Effects of Centella asiatica L. Towards Number of Osteoclasts, Osteoblasts and. Osteocytes in Tibiae of Ovariectomized Rats (Rattus norvegicus)

Effects of Centella asiatica L. Towards Number of Osteoclasts, Osteoblasts and Osteocytes in Tibiae of Ovariectomized Rats (Rattus norvegicus) Vanissa; Yulita; Sri Angky Soekanto; Erik Idrus

Corresponding address: Department of Oral Biology, Faculty of Dentistry, Universitas Indonesia. Jalan Salemba Raya No. 4 Jakarta Pusat 10430 Indonesia. Phone: +62 21 31906289, Fax: +62 21 31906289 Email address: [email protected] (Vanissa)

1

Effects of centella..., Vanissa, FKG UI, 2013

ABSTRACT Estrogen deficiency in post-menopausal women results in reduced bone quality as seen in osteoporotic patients. Thus, an alternative estrogen source is needed as postmenopausal osteoporosis therapy. In this research, the efectivity of Centella as phytoestrogens is examined. Therapy with Centella extract in doses of 60mg/kgBW, 120mg/kgBW and 180mg/kgBW is administered in ovariectomized rats for 30 days. Histologic samples with HE staining show increased number of osteocytes, followed by decreased number of osteoclasts but no significant increase of osteoblasts. Key Words: Centella asiatica; estrogen; osteoporosis; bone cells

ABSTRAK Defisiensi estrogen pada wanita post-menopausal berakibat pada menurunnya massa tulang seperti yang terlihat pada penderita osteoporosis. Oleh karena itu, diperlukan bahan pengganti estrogen sebagai terapi osteoporosis post-menopausal. Melalui penelitian ini diteliti efektifitas pegagan sebagai bahan pengganti estrogen. Terapi dengan ekstrak pegagan konsentrasi 60mg/kgBB, 120mg/kgBB, dan 180mg/kgBB pada tikus yang telah diovariektomi dilakukan selama 30 hari. Sajian histologi dengan pewarnaan HE menunjukkan hasil peningkatan jumlah osteosit, diikuti dengan penurunan jumlah osteoklas namun tidak ada peningkatan jumlah osteoblas yang bermakna. Kata Kunci: pegagan; estrogen; osteoporosis; sel tulang

2


PENDAHULUAN Osteoporosis adalah suatu penyakit tulang yang ditandai dengan pengurangan densitas massa atau volume. Pengurangan densitas tersebut dapat menyebabkan pengurangan kekuatan mekanik tulang, sehingga tulang lebih rentan mengalami fraktur.(1) Osteoporosis telah dikaitkan dengan umur lanjut, dan sudah menjadi masalah kesehatan utama bahkan di negara-negara maju sekalipun, terutama pada wanita postmenopausal. Pada wanita postmenopausal, proses bone remodelling bertambah secara signifikan dan terus bertambah sampai 40 tahun setelah berhentinya fungsi ovarium, yang menyebabkan kontinuitas dan resorpsi tulang yang progresif. Peningkatan aktivitas pergantian tulang ini diduga karena memendeknya umur osteoblas dan memanjangnya umur osteoklas.(2) Terapi penggantian hormon merupakan terapi paling efektif dan satu-satunya terapi yang menunjukkan hasil nyata untuk mencegah kehilangan densitas tulang dan mengurangi risiko fraktur.(3) Namun banyak wanita yang beralih ke fitoestrogen sebagai terapi penggantian hormon daripada menggunakan terapi penggantian estrogen karena adanya efek samping yang tidak diinginkan seperti meningkatkan risiko kanker payudara dan pendarahan endometrium. Fitoestrogen merupakan zat kimia yang ditemukan pada tanaman yang bisa berfungsi seperti hormon estrogen dan diproduksi secara alami pada tubuh.(4) Ratusan tanaman telah dilaporkan mengandung fitoestrogen, salah satunya adalah pegagan (Centella asiatica L.). Pegagan merupakan tumbuhan kosmopolit atau memiliki daerah penyebaran sangat luas, terutama di daerah tropis dan subtropis. Tanaman ini tumbuh dengan baik di tempat-tempat terbuka, tempat yang memiliki cukup sinar matahari, dan tempat yang agak terlindung yang tanahnya subur dan agak lembab.

