböző Candida faj hozható összefüggésbe [109]. A fertőzések több mint 90 % százalékát mindössze öt faj okozza, a legfontosabb patogén továbbra is a C. albicans de az egyéb fajok, mint a C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei jelentősége is folyamatosan növekszik [45, 52, 109]. Fontos továbbá, hogy gyakran társulnak a nem C. albicans fertőzések hematológiai malignus folyamatokhoz, illetve az European Confederation of Medical Mycology szerint az életkor függvényében is más fajok kerülhetnek előtérbe. Ezek alapján idősebb betegeknél fokozatosan csökken a C. parapsilosis incidenciája, viszont a C. glabrata által okozott invazív mikózisok aránya növekszik [70, 110]. A C. glabrata a második legfontosabb opportunista patogén az invazív mikózisok kialakulásában a világ legtöbb országában, de relatíve alacsony incidenciával rendelkezik Latin-Amerikában [109]. Egyes szerzők szerint ezek az adatok a flukonazol (FLU) széleskörű alkalmazásával hozhatóak összefüggésbe [73]. Ugyancsak gyakori a megjelenése a tumoros betegek ellátásával foglalkozó centrumokban [33]. További hajlamosító tényezők lehetnek még a C. glabrata által okozott invazív fertőzésekre a hosszantartó széles spektrumú antibiotikumterápia, centrális véna katéter alkalmazása és a parenteralis táplálás [109]. A C. parapsilosis előfordulása a bőrön sokkal gyakoribb, mint a nyálkahártyán [55, 125]. A kórokozó jó biofilm-képző tulajdonsága katéterek és implantátumok esetén hoz létre a gyógyszerek számára nehezen átjárható barriert [55]. Jól ismert etiológiai szerepe az 7
újszülöttek gombás fertőzéseinél is [91]. A latin-amerikai populációban évek óta növekvő tendenciát mutat, bár fontos megjegyezni, hogy az általa kiváltott invazív mikózisok mortalitása kisebb, mint más Candida fajoké [109]. Mivel exogén forrásból kerül be a szervezetbe,
jó
infekció-kontrol
esetén,
kellő
odafigyeléssel
(kézmosás,
higiénés
rendszabályok betartása katéterek alkalmazásánál) a fertőzések nagy része elkerülhető [70]. Finnországban a C. parapsilosis törzs által okozott neonatális infekciók számának csökkenését is a higiénés módszerek magas szintű alkalmazásával érték el [109]. A C. tropicalis az egyik legfontosabb fungális patogén neutropéniás, leukemiás betegek esetében [94]. Statisztikailag a negyedik leggyakoribb kórokozó az invazív mikózisok epidemiológiájában Észak-Amerikában, második Latin-Amerikában, és a C. glabrata-nál gyakoribb Ázsiában [33]. Világszerte évről-évre növekszik az általa okozott gombás fertőzések aránya, egyedül az Egyesült Államokban csökken a gyakorisága, köszönhetően a széles körben alkalmazott FLU profilaxisnak [99, 109]. A C. tropicalis-hoz hasonlóan a C. krusei is szerepet játszhat a malignus hematológiai betegségben szenvedők invazív mikózisának a kialakulásában [79, 111]. Gyakoriságát az összes Candida fertőzés mintegy 2-4%-ára teszik, de ettől az értéktől nagyobb előfordulási gyakoriság mutatkozik, ha az adatokat speciális fekvőbeteg osztályokra lebontva (pl. hematológia) vizsgáljuk [111]. Az esetek számának emelkedéséért sokan szintén a FLU profilaxist teszik felelőssé [63, 70, 99], bár egyes intézetekben a C. krusei prevalenciája már a FLU profilaxis bevezetése előtt is emelkedett volt [111].
A penészgomba fertőzések által okozott invazív mikózisok közül legnagyobb jelentősége az aspergillosisnak van. Az előfordulási gyakoriság függ a földrajzi elhelyezkedéstől is, Európában az összes gombás fertőzés több mint 7%-ért felelős [70]. A fertőzés kockázatát számos megbetegedés növelheti, mint a hematológiai malignus megbetegedések, krónikus obstruktív tüdőbetegség (COPD) és a neutropénia [109]. A mortalitási adatok széles határok között változhatnak (38%-94%), és függnek az alapbetegségtől, illetve a földrajzi lokalizációtól is. A mortalitás igen magas (csaknem 100%-os) COPD esetében, bár ezek a statisztikák csak hiányosan dokumentált esetek alapján készültek [70]. Az epidemiológiai vizsgálatok szerint az invazív mikózisok napjainkban komoly problémát jelentenek, és növekvő tendenciát mutatnak. A candidiasis a leggyakoribb ilyen típusú fertőzés, és bár számos tekintetben megfelelő információk állnak rendelkezésünkre, még ma
8
sem világos, hogy a megfelelően kiválasztott profilaxis, vagy a célzott antimikotikus kezelés a célravezetőbb az incidencia és a mortalitási ráta csökkentése érdekében [70]. 2.2 Az antifungális szerek csoportosítása Az antifungális szerek fejlődése a terápiás igényeknek megfelelően napjainkban is folyamatos, és az utóbbi időben számos új készítmény vált elérhetővé a klinikum számára [32, 72]. Ide tartozik a széles hatásspektrummal rendelkező vorikonazol, a zygomycosisok ellen is hatásos posakonazol, illetve a sejtfal szintézisét gátló caspofungin, mikafungin és az anidulafungin [34, 35, 40]. Általánosan elmondható, hogy az antimikotikumok egyik támadáspontja az ergoszterol szintézisének gátlása, ami a gomba sejtmembránjának fontos összetevője. Másik lehetséges támadáspont maga a membrán, illetve a sejtfal direkt károsítása. A legfontosabb hatóanyagok szerint az antimikotikumokat öt osztályba sorolhatjuk. Ezek az azolok, poliének, echinocandinok, allylaminok, és a DNS szintézist gátló szerek [20, 23, 47]. 2.2.1 Azol típusú antifungális szerek Ide tartoznak a leggyakrabban és legrégebben használt (1960-as évek végétől) antifungális szerek, amelyek gátolják az ergoszterol bioszintézisét a citokróm P-450-dependens lanoszterol-14α-demetiláz (CYP51) enzim blokkolásával. Klinikai szempontból két nagyobb csoportba sorolhatóak: az imidazol származékok (pl. ketokonazol, mikonazol, clotrimazol) a szuperficiális mikózisok kezelésének jól bevált gyógyszerei. A másik csoportjuk a triazolok (pl.: FLU, itrakonazol, vorikonazol és a posakonazol) mind a felületi, mind az invazív fertőzések kezelésére jól alkalmazhatók [78, 99, 103, 114]. Az első generációs triazolok: Az 1990-es évek elején felfedezett flukonazolnak kitűnő aktivitása van a Candida fajok döntő része ellen, de a penészgombák ellen nem hatásos [114]. Széles körű felhasználása miatt a FLU iránt csökkent érzékenységet mutató izolátumok száma növekedett, főleg a nem albicans Candida fajok esetében (a C. krusei primer reziszenciával rendelkezik [112], a C. glabrata pedig másodlagosan rezisztens a FLU-ra [62]. Oralis és intravénás formában is elérhető. Szájüregi fertőzések kezelésére is alkalmazható mind kapszula mind szuszpenzió formában, melyek közül az utóbbi a költséghatékonyabb [103]. Bár in vitro hatékonysága hasonló a flukonazoléhoz, az itrakonazol a kevésbé kedvelt azolok közé tartozik [23, 78]. Az oldat farmakokinetikai tulajdonságai sokkal kedvezőbbek a FLU9
hoz képest, de rossz íze miatt a betegek kevésbé tolerálják [20]. Később intravénásan beadható formáját is kifejlesztették, ami az invazív mikózisok terápiáját biztonságosabbá tette. Az újabb azolszármazékok megjelenésével azonban jelentősége sokat csökkent, bár szájüregi gombás elváltozások kezelésére per os egyszerűen alkalmazható és elérhető szer [23]. Második generációs triazolok: Az ide tartozó vorikonazol az előzőekhez képest szélesebb hatásspektrummal rendelkezik (hatékony még pl. az Aspergillus, Scedosporium és a Fusarium fajok ellen is) [20, 23]. Kémiailag a FLU szerkezetének módosításával hozták létre. Hatékony alternatívát jelent a FLU rezisztens Candida fertőzések kezelésében, bár a hatásos szérumszint beállítása esetenként nehéz lehet, és keresztrezisztencia is előfordulhat [23, 99]. A posakonazol a legszélesebb hatásspektrumú azol a klinikai gyakorlatban, azonban csak per os formában érhető el [23, 78]. Kémiailag az itrakonazol származéka, és három éve használatos invazív gombás fertőzések kezelésére, egyéb terápiára nem reagáló esetekben. Penészgombák ellen is hatékony (pl. A. fumigatus), a sarjadzógombák ellen az idő-ölés görbék alapján lehet fungicid (pl. C. krusei, C. lusitaniae, C. inconspicua esetén), illetve fungisztatikus (pl. C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis és C. guilliermondii esetében) aktívitású is [130]. Teljes keresztrezisztenciát nem írtak le vele kapcsolatban [63, 78]. Mellékhatások: A triazolok relatíve biztonságosan alkalmazható gyógyszerek. Bár ismert májkárosító hatással rendelkeznek (a klinikai tünetek a transzamináz enzimszint emelkedésétől a klinikai hepatitisig terjedhetnek), csak a betegek kb. 5%-ánál kell ezért a terápiát felfüggeszteni. A legnagyobb problémát a rifampicinnel történő gyógyszerinterakció jelentheti, ezért együttes alkalmazásukat kerülni kell [47].
2.2.2 Poliének A poliének olyan gombaellenes gyógyszerek, amelyek hatásukat az ergoszterol tartalmú membránon fejtik ki. Ezek a gyógyszerek amfipatikusak, azaz hidrofóbok és hidrofilek is egyben. Beépülve a membránba a gyógyszer csatornát hoz létre, amelyen keresztül a kálium ionok elszivárognak, így lecsökken a proton gradiens a membránon belül. A csoportba tartozó amphotericin B (AMB)-t (csak intravénásan alkalmazható) és a nystatint (drazsé, szuszpenzió 10
formájában, lokális candidiasis esetén) szintén gyakran használják gombás fertőzések kezelésére [10, 20]. Az AMB fungicid hatása nagyban függ a teszelt Candida fajoktól, valamint az inkubációs időtől is. Bizonyos fajok esetén (C. albicans, C. dubliniensis, C. lusitaniae és C. inconspicua) az ölő hatás 2 mg/L koncentráción, már 1-6 óra múlva bekövetkezik, míg más fajok esetén (C. krusei, C. tropicalis, C. parapsilosis) 36-48 óra szükséges ugyanazon hatás eléréséhez [17, 79]. A klinikai kezelés sikerességének előrejelzésére a makrodilúciós és az Etest® módszerrel meghatározott 48 órás MIC érték alkalmas. A terápiás sikertelenséget AMB esetén Etest® alkalmazásával lehet diagnosztizálni a legjobban (MIC ≥ 0,38 mg/L) [26]. Mellékhatásként az AMB esetén a dózisfüggő nefrotoxicitást kell megemlíteni, mely rendszerint reverzibilis [10, 23]. Bár a gyógyszer már kb. 50 éve ismert, még mindig nem sikerült érzékenységi határértéket megállapítani, vagyis azt a MIC értéket meghatározni, amely értéktől kezdve az illető izolátum érzékeny, mérsékelten érzékeny, illetve rezisztens az AMB iránt [92]. 2.2.3 Allylaminok Széles körben használják őket köröm és bőrgombásodás kezelésére, és az idetartozó terbinafin (tabletta, krém, oldat) az egyik lehetséges alternatíva az onychomycosis kezelésére. Helyi alkalmazását általában a betegek jól tolerálják. Mellékhatásként gasztrointesztinalis problémák, ízérzészavar, emelkedett májenzimértékek emelhetőek ki [23]. 2.2.4 Echinocandinok Az echinocandinok félszintetikus lipoproteinek, melyeket gombák által termelt természetes anyagok kémiai módosításával hoztak létre [34]. A CAS-t a pneumocandin B0 nevű, a Glarea lozoyensis által szintetizált vegyület átalakításával készítették [35]. Kémiai szerkezetük szerint ciklikus hexapeptid molekulák, melyekhez a terápiás hatást biztosító lipid oldallánc csatlakozik. Klinikailag jelentős képviselőjük a CAS mellett még a mikafungin (MICA), az anidulafungin (ANI) és újabban az aminocandin. Az echinocandinok koncentrációfüggő, nem kompetitív antagonistái a β-1,3-D-glükán szintetáznak. Az enzim által szintetizált glükán, a gomba sejtfalkomponenseinek 30-60%-át teszi ki [34, 35, 140]. A gátló hatás pontos helye, és mechanizmusa még ugyan ma sem 11
tisztázott, de a gátlás következtében a sejtfal tulajdonságai megváltoznak, ozmotikus instabilitás lép fel, és lízis jön létre. Mivel a humán sejtek nem tartalmaznak glükánt, így direkt sejtkárosító hatás esetükben nem jön létre [72]. A CAS jól alkalmazható olyan Candida fajok ellen is, amelyek más antifungális szerekkel szemben csökkent érzékenységet mutatnak, illetve rezisztensek [56, 77, 112, 119]. Ilyenek például a C. krusei (azol rezisztens), a C. dubliniensis (FLU rezisztens) és a C. glabrata (AMB és triazol rezisztens) fajok [15, 62, 112]. Az irodalmi adatok szerint a MIC (definició szerint az adott antifungális szer azon legkisebb koncentrációja, amely már gátolja a mikroorganizmusok szemmel látható növekedését a gyógyszert nem tartalmazó kontrollhoz képest) 0,015-4 mg/L értékek között változik a különböző fajok függvényében az echinocandinok esetén [105]. A C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis és a C. krusei fajok alacsony MIC90 (az a MIC érték mely az izolátumok 90%nak a növekedését gátolja) értéket mutatnak (0,125 mg/L ≤ MIC90≤ 1 mg/L) [19, 30, 95, 106]. Más fajoknál, mint például a C. parapsilosis és a C. guilliermondii a MIC90 ≥ 2 mg/L-nek is adódhat [6, 87]. A többi echinocandinhoz hasonlóan a CAS hatástalan a Cryptococus neoformans ellen (az átlagos MIC érték 32 mg/L). Más sarjadzógombák esetén is megfigyelhető rezisztencia (Trichosporon MIC ≥ 16 mg/L, Rhodotorula MIC ≥ 8 mg/L) [72]. A fonalas gombák közül a CAS hatásos az A. fumigatus, A. flavus, A. niger és A. terreus fajok ellen (MIC ≤ 0,5 mg/L). Az AMB-vel, illetve vorikonazollal együtt adva szinergista hatást észleltek in vitro Aspergillus fajok esetében [72]. In vitro viszont hatástalannak bizonyul a Fusarium, és a Mucor fajok ellen (MIC > 50-100 mg/L) [72]. A csoportba tartozó szerek farmakokinetikai szempontból számos hasonló tulajdonsággal rendelkeznek. Ilyenek például a per os bevitel alacsony hatékonysága, magas fehérjekötődési képesség, és az alacsony gyógyszerkoncentráció a cerebrospinális folyadékban, az üvegtestben és a vizeletben [40, 41, 96, 137]. Ebből következik az a tény is, hogy az echinocandinok, illetve aktív metabolitjaik klinikai hatékonysága elhanyagolható meningitisz, endoftalmitisz és húgyuti fertőzések esetén. Az emberi szervezetben a CAS lineáris farmakokinetikát mutat széles dózishatárok között (5100 mg). Intravénás alkalmazásnál 70 mg CAS beadása után a csúcs plazmakoncentráció 12 mg/L-nek adódott, és 24 óra elteltével is 1-2 mg/L értékeket mutatott különböző szervek esetén [49, 72, 76].