3


Kandungan fitokimia daun pegagan terdiri dari golongan terpenoid, flavonoid, minyak astiri, dan asam amino.(5) Golongan flavonoid yang dapat berperan sebagai fitoestrogen yang dikandung pegagan adalah kuersetin, kaemferol, macam-macam glikosida, katekin, rutin, naringin, flavonoid castilliferol, dan castillicetin.(6, 7) Kaemferol, sebuah flavonol yang merupakan turunan rhizoma Kaempferia galangal L., adalah fitoestrogen yang mempunyai efek osteogenik dan dapat ditemukan di dalam pegagan. Penelitian membuktikan bahwa kaemferol menstimulasi diferensiasi osteogenik pada osteoblas secara in vitro melalui signal reseptor estrogen.(8) Kuersetin dan kaemferol juga memberikan efek menghambat resorpsi tulang dan apoptosis selsel dewasa osteoklas.(9) Kuersetin, yang juga terkandung dalam pegagan, juga menunjukkan efek stimulasi yang signifikan pada proliferasi dan mineralisasi pada sel tulang osteoblas tikus, sehingga membantu proses pembentukan tulang.(10) Golongan flavonol lain yang terkandung dalam daun pegagan, meningkatkan kelangsungan hidup sel osteoblas dan aktivitas alkalin fosfatase. Terapi dengan penggunaan katekin mengurangi produksi sitokin yang menyebabkan resorpsi tulang dan apoptosis pada osteoblas. Hasil dari proses tersebut adalah pencegahan osteoporosis dan penyakit inflamasi tulang.(11) Flavonoid lain yang terkandung dalam pegagan adalah naringin. Naringin dapat menekan jumlah osteoklas yang terbentuk karena interleukin-1 (IL-1). Naringin membantu menambah massa tulang dengan menekan formasi osteoklas pada tikus, dan dengan sendirinya mencegah penyakit tulang, seperti osteoporosis.(12) Berdasarkan hal-hal tersebut diharapkan pegagan (Centella asiatica L.) dapat memberikan efek pencegahan pada osteoporosis post-menopausal dengan mengurangi jumlah osteoklas dan meningkatkan jumlah osteoblas.

4


METODE PENELITIAN Penelitian ini menggunakan studi eksperimental dengan “Post Control Group Design”. Hewan coba 30 tikus dirandomisasi dalam 6 kelompok, yaitu: tikus normal (SHAM), tikus ovariektomi tanpa perlakuan (Kontrol negatif), tikus ovariektomi yang diberi ekstrak daun pegagan dengan tiga dosis yang berbeda (P1=60;P2=120;P3=180 mg/kgBB) dan tikus ovariektomi yang diberi Vitamin E (Kontrol positif) selama 4 minggu. Sediaan histologi diberi pewarnaan HE dan digunakan untuk menghitung jumlah sel osteoklas, osteoblas dan osteosit. Data jumlah osteoklas, osteoblas dan osteosit yang telah diperoleh akan dianalisa dengan uji normalitas Saphiro-Wilk dan pada data yang terdistribusi tidak normal dan tidak homogen, dilakukan uji nonparametrik Kruskal Wallis. Pada hasil uji data osteoklas dan osteosit yang hasilnya bermakna, dilanjutkan dengan Posthoc Mann-Whitney. Data jumlah osteoblas dan osteoklas dianalisis dengan uji korelasi Pearson, sedangkan data jumlah osteosit dianalisa dengan uji korelasi Spearman. HASIL PENELITIAN Evaluasi keberhasilan ovariektomi dilakukan dengan mengukur panjang tulang trabekular tikus SHAM dan OVX. Dalam luas lapang pandang yang sama, panjang tulang trabekular tikus yang tidak diovariektomi lebih panjang dari panjang tulang trabekular tikus yang dilakukan proses ovariektomi. Dari hasil pengukuran ini, prosedur ovariektomi dapat dinyatakan efektif. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penurunan jumlah osteoklas yang signifikan terhadap kelompok kontrol negatif (p<0.005) pada kelompok dengan pemberian ekstrak pegagan dosis 60mg/kgBB (P1), dan dosis 120 mg/kgBB (P2). Hasil penelitian tidak menunjukkan peningkatan jumlah osteoblas yang bermakna. Namun, hasil penelitian menunjukkan bahwa peningkatan jumlah osteosit yang signifikan

5


terhadap kelompok pemberian ekstrak pegagan dengan dosis 180mg/kgBB (P3) (p<0.005) pada kelompok kontrol negatif (K-), serta korelasi yang kuat dan signifikan antara pemberian ekstrak daun pegagan dengan peningkatan jumlah sel osteosit (p<0.005 dengan koefisien korelasi=0.756). Kesimpulan yang diperoleh dari penelitian ini adalah pemberian ekstrak daun pegagan dapat menurunkan jumlah sel osteoklas dan meningkatkan jumlah sel osteosit pada tulang tibia tikus pasca ovariektomi. DISKUSI Estrogen melindungi tulang dengan menyeimbangkan aktivitas pembentukan oleh osteoblas dan resorpsi tulang oleh osteoklas dengan menginduksi apoptosis pada sel osteoklas. Studi menunjukkan adanya peran reseptor Fas ligand (FasL) pada proses terjadinya apoptosis osteoklas yang diinduksi hormon estrogen dengan mekanisme autokrin sel osteoklas itu sendiri. FasL berikatan dengan estrogen receptor α (ERα) pada osteoklas sehingga terjadi apoptosis sel osteoklas dewasa.(13) Teori lain juga menunjukkan mekanisme parakrin dimana estrogen mempengaruhi kelangsungan hidup sel osteoklas dengan meningkatnya FasL pada osteoblas, sehingga mencetuskan terjadinya apoptosis pre-osteoklas.(14) Flavonoid yang terkandung dalam pegagan telah terbukti dalam penelitian secara in vitro dapat membantu formasi dan menghambat resorpsi tulang. Di antaranya yaitu kuersetin yang menstimulasi proliferasi osteoblas dan apoptosis osteoklas, naringin yang menekan jumlah osteoklas karena menghambat produksi sitokin IL-1, kaemferol yang menstimulasi diferensiasi osteogenik pada osteoblas dan apoptosis osteoklas dan katekin yang menghambat produksi sitokin TNF-α dan IL-6 sehingga menghambat apoptosis osteoblas. Berdasarkan hal-hal tersebut, pegagan diharapkan dapat memberikan efek pencegahan terhadap osteoporosis.