12
A lebontásuk elsősorban a májon keresztül történik, függetlenül a citokróm P450 enzimtől a molekula hidrolízisével és N-acetilálásával [34, 35]. Emellett azonban gyógyszer-interakciók, különösen immunszupresszív szerek alkalmazásánál előfordulhatnak. A CAS esetében a májsejtekben történő degradáció lassú folyamat, és a gyógyszer bejutásáért felelős fehérje (OATP-1B1), jól ismert szubsztrátja a ciklosporinnak is. Együttes alkalmazás során a CAS koncentráció-idő görbe alatti területe (AUC) 35%-os növekedést mutatott. Ezek függvényében a terápiás dózis módosítására is szükség lehet [34]. Májkárosodás esetén a CAS alkalmazásánál az AUC ugyancsak szignifikánsan növekedett, míg MICA-nál csökkenést mutatott, ANI-nál pedig gyakorlatilag nem változott [13, 100]. Így elmondható, hogy csupán a CAS használatánál van szükség a fenntartó dózis csökkentésére (50 mg-ról 35 mg-ra) 70 mg kezdeti adag után, a másik két szer esetében ez nem indokolt. A degradációs termékek lassan, több napon keresztül az epével választódnak ki [99, 149]. Az echinocandinok krónikus veseelégtelenségben is biztonságosan alkalmazhatók, mivel eliminációjuk nem a vesén keresztül történik. A beadott dózis kis mennyisége (2%) választódik ki változatlan formában a vizeletbe 24 óra alatt 70 mg intravénás napi dózis mellett [142]. A
gyermekgyógyászatban
történő
felhasználásáról
még
kevés
információ
áll
rendelkezésünkre [32]. Az egyik tanulmányban invazív mikózisban szenvedő csecsemőket, illetve gyerekeket kezeltek 2 mg/kg/nap dózisban adagolt CAS-al. A vizsgálatban ugyanolyan plazma koncentrációt értek el, mint a kontroll csoportként használt felnőtt csoportban (50 mg/nap), bár alkalmazásuknál a klinikai mellékhatások is gyakrabban jelentkeztek (láz, hiperventiláció, hipertenzió) [91, 124]. Nem szükséges viszont a terápiás dózis módosítása időskorú betegeknél, bár egyes szerzők megjegyezték, hogy a plazma gyógyszerkoncentráció valamivel magasabb volt (28%-kal nagyobb AUC) mint a kontroll csoportban [35]. Az echinocandinok felezési ideje hosszú, így elegendő a naponta egyszeri alkalmazás [12]. Jelentős toxicitással nem rendelkeznek, a keresztreakciók esélye minimális, hepatitis kialakulása ritka. Mellékhatásként hisztamin felszabadulást indukálhatnak, így az infúzió helyén kiütések jelenhetnek meg. Ritkán láz, fejfájás is előfordulhat [34]. 2.2.5 DNS szintézist gátló szerek Az ide tartozó 5-fluorocitozin (5-FC) a citozin permeáz segítségével jut a sejtbe és a citozin deamináz segítségével deaminálódik 5-fluorouracillá (FU). Az 5-FC gombaspecifikus, mert 13
az emlősök sejtjei nem tartalmaznak citozin deaminázt. Az FU bomlásterméke ezután vagy tovább metabolizálódik és beépül a gombasejt RNS-ébe, vagy pedig egy másik lebontási útvonalon keresztül keletkezik olyan végtermék ami meggátolhatja a DNS bioszintézist [23]. Az 5-FC-vel szemben elég gyakori a szekunder rezisztencia, ezért önállóan már nem alkalmazzák. Az AMB-vel együtt adva az invazív mikózisok kombinációs kezelésében játszik szerepet. Csak a sarjadzógombák ellen hatásos, és csak per os formában érhető el [57]. 2.2.6 Candida fertőzések kezelésének általános alapelvei Az invazív mikózisok kezelése minden esetben hospitalizációt igényel és monoterápiában, vagy kombinációs terápiában alkalmazott AMB, echinocandin, illetve azol terápiát jelent [29, 33, 57, 60, 97]. A superficiális, és oralis Candida fertőzések kezelésénél a megfelelő terápia kiválasztásához elengedhetetlen a helyes diagnózis [125]. Az anamnézis felvétel és a betegvizsgálat során fontos felderíteni azokat a tényezőket, melyek az adott állapot kialakulásában szerepet játszhatnak. A lehetséges okok között szerepelhetnek helyi (pl.: kivehető fogpótlás) és szisztémás tényezők (vas, folsav, B12-vitaminhiány), diabetes, immunhiányos állapot és gyógyszerszedés (antibiotikum, szteroid) [81]. A szisztémás eltérések ellenőrzésével és kezelésével párhuzamosan történik a helyi kezelés, amelynek során számos lehetőség közül választhatunk [2]. Használhatunk lokálisan ható, illetve per os készítményeket [23, 125]. Mivel a fertőzések nagy részét a C. albicans okozza, elsődleges választánsként az azol származékok a megfelelőek. Ugyancsak hatásos a helyi nystatinos kezelés is [75]. Rekurrens Candida fertőzések esetén a FLU adás javasolt per os [23]. Ezekben az esetekben azonban szükséges lehet az adott faj antifungalis érzékenységének meghatározása. FLU rezisztencia esetén az echinocandin csoportba tartozó CAS, illetve a második generációs triazolok közül pl. a vorikonazol jöhet szóba [35, 81]. A fogászati kezelés szempontjából fontos továbbá az is, hogy ha a beteg kivehető fogpótlással rendelkezik, akkor a lokális kezelés idejére a fogsorviseléstől el kell tiltani (C. albicans rekolonizáció a protézis műanyag felszínéről), és a kezelés után új fogpótlást kell készíteni [10, 16, 23].
14
2.3 Az antifungális érzékenység meghatározása sarjadzó gombák esetében Az antifungális érzékenység meghatározásánál a referencia eljárás a standard dilúciós (hígításos) módszer [90]. A „standardizálásra” azért volt szükség, mert a különböző érzékenységi teszteknél, különböző laboratóriumokban ugyanazon faj esetében akár 104 nagyságrendű különbségek is előfordultak a kapott MIC értékek vonatkozásában [120]. A standard dilúciós módszert két nagyobb csoportra lehet osztani. Az egyik a standard makrodilúciós módszer, melynek lényege hogy 10 mL-es végtérfogattal dolgozunk (táptalaj+antifungális szer+gomba) a MIC érték meghatározása során. Hátránya hogy jóval anyagigényesebb a nála szélesebb körben használt mikrodilúciós módszernél. A mikrodilúciós módszer protokolját 2002-ben módosította a National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), és az M27-A2 jelzésű dokumentumában foglalta össze a változásokat [90]. A módosításokra azért volt szükség, mert a mikrodilúciós módszert főleg az azol típusú antifungális szerekre fejlesztették ki. Az utóbbi tíz évben kifejlesztett echinocandinok esetében is ezt a módszert használjuk. Az így felállított standardoknak köszönhetően a módszer jól reprodukálhatóvá vált. A legújabb változat 2008-ban vált hozzáférhetővé [28]. A mikrodilúciós módszer esetén az RPMI-1640 nevű folyékony tápközeget alkalmazzuk, amelynek pontos összetételét az M27-A2 tartalmazza (1. melléklet) [90]. A kezdő csíraszám általában 103 CFU/mL, és a vizsgálat kivitelezésénél a 96 üregű ELISA lemezt használjuk és általában 48 órás inkubációs idő elteltével olvassuk le a MIC értéket [90]. Az azol típusú antifungális szereknél részleges, míg az AMB esetében teljes gátlásnak kell megvalósulnia a MIC meghatározása esetén [92]. Echinocandinoknál Pfaller és munkatársai vizsgálata szerint a részleges gátlás elegendő (24 óra) a MIC értékének meghatározásánál [105]. Sajnos a legutóbbi vizsgálatok szerint a terápiás eredmények és a kapott MIC értékek között nincs egyértelmű összefüggés, mert az adott antifungalis szer iránt alacsony MIC értékkel rendelkező C. albicans törzsek esetén a terápiás sikertelenség magasabb volt, mint C. parapsilosis fertőzés esetén (ahol a MIC90 az 1-2 mg/L értéket is elérte) [61, 104, 113]. A standard mikrodilúciós módszernél alkalmazott tápközeg egyik lehetéges alternatívája az antibiotikum médium 3 (AM3) (2. melléklet) lehet, amely főleg AMB esetében kedvelt [92]. Hátránya viszont, hogy húskeverékből készül, így állandó összetétele nem garantált, és a különböző gyártóktól vásárolt AM3 esetén a MIC értékek is különbözőek lehetnek AMB esetében. A táptalaj választása az echinocandinok fungicid aktivitását is befolyásolhatja. AM3 alkalmazása esetén alacsonyabb MIC értékeket kapunk, illetve az ölő hatás is alacsonyabb koncentrációknál következik be, mint RPMI-1640 esetén [11, 98, 116].
15
A MIC értékének meghatározása során alkalmankét észlelhető az úgynevezett „trailing” hatás, amely redukált, de folyamatos növekedést jelent a MIC érték feletti koncentrációkon [14, 43]. Fleischhaker és munkatársai C. dubliniensis esetén mindhárom echinocandin vizsgálatával „trailing” növekedést tudtak kimutatni (ANI esetében 80%-os gyakoriságot észleltek) [43]. Jacobsen és munkatársai ezt viszont csak az EUCAST protokollal tudták kimutatni (NCCLSel nem), bár ebben az esetben a MICA és a CAS mutatott „trailing” növekedést C. dubliniensis-nél [56]. 2.4 Alternatív módszerek a minimális gátló koncentráció meghatározására A standard dilúciós módszer költség- és időigényes volta miatt rutin laboratóriumi diagnosztikában általában nem alkalmas a MIC meghatározására [68]. Alternatív lehetőségként számos gyártócég által kifejlesztett teszt áll rendelkezésünkre, amelyek közül a két legjobban bevált módszert ismertetem, röviden. A diffúziós és dilúciós módszerek kombinálása révén létrehozott Etest® is alkalmas a MIC érték meghatározására [37]. Tulajdonképpen ez egy egyszerű, felhasználóbarát, agardiffúzión alapuló MIC meghatározási módszer, gyógyszert tartalmazó papírcsík segítségével. A 24 vagy 48 órás inkubáció után a leoltott táptalajon egy ellipszis alakú gátlási zóna jön létre a meghatározott koncentrációgradiensű csík körül, és ahol az elliptikus gátlási zóna metszi a csíkot, ott van a keresett MIC érték [37, 68, 110]. Kolorimetriás MIC érték meghatározást kínál a Sensititre®YeastOne® (Trek Diagnostic Systems) antifungális panel, amely mikrodilúción alapszik. Az eredmények 24 órás inkubáció után olvashatóak le, és több szerző szerint is kitűnő korrelációt mutatnak a standard módszerrel [18, 21, 39, 108].
16
2.5 A minimális fungicid koncentráció meghatározása A minimális fungicid koncentráció (MFC) definíció szerint az antifungális szer azon legkisebb koncentrációja, amely a gomba 99.9%-át elpusztítja 24 óra alatt a kiindulási inokulumhoz képest [90]. Az MFC értékének meghatározása legelőször a polién típusú antifungális szerek esetén történt meg [17]. Ennek a paraméternek klinikai jelentősége sarjadzógombák esetén nem tisztázott, és úgy tűnik, hogy nem lehet olyan egyértelmű következtetéseket levonni, mint a baktériumok MBC értékeinek ismeretében (itt ugyanis ha az MBC alacsony, akkor például endokarditisz vagy bakteriémia esetén a gyógyulásnak sokkal nagyobb az esélye) [104]. Az újabb típusú antifungális szereknél, így az echinocandinoknál is elkezdődött az MFC értékek meghatározása, amelyek meghatározásában saját kutatócsoportunk is részt vett, és ezeknek az adatoknak a klinikai relevanciájának feldolgozása is folyamatban van [19, 41]. Az MFC a gyógyszer in vitro ölési képességét jellemzi. A korábban használt módszer azonban nincs standardizálva sem a különböző gyógyszerekre, sem a különböző Candida fajokra. Ennek oka abban keresendő, hogy a MFC érték meghatározását általában a MIC érték meghatározása előzi meg [117]. Az NCCLS M27-A2 dokumentuma szerint ilyenkor a kiindulási inokulum sejtszáma 0,5x103 vagy 2,5x103 CFU/mL lehet. Ha a szuszpenziókból 10 μL-t használunk a mintavétel során, akkor 101 CFU/mL csíraszámmal rendelkezünk csupán (amelyből már nem lehet 99,9 %-os telepszám csökkenést számítani). Így érthető, hogy még az egész volumen felhasználása mellett sem teljesíthető az MFC diagnosztikus kritériuma (≥ 99.9%-os csíraszám a kezdő inokulumhoz képest) [17, 117]. A probléma kiküszöbölésére Canton és munkatársai módosításokat javasoltak a MFC meghatározásánál AMB esetében [17]. A diagnosztikus kritérium teljesítése miatt nagyobb kezdő csíraszámot használtak (104 CFU/mL), és nagyobb mintavételi térfogatott (200 μL). Az antifungális „carryover” elkerülése végett a Sabouraud agarra történő leoltás után, a foltot hagyták megszáradni, majd óvatosan kaccsal „kihúzták” a telepeket a megszáradt foltról. Ezen vizsgálat alapján úgy találták, hogy a megnövelt kezdeti inokulumkoncentráció nem növelte szignifikáns mértékben a MIC értékeket, tehát ezekkel a módosításokkal lehetővé vált a fungicid hatás definíció szerinti meghatározása [17].
17
2.6 Az idő-ölés görbék: Egy adott szer fungicid hatásának jellemzésére az MFC értékének meghatározása mellett az úgynevezett idő-ölés („time-kill”) görbék is alkalmasak. Ennek a módszernek a segítségével jóval dinamikusabban írható le az antifungális szer és a kórokozó között kialakuló kölcsönhatás, és a klinikum számára is hasznosabb információkat nyújthat [25, 79]. A görbéket általában arra használjuk, hogy megállapítsuk egy adott szer fungicid vagy fungisztatikus hatását különböző kórokozók ellen, de vizsgálható továbbá még az antagonista és szinergista hatások jelenléte is [19, 117]. A vizsgálómódszer standardizálására Klepser és munkatársai tettek kísérletet, felhasználva az M27-A2 dokumentum által leírt kritériumokat (5. táblázat) [66, 117]. 5. táblázat: Javasolt kritériumok az idő-ölés görbék által történő antifungális érzékenység meghatározásához gombák esetén [66, 117].
Vizsgálómódszer Tápközeg Az inokulum csíraszáma Az inkubáció feltételei Hőmérséklet Rázatás A rázatás időtartalma Mintavételi időpontok Transzfer volumen A mintavétel előtti vortexelés A kioltáshoz használt táptalaj Az inkubáció feltételei (agar) Hőmérséklet Időtartam Mennyiségi meghatározás limitje Eredmények értékelése Fungicid Fungisztatikus Szinergista
Idő-ölés görbék által, a makrodilúciós (10mL) leveshígításos módszernek megfelelően RPMI-1640 folyékony tápközeg (pH 7.0) MOPS pufferrel 5x105 CFU/mL 35 ◦C Folyamatosan szükséges 24 óra 0, 2, 4, 8, 12 és 24 óra 4x30 µL Szükséges Burgonya-dextróz agar 35 ◦C 48 óra 50 CFU/mL A csíraszám ≥99.9%-os csökkenése a kiindulási inokulumhoz képest (CFU/mL), vagy ≥3-log10 redukció A csíraszám <99.9%-os csökkenése a kiindulási inokulumhoz képest (CFU/mL), vagy <3-log10 redukció A csíraszám csökkenése ≥2-log10 (CFU/mL) kombináció esetén, az önállóan alkalmazott szerhez képest
18
Mint azt már korábban említettük, ezen kritériumok mellet (103 CFU/mL) eleve lehetetlen a 99.9%-os fungicid hatás detektálása, illetve a mintavételi hibák és az antifungális „carryover” kiküszöbölése
[117].
Ezeket
a
hibákat a
kiindulási
inokulum koncentrációjának
megnövelésével (105 CFU/mL), illetve a mintavételi volumen megemelésével lehet minimalizálni (30 μL) [66, 117]. Bár a módszer az RPMI-1640 tápközeg használatát javasolja a vizsgálatokhoz, abban több szerző is egyetért, hogy a fungicid hatás nagymértékben függ a választott médium típusától is, így az echinocandinoknál is megfigyelhető ez az eltérés különböző tápközegek esetén (RPMI-1640/AM3) [11, 25, 89]. Klepser és munkatársai kísérleteik során úgy találták, hogy a „csövek rázatása” az idő-ölés kísérletek során nem feltétlenül szükséges az echinocandinok, a poliének és a triazolok esetében, de azt is megjegyezték, hogy a kontroll törzsek növekedése ezen esetekben gyorsabb volt, mint nélküle [117]. Így elmondható, hogy a módszer alkalmazása során a „csövek rázatása” csupán csak egy megfontolandó javaslat a szerző részéről, bár ezt az ajánlást munkacsoportunk minden általunk végzett vizsgálatnál rutinszerűen alkalmazta [117]. Ez a „standardizált” idő-ölés módszer jó reprodukálhatósággal rendelkezik (90-93%), de ennek ellenére még mindig maradtak megoldatlan kérdések [117]. Ilyen például az a tény, hogy a sejtfal-károsító hatással rendelkező antifungális szerek, így az echinocandinok is sokkal intenzívebb hatást fejtenek ki az aktív növekvő sejteken, mint a stacioner állapotban lévőkön [117]. Külön figyelmet érdemelhet az is, hogy az antifungális szerek stabilitása is változhat a kísérletek során, így Klepser és minkatársai egyes kísérleteik során 50%-os koncentráció csökkenést tudtak kimutatni AMB esetén a 24. órai mintavételkor [65]. Számos előnyük ellenére az idő-ölés görbék főként csak a sarjadzó gombák vizsgálatára alkalmasak, penészgombák vizsgálatával kapcsolatban még nagyon kevés adat áll rendelkezésünkre [117]. 2.7 A rezisztencia és a paradox növekedés A gombasejtfal integritása alapvető jelentőségű a sejt működése szempontjából. A sejtfal külső rétegét glükoproteinek, belső rétegét pedig szénhidrát polimerek alkotják (glükán, kitin, galactomannán), és ezek folyamatos és dinamikus átépülése biztosítja a határvonalat a külső környezettel szemben [34, 104, 140]. A glükán szintézisét végző glükán szintetáz egy olyan enzimkomplex, amelynek legalább két alegysége van [34]. Az Fks1 a katalitikus alegység, amely a sejtfal poliszaharid molekuláinak glikozidos kötését hozza létre. A másik az Fks2 alegység, amely 88%-ban megegyező
19
aminosav szekvenciát mutat az Fks1-el. Ezen alegységek, bár változó arányban minden gombafajnál megtalálhatók [34, 35, 40, 85]. S. cerevisiae-nél az Fks1 alegység transzkripciója calcineurin függő. A folyamatban fontos szerepet játszik még a Rho nevű GTP-kötő regulátor fehérje, amely szabályozza a glükán szintetáz aktivitását [46]. Ez a folyamat viszont nem független a protein kináz C-útvonaltól és befolyásolhatja a „mitogen-activated protein” kináz, és a „high osmolarity glicerol” válasz is [140]. Néhány fajnál azonban (C. glabrata) úgy tűnik, hogy az Fks2 alegység jelentősebb szerepet játszhat a glükán szintézisben, mint az Fks1 [30, 34, 140]. Az echinocandinok az Fks1 alegységen fejtik ki hatásukat, tehát ennek a helynek a mutációja különböző mértékű rezisztenciát eredményezhet [7, 8, 36, 42, 58, 71, 146]. C. parapsilosis és a C. guilliermondii esetén a MIC érték akár a 100-szorosa is lehet a C. albicans fajoknál tapasztalt alacsonyabb MIC értékeknek [34]. Magas MIC (> 2 mg/L) értékkel rendelkező C. albicans, C. glabrata, C. krusei és C. tropicalis klinikai izolátumokat és terápiás sikertelenséget tapasztalt több szerző [45, 52, 54, 102, 86, 126]. Egyes esetekben a glükán szintetáz enzim Fks1 alegységének az 1. és a 2. ún. „forró területein” („hot-spot” régiók) mutattak ki aminosav változást [8, 62, 101, 104]. C. krusei által kiváltott endoftalmitisz és orofaringeális candidiasis esetében in vitro is megpróbálták igazolni az Fks1 alegység mutációját [52]. A szerzők ugyan ki tudták mutatni mindhárom echinocandinnal szemben a csökkent érzékenységet, de nem tudták kimutatni az Fks1 alegység mutációját [52]. Hernandez és munkatársai egy esettanulmány keretén belül számoltak be a klinikai echinocandin rezisztenciáról [54]. C. albicans által kiváltott, AIDS–ben szenvedő betegek refrakter orofaciális gombás elváltozásának kezelésére CAS-t választottak, amely terápia hatásos volt, de amikor a gyógyszer adagolását felfüggesztették, a tünetek kiújultak [54]. A vizsgálatok során demonstrálni tudták a MIC értékek jelentős emelkedését (0,25 mg/L az első minta és > 64 mg/L az utolsó minta esetén) [54]. Egy másik esetben C. parapsilosis által kiváltott endokarditisz kezelésére kombinációs terápiaként alkalmaztak CAS-t és intravénás FLU-t (a kezdeti terápia AMB és 5-FC volt) [87]. A kezdei mintavétel során alacsony MIC értékkel rendelkező izolátumokat diagnosztizáltak CAS és ANI iránt (2 mg/L, 1 mg/L), viszont MICA esetén a MIC érték magasnak bizonyult (8 mg/L). Az alkalmazott terápiát később orális FLU-ra cserélték 6 hét után. Három hónap múlva a C. parapsilosis rezisztenciát mutatott a FLU iránt, és a CAS valamint a MICA MIC értékei is megemelkedtek (> 16 mg/L) [87]. Ezek az adatok felvetették a keresztrezisztencia kialakulásának lehetőségét az echinocandinok esetében is [87]. 20
A paradox növekedés első beszámolója Hall és munkatársai nevéhez fűződik (1988), akik a cilofungin (korai, de klinikai használatba nem került echinocandin) gátló hatását vizsgálták C. albicans és C. tropicalis törzsek esetén [53]. Hall és munkatársai in vitro összehasonlították az alacsony és magas koncentrációjú cilofungin Candida fajokkal szembeni gátló hatását. A magasabb koncentráció értékeken ugyanolyan telepszámot figyeltek meg, mint a kontroll minták esetében [53]. A paradox növekedés (PG) definició szerint azt jelenti, hogy a MIC érték felett még legalább két hígításban növekedésgátlás van, de a magasabb koncentrációkon szabad szemmel láthatóan is megjelenik a növekedés a táplemez üregeiben [43, 120, 136]. A paradox hatás kialakulása tehát az alkalmazott koncentráció függvényében négyfázisú folyamat: a MIC alatti értékeken növekedés, a MIC értéken gátlás, magasabb koncentráción a gátlás megszűnése (újbóli növekedés), majd végleges gátlás látható (1. ábra) [134, 144].
Százalékos növekedés (%)
120 100 80 60 40 20 0 1. Fázis
2. Fázis
3. Fázis
4. Fázis
Echinocandin koncentráció →
1. ábra: A paradox növekedés különböző fázisai Candida fajoknál in vitro [144].
Az echinocandinok közül a paradox növekedés legtöbbször a CAS-nál fordul elő: 91%-ban C. dubliniensis, 90%-ban C. parapspilosis, 60%-ban C. albicans, 40%-ban C. tropicalis és 10%-ban C. krusei fajoknál [22, 144]. MICA esetében ez a gyakoriság: 70%-os C. tropicalis, 63%-os C. dubliniensis és 60%-os C. krusei izolátumoknál. Paradox növekedést C. albicans és C. parapsilosis MICA esetén nem mutatott [43]. Az ANI okozta paradox hatás 40%-os előfordulási gyakoriságú C. albicans és 20%-os C. tropicalis esetén [22], míg C. dubliniensis izolátumoknál paradox jelenséget nem, de „trailing” növekedést tapasztaltak [43].
21
Az antifungális szerek alkalmazása a gombasejtekben kiválthatja a stressz válasz adaptációs útvonalak aktiválódását, amelyeknek egyik fontos regulátora a calcineurin enzim. Ezen folyamat során a Hsp90 hozzákapcsolódik a calcineurin katalitikus alegységéhez és aktiválja azt, ami az adott szer redukált hatásához, valamint PG-hez vezethet [31]. Hsp90 inhibítor alkalmazása során, valamint Hsp90 kódoló genom károsodása esetén ez a stressz válasz gátlódik, és a fungicid hatás fokozódhat [31, 59]. Úgy tűnik, hogy C. albicans esetén a Hsp90-nek meghatározó szerepe lehet a klinikai rezisztencia/tolerancia kialakulásában [128]. Stevens és munkacsoportja 12,5 mg/L CAS jelenlétében meghatározta a gombasejtfal ß-1,3D-glükán, ß-1,6-D-glükán és kitin mennyiségét PG-t mutató C. albicans izolátumokban [135]. Habár a ß-1,3-D-glükán és a ß-1,6-D-glükán mennyisége kevesebb volt, mint a kezeletlen sejtkultúrákban, addig a kitin mennyisége több mint a hatszorosára emelkedett a CAS kezelést követően [135]. Eredményüket más szerzők is igazolták, [141] illetve A. fumigatus esetén is megfigyelték ezt a jelenséget [44]. A biofilmbe ágyazott Candida fajok MIC meghatározása során a PG még gyakoribb volt (80%), mint planktonikus állapotban (40%) [82]. A szerzők úgy találták, hogy a C. tropicalis-nál a PG kevésbé jelentkezett, mint C. albicans esetén. A biofilmben a Candida fajok tehát szélesebb tartományban, és magasabb CAS koncentráción mutatnak PG-t, mint a planktonikus sejtek [55, 82, 127]. Fénymikroszkópos sejt-morfológiai elváltozások is láthatóak a PG során [82]. Ilyen a hifa és a pszeudohifa növekedés gátlása, az óriássejtek megjelenése, és a sejtek csomókba tapadása mind planktonikus, mind biofilm állapotban [82]. Ezek a jelenségek azonban 50%-os szérum jelenlétében eltűnnek (az echinocandinok nagy affinitással kötődnek a szérumfehérjékhez) [46]. Állatkísérletekben in vivo körülmények között is megfigyelték ezt a jelenséget [27, 147]. Wiederhold és munkatársai kísérleti nyulaknál mesterségesen invazív aspergillosist idéztek elő, és azt találták, hogy >3 mg/kg/nap dózisok esetén a túlélési ráta szignifikánsan lecsökkent. Rágcsálókkal végzett vizsgálatokban a megfelelően kiválasztott CAS dózisoknál igazolták a koncentrációfüggő antifungális aktivitást [147]. A kísérlet során előre meghatározott időpontokban intraperitoneálisan 0,25 mg/kg, 1 mg/kg és 4 mg/kg CAS-t adagoltak. PG-t észleltek a legnagyobb dózist kapott csoportnál [147]. Clemons és munkatársai C. albicans-al intravénásan megfertőzött egereket kezeltek különböző dózisú CAS-al (0,01-20 mg/kg). Vizsgálatuk során egy izolátum mutatott PG-t 20 mg/kg CAS dózis esetén [27].
22
Gumbo és munkatársai ugyanakkor nem találtak PG-t C. glabrata-val fertőzött egerek esetében intraperitoniálisan beadott MICA után (0-100 mg/kg), viszont vizsgálataik során csupán egy izolátummal dolgoztak [50]. Összegezve tehát a PG egy alternatív „menekülési útvonal” a sejtfal integritásának fenntartására [140]. A glükán szintetáz működésének gátlása adaptív válaszként kompenzatórikus kitin szint emelkedést eredményezhet [141]. A folyamatot a protein kináz C, calcineurin és a „high osmolarity glycerol” útvonalak szabályozhatják. Ez a folyamat lehet a felelős a C. albicans magas in vitro paradox növekedéséért [140, 141].
23
3. Célkitűzések:
1. A minimális gátló koncentráció értékek meghatározásával RPMI-1640 és antibiotikum medium 3 táptalajban szerettünk volna arra a kérdésre választ találni, hogy a C. albicans, C. krusei, C. dubliniensis és C. tropicalis fajok milyen gyakorisággal mutatnak paradox növekedést magas caspofungin koncentráció alkalmazása esetén.
2. A paradox növekedés pontosabb előfordulási gyakoriságát próbáltuk meghatározni RPMI-1640 és antibiotikum medium 3 táptalajban az idő-ölés görbék és a minimális fungicid koncentráció értékek összehasonlító vizsgálatával.
24
4. Anyagok és módszerek 4.1 A sarjadzó gombák eredete Vizsgálataink során a Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum Orvosi Mikrobiológiai Intézetében izolált Candida törzsek közül választottunk ki 45 izolátumot (15 db C. albicans, 15 db C. krusei, 15 db C. tropicalis). Minden faj esetén az American Type Culture Collection (ATCC®) teszttörzseit használtuk referenciaként (C. albicans ATCC 14053, C. krusei ATCC 6258, C. tropicalis ATCC 750). Hat db C. dubliniensis izolátumot korábbi munkájából Somogyvári Ferenc bocsátott a rendelkezésünkre, és a C. dubliniensis esetében referenciaként a CD36 jelzésű törzset használtuk [131]. A törzsek részben vérből kerültek izolálásra (C. albicans 8 db, C. krusei 4 db, C. tropicalis 5 db), illetve sebváladékból, testüregekekből, nyálkahártyákról és szájüregből történt a mintavételezésük. 4.2 A sarjadzó gombák azonosítása A törzsek azonosításának első lépése a csíratömlő képzés kimutatásán alapult, amely esetében a Sabouraud-agaron kinőtt tenyészeteket fötális borjúszérumban inkubáltuk 2 órán át. A teszt pozitív volt a C. albicans, míg negatív a C. tropicalis, és C. krusei fajok esetén. A törzsek előzetes elkülönítésére, illetve a tenyészetek tisztaságának ellenőrzésére CHROMagar Candida (Becton Dikinson) táptalajt használtunk. A további azonosításokban szerepelt még az API ID32 panel (BioMérieux), amely eredményeit 48 órás inkubáció után olvastuk le. A 6 db C. dubliniensis izolátum azonosítása molekuláris biológiai módszerek alapján már korábban megtörtént [131]. 4.3 A minimális gátló koncentráció meghatározása A MIC érték meghatározását a NCCLS M27-A2 dokukumentum ajánlásának megfelelően végeztük el. A korábban említettek szerint a standard 103 CFU/mL mellett emelt csíraszámmal (105 CFU/mL) is meghatároztuk a MIC értéket mind RPMI-1640 (Sigma), mind pedig AM3 (Fluka) tápközegben [17, 117]. A CAS (Merck Research Laboratories) szubsztanciát steril desztillált vízben (standard NCCLS módszernek megfelelően) oldottuk fel. A táplemez üregeiben a CAS koncentráció a C. tropicalis esetén 0,024-12,5 mg/L, a többi törzs esetében 0,015-8 mg/L volt. Az MFC meghatározásához is ugyanezen CAS táplemezeket használtuk, melyeket -20 oC-on tároltuk. A gombaszuszpenziók elkészítése során az előírásnak megfelelő 0,5 McFarland sürűségű oldatot
készítettünk
denzitométer
segítségével
(0,85%-os
fiziológiás
sóoldat 25
felhasználásával). Minden táplemezen volt sarjadzó gombát nem tartalmazó táptalaj kontroll (negatív kontroll), illetve egy gyógyszert nem tartalmazó gomba kontrol (növekedési kontroll). Minden vizsgálatot legalább kétszer végeztünk el. 4.4 A minimális fungicid koncentráció meghatározása A CAS iránti MFC meghatározása az összes izolátum esetében a mikrodilúciós lemezek 48 órán keresztül 35°C-on történő inkubációja után történt meg, Canton és munkatársai ajánlása alapján [17]. A módszert módosítva az inokulumok kezdő csíraszáma 105 CFU/mL volt RPMI-1640, illetve AM3 tápközegek esetén is [17]. C. albicans, C. krusei és a C. dubliniensis fajok esetében a 48 órás inkubációs idő után leolvasott MIC érték fölötti üregektől kezdve, a teljes tartalmat (200 µL) pipettával összeszuszpendáltuk, majd 2-2 Sabouraud-agarra oltottuk ki (100-100 µL). A kioltott cseppet hagytuk megszáradni, majd a gombasejteket steril kaccsal kihúztuk a táptalaj teljes felületén. A kinőtt telepek megszámolása 48 óra múlva történt meg, szintén 35 oC-on történő inkubáció után. A C. tropicalis esetében az MFC értéket 24 óra után is meghatároztuk 105 CFU/mL emelt csíraszám alkalmazásával. A C. dubliniensis és a C. tropicalis esetében a nemzetközi irodalmi adatok szerint az úgynevezett „trailing” növekedést (folyamatos növekedés a MIC feletti koncentrációkon) is megvizsgáltuk RPMI-1640 és AM3 tápfolyadékokban [43, 56]. 4.5 Az idő-ölés görbék meghatározása A vizsgálatok Klepser és munkatársai módszerén alapultak [66]. A kísérletek elkezdése előtt megvizsgáltuk, hogy a CAS különböző koncentrációinak (0,5-16x MIC) jelenléte hogyan befolyásolja a kezdő csíraszámot. Esetünkben 500 CFU/mL volt a kezdő csíraszám. A gombaszuszpenzió elkészítése után 4x30 µL-t rögtön kioltottunk Sabouraud-agarra majd a kinőtt telepeket 48 órás inkubáció után megszámoltuk. Antifungális „carryover”-t akkor észlelünk, ha a kinőtt gombatelepek száma több mint 25%-kal kisebb volt különböző gyógyszerkoncentrációk esetében a kontroll csövekéhez képest. A kezdő csíraszám minden esetben 105 CFU/mL volt, amelyet spektrofotométerrel állítottunk be és kvantitatív kioltással ellenőriztünk. A CAS koncentráció értékei C. tropicalis esetében 0,024-12,5 mg/L, a C. albicans, C. krusei és a C. dubliniensis fajok esetében 0,06-16 mg/L voltak.
26
Az elkészített gombaszuszpenziókat folyamatos rázatás mellett, sötétben 35 oC-on inkubáltuk, és a csövekből steril körülmények között előre meghatározott időpontokban 100 µl-t vettünk ki, és a kimért mintákból fiziológiás sóoldattal sorozathígítást (10-1, 10-2, 10-3, 10-4) készítettünk. Abban az esetben, ha a kitenyésztett csíraszám várhatóan kevesebb volt, mint 1000 CFU/mL (jelentősebb ölő hatás), akkor a szuszpenziókból direkt kioltást is alkalmaztunk, azaz hígitási sorozat készítése nélkül oltottunk ki Sabouraud-agarra [66]. A kioltási időpontok a C. tropicalis és C. dubliniensis esetében 0, 2, 4, 8, 12, 24 és 48 óra, a C. albicans és C. krusei esetében 0, 4, 8, 12, 24 és 48 óra voltak, melyeket a megfelelő tesztörzseken végzett előzetes mérések alapján határoztunk meg. A kioltás során a hígítási sorozatokból 4x30 µL mintákat vettünk, és Sabouraud-agar felületére cseppentettük azokat. A mintákat hagytuk szobahőmérsékleten megszáradni, majd 48 órán keresztül 35 oC-on inkubáltuk, majd a kinőtt telepeket megszámoltuk, és a kapott csíraszámból a hígításokat figyelembe véve meghatároztuk az élő gombasejtek számát. A C. tropicalis esetén még az is vizsgálatra került, hogy 1 mg/L AMB, 1 mg/L FLU és 1 mg/L 5-FC hozzáadása a nagy koncentrációjú CAS-t tartalmazó csövekhez (6-12,5 mg/L) hogyan befolyásolja a PG-t, illetve képes-e annak felfüggesztésére. Minden vizsgálatot legalább kétszer végeztünk el, majd a kapott eredményeket átlagoltuk. 4.6 Az eredmények értékelésének szempontjai Vizsgálataink során meghatározásra került mind a négy faj esetében a MIC érték 24 óra elteltével (részleges gátlás, MICPI, NCCLS M27-A2 ajánlása szerint). A MIC érték annál a gyógyszerkoncentrációnál volt, ahol a kontrollhoz képest szemmel látható turbiditáscsökkenés volt észlelhető [90]. A MIC érték meghatározása a C. albicans és a C. krusei fajok esetében 48 óra elteltével is megtörtént (teljes gátlás, MICTI) [66]. Ilyenkor a MIC értéket az első teljesen tiszta üregnél kaptuk meg. A fungicid aktivitást úgy definiáltuk, hogy a telepszámban bekövetkező csökkenés a kezdő csíraszámhoz képest legalább 99,9 %-os. Ezt a kritériumot használtuk mind az MFC tesztek, mind az idő-ölés görbék vizsgálatánál is [66,117]. A PG-t úgy definiáltuk, hogy a részleges gátlással meghatározott MIC érték után legalább két tiszta üregre van szükség a táplemezen, és utána megint növekedést kell tapasztalnunk a nagyobb koncentrációk esetében. Tehát van növekedés a legalacsonyabb, nincs növekedés a köztes koncentráción, de magasabb koncentráción a növekedés újból megjelenik [144].
27
A „trailing” hatás vizsgálatát (csökkent, de jól észlelhető növekedés a MIC értéket meghaladó koncentrációkon), a C. tropicalis és a C. dubliniensis fajok esetén végeztük el, mely során meghatározásra került az, hogy még hány üregben történt növekedés a MICPI-hez képest.
28
5. Eredmények 5.1 A minimális gátló koncentráció meghatározása során kapott eredmények A C. tropicalis esetében függetlenül az alkalmazott közegtől (RPMI-1640, AM3) normál (103 CFU/mL) és emelt (105 CFU/mL) kezdő csíraszám esetén a MICPI érték 0,024 mg/L-nek adódott. C. dubliniensis vizsgálatánál (7. táblázat) RPMI-1640 táptalaj alkalmazásánál a MICPI értékek 0,06-0,25 mg/L között változtak normál kezdő csíraszám esetében, kivéve a 4. számú izolátumot, amelynél ez az érték 8 mg/L-nek adódott. Nagyobb kezdő csíraszám esetén (105 CFU/ml) a MICPI érték egy-két hígítási fokot emelkedett (0,12-0,25 mg/L), de a 4. számú izolátumnál a MICPI érték nem változott (8 mg/L). AM3 alkalmazásakor függetlenül az alkalmazott csíraszámtól a MICPI érték egységesen 0,03 mg/L-nek adódott (6. táblázat). 6. táblázat: A minimális gátló koncentráció (MIC) és a minimális fungicid koncentráció (MFC) értékei C. dubliniensis klinikai izolátumok, és CD36 referencia törzs esetén caspofungin alkalmazása során. A minimális fungicid koncentrációt 48 órás inkubáció után határoztuk meg 105 CFU/mL kezdő csíraszám esetén.
RPMI-1640 MIC (mg/L)
Antibiotikum medium 3 MICa (mg/L)
a
Izolátumok
1 2 3 4 5 6 CD36
5
10³ (CFU/mL)
10 (CFU/mL)
0,12 0,25 0,12 8 0,12 0,25 0,06
0,25 0,25 0,25 8 0,12 0,25 0,12
MFCb (mg/L) >8 >8 >8 >8 >8 >8 >8
5
10³ (CFU/mL)
10 (CFU/mL)
0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03
0,03c 0,03c 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03
a
A MIC érték meghatározására 24 órás inkubáció után került sor.
b
A kiindulási inokulum 105 CFU/mL.
c
Paradox növekedés volt észlelhető.
MFCb (mg/L) 0,06c 0,12c 0,12c 0,06 0,06c 0,12c 0,06c
A C. albicans esetén a MIC értékeket 24 (MICPI, részleges gátlás) és 48 óra múlva is meghatároztuk (MICTI, teljes gátlás). A MICPI értékek leolvasás után 0,015-0,06 mg/L-nek adódtak RPMI-1640 táptalaj alkalmazásakor. AM3 használatakor a kapott értékek valamivel alacsonyabbak lettek (0,015-0,03 mg/L). Negyvennyolc óra múlva a MICTI 0,25-1 mg/L
29
között volt RPMI-1640 esetében. AM3-t alkalmazva a kapott értékek kisebbnek adódtak (0,015-0,06 mg/L). C. krusei esetén a 24 órás, részleges gátlási kritériummal leolvasott MIC értékek RPMI-1640 tápközeg alkalmazásánál 0,12-0,25 mg/L között változtak, míg AM3-ban egységesen 0,12 mg/L-nek adódott. A 48 órás leolvasást követően a MICTI RPMI-1640 és AM3 esetén 2 mg/Lnek, illetve 0,25 mg/L-nek adódott (7. táblázat). 7. táblázat: A minimális gátó koncentráció és a minimális fungicid koncentráció értékeinek összehasonlítása C. albicans és C. krusei esetében caspofungin alkalmazásánál. RPMI-1640 Az izolátumok számozása
MICPI (mg/L)
MICTI (mg/L)
Antibiotikum medium 3
MFC (mg/L)
MICPI (mg/L)
MICTI (mg/L)
MFC (mg/L)
C. albicans ATCC 14053
0,015
0,25
1
0,015
0,015
0,03
7111
0,03
1
1
0,015
0,06
0,03
10598
0.015
0,25
1
0,015
0,03
0,03
14057
0,06*
1*
0,5*
0,015*
0,03*
0,03*
21186
0,015
1
1
0,03
0,03
0,03
8812
0,015
0,5
1
0,015
0,015
0,03
C. krusei ATCC 6258
0,12
2
1
0,12*
0,25*
0,5
2894
0,25
2
2
0,12
0,25
0,25
4363
0,25
2
1*
0,12
0,25
0,25
5029
0,25
2
2
0,12
0,25
0,25
1. A részleges gátlás MIC értéke 24 óra után került leolvasásra. 2. A teljes gátlás MIC értéke 48 óra után került leolvasásra. 3. A minimális fungicid koncentráció 48 óra után került meghatározásra. *
Paradox növekedés volt megfigyelhető.
30
5.2 A paradox növekedés vizsgálata során kapott eredmények 5.2.1 Paradox növekedés vizsgálata a minimális gátló koncentráció értékeinek alapján C. albicans esetében a 14057-es számú izolátum mindkét tápközegben mutatta a PG-t (7. táblázat). A C. krusei vizsgálatánál csak a teszttörzs (ATCC 6258) mutatott PG-t, de csak az AM3 alkalmazása során (7. táblázat). A C. tropicalis vizsgálata során RPMI-1640 tápközeg alkalmazásánál két izolátumnál (4. és 15. izolátumok) tapasztaltunk PG-t 12,5 mg/L CAS koncentráción (103 CFU/mL kezdő csíraszám esetében). Emelt csíraszám alkalmazásakor a C. tropicalis izolátumok egységesen „trailing” növekedést mutattak, a legmagasabb koncentráció értékig (12,5 mg/L). A C. dubliniensis esetében RPMI-1640 tápközeg használatakor emelt csíraszámnál nem tapasztaltunk PG-t. AM3 alkalmazása során emelt csíraszám alkalmazásakor két izolátum esetén (1., 2.) 48 órás inkubáció után tapasztaltunk PG-t (6. táblázat). A „trailing” növekedés az AM3 táptalaj esetén egyáltalán nem volt tapasztalható, függetlenül a kezdő csíraszámtól és az inkubációs időtől. RPMI-1640 használatánál viszont az összes izolátumnál megjelent a „trailing” növekedés 48 órás inkubációt követően. 5.2.2 Paradox növekedés vizsgálata a minimális fungicid koncentráció értékeinek alapján A C. albicans és a C. krusei vizsgálata során RPMI-1640 táptalaj használatakor az MFC értékek 0,5-1 mg/L-nek, illetve 1-2 mg/L-nek adódtak, 48 órás inkubáció után. AM3 alkalmazásakor ezen értékek C. albicans esetében 0,03 mg/L-nek, C. krusei vizsgálatakor 0,25-0,5 mg/L-nek bizonyultak. Az MFC teszt során egy C. albicans izolátum (14057. számú), és egy C. krusei izolátun (4363. számú) mutattak PG-t RPMI-1640 alkalmazásánál (7. táblázat). A C. dubliniensis vizsgálatánál az MFC értékek RPMI-1640 táptalajban nagyobbak voltak, mint 8 mg/L minden izolátum esetében. AM3-t alkalmazva tápközegként, az összes MFC érték ≤ 0,12 mg/L-nek adódott, és a 4. izolátum kivételével az összes izolátum mutatta a PG-t (6. táblázat). A C. tropicalis esetében a kapott MFC értékeket RPMI-1640 táptalaj alkalmazásakor grafikus ábrán tüntettük fel. Összesen hat izolátum nőtt 24 óra múlva 6,25 mg/L CAS koncentrációnál, illeve 48 óra múlva ez a szám hétre változott. A hetes számú izolátum kivételével mind 24, mind pedig 48 óra múlva nőttek az izolátumok 12,5 mg/L CAS koncentráción. Tehát, a 16 izolátumból 15 mutatta a PG jelenséget (2. ábra).
31
AM3 tápközegben az MFC értékek ≤ 0,09 mg/L-nek adódtak, ami megfelelt a ≤ 4xMIC értéknek (csak alacsony koncentráción volt növekedés). A 6. izolátum PG-t mutatott (növekedés 6,25 és 12,5 mg/L-es CAS koncentrációnál). Tehát, AM3 tápközeg esetén a CAS ölési képessége fokozódott, és PG csupán egy esetben jelentkezett.
µg/ml 12,50 6,25 3,12
24 óra
1,56 0,78 0,39 0,19 0,09 0,04
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
µg/ml 12,50 6,25 3,12
48 óra
1,56 0,78 0,39 0,19 0,09 0,04
2. ábra: A C. tropicalis klinikai izolátumok eltérő növekedési viszonyai különböző caspofungin koncentrációk esetében (0,04-12,5 mg/L) a minimális fungicid koncentráció meghatározása során, 24 és 48 óra után RPMI-1640 médiumban.
5.3 Az idő-ölés görbék vizsgálatakor kapott eredmények C. tropicalis esetében a kapott eredmények megerősítették a 24, illetve a 48 órás leolvasás után MFC-vel kapott eredményeket. Alacsony CAS koncentráció esetén fungisztatikus hatást észleltünk, majd fungicid aktivitást tapasztaltunk a köztes koncentrációkon (≤ 3,12 mg/L), viszont magas CAS értékeknél (6,25-12,5 mg/L) újra csak fungisztatikus hatás volt megfigyelhető. A 12,5 mg/L koncentráción nőtt telepekkel újból elvégezve az idő-ölés görbéket az eredetivel megegyező görbéket kaptunk. Az idő-ölés görbék eredményei jól korreláltak az MFC teszt eredményeivel, kivéve a 4. izolátumot és az ATCC 750 teszttörzset RPMI-1640 tápközeg alkalmazásánál. A teszttörzs az MFC teszt során növekedést mutatott 32
minden vizsgált CAS koncentráción 24, illetve 48 óra múlva is. Az idő-ölés görbék vizsgálata során 256xMIC értéknél, 24 óra elteltével fungicid hatás jelentkezett, de 512xMIC tartományban újbóli növekedést tapasztaltunk. A reprezentatív idő-ölés görbét az 3. ábra mutatja. Hasonló, bár kisebb eltérés volt a 4. izolátum esetében is. FLU hozzáadása (1mg/L) a kiindulási inokulomokhoz, függetlenül az alkalmazott tápközegektől 24 óra múlva az összes klinikai izolátum esetében megszüntette a PG-t (az azonos koncentrációjú AMB, illetve 5-FC hatástalan volt). Ettől különböző eredményeket kaptunk az ATCC 750 teszttörzs esetén, amikor is 1 mg/L AMB hozzáadása szüntette meg a PG-t (ez esetben az FLU és az 5-FC hatástalan volt, azaz a PG továbbra is megfigyelhető volt) (4. ábra). C. dubliniensis vizsgálata során kétféle típusú idő-ölés görbét kaptunk a hat klinikai izolátum és a CD36 teszttörzs esetében. RPMI-1640-ben fungisztatikus hatást tapasztaltunk, de AM3ban ugyanazon törzsek tipikus PG-t mutattak. Azaz fungicid hatást kaptunk 0,12-4 mg/L (4x128xMIC értékek) CAS koncentrációnál 12 óra múlva, alatta viszont csak fungisztatikus aktivitás mutatkozott. A 8-16 mg/L (256-512x MIC) CAS értékeknél is csak a fungisztatikus hatást lehetett tapasztalni. A reprezentatív idő-ölés görbét az 5. és az 6. ábra mutatja. A 4. izolátum eltérően viselkedett a többiekhez képest. Ebben az esetben a MIC érték eleve 8 mg/L- nek adódott. Fungicid hatást kaptunk 8-16 mg/L (1x-2x MIC) CAS koncentrációknál, az ettől alacsonyabb koncentrációkon fungisztatikus hatást mértünk RPMI-1640 tápközeg esetében. AM3 alkalmazásánál a CAS fungicid volt minden alkalmazott koncentráción, 24 óra elteltével. PG ez esetben nem volt megfigyelhető (7. és 8. ábra).
33
1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 512xMIC 256xMIC 128xMIC 32xMIC 8xMIC 2xMIC 1xMIC Kontroll
CFU/mL
1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
2
4
8
12
24
48
idő(óra)
3. ábra: A C. tropicalis 15. izolátumának reprezentatív idő-ölés görbéje caspofungin egyedüli alkalmazásánál A minimális gátló koncentráció 0,024 mg/L. Minden időpont két egymástól független kísérlet átlagértékét mutatja.
1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 CAS FLU CAS+FLU AMB CAS+AMB 5-FC 5-FC+CAS Kontroll
CFU/mL
1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
4
8
12
24
48
idő(óra)
4. ábra: A C. tropicalis 4. izolátumának idő-ölés görbéje caspofungin (CAS) egyedüli alkalmazásánál, illetve CAS és flukonazol (FLU), CAS és amphotericin B (AMB), valamint CAS és 5-fluorocitozin (5FC) antifungális szerek kombinációjánál. Minden időpont két egymástól független kísérlet átlagértékét mutatja
34
1,00E+07
1,00E+06
16 mg/L
1,00E+05 CFU/mL
8 mg/L 4 mg/L 1,00E+04
2 mg/L 1 mg/L 0,06 mg/L
1,00E+03
Kontroll
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00 0
2
4
12
24
48
idő(óra)
5. ábra: Az 5. számú C. dubliniensis izolátum idő-ölés görbéje caspofungin esetén RPMI-1640 tápközeg alkalmazásánál. A vizsgált koncentrációkon a caspofungin csak fungisztatikus volt. A többi törzs esetén (beleértve a CD36 teszttörzset is) hasonló eredményeket kaptunk. Minden időpont két egymástól független kísérlet átlagértékét mutatja. 1,00E+07
1,00E+06
CFU/mL
1,00E+05 16 mg/L 8 mg/L
1,00E+04
4 mg/L 2 mg/L 1,00E+03
1 mg/L 0,06 mg/L Kontroll
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00 0
2
4
12
24
48
idő(óra)
6. ábra: Az 5. számú C. dubliniensis izolátum idő-ölés görbéje caspofungin esetén AM3 tápközeg alkalmazásánál. A caspofungin kezdetben fungicid aktivitást mutatott, amely 12 óra elteltével csak fungisztatikus volt. A többi vizsgált törzs esetén (beleértve a CD36 teszttörzset is) az eredmények hasonlónak bizonyultak. Minden időpont két egymástól független kísérlet átlagértékét mutatja.
35
1,00E+07
1,00E+06
CFU/mL
1,00E+05
16 mg/L 8 mg/L 4 mg/L 2 mg/L Kontroll
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00 0
2
4
12
24
48
idő(óra)
7. ábra: A 4. számú C. dubliniensis izolátum idő-ölésés görbéje caspofungin esetén RPMI-1640 tápközeg alkalmazásánál. Minden időpont két egymástól független kísérlet átlagértékét mutatja.
1,00E+07
1,00E+06
CFU/mL
1,00E+05
16 mg/L 8 mg/L 4 mg/L 2 mg/L Kontroll
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00 0
2
4
12
24
48
idő(óra)
8. ábra: A 4. számú C. dubliniensis izolátum idő-ölés görbéje caspofungin esetén AM3 tápközeg alkalmazásánál. 24 óra után a caspofungin minden koncentráción fungicid volt. Minden időpont két egymástól független kísérlet átlagértékét mutatja.
36
A C. albicans vizsgálatánál több különböző típusú ölési görbét kaptunk, a különböző tápoldatok használatánál. A referenciaként alkalmazott teszttörzs (ATCC 14053) PG-t mutatott mindkét alkalmazott médium esetében. Fungicid hatást tapasztaltunk már 0,12 mg/L CAS koncentrációnál, és ezen érték feletti tartományban mindkét vizsgált médiumban csak fungisztatikus
hatás
volt
megfigyelhető,
RPMI-1640
alkalmazásakor
1-16
mg/L
koncentrációk között, illetve 8-16 mg/L értéktartományban AM3 esetében (8. táblázat, 9. és 10. ábra). Hasonló helyzet volt megfigyelhető két klinikai izolátum esetében (7111. és 10598. számú izolátumok), RPMI-1640 táptalaj használatakor (fungisztatikus hatás) bármely tesztelt koncentráción 24 óra múlva. Negyvennyolc órás inkubációs idő után mindkét izolátum 16 mg/L-es CAS koncentráción elpusztult (fungicid hatás). Alacsonyabb koncentráción fungisztatikus hatást tapasztaltunk (8. táblázat, 11. ábra). AM3 alkalmazásakor a 7111. számú izolátum esetén már 12 óra múlva 0,12-8 mg/L koncentráció tartományban fungicid hatás volt látható, majd 24 óra elteltével 16 mg/L koncentráción fungicid hatás volt tapasztalható (a koncentráció emelésével az ölési mechanizmus lelassult). A 10598. számú izolátum vizsgálatakor az ölés lassabb volt, és 24 óra múlva PG-t tapasztaltunk 16 mg/L koncentrációnál, ennél alacsonyabb CAS értékeknél viszont fungicid hatás volt detektálható, majd 48 óra után ≥ 0.5 mg/L koncentráción fungicid hatást mutatott (8. táblázat, 12. ábra). A 8812. és 21186. izolátumok fungisztatikus hatást mutattak RPMI-1640 tápközegben 24 óra elteltével, majd tipikus PG volt megfigyelhető 48 óra múlva. A vizsgált koncentráció tartományokban 0,5-2 mg/L-nél fungicid hatást, 4-16 mg/L-nél és 0,12 mg/L CAS értékeknél fungisztatikus aktivitást tapasztaltunk (8. táblázat, 13. ábra). AM3 alkalmazásakor a 8812. számú izolátum 0,12-16 mg/L tartományban fungicid, 16 mg/Lnél fungisztatikus aktivitást mutatott 24 óra elteltével, majd 48 óra múlva már ≥ 0,12 mg/L CAS koncentrációnál teljes ölés volt megfigyelhető (fungicid hatás) (8. táblázat, 14. ábra). A 14057. számú izolátum minden alkalmazott CAS koncentrációnál fungisztatikus ölési görbét mutatott RPMI-1640 tápközegben. AM3 használata során tipikus PG görbét kaptunk. Ebben az esetben 24 óra elteltével 4-16 mg/L tartományban fungisztatikus hatást tapasztaltunk, ≤ 2 mg/L értéknél a hatás egyértelműen fungicid volt. 48 óra után az ölő aktivitás fokozódását tapasztaltuk, ≤ 8 mg/L értéknél fungicid, míg 16 mg/L esetén fungisztatikus hatást észleltünk (8. táblázat). A három C. krusei klinikai izolátum esetén ≥ 2 mg/L CAS értékeknél 24, illetve 48 óra múlva is fungicid aktivitást tapasztaltunk RPMI-1640 tápközegben. AM3 alkalmazásánál a CAS 37
ölési aktivitása fokozódott 0,12-0,5 mg/L tartományban fungicid volt 24 óra elteltével, majd 48 óra múlva a fungicid hatás már ≥ 0,12-0,25 mg/L CAS koncentrációkon jelentkezett. A reprezentatív idő-ölés görbéket a 15. és a 16. ábra mutatja. Az ATCC 6258 teszttörzs vizsgálatánál 24 óra múlva ≥ 0,5 mg/L CAS koncentrációnál fungicid aktivitást tapasztaltunk RPMI-1640 használatánál. Negyvennyolc óra elteltével a fungicid hatás ≥ 0,25 mg/L-nél jelentkezett. Hasonló értékeket kaptunk AM3 használata során is. A C. krusei vizsgálata során paradox növekedést egy esetben sem tapasztaltunk (8. táblázat).
38
8. táblázat: A tápoldat hatása a caspofungin ölési mechanizmusára a C. albicans and C. krusei izolátumok esetében.
Izolátumok
RPMI-1640
AM3
A caspofungin hatása az „idő-ölés”
A caspofungin hatása az „idő-ölés”
vizsgálat során
vizsgálat során
24 óra után
48 óra után
24 óra után
48 óra után
PGb mg/L-nél
PGb 8 mg/L-nél
PGb 8 mg/L-
kezdődik
kezdődik
nél kezdődik
fungicida
fungicida
fungicid a
16 mg/L-nél
≥ 0,12 mg/L
≥ 0,12mg/L
C. albicans
ATCC14053
7111
10598
fungisztatikus
fungisztatikus
fungisztatikus
8812
fungisztatikus
21186
fungisztatikus
fungicid
PGb
a
16 mg/L-nél
16 mg/L-nél
≥ 0,5 mg/L
kezdődik
PGb 4 mg/L-nél
fungicid a
fungicid a
kezdődik
≥ 0,12 mg/L
≥ 0,12mg/L
PGb 4 mg/L-nél
PGb 16 mg/L-nél
fungicid a
kezdődik
kezdődik
≥ 0,12mg/L
b
14057
fungicid a
PG 4 mg/L-nél
PGb 16 mg/L-
kezdődik
nél kezdődik
fungicid a
fungicid a
fungicid a
≥ 0,5 mg/L
≥ 0,25 mg/L
≥ 0,5mg/L
≥ 0,25mg/L
fungicid a
fungicid a
fungicid a
fungicid a
≥ 2 mg/L
≥ 2 mg/L
≥ 0,12mg/L
≥ 0,12mg/L
fungicid a
fungicid a
fungicid a
fungicid a
≥ 2 mg/L
≥ 2 mg/L
≥ 0,5 mg/L
≥ 0,25mg/L
fungicid a
fungicid a
fungicid a
fungicid a
≥ 2 mg/L
≥ 2 mg/L
≥ 0,12 mg/L
≥ 0,12 mg/L
fungisztatikus
fungisztatikus C. krusei
ATCC 6258 2894 4363 5029
fungicid
a
a
A legalacsonyabb koncentráció, amelynél a caspofungin fungicid volt.
b
A legalacsonyabb koncentráció, amelynél paradox növekedés volt megfigyelhető.
39
1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06
16 mgL 8 mg/L
1,00E+05
CFU/mL
4 mg/L 1,00E+04
1 mg/L 0,5 mg/L
1,00E+03
0,1 mg/L Kontroll
1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
4
8
12
24
48
idő (óra)
9. ábra: A C. albicans ATCC 14053 teszttörzs idő-ölés görbéje caspofungin alkalmazásánál RPMI1640 tápközegben.
1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06
16 mg/L 8 mg/L
1,00E+05
CFU/mL
4 mg/L 1,00E+04
1 mg/L 0,5 mg/L
1,00E+03
0,1 mg/L Kontroll
1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
4
8
12
24
48
idő (óra)
10. ábra: A C. albicans ATCC 14053 teszttörzs idő-ölés görbéje caspofungin alkalmazásánál AM3 tápközegben.
40
1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 16 mg/L 8 mg/L
1,00E+05
CFU/mL
4 mg/L 1,00E+04
1 mg/L 0,5 mg/L
1,00E+03
0,1 mg/L Kontroll
1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
4
8
12
24
48
idő (óra)
11. ábra: A 7111. számú C. albicans izolátum idő-ölés görbéje caspofungin alkalmazásánál RPMI1640 tápközegben.
1,00E+08
1,00E+07
1,00E+06 16 mg/L 8 mg/L
CFU/mL
1,00E+05
4 mg/L 1,00E+04
1 mg/L 0,5 mg/L
1,00E+03
0,1 mg/L Kontroll
1,00E+02 1,00E+01
1,00E+00 0
4
8
12
24
48
idő (óra)
12. ábra: A 7111.számú C. albicans izolátum idő-ölés görbéje caspofungin alkalmazásánál AM3 tápközegben.
41
1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 16 mg/L 8 mg/L
1,00E+05
CFU/mL
4 mg/L 1,00E+04
1 mg/L 0,5 mg/L
1,00E+03
0,1 mg/L Kontroll
1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
4
8
12
24
48
idő (óra)
13. ábra: A 8812.számú C. albicans izolátum idő-ölés görbéje caspofungin alkalmazásánál RPMI1640 tápközegben.
1,00E+07 1,00E+06
16 mg/L 8 mg/L
1,00E+05
CFU/mL
4 mg/L 1,00E+04
1 mg/L 0,5 mg/L
1,00E+03
0,1 mg/L Kontroll
1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
4
8
12
24
48
idő(óra)
14. ábra: A 8812. számú C. abicans izolátum idő-ölés görbéje caspofungin alkalmazásánál AM3 tápközegben.
42
1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06
16 mg/L 8 mg/L
1,00E+05
CFU/mL
4 mg/L 1,00E+04
1 mg/L 0,5 mg/L
1,00E+03
0,1 mg/L Kontroll
1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
4
8
12
24
48
idő (óra)
15. ábra: A 2894. számú C. krusei izolátum idő-ölés görbéje caspofungin alkalmazásánál RPMI1640 folyékony tápközegben.
1,00E+08
1,00E+07
1,00E+06
16 mg/L 8 mg/L
1,00E+05
CFU/mL
4 mg/L 1 mg/L
1,00E+04
0,5 mg/L 1,00E+03
0,1 mg/L Kontroll
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00 0
4
8
12
24
48
idő (óra)
16. ábra: a 2894. számú C. krusei izolátum idő-ölés görbéje caspofungin alkalmazásánál AM3 folyékony tápközegben.
43
6. Fontosabb megállapítások, következtetések Az echinocandinok klinikumba való bevezetése örvendetes volt az új évezred elején, hiszen az invazív gombafertőzések által okozott mortalitás mind a neutropéniás, mind pedig a nem-neutropéniás betegek esetén továbbra is magas volt, annak ellenére, hogy a FLU már több mint tíz éve széleskörben használatos volt a kezelésben [33, 78]. Bár az echinocandinok bizonyos Aspergillus fajok ellen is hatékonyak, szerepük döntően az invazív Candida fertőzésekre korlátozódik [34, 35]. Az echinocandinok a betegek többsége számára jól tolerálható antifungális szerek [13, 35, 119]. Legtöbb klinikai tapasztalat a CAS-al van, bár a preklinikai és klinikai tanulmányok száma napjainkban egyre növekszik a MICA-al és az ANI-al kapcsolatban is [13, 95]. Ismereteink bővítése erről az új antifungális csoportról mindenképpen szükséges, hiszen klinikumba való bevezetésük ellenére jelentősen nem csökkent a mortalitás az invazív candidasisban szenvedő betegek között [118]. Az echinocandinok esetén jelenleg három fő kérdés merül fel a kutatások, illetve a klinikai használat során, amelyek egymással szorosan összefüggnek: milyen érzékenységi határértéket válasszunk a rezisztens izolátumok felismerésére, mi lehet az optimális dozírozás, és lehet-e a PG-nek szerepe a kezelés során [105, 142, 145]. Az érzékenységi határérték („break-point” az angolszász irodalomban) jelenleg 2 mg/L. Ez az érték több ezer klinikai izolátum MIC meghatározása, a MIC értékek eloszlása, valamint a MIC érték és a klinikai siker valószínűsége alapján került meghatározásra [105]. Jól ismert, hogy a Candida fajok többsége alacsony MIC90 értékkel rendelkezik mindhárom echinocandin iránt, és az is, hogy a C. parapsilosis és a C. guilliermondii fajok MIC90 értéke relatíve magas (1-2 mg/L). Invazív candidasisban szenvedő betegek kezelésénél az alacsony MIC-el rendelkező izolátumok esetén az echinocandin terápia nem szignifikánsan jobb, mint a magasabb MIC értékkel rendelkező C. parapsilosis esetén [6, 139]. Ezzel ellentétben, számos olyan tanulmány áll már rendelkezésre, ahol echinocandin (főleg CAS) terápia során valódi klinikai sikertelenség dokumentálható, ahol a három echinocandinnak a MIC értéke 2-8 mg/L között változik [58, 67, 101, 146]. A magyarázat a következő lehet: Terápiás sikertelenség esetén a glükán szintetáz enzim Fks1 alegységének az 1. és a 2. ún. „forró területein” („hot-spot” régiók) jól kimutatható aminosav változás detektálható [8, 101, 104]. Echinocandin rezisztens C. albicans izolátumok esetén az Fks1 alegység 44
„első forró területein” (641-649 aminosav-régió) a 645-ös számú szerin cseréje fenilalaninra, tirozinra vagy prolinra, 8-100-szorosára növeli a MIC értékeket, illetve a glükán szintetáz enzim gátlásához legalább 50-szer több echinocandin kell. Az Fks1 alegység „második forró területein” (1345-1365 aminosav-szakasz) csak egy esetben figyeltek meg mutációt [7, 8, 102]. Hasonló mutációkat figyeltek meg C. glabrata, C. tropicalis és C. krusei esetén is [58, 62]. In vivo állatkísérletben ezekkel az izolátumokkal végzett vizsgálatok szintén megerősítették ezen izolátumok csökkent érzékenységét az echonocandinok iránt [54]. Ezzel ellentétben, a C. parapsilosis, a C. orthopsilosis, a C. metapsilosis és a C. guilliermondii fajok primer, csökkent érzékenységgel rendelkeznek az echinocandinok iránt [104]. A „psilosis” csoport esetén ennek az, az oka, hogy a glükán szintetáz enzimben a 660-adik aminosav prolin helyett alanin [140]. C. guilliermondii esetén a legfontosabbnak a 642-edik aminosav-csere (metionin-leucinra) tűnik [104]. In vivo állatkísérletek igazolták eddig a C. parapsilosis és a C. guilliermondii fajok csökkent érzékenységét az echinocandinok iránt [9]. Mindazonáltal, a C. parapsilosis, mint faj sokkal kisebb virulenciával rendelkezik, mint pl. a C. albicans, ez lehet a klinikumban hatásos echinocandin terápia kulcsa ezen faj ellen [4]. A csökkent virulenciát egérkísérletek jól mutatják [5], amelyben 107 CFU/egér C. albicans esetén 100 %-os halálozást, míg ugyanezen dózis C. parapsilosis esetén 100 %-os túlélést eredményezett a gombák intravénás adagolása során. Andes és munkatársainak több mint 80 C. parapsilosis izolátum in vivo tesztelése során csak 15 esetben sikerült olyan izolátumot találniuk, amely jól szaporodik egérben, azaz alkalmas lehet az in vivo farmakodinámiás kísérletekhez [4]. A rutin, klinikai anyagból izolált Candida fajok MIC90 értéke ≤ 0,25 mg/L, a C. parapsilosis-t és a C. guilliermondii fajokat leszámítva [105]. Ezért logikusnak tűnik, hogy a C. parapsilosis és a C. guilliermondii természetes, csökkent érzékenységét az echinocandinok iránt elkülönítsük a terápia során, a szekunder módon kialakult valódi echinocandin rezisztenciától [42, 85]. Ennek első lépése a pontos fajazonosítás. Azaz, ha tudjuk, hogy a kérdéses fajok a C. parapsilosis vagy a C. guilliermondii, akkor nem az echinocandinok lesznek az elsőként alkalmazott antifungális szerek [99]. Másodlagos rezisztencia leggyakrabban C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis és C. krusei esetén figyelhető meg, amelyeknek a MIC90 értéke eredendően alacsony [104, 105]. Ha a pontos fajazonosítás után a MIC érték ezen fajok iránt relatíve magas (≥ 0,5 mg/L), akkor valószínűleg szerzett rezisztenciáról van szó. Mind a standard mikrodilúciós 45
módszer, mind az EUCAST EDef 7.1, mind pedig az Etest® alkalmasnak tűnnek a rezisztens izolátumok szűrésére [107, 121]. Azonban, csak glükán szintetáz enzimben bekövetkezett aminosav-csere kimutatása bizonyítja a rezisztenciát, amely rezisztencia az összes echinocandinra vonatkozik [34, 104, 107]. Az optimális dozírozás a következő fontos kérdés. Echinocandintól függően jelenleg a napi 1-2 mg/kg a javasolt adag [34, 99]. Ezeknek a dózisoknak a hatékonyságát in vivo farmakokinetikai és farmakodinámiás adatok is alátámasztják [76, 123, 142]. Ezeket a dózisokat a betegek jól tolerálják, de sajnos a mortalitás jelentősen nem csökkent az 1990-es évekhez képest [118]. Ezért vetődött fel a dózisemelés mint lehetséges megoldás a klinikai siker növelése érdekében [12, 100]. MICA esetén bebizonyosodott, hogy a napi 8 mg/kg-os dózis, legalább hét napon keresztül alkalmazva is biztonságos, a mellékhatások nem fordultak szignifikánsan gyakrabban elő, mint a napi 100 mg-os kontroll-csoportban [129]. Pappas és munkatársai a napi 100 mg MICA és a napi 50 mg CAS hatékonyságát hasonlították össze a napi 150 mg-os dózisban adagolt MICA-al [100]. A három csoportban a betegek 5,9-11,5 %-a volt neutropéniás. Bár a klinikai siker mindhárom csoportban hasonló volt, fajra lebontva érdekes megfigyeléseket lehet tenni. A terápiás sikertelenség (statisztikailag nem szignifikánsan), gyakoribb volt azoknál az invazív candidazisban szenvedő betegeknél, akiknél a kórokozó a C. albicans, a C. glabrata vagy a C. tropicalis volt. Hasonló eredményeket lehetett látni Betts és munkatársainak a vizsgálataiban is [12], akik a napi standard, 50 mg-os CAS terápiával hasonlították össze a háromszoros, napi 150 mg-os CAS terápiát. A dózis emelése számszerűleg növelte a terápiás sikert C. albicans és C. parapsilosis-sal fertőzött betegek esetén, míg C. tropicalis és C. glabrata esetén több volt a terápiás sikertelenség. Mindkét említett vizsgálatban a szerzők hangsúlyozták, hogy ezek a különbségek statisztikailag nem szignifikánsak [12, 100]. Mindazonáltal a PG lehetősége felvetődik mind a két esetben, mint a terápiás sikertelenségek mögött álló egyik lehetséges tényező. A PG mint a bevezetőben is említettem egy in vitro észlelt jelenség, amelynek klinikai jelentősége nem tisztázott [43, 144]. A mikrodilúciós módszerrel végzett MIC meghatározás során, különösen nem gyakorlott leolvasók esetén zavarhatja a MIC leolvasás eredményét. Eddig a szerzők döntően a standard mikrodilúciós módszerrel (normál vagy emelt kezdő csíraszám) tanulmányozták a PG gyakoriságát a különböző Candida fajok esetén, amelyekben a folyékony tápközeg vagy RPMI-1640 vagy AM3 volt. Legújabban, Khlif és munkatársai caspofungin esetén Etest® alkalmazásával 46
voltak képesek kimutatni a PG-t [64]. Legfrissebb, saját eredményeink MICA esetén, szintén azt mutatják, hogy az Etest® alkalmas lehet a MIC meghatározás során a PG kimutatására (nem közölt, saját adatok). A mikrodilúciós érzékenységi vizsgálatok során a pontos MIC meghatározást a PG mellett a „trailing” hatás is zavarhatja. A „trailing” hatás főleg a FLU és posakonazol iránti MIC meghatározásnál szembetűnő C. albicans és C. tropicalis fajok esetén [1, 130]. A MIC meghatározást könnyítheti ilyenkor, hogy az üregek tartalmát gondosan összeszuszpendáljuk, így akár szabad szemmel, akár ELISA leolvasóval is pontosabb lehet a leolvasás [56]. A „trailing” definíció szerint jól látható növekedést jelent a MIC érték feletti üregekben, de idő-ölés görbék és in vivo eredmények is azt mutatják, hogy ezek az izolátumok reagálnak az antifungális terápiára [43]. A „trailing” jelenség az echinocandinok esetén is megfigyelhető [14, 64]. Sőt, kezdetben a MIC meghatározás során, a teljes gátlás volt a végpont, azaz a részleges gátláshoz képest a MIC érték, akár 4-5 hígítási fokkal is magasabb volt [116]. Később észlelték, hogy a részleges gátlás utáni növekedés az üregekben nem valódi növekedés, hanem elpusztult gombasejttörmelék. Így a későbbiekben a részleges gátlás lett a MIC leolvasás végpont-kritériuma [28, 116]. Stevens és munkatársai a paradox jelenség vizsgálatánál életképes gombasejteket észleltek a táplemez üregekben, jelezve, hogy a sejtek túlélnek nagy CAS koncentráció hatására [134]. Sőt, ha ezekből az üregekből végzi el újra a MIC meghatározását, a jelenség ismét észlelhető, miközben a MIC érték továbbra is nagyon alacsony [134]. Ezek az eredmények sarkalltak bennünket arra, hogy a jelenséget a CAS fungicidfungisztatikus hatása felől közelítsük meg négy, klinikai szempontból releváns Candida faj esetén. Azaz, a jelenség összefüggésben lehet az echinocandinok csökkent ölőképességével. Arra is próbáltunk válasz találni, hogy melyik módszer a legalkalmasabb a jelenség kimutatására. A négy vizsgált faj esetén alacsony (103 CFU/mL) kezdő-csíraszám alkalmazásakor csak kis százalékban tapasztaltunk PG-t a MIC meghatározás során, függetlenül a használt tesztközegtől. A kezdő csíraszám emelésének elméletileg fokoznia kellett volna azon gombasejtek számát, amelyek mutatják a PG-t, de RPMI-1640 közeg inkább a „trailing” jelenség gyakorisága nőtt. AM3 alkalmazása során a „trailing” visszaszorult így könnyebb volt a MIC leolvasása is [43, 56, 66].
47
C. tropicalis izolátumok esetén az alacsonyabb és a legnagyobb koncentrációkon előforduló csökkent ölést 24 és 48 óra után tápközegtől függetlenül is ki tudtuk mutatni, az MFC teszttel. Az ölés AM3 alkalmazásakor alacsonyabb koncentrációkon következett be, megerősítve korábbi szerzők megfigyelését, hogy AM3-ban az antifungális szerek gyorsabban ölik a gombákat, mint RPMI-1640-ben [11]. MFC teszt alkalmazásával a CAS RPMI-1640-ben, a C. dubliniensis izolátumok kivételével általában fungicidnak bizonyult. AM3 közegben az MFC teszt hasznosnak tűnik a PG kimutatására, ami különösen a C. dubliniensis izolátumoknál volt feltűnő (az MFC > 8 mg/L RPMI-1640-ben, míg AM3-ban tipikus PG 48 óra után, egy izolátumot kivéve). Az idő-ölés görbék döntően megerősítették, illetve pontosították az MFC kísérletekben kapott eredményeinket. Véleményünk szerint a PG pontos előfordulási gyakoriságát az egyes Candida fajok esetén az idő-ölés görbék segítségével kell megállapítani. Mindazonáltal, az ölés időbeli alakulásáról is felvilágosítást ad ez a módszer [116]. Rövidebb (24 óra) inkubációs idő után, fungisztatikus, esetleg PG hatás, míg hosszabb (48 óra) inkubációs idő után fungicid, esetleg PG hatás jelentkezett. Azaz, hosszabb inkubációs idő után a fungisztatikus hatás átmehet PG-be (alacsonyabb koncentrációkon az ölés nő), míg a PG átmehet teljes fungicid hatásba (az ölés magasabb koncentrációkon is létrejön). Ez a tendencia főleg C. albicans és a vele szoros rokonságban levő C. dubliniensis esetén volt jól látható. Mindkét faj esetén a jelenséget a tápközeg is jelentősen befolyásolta (AM3-ban a CAS gyorsabban ölt). Sőt, az egyik C. dubliniensis izolátum (4. számú) esetén AM3-ban nemcsak a MIC volt sok hígítási fokkal alacsonyabb, mint RPMI-1640-ben (8 mg/L) hanem közepes koncentrációkon fungicid hatás jelentkezett. A legmagasabb koncentrációkon a gyengébb ölést (PG) ugyanennél az izolátumnál továbbra is megfigyelhettük AM3-ban is. Sajnos, a jelenség molekuláris hátterét nem volt módunk tanulmányozni. Észre kell azonban venni, hogy in vitro ugyanolyan mértékű csökkent ölést (fungisztatikus hatást) kapunk alacsonyabb, mint nagyobb CAS koncentrációkon (a PG, tehát mint fungisztatikus hatás észlelhető). Csak in vitro oldalról megközelítve a jelenséget, feltehetjük a kérdést, hogy mi értelme van nagy CAS koncentrációt alkalmazni, ha sokkal kisebb koncentrációkkal ugyanazt a hatást (fungisztatikus) tudjuk elérni. Másik kérdés, hogy az általunk megfigyelt jelenségnek van-e in vivo terápiás következménye? Az echinocandinok koncentráció-függő aktivitást fejtenek ki mind in vitro, mind pedig in vivo [34, 35, 72]. In vitro fungicid hatást (PG-vel vagy anélkül) vagy fungisztatikus 48
hatást fejtenek ki. In vivo hatásuk attól függ, hogy a fertőzés helyén elég nagy lesz-e a gyógyszer-koncentráció. Rossz penetrációjuk miatt endoftalmitisz, meningitisz és húgyuti fertőzések kezelésére nem használhatjuk őket [40]. A többi belső szervbe azonban jól penetrálnak a vérből, ezért a belső szervekben a plazmához képest 3,1-20 szoros koncentrációkat lehet mérni [51]. Legutóbb, Andes és munkatársai határozták meg egérmodellükben mindhárom echinocandin 5, 20 és 80 mg/kg egyszeri dózisainak 24 óras echinocandin-szintjét a plazmában [4]. Figyelemre méltó, hogy akár egyszeri, 5 mg/kg-os caspofungin dózis is 18 mg/L csúcskoncentrációt eredményez. Figyelembe véve, hogy az echinocandinok esetén 97-99 %-os a szérumban a fehérjékhez kötődés, visszaszámolva, valószínűsíthető, hogy 0,1-0,2 mg/L-nél nem lesz nagyobb a szabad, azaz aktív echinocandin koncentráció. Így nem meglepő, hogy a kutatók egy részének az a véleménye, hogy a PG-nek in vivo nem valószínű, hogy szerepe lehet az esetleges terápiás sikertelenségekben [145]. Érdemes szétválasztani a szérumban mérhető egyszeri dózis után mérhető echinocandin szinteket a tartósan nagyobb dózisban adagolt szérumszintektől. Tartós adagoláskor elméletileg lehetőség van arra, hogy az echinocandinok fehérjéhez nem kötött frakciója a szérumban növekedjen, így elérjen egy olyan szintet, ahol a kórokozó ellen nem érvényesül az ölő hatás. Sajnos, tartósan nagyobb dózisban adagolt echinocandin terápia közben a szérum-echinocandin szintet még nem vizsgálták. Másik fontos tényező, hogy a gombák nemcsak a vérben fordulhatnak elő, hanem akármelyik belső szervünk invázióját előidézhetik, ahonnan kiírtásuk sokkal nehezebb lehet. Az echinocandinok a vérből a szövetekbe lépnek fel, majd onnan, mint depóból, térnek vissza a vérbe [34]. Ez a jellegzetes farmakokinetika teszi lehetővé a napi egyszeri echinocandin adagolást [40]. Nem tudjuk azonban (nincs irodalmi adat), hogy a szövetekben, különösen tartósan nagyobb napi dózisok esetén milyen magas az echinocandin-szint, milyen mértékű a fehérjéhez kötődés. Elméleti lehetőség van arra, hogy a szövetekben kialakuljon egy olyan szabad echinocandin koncentráció, ahol a kórokozó életben marad. Így véleményünk szerint, a PG jelentőségét nem lehet egyértelműen kizárni a terápiás sikertelenségek egyik okaként [12, 100]. Tartósan nagyobb dózisú echinocandin terápia nem növelte szignifikánsan az invazív candidasisban szenvedő betegek túlélését, miközben az eleve drága napi terápiás költség 2-3-szorosára nőtt [12, 100]. Ráadásul bizonyos fajok esetén nem lehet kizárni a PG szerepét a sikertelen terápiában. Ezért a tartósan nagyobb dózisú echinocandin terápiának úgy tűnik, hogy több a hátránya, mint az előnye. Következésképp a 49
mortalitás csökkentése érdekében talán helyesebb, ha az echinocandinokat normál dózisban adagoljuk, és esetleg AMB-vel vagy valamilyen triazollal kombináljuk. Az AMB, a FLU, az 5-FC és a posakonazol az echinocandinokkal nem mutatnak antagonista hatást, sőt saját eredményeink azt is mutatják, hogy ezek a gyógyszerek megszüntetik az in vitro észlelt PG-t (4. ábra). Így a jövőben a kombinációs terápiának lehet, hogy nagyobb szerepe lesz az antifungális terápiában [57, 83, 88]. A szájüregi Candida fertőzéseknél a C. albicans dominanciája mellett előtérbe kerültek egyéb, korábban ritkán izolált fajok (C. glabrata, C. dubliniensis, C. tropicalis, C. krusei) is, amelyek esetenként akár primer rezisztenciával is rendelkezhetnek a konvencionális (polién, azol) antifungális terápiával szemben (pl. C. glabrata) [93]. Így az echinocandinok, mint pl. a CAS, jó alternatívát jelenthetnek az orofaringeális candidiasis kezelése, valamint egyes azol rezisztens esetek során is [55, 61, 115].
50
7. Az eredmények összefoglalása Az echinocandinok csoportjába tartozó caspofungin mind az orofaringeális, mind a szisztémás Candida fertőzések kezelésére is alkalmazható új antifungális szer. Az elvégzett in vitro érzékenységi vizsgálatok során számos szerző tapasztalt magasabb echinocandin koncentráció tartományokban növekedést (Eagle-hatást), de a jelenség pontos előfordulási gyakorisága nem volt ismert. Kísérleteink során orofaringeális szempontból is kiemelkedő jelentőséggel bíró Candida fajok (C. albicans, C. dubliniensis, C. krusei és C. tropicalis) esetén vizsgáltuk a nagy dózisú caspofungin alkalmazásakor fellépő paradox növekedést. A jelenséget, minimális gátló koncentráció meghatározása mellett a caspofungin által kiváltott ölés segítségével is vizsgáltuk a minimális fungicid koncentráció és az idő-ölés görbék meghatározása által két különböző tápközegben (RPMI-1640, antibiotikum médium 3). Munkánk során a következő fontos eredményeket kaptuk: 1. Antibiotikum médium 3 közegben a minimális gátló koncentráció értékek alacsonyabbnak adódtak és a pontos leolvasást gyakran zavaró „trailing” jelenség sem jelentkezett az RPMI-1640-el összehasonlítva a négy vizsgált faj esetén. 2. A minimális fungicid koncentráció és az idő-ölés görbék segítségével C. tropicalis izolátumok vizsgálatakor egyértelműen bebizonyítottuk, hogy a paradox növekedés, mint csökkent ölési képesség figyelhető meg nagy caspofungin koncentráció jelenlétében, tápközegtől függetlenül. 3. C. albicans és C. dubliniensis izolátumok esetén RPMI-1640 közegben döntően fungisztatikus hatást észleltünk, de az ölő hatás antibiotikum médium 3 közegben 24 óra, de főleg 48 óra után fokozódott, ami paradox növekedés vagy fungicid hatás formájában jelentkezett. 4. Az idő-ölés görbék tápközegtől függetlenül egyértelműen bizonyították, hogy a paradox növekedés C. krusei esetén nem fordul elő. 5. A paradox növekedés tanulmányozására először alkalmaztuk a minimális fungicid koncentráció meghatározását és az idő-ölés görbék felvételét. Eredményeink döntően megerősítették, illetve pontosították korábbi szerzők vizsgálatainak eredményeit
a
paradox
növekedés
előfordulását
illetően.
Preklinikai
és
klinikai
vizsgálatoknak kell tisztázni a nagy caspofungin koncentráció jelenlétében in vitro kialakuló paradox növekedés in vivo jelentőségét az echinocandinokkal történő biztonságos terápia érdekében. 51
8. Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretném köszönetemet kifejezni elsősorban témavezetőmnek, Dr. Majoros László egyetemi docensnek, hogy érdeklődésemet felkeltette ezen kutatási téma iránt, valamint hogy hasznos tanácsaival, észrevételeivel és útmutatásával minden körülmények között segítségemre volt.
Köszönöm továbbá Dr. Kelentey Barna egyetemi docensnek, hogy segítőkészségével és javaslataival segítette munkámat.
Köszönettel tartozom a Gyógyszerészeti Tudományok Doktori Iskola korábbi, és jelenlegi vezetőinek, Prof. Dr. Gergely Lajos, és Prof. Dr. Tósaki Árpád egyetemi tanároknak, hogy lehetővé tették Doktori Iskolájukban dolgozatom elkészítését.
Köszönöm Dr. Kónya József egyetemi docensnek, hogy intézetében lehetővé tette számomra a kísérletes munkám elvégzését.
Köszönöm Prof. Dr. Hegedűs Csabának és Prof. Dr. Márton Ildikónak hogy lehetővé tették számomra, hogy a kutatásokra megfelelő mennyiségű időt szakíthattam az oktatási és a betegellátási munka mellett.
Hálával tartozom Pappné Falusi Erzsébetnek, Szilágyi Juditnak és Dr. Sóczó Georginának, hogy a laboratóriumi munkában adódó nehézségeken minden körülmények között átsegítettek.
Végül köszönöm feleségemnek Dr. Vargáné Dr. Csobán Katalinnak, és gyermekeimek Varga Dóra Líviának és Varga Lilla Violának a tőlük kapott sok szeretetet, türelmet és kitartó támogatást.
52
9. Mellékletek 1. számú melléklet: az RPMI-1640 tápközeg összetétele (glutaminnal és fenolvörössel, bikarbonát nélkül).
Alkotórész
g/L víz
Alkotórész
g/L víz
L-arginin (szabad bázisú)
0,200
Biotin
0,0002
L-aszpargin (vízmentes)
0,050
D-pantoténsav
0,00025
L-aszparaginsav
0,020
Kolin-klorid
0,003
L-cisztein
0,0652
Fólsav
0,001
L-glutaminsav
0,020
Myo-inozitol
0,035
L-glutamin
0,300
Nikotinamid
0,001
Glicin
0,010
Para-amino-benzoesav
0,001
L-hisztidin (szabad bázisú)
0,015
Piridoxin HCl
0,001
L-hidroxiprolin
0,020
Riboflavin
0,0002
L-izoleucin
0,050
Tiamin HCl
0,001
L-leucin
0,050
B12 vitamin
0,000005
L-lizin
0,040
Kalcium-nitrát xH2O
0,100
L-metionin
0,015
Kálium-klorid
0,400
L-fenil-alanin
0,015
Magnézium-szulfát (vízmentes)
L-prolin
0,020
Nátrium-klorid
6,000
L-szerin
0,030
Nátrium-foszfát, kétbázisú (vízmentes)
0,800
L-treonin
0,020
D-glükóz
2,000
L-triptofán
0,005
Glutation, redukált
0,001
Fenolvörös, Na
0,0053
L-tirozin L-valin
0,02883
0,04884
0,020
53
2. számú melléklet: Az antibiotikum médium 3 tápközeg összetétele. Alkotórész
g/L víz
Zselatin
5,0
Marhahús kivonat
1,5
Élesztő kivonat
1,5
Dextróz
1,0
Nátrium-klorid
3.5
Kálium-foszfát (dibázikus)
3,68
Kálium-foszfát (monobázikus)
1,32
54
10. Irodalomjegyzék 1. Agrawal D., Patterson T. F., Rinaldi M. G., Revankar S. G. 2007. Trailing endpoint phenotype of Candida spp. In antifungal susceptibility testing to fluconazole is eliminated by altering incubation temperature. J. Med. Microbiol. 56(7): 1003-1004. 2. Akpan A., Morgan R. 2002. Oral candidiasis. Postgrad. Med. J. 78:455-459. 3. Alberth M., Majoros L., Kovalecz G., Borbás E., Szegedi I., Marton I., Kiss C. 2006. Significance of oral Candida infections in children with cancer. Pathol. Oncol. Res. 12: 237-41. 4. Andes D., Diekema D. J., Pfaller M. A., Bohrmuller J., Marchillo K., Lepak A. 2010. In vivo comparison of the pharmacodynamic targets for echinocandin drugs against Candida species. Antimicrob. Agents Chemother. 54(6): 24972506. 5. Arendrup M., Horn T., Frimodt-Moller N. 2002. In vivo pathogenicity of eight medically relevant Candida species in an animal model. Infection 30: 286291. 6. Asbeck E., Clemons K. V., Martinez M., Tong A., Stevens D. A. 2008. Significant differences in drug susceptibility among species in the Candida parapsilosis group. Diag. Microbiol. Infect. Dis. 62: 106-109. 7. Baixench M. T., Aoun N., Desnos-Ollivier M., Garcia-Hermoso D., Bretagne S., Ramires S. 2007. Acquired resistance to echinocandins in Candida albicans: case report and review. J. Antimicrob. Chemother. 59(6): 1076-1083. 8. Balashov S. V., Park S., Perlin D. S. 2006. Assessing resistance the echinocandin antifungal drug caspofungin in Candida albicans by profiling mutations in FKS1. Antimicrob. Agents Chemother. 50(6): 2058-2063. 9. Barchiesi F., Spreghini E., Tomassetti S., Giannini D., Scalise G. 2007. Caspofungin in conbination with amphotericin B against Candida parapsilosis. Antimicrob. Agents Chemother. 51(3): 941-945. 10. Barkvoll P., Attramadal A. A. 1989. Effect of nystatin and chlorhexidine digluconate on Candida albicans. Oral. Surg. Oral. Med. Oral. Pathol. 67:279281. 55
11. Bartizal, C., Odds F. C. 2003. Influences of methodological variables on susceptibility testing of caspofungin against Candida species and Aspergillus fumigatus. Antimicrob. Agents Chemother. 47: 2100-2107. 12. Betts R. F., Nucci M., Talwar D., Gareca M., Queiroz-Telles F., Bedimo R. J., Herbrecht R., Ruiz-Palacious G., Young J. H., Baddley J. W., Strohmaier K. M, Tucker K. A., Taylor A. F., Kartsonis N. A. 2009. A multicenter, double-blind trial of a high-dose caspofungin treatment regimen verus a standard caspofungin treatment regimen for adult patients with invasive candidiasis. Clin. Infect. Dis. 48:1676-1684. 13. Bormann A. M., Morrison V. A. 2009. Review of the pharmacology and clinical studies of micafungin. Drug Des. Devel. and Ther. 3: 295-302. 14. Braga-Silva L. A., Mesquita D. G. A., Ribeiro M. D., Carvalho S. M. F., Fracalanzza S. E. L., Santos A. L. S. 2009. Trailing end-point phenotype antibiotic-sensitive strains of Candida albicans produce different amounts of aspartyl peptidases. Braz. J. Med. Biol. Res. 42(8): 765-770. 15. Brzankalski G. E., Najvar L. K., Wiederhold N. P., Bocanegra R., Fothergill A. W., Bocanegra R., Fothergill A. W., Rinaldi M. G., Patterson T. F., Graybill J. R. 2008. Evaluation of aminocandin and caspofungin against Candida glabrata including isolates with reduced caspofungin susceptibility. J. Antimicrob. Chemother. 62: 1094-1100. 16. Cannon R. D., Holmes A. R., Mason A. B., Monk B. C. 1995. Oral Candida: clearance, colonization, or Candidiasis? J. Dent. Res. 74:1152-1161. 17. Canton E. , Peman J., Viudes A., Quindós G., Gobernado M., Espinel-Ingroff A. 2003. Minimum fungicidal concentrations of amphotericin B for bloodstream Candida species. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 45:203-206. 18. Canton E., Peman J., Gobernado M., Alvarez E., Baquero F., Cisterna R., Gil J., Martin-Mazuelos E., Rubio C., Sanchez-Sousa A., Serrano C. 2005. Sensititre YeastOne® caspofungin susceptibility testing of Candida clinical isolates: correlation with results of NCCLS M27-A2 multicenter study. Antimicrob. Agents Chemother. 49(4):1604-1607. 19. Canton E., Peman J., Valentin A., Espinel-Ingroff A., Gobernado M. 2009. In vitro activites of echinocandins against Candida krusei determined by three 56
methods: MIC and minimal fungicidal concentracion measurements and timekill studies. Antimicrob. Agents Chemother. 53(7): 3108-3111. 20. Carrillo-Munoz A. J., Giusiano G., Ezkurra P. A., Quindos G. 2006. Antifungal agents: Mode of action in yeast cells. Rev. Esp. Quimioterap. 19(2): 130-139. 21. Castro C., Serrano M. C., Valverde A., Pemán J., Almeida C., Martín-Mazuelos E. 2008. Comparison of the Sensititre YeastOne® colorimetric antifungal panel with the modified clinical and laboratory standarts institute broth microdilution (M38-A) method for antifungal susceptibility testing of dermatophytes. 54:427430. 22. Chamilos G., Lewis R. E., Albert N., Kontoyiannis D. P. 2007. Paradoxical effect of echinocandins across Candida species in vitro: evidence for echinocandin-specific and Candida species-related differences. Antimicrob. Agents Chemother. 51: 2257-2259. 23. Chen S. C., Sorell T. C. 2007. Antifungal agents. Med. J. Aust. 187:404-409. 24. Chunchanur S. K., Nadgir S. D., Halesh L. H., Patil B. S., Kausar Y., Chandrasekhar M. R. 2009. Detection and antifungal susceptibility terting of oral Candida dubliniensis from human immunodeficiency virus-infected patients. Indian J. Pathol. Microb. 52(4): 501-504. 25. Clancy C. J., Huang H., Cheng S., Derendorf H., Nguyen M. H. 2006. Characterizing the effects of caspofungin on Candida albicans, Candida parapsilosis, and Candida glablata isolates by simultaneous time-kill and postantifungal-effect experiments. Antimicrob. Agents. Chemother. 50: 25692572. 26. Clancy C. J., Nguyen M. H. 1999. Correlation between in vitro susceptibility determined by E test and response to therapy with amphotericin B: results from a multicenter prospective study of candidemia. Antimicrob. Agents Chemother. 43(5): 1289-1290. 27. Clemons K.V., Espiritu M., Parmar R., Stevens D. A. 2006. Assessment of paradoxical effect of caspofungin in therapy of candidiasis. Antimicrob. Agents Chemother. 50:1293-1297.
57
28. Clinical Laboratory Standards Institute. 2008. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard CLSI document M27-A3. Clinical Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. 29. Cornely O. A., Lasso M., Betts R., Klimko N., Vazquez J., Dobb G., Velez J., Williams-Diaz A., Lipka J., Taylor A., Sable C., Kartsonis N. 2007. Caspofungin for the treatment of less common forms of invasive candidiasis. J. Antimicrob. Chemother. 60: 363-369. 30. Cota J., Carden M., Graybill J. R., Najvar L. K., Burgess D. S., Wiederhold N. H. 2006. In vitro pharmacodynamics of anidulafungin and caspofungin against Candida glablata isolates, including strains with decreased caspofungin susceptibility. Antimicrob. Agents Chemother. 50(11): 3926-3928. 31. Cowen L. E. 2009. Hsp90 orchestraes stress response signaling govering fungal drug resistance. PLoS Pathog. 5(8):e1000471. doi:10.1371/journal.ppat. 1000471. 32. Das S., Shivaprakash M. R., Chakrabarti A. 2009. New antifungal agents in pediatric practice. Indian Pediatr. 46: 225-231. 33. De Rosa F. G., Garazzino S., Pasero D., Di Perri G., Ranieri V. M. 2009. Invasive candidiasis and candidemia: new guidelines. Minerva Anestesiol. 75: 453-458. 34. Denning DW. Echinocandin antifungal drugs. 2003. Lancet 362(9390): 11421151. 35. Deresinski S. C., Stevens D. A. 2003. Caspofungin. Clin. Infect. Dis. 36: 14451457. 36. Desnos-Ollivier M., Bretagne S., Raoux D., Hoinard D., Dromer F., Dannaoui E. 2008. Mutations in the fks1 gene in Candida albicans, C. tropicalis, and C. krusei correlate with elevated caspofungin MICs uncovered in AM3 medium using the method of the European Committee on antibiotic susceptibility testing. Antimicrob. Agents Chemother. 52(9): 3092-3098. 37. Desnos-Ollivier M., Dromer F., Dannaoui E. 2008. Detection of caspofungin resistance in Candida spp. by Etest. J. Clin. Microbiol. 46(7): 2389-2392. 38. Ellepola A. N. B., Samaranayake L. P. 2000. Oral candidal infections and antimycotics. Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 11(2):172-178. 58
39. Eraso E., Ruesga M., Villar-Vidal M., Carrillo-Munoz A. J., Espinel-Ingroff A., Quindos G. 2008. Comparative evaluation of ATB Fungus 2 and Sensititre YeastOne panels for testing in vitro Candida antifungal susceptibility. Rev. Iberoam. Micol. 25:3-6. 40. Eschenauer G., DePestel D. D., Carver P. L. 2007. Comparison of echinocandin antifungals. Ther. Clin. Risk Manag. 3(1): 71-97. 41. Espinel-Ingroff A. 2003. In vitro antifungal activites of anidulafungin and micafungin, licensed agents and the investigational triasole posaconazole as determined by NCCLS methods for 12,052 fungal isolates: review of the literature. Rev. Iberoam. Micol. 20:121-136. 42. Espinel-Ingroff A. 2008. Mechanism of resistance to antifungal agents: yeast and filamentous fungi. Rev. Iberroam. Micol. 25: 101-106. 43. Fleischhacker M., Radacke C., Schulz B., Ruhnke M. 2008. Paradoxical growth effects of the echinocandins caspofungin and micafungin, but not of anidulafungin, on clinical isolates of Candida albicans and C. dubliniensis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 27(2): 127-131. 44. Fortwendel J. R., Juvadi P. R., Perfect B. Z., Rogg L. E., Perfect J. R., Steinbach W. J. 2010. Transcriptional regulation of chitin synthases by calcineurin controls paradoxical growth of Aspergillus fumigatus in response to caspofungin. Antimicrob. Agents Chemother. 54(4):1555-1563. 45. Garcia-Effron G., Kontoyiannis D. P., Lewis R. E., Perlin D. S. 2008. Caspofungin-resistant
Candida
tropicalis
strains
causing
breakthrough
fungemia in patients at high risk for hematologic malignancies. Antimicrob. Agents Chemother. 52(11): 4181-4183. 46. Garcia-Effron G., Park S., Perlin D. S. 2009. Correlating echinocandin MIC and kinetic inhibition of fks1 mutant glucan synthases for Candida albicans: implications for interpretive breakpoints. Antimicrob. Agents Chemother. 53(1): 112-122. 47. Georgopapadakou N. H, Walsh T. J. 1996. Antifungal agents: chemotherapeutic targets and immunologic strategies. Antimicrob. Agents Chemother. 40: 279291.
59
48. Gilfillan G. D., Sullivan D. J., Haynes K., Parkinson T., Coleman D. C., Gow A. R. 1998. Candida dubliniensis: phylogeny and putative virulence factors. Microbiology. 144: 829-838. 49. Gumbo T. 2007. Impact of pharmacodynamics and pharmacokinetics on echinocandin dosing strategies. Curr. Opin. Infect. Dis. 20: 587-591. 50. Gumbo T., Drusano G. L., Liu W., Kulawy R. W., Fregeau C., Hsu V., Louie A. 2007. Once-weekly micafungin therapy is as effective as daily therapy for disseminated candidiasis in mice with persistent neutropenia. Antimicrob. Agents Chemother. 51(3): 968-974. 51. Hajdu R., Thompson R., Sundelof J. G., Pelak B. A., Bouffard F. A., Dropinski J. F., Kropp H. 1997. Preliminary animal pharmacokinetics of the parenteral antifungal agent MK-0991 (L-743,872). Antimicrob. Agents Chemother. 41(11): 2339-2344. 52. Hakki M., Staab J. F., Marr K. A. 2006. Emergence of a Candida krusei with reduced susceptibility to caspofungin during therapy. Antimicrob. Agents Chemother. 50(7): 2522-2524. 53. Hall G. S., Myles C., Pratt K. J., Washington J. A. 1988. Cilofungin (LY121019), an antifungal agent with specific activity against Candida albicans and Candida tropicalis. Antimicrob. Agents Chemother. 32(9): 13311335. 54. Hernandez S., Lopez-Ribot J. L., Najvar L. K., McCarthy D. I., Bocanegra R., Graybill J. R. 2004. Caspofungin resistance in Candida albicans: correlating clinical outcome with laboratory susceptibility testing of three isogenic isolates serially obtained from a patient with progressive Candida esophagitis. Antimicrob. Agents Chemother. 48(4): 1382-1383. 55. Jabra-Rizk M. A., Falkler W. A., Meiller T. F. 2004. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10(1): 14-19. 56. Jacobsen M. D., Whyte J. A., Odds F. C. 2007. C. albicans and C. dubliniensis respond differently to echinocandin antifungal agents in vitro. Antimicrob. Agents Chemother. 51(5): 1882-1884. 57. Johnson M. D., MacDougall C., Ostrosky-Zeichner L. 2004. Combination antifungal therapy. Antimicrob. Agents Chemother. 48: 693-715. 60
58. Kahn J. N., Garcia-Effron G., Hsu M., Park S., Marr K. A., Perlin D. S. 2007. Acquired echinocandin resistance in a Candida krusei isolate due to modification of glucan synthase. Antimicrob. Agents Chemother. 51(5): 18761878. 59. Kaneko Y., Ohno H., Imamura Y., Kohno S. Miyazaki Y. 2009. The effects of an Hsp90 inhibitor on the paradoxical effect. J. Infect. Dis. 62: 392-393. 60. Kartsonis N. A., Saah A., Lipka J., Taylor A., Sable C. A. 2004. Second-line therapy with caspofungin for mucosal or invasive candidiasis: results from the caspofungin compassionate-use study. J. Antimicrob. Chemother. 53: 878-881. 61. Kartsonis N., Killar J., Mixson L., Hoe C., Sable C., Bartizal K., Motyl M. 2005. Caspofungin susceptibility testing of isolates from patiens with esophageal candidiasis or invasive candidiasis: relationship of MIC to treatment outcome. Antimicrob. Agents Chemother. 49(9): 3616-3623. 62. Katiyar S., Pfaller M., Edlind T. 2006. Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates exhibiting reduced echinocandin susceptibility. Antimicrob. Agents Chemother. 50(8): 2892-2894. 63. Kauffman C. A. 2006. Fungal infections. Proc. Am. Thorac. Soc. 3: 35-40. 64. Khlif M., Bogreau H., Michel-Nguyen A., Ayadi A., Ranque S. 2010. Trailing or paradoxical growth of Candida albicans when exposed to caspofungin is not associated with microsatellite genotypes. Antimicrob. Agents Chemother. 54(3): 1365-1368. 65. Klepser M. E., Lewis R. E., Ernst E. J., Petzold C. R., Bailey E. M., Burgess D. S., Calver P. L., Lacy M. K., Mercier R.-C., Nicolau D. P., Zhanel G. G., Pfaller M. A. 2001. Multi-center evaluation of antifungal time-kill methods. Infect. Dis. Pharmacother. 5: 29-41. 66. Klepser, M. E., E. J. Ernst, R. E. Lewis, M. E. Ernst, and M. A. Pfaller. 1998. Influence of test conditions on antifungal time-kill curve results for standardized methods. Antimicrob. Agents Chemother. 42:1207–1212. 67. Kofteridis D. P., Lewis R. E., Kontoyiannis D. P. 2010. Caspofungin-non susceptible Candida isolates in cancer patients. J. Antimicrob. Chemother. 65: 293-295.
61
68. Koga-Ito C. Y., Lyon J. P., Resende M. A. 2008. Comparison between E-test and CLSI broth microdilution method for antifungal susceptibility testing of Candida albicans oral isolates. Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo. 50(1): 7-10. 69. Koga-Ito C. Y., Lyon J. P., Vidotto V., de Resende M. A. 2006. Virulence factors and antifungal susceptibility of Candida albicans isolates from oral candidosis patients and control individuals. Mycopathologia. 161:219-223. 70. Lass-Flörl C. 2009. The changing face of epidemiology of invasive fungal disease in Europe. Mycoses. 52: 197-205. 71. Laverdiere M., Lalonde R. G., Baril J. G., Sheppard D. C., Park S., Perlin D.S. 2006 Progressive loss of echinocandin activity following prolonged use for treatment of Candida albicans oesophagitis. J. Antimicrob. Chemother. 57 (4): 705-708. 72. Letscher-Bru V., Herbrecht R. 2003. Caspofungin: the first representative of a new antifungal class. J. Antimicrob. Chemother. 51:513-521. 73. Li L., Redding S., Dongari-Bagtzoglou A. 2007. Candida glablata, an emerging oral opportunistic pathogen. J. Dent. Res. 86(3): 204-215. 74. Linares C. E. B., Lorento E. S., Silveira C. P., Pozzatti P., Scheid L.A., Santurio J. M. 2007. Enzymatic and haemolytic activites of Candida dubliniensis strains. Rev. Inst. Med. Trop. Med. S. Paulo. 49(4): 203-206. 75. Lopez-Martinez R. 2010. Candidosis, a new challenge. Clin. Dermatol. 28: 178-184. 76. Louine A., Deziel M., Liu W., Drusano M. F., Gumbo T., Drusano G. L. 2005. Pharmacodynamics of caspofungin in a murine model of systemic candidiasis: importance of persistence of caspofungin in tissues to understanding drug activity. Antimicrob. Agents Chemother. 49(12): 5058-5068. 77. Majoros L., Kardos G., Szabó B., Sipiczki M. 2005. Caspofungin susceptibility testing of Candida inconspicua: correlation of different methods with the minimal fungicid concentration. Antimicrob. Agents Chemother. 49:3486-3488. 78. Majoros L., Kardos G.: Fungicidal activity of azole antifungal agents. 2008. Anti-Infect. Agents. Med. Chem. 7:118-125.
62
79. Majoros L., Szegedi I., Kardos G., Erdész C., Kónya J., Kiss C. 2006. Slow response of invasive Candida krusei infection to amphotericin B in a clinical time-kill study. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 25:803-806. 80. McCullough M. J., Ross B. C., Reade P. C. 1996. Candida albicans: a review of its history, taxonomy, epidemiology, virulence, attributes, and methods of strain differentiation. Int. J. Oral Maxillofac. Surg. 25:136-144. 81. McCullough M. J., Savage N. W. 2005. Oral candidosis and the therapeutic use of antifungal agents in dentistry. Aus. Dent. J. 50(2):S36-S39. 82. Melo A. S., Colombo A. L., Arthington-Skaggs B. A. 2007. Paradoxical growth effect of caspofungin observed on biofilms and planktonic cells of five different Candida species. Antimicrob. Agents. Chemother. 51: 3081-3088. 83. Mihu C. N., Kassis C., Ramos E. R., Jiang Y., Hachem R. Y. 2010. Does combination of lipid formulation of amphotericin B and echinocandins improve outcome of invasive Aspergillosis in hematological malignancy patiens? Cancer 116(22): 5290-5296. 84. Mills E. J., Perri D., Cooper C., Nachega J. B., Wu P., Tleyjeh I., Phillips P. 2009. Antifungal treatment for invasvie Candida infections: a mixed treatment comparison meta-analyzis. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8:23 doi: 10.1186/1476-0711-8-23. 85. Mishra N. N., Prasad T., Sharma N., Payasi A., Prasad R. Gupka D. K., Singh R. 2007. Pathogenicity and drug resistance in Candida albicans and other yeast species. A review. Acta Microbiol. Immunol. Hung. 54(3): 201-235. 86. Mora-Duarte J., Betts R., Rotstein C., Colombo A. L., Thompson-Moya L., Smietana J., Lupinacci R., Sable C., Kartsonis N., Perfect J. 2002. Comparison of caspofungin and amphotericin B for invasive candidiasis. N. Engl. J. Med. 347(25): 2020-2029. 87. Moudgal V., Little T., Boikov D., Vazquaez J. A. 2005. Multiechinocandinand multiazole-resistant Candida parapsilosis isolates serially obtained during therapy for prosthetic valve endocarditis. Antimicrob. Agents Chemother. 49(2):767-769.
63
88. Mukherjee P. K., Sheehan D. J., Hitchcock C. A., Ghannoum M. A. 2005. Combination treatment of invasive fungal infections. Clin. Microbiol. Rev. 18(1): 163-194. 89. Muller F. M., Kurzai O., Hacker J. 2001. Effect of the growth medium on the in vitro antifungal activity of micafungin (FK-463) against clinical isolates of Candida dubliniensis. J. Antimicrob. Chemother. 48: 713-715. 90. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2002. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard M27-A2. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa. 91. Neely M., Jafri H. S., Seibel N., Knapp K., Adamson P. C., Bradshaw S. K., Strohmaier K. M., Sun P., Bi S., Dockendorf M. F., Stone J. A., Kartsonis N. A. 2009. Pharmacokinetics and safey of caspofungin in older infants and toddlers. Antimicrob. Agents Chemother. 53(4): 1450-1456. 92. Nguyen M. H., Clancy C. J., Yu V. L., Yu Y. C., Morris A. J., Snydman D. R., Sutton D. A., Rinaldi M. G. 1998. Do in vitro susceptibility data predict the microbiologic response to amphotericin B? Results of a prospective study of patiens with Candida fungemia. J. Infect. Dis. 177: 425-430. 93. Niimi M., Firth N. A., Cannon R. D. 2010. Antifungal drug resistance of oral fungi. Odontology 98: 15-25. 94. Okawa Y., Miyauchi M., Kobayashi H. 2008. Comparison of pathogenicity of various Candida tropicalis strains. Biol. Pharm. Bull. 31(8): 1507-1510. 95. Ostrosky-Zeichner L., Paetznik V. L., Rodriguez J., Chen E., Sheehan D. J. 2009. Activity of anidulafungin in a murine model of Candida krusei infection: evaluation of mortaly and disease burden by quantitative tissue cultures and measurement of serum (1,3)-β-D-glucan levels.
Antimicrob. Agents
Chemother. 53(4): 1639-1641. 96. Paderu P., Garcia-Effron G., Balashov S., Delmas G., Park S., Perlin D. S. 2007. Serum differentially alters the antifungal properties of echinocandin drugs. Antimicrob. Agents Chemother. 51(6): 2253-2256. 97. Pai M. P. 2009. Antifungal combinations against stimulated Candida albicans endocardial vegetations. Antimicrob. Agents Chemother. 53(6):2629-2631.
64
98. Pai, M. P., Jones A. L., Mullen C. K. 2007. Micafungin activity against Candida bloodstream isolates: effect of growth medium and susceptibility testing method. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 58:129-132. 99. Pappas P. G., Kauffman C. A., Andes D., Benjamin D. K., Calandra T. F., Edwards J. E., Filler S. G., Fisher J. F., Kulberg B., Ostrosky-Zeicher L., Reboli A. C., Rex J. H., Walsh T. J., Sobel J. D. 2009. Clinical practice guidelines for the management of candidiasis: 2009 update by the infectious diseases society of America. Clin. Infect. Dis. 48:503-535. 100.
Pappas, P. G., Rotstein C. M. F., Betts R. F., Nucci M., Talwar D., De
Waele J. J. , Vazquez J. A., Dupont B. F., Horn D. L., Ostrosky-Zeichner L., Reboli A. C., Suh B., Digumarti R., Wu C., Kovanda L. L., Arnold L. J., Buell D. N. 2007. Micafungin versus caspofungin for treatment of candidemia and other forms of invasive candidiasis. Clin. Infect. Dis. 45:883-893. 101.
Park S., Kelly R., Kahn J. N., Robles J., Hsu M. J., Register E., Li W., Vyas
V., Fan H., Abruzzo G., Flattery A., Gill C., Chrebet G., Parent S. A., Kurtz M., Teppler H., Douglas C. M., Perlin D. S. 2005. Specific substitutions in the echinocandin target Fks1p account for reduced susceptibility of rare laboratory and clinical Candida sp. Isolates. Antimicrob. Agents Chemother. 49(8): 32643273. 102.
Pasquale T., Tomada J. R., Ghannoun M., Dipersio J., Bonilla H. 2008.
Emergence of Candida tropicalis resistant to caspofungin. J. Antimicrob. Chemother. 61(1):219. 103.
Pasqualotto A. C., Denning D. W. 2008. New and emerging treatments for
fungal infections. J. Antimicrob. Chemother. 61: i19-i30. 104.
Perlin D. S. 2007. Resistance to echinocandin-class antifungal drugs. Drug.
Resist. Updat. 10(3):121-131. 105.
Pfaller M. A., Boyken L., Hollis R. J., Kroeger J., Messer S. A., Tendolkar
S., Diekema D. J. 2008. In vitro susceptibility of invasive isolates of Candida spp. to anidulafungin, caspofungin, and micafungin: six years of global surveillance. J. Clin. Microbiol. 46(1):150-156.
65
106.
Pfaller M. A., Boyken L., Hollis R. J., Messer S. A., Tendolkar S., Diekema
D. J. 2006. In vitro susceptibilities of Candida spp. to caspofungin: four years of global surveillance. J. Clin .Microbiol. 44(3): 760-763. 107.
Pfaller M. A., Castanheira M., Diekema D. J., Messer S. A., Moet G. J.,
Jones R. N. 2010. Comparison of European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) and Etest methods with the CLSI broth microdilution method for echinocandin susceptibility testing of Candida species. J. Clin. Microbiol. 48(5):1592-1599. 108.
Pfaller M. A., Chaturvedi V., Diekema D. J., Ghannoum M. A., Holliday N.
M., Killiam S. B., Knapp C. C., Messer S. A., Miskov A., Ramani R. 2008. Clinical evaluation of the Sensitre YeastOne® colorimetric antifungal panel for antifungal
susceptibility
testing
of
the
echinocandins
anidulafungin,
caspofungin and micafungin. Antimicrob. Agents Chemother. 46(7): 21552159. 109.
Pfaller M. A., Diekema D. J. 2007. Epidemiology of invasive candidiasis: a
persistent public health problem. Clin. Microbiol. Rev. 20(1):133-163. 110.
Pfaller M. A., Diekema D. J., Boyken L., Messer S. A, Tendolkar S., Hollis
R. J. 2003. Evaluation of the Etest and disk diffusion methods for determining susceptibilities of 235 bloodstream isolates of Candida glabrata to fluconazole and voriconazole. J. Clin. Microbiol. 41:1875-1880. 111.
Pfaller M. A., Diekema D. J., Gibbs D. L., Newell V. A., Nagy E.,
Dobiasova S., Rinaldi M., Barton R., Veselov A. 2008. Candida krusei, a multidrug-resistant opportunistic fungal pathogen: geographic and temporal trends from the ARTEMIS DISK antifungal surveillance program, 2001 to 2005. J. Clin. Microbiol. 46(2): 515-521. 112.
Pfaller M. A., Diekema D. J., Messer S. A., Hollis R. J., Jones R. N. 2003.
In vitro activites of caspofungin compared with those of fluconazole and itraconazole against 3,959 clinical isolates of Candida spp., including 157 fluconazole-resistant isolates. Antimicrob. Agents Chemother. 47(3):10681071. 113.
Pfaller M. A., Diekema D. J., Ostrosky-Zeichner L., Rex J. H., Alexander B.
D., Andes D., Brown S. D., Chaturvedi V., Ghannoum M. A., Knapp C. C., 66
Sheehan D. J., Walsh T. J. 2008. Correlation of MIC with outcome for Candida species tested against caspofungin, anidulafungin, and micafungin: analysis and proposal for interpretive MIC breakpoints. Antimicrob. Agents Chemother. 46(8): 2620-2629. 114.
Pfaller M. A., Diekema D. J., Sheehan D. J. 2006. Interpretive breakpoints
for fluconazole and Candida revisited: a blueprint for the future of antifungal susceptibility testing. Clin. Microbiol. Rev. 19: 435-447. 115.
Pfaller M. A., Messer S. A., Boyken L., Rice C., Tendolkar S., Hollis R. J.,
Diekema D. J. 2003. Caspofungin activity against clinical isolates of flukonazole-resistant Candida. J. Clin. Microbiol. 41(12): 5729-5731. 116.
Pfaller M. A., Messer S. A., Boyken L., Rice C., Tendolkar S., Hollis R. J.,
Diekema D. J. 2004. Further standardization of broth microdilution methodology for in vitro susceptibility testing of caspofungin against Candida species by use of an international collection of more than 3,000 clinical isolates. J. Clin. Microbiol. 42: 3117-3119. 117.
Pfaller M. A., Sheehan D. J., Rex J. H. 2004. Determination of fungicidal
activites against yeasts and molds: lessons learned from bactericidal testing and the need for standardization. Clin. Microbiol. Rev. 17: 268-280. 118.
Pound M. W., Townsend M. L., Drew R. H 2010. Echinocandin
pharmacodynamics:
review
and
clinical
implications.
J.
Antimicrob.
Chemother. 65:1108-1118. 119.
Reboli A. C., Rotstein C., Pappas P. G., Chapman S. W., Kett D. H., Kumar
D., Betts R., Wible M., Goldstein B. P., Schranz J., Krause D. S., Walsh T. J.2007. Anidulafungin versus fluconazole for invasive candidiasis. N. Engl. J. Med. 356 (24): 2472-2482. 120.
Rex J. H., Phaller M. A., Walsh T. J., Chaturvedi V., Espinel-Ingroff A.,
Ghannoum M. A., Gosey L. L., Odds F. C., Rinaldi M. G., Sheehan D. J., Warnock D. W. 2001. Antifungal susceptibility testing: Practical aspects and current challenges. Clin. Microbiol. Rev. 14: 643-658. 121.
Rodrigez-Tudela J. L., Gomez-Lopez A., Arendrup M. C., Garcia-Effron G.,
Perlin D. S., Lass-Flörl C., Cuenca-Estrella M. 2010. Comparison of
67
caspofungin MICs by means of EUCAST method Edef 7.1 using two different concentracions of glucose. Antimicrob. Agents Chemother. 54(7):3056-3057. 122.
Romeo O., Criseo G. 2009. Molecular epidemiology of Candida albicans
and its closely related yeasts Candida dubliniensis and Candida africana. J. Clin. Microbiol. 47(1): 212-214. 123.
Rüping M. J. G. T., Vehreschild J. J., Cornely O. A. 2008. Patients at high
risk of invasive fungal infections-when and how to treat. Drugs. 68(14): 19411962. 124.
Saez-Llorens X., Marcias M., Maiya P., Pineros J., Jafri H. S., Chatterjee
A., Ruiz G., Raghavan J., Bradshaw S. K., Kartsonis N. A., Sun P., Strohmaier K. M., Fallon M., Bi S., Stone J. A., Chow J. W. 2009. Pharmacokinetics and safety of caspofungin in neonates and infants less than 3 months of age. Antimicrob. Agents Chemother. 53(3): 869-875. 125.
Samaranayake L. P., Leung W. K., Jin L. 2009. Oral mucosal fungal
infections. Periodontol. 2000. 49: 39-59. 126.
Schelenz S., Ross C. N. 2006. Limitations of caspofungin in the treatment of
obstructive pyonephrosis due to Candida glabrata infection. BMC Infect. Dis. 6: 126. doi:10.1186/1471-2334-6-126. 127.
Senevirante C. J., Jin L. J., Samaranayake Y. H., Samaranayake L. P. 2008.
Cell density and cell aging as factors modulating antifungal resistance of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 52(9): 3259-3266. 128.
Singh S. D., Robbins N., Zaas A. K., Schell W. A., Perfect J. R., Cowen L.
E. 2009. Hsp90 governs echinocandin resistance in the pathogenic yeast Candida
albicans
via
calcineurin.
PLoS
Pathog.
5(7):e1000532.
doi: 10.1371/journal.ppat. 1000532. 129.
Sirohi B., Powles R. L., Chopra R., Russel N., Byrne J. L., Prentice H. G.,
Potter M., Koblinger S. 2006. A study to determine the safety and maximum tolerated dose of micafungin (FK463) in patients undergoing haematopoietic cell transplantation. Bone Marrow Transplantation 38:47-51. 130.
Sóczó G., Kardos G., McNicholas P. M., Falusi E., Gergely L., Majoros L.
2007. Posaconazole susceptibility testing against Candida species: comparison of broth microdilution and E-test methods. Mycoses 50:178-182. 68
131.
Somogyvári F., Doczi I., Serly J., Ahmad S., Nagy E. 2007. Rapid
discrimination between Candida albicans and Candida dubliniensis by using real-time polymerase chain reaction. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 58: 367369. 132.
Southerm P., Horbul J., Maher D., Davis D. A. 2008. C. albicans
colonization
of
human
mucosal
surfaces.
PLoS
ONE
3(4):e2067.
doi:10.1371/journal.pone.0002067. 133.
Soysa N. S., Samaranayake L. P., Ellepola A. N. B. 2008. Antimicrobials as
a contributory factor in oral candidosis- a brief overview. Oral Dis.14:138-143. 134.
Stevens D. A., M. Espiritu, and R. Parmar. 2004. Paradoxical effect of
caspofungin: reduced activity against Candida albicans at high drug concentrations. Antimicrob. Agents Chemother. 48:3407-3411. 135.
Stevens D. A., M. Ichinomiya, Y. Koshi, and H. Horiuchi. 2006. Escape of
Candida from caspofungin inhibition at concentrations above the MIC (paradoxical effect) accomplished by increased cell wall chitin; evidence for ß1,6-glucan synthesis inhibition by caspofungin. Antimicrob. Agents Chemother. 50: 3160-3161. 136.
Stevens D. A., T. C. White, D. S. Perlin, C. P. Selitrennikoff. 2005. Studies
of the paradoxical effect of caspofungin at high drug concentrations. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 51:173-178. 137.
Stone J. A., Holand S. D., Wickersham P. J., Sterrett A., Schwartz M.,
Bonfiglio C., Hesney M., Winchell G. A., Deutsch P. J., Greenberg H., Hunt T. L., Waldman S. C. 2002. Single- and multiple-dose pharmacokinetics of caspofungin in healtly men. Antimicrob. Agents Chemother. 46(3): 739-745. 138.
Sullivan D. J., Morga G., Donnelly S., Gee S., Pinjon E., McCartan B.,
Shanley D. B., Coleman D. C. 1999. Candida dubliniensis: An update. Rev. Iberoam. Micol. 16: 72-76. 139.
Trofa D., Gácser A., Nosanchuk J. D. 2008. Candida parapsilosis, an
emerging fungal pathogen. Clin. Microbiol. Rev. 21(4): 606-625. 140.
Walker L. A., Gow N. A., Munro C. A. 2010. Fungal echinocandin
resistance. Fungal Genet. Biol. 47(2): 117-126.
69
141.
Walker L. A., Munro C. A., de Brujin I., Lenardon M. D., McKinnon A.,
Gow N. A. R. 2008. Stimulation of chitin synthesis rescues Candida albicans from echinocandins. PLoS Pathog. 4(4):e1000040. doi:10.1371/ journal.ppat. 1000040 142.
Walsh T. J., Adamson P. C., Seibel N. L., Flynn P. M., Neely M. N.,
Schwartz C., Shad A., Kaplan S. L., Roden M. M., Sone J. A., Miller A., Bradshaw S. K., Li S. X., Sable C. A., Kartsonis N. A. 2005. Pharmacokinetics, safety, and tolerability of caspofungin in children and adolescents. Antimicrob. Agents Chemother. 49(11): 4536-4545. 143.
van Hal S. J., Stark D., Harkness J., Marriott D. 2008. Candida dubliniensis
meningitis as delayed sequela of treated C. dubliniensis fungemia. Em. Infect. Dis. 14(2): 327-329. 144.
Wiederhold N. P. 2007. Attenuation of echinocandin activity at elevated
concentrations: a review of the paradoxical effect. Curr. Opin. Infect. Dis. 20:574-578. 145.
Wiederhold N. P. 2009. Paradoxical echinocandin activity: a limited in vitro
phenomenon? Med. Mycol. 47 (1): S369-375. 146.
Wiederhold N. P., Grabinski J. L., Garcia-Effron G., Perlin D. S., Lee S. A.
2008. Pyrosequencing to detect mutations in FKS1 that confer reduced echinocandin susceptibility in Candida albicans. Antimicrob. Agents Chemother. 52(11): 4145-4148. 147.
Wiederhold N. P., Kontoyiannis D. P., Chi J., Prince R. A., Tam V. H.,
Lewis R. E. 2004. Pharmacodynamics of caspofungin in a murine model of invasive pulmonary aspergillosis: evidence of concentration-dependent activity. J. Infect. Dis. 190: 1494-1471.
70
11. Az értekezésben felhasznált közlemények 1. Sóczó G., Kardos G., Varga I., Kelentey B., Gesztelyi R., Majoros L. 2007. In vitro studies with C. tropicalis isolates exhibiting paradoxical growth in the presence of high concentrations of caspofungin. Antimicrob. Agents Chemother. 51(12): 4474-4476. IF: 4,39 Független idéző: 3 2. Varga I., Sóczó G., Kardos G., Majoros L. 2008. Time-kill studies investigating the killing activity of caspofungin against Candida dubliniensis:
comparing
RPMI-1640
and
antibiotic
medium
3.
J. Antimicrob. Chemother. 62: 149-152. IF: 4,328 Független idéző: 0 3. Varga I., Sóczó G., Kardos G., Kemény-Beke Á., Kelentey B., Márton I., Majoros L. 2009. Differences in killing activity of caspofungin and paradoxical growth between C. albicans and C. krusei clinical isolates in different media. J. Chemother. 21(1): 36-41. IF: 1,166 Független idéző: 0 12. Egyéb közlemények, Fontosabb poszterek 1. Varga I., Sóczó G., Kardos G., Borbély Á., Szabó Z., Kemény-Beke Á., Majoros L. 2008. Comparison of killing activity of caspofungin against Candida parapsilosis, Candida orthopsilosis and Candida metapsilosis. J. Antimicrob. Chemother. 62: 1466-1468. IF:4,328 Független idéző: 2 2. Sóczó G., Kardos G., McNicholas P. M., Balogh É., Gergely L., Varga I., B. Kelentey B., Majoros L. 2007. Correlation of posaconazole minimum fungicidal concentration and time-kill test against nine Candida species. J. Antimicrob. Chemother. 60: 1004-1009. IF: 4,038 Független idéző: 12
1. Varga I., Sóczó G., Kelentey B., Majoros L. A caspofungin in vitro antimikrobilalis aktivitásának meghatározása Candida speciesek esetében. Magyar Kisérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság és a Magyar Élettani Társaság LXXII. Vándorgyűlése, Debrecen, 2008. Június 4-6. 2. Varga I., Sóczó G., Kardos G., Kemény-Beke Á., Keleentey B., Márton I., Majoros L. A caspofungin in vitro antimikrobiális aktivitásának meghatározása, és a paradox növekedés Candida albicans és Candida krusei fajok esetén. Magyar Élettani Társaság LXXIII. Vándorgyűlése, Budapest, 2009. Augusztus 27-29. 71