6


Ovariektomi menyebabkan peningkatan produksi sitokin TNF-α, yang menyebabkan osteoclastogenesis yang diinduksi RANKL dan Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) sehingga jumlah osteoklas akan meningkat.(15) Hasil penelitian terhadap kelompok perlakuan menunjukkan penurunan jumlah sel osteoklas secara signifikan pada tikus yang diovariektomi dengan pemberian ekstrak daun pegagan dosis 60mg/kgBB, dan 120mg/kgBB namun tidak pada dosis 180mg/kgBB. Sebaliknya, tingginya angka osteoklas pada kelompok dosis 180mg/kgBB menunjukkan bahwa pegagan sebagai sumber estrogen alami dalam dosis tersebut sudah tidak optimal untuk menghambat diferensiasi osteoklas, namun sebaliknya, jumlah osteoklas meningkat. Karena pemberian flavonoid pada dosis yang sangat tinggi dapat menyebabkan flavonoid bekerja sebagai pro-oksidan dan memperbanyak radikal bebas dalam tubuh, sehingga stres oksidatif bertambah dan menyebabkan kerusakan tulang. (16) Kekurangan estrogen dapat menyebabkan stres oksidatif pada tulang dan tulang sumsum, dan menstimulasi apoptosis sel osteoblas, sehingga kerusakan tulang semakin cepat.(17) Pegagan telah dilaporkan memberikan efek proteksi terhadap stress oksidatif dengan mengaktivasi enzim asam d-aminolevulinatdehidratase (ALAD), menghambat peroksidasi lipid, dan mengaktifkan enzim antioksidan. Oleh karena itu pemberian pegagan dapat mencegah apoptosis osteoblas sehingga membantu formasi tulang. Namun hasil penelitian terhadap kelompok perlakuan tidak menunjukkan peningkatan jumlah sel osteoblas yang signifikan pada tikus yang diovariektomi dengan pemberian ekstrak daun pegagan. Hal ini dapat disebabkan oleh waktu penelitian yang kurang lama. Sebab lainnya juga bisa dikarenakan fitoestrogen memiliki sifat dose-dependent.(18) Penelitian lain dengan pemberian katekin pada tikus ovariektomi selama 3 bulan

7


memberikan hasil peningkatan densitas tulang dengan meningkatkan aktivitas osteoblas.(19) Fitoestrogen mempunyai efek dose-dependent pada osteoblas dan sel osteoprogenitor, menstimulasi proses osteogenesis pada konsentrasi rendah dan menghambat proses osteogenesis pada dosis tinggi.(20) Wattel menyebutkan bahwa flavonoid kuersetin dan kaempferol bekerja optimal pada dosis berbeda. Terdapat berbagai macam flavonoid yang terkandung dalam pegagan, kuersetin, rutin, naringin, kaempferol, dan katekin, namun tidak semuanya dapat bekerja karena sifat dosedependent ini. Tiap tipe fitoestrogen juga memiliki mekanisme kerja yang kompleks dan spesifik, serta dosis optimal yang berbeda-beda.(21) Osteoklas menunjukkan hasil yang signifikan karena sel osteoklas hanya membutuhkan waktu 3 minggu untuk melakukan resorpsi tulang dan sesuai dengan penelitian menunjukkan bahwa fitoestrogen bekerja dengan menghambat pembentukan dan aktivitas osteoklas.(20) Pada hasil analisa statistik didapatkan korelasi yang kuat (R=0,775) dan signifikan (p=0,000) mengenai hubungan antara peningkatan dosis ekstrak daun pegagan dengan jumlah sel osteosit tikus Wistar. Arah korelasi adalah positif, yang berarti semakin besar dosis ekstrak daun pegagan, maka semakin besar jumlah sel osteosit tikus wistar. Kenaikan jumlah sel osteosit membantu mempertahankan homeostatis mineral secara sistemik pada tubuh. Kemampuan memanipulasi pembentukan osteosit berpotensi untuk meregulasi fungsi osteoblas dalam penyakit tulang, terutama osteoporosis. Dengan bertambahnya jumlah sel osteosit, diharapkan dapat meningkatkan proses osteogenesis

melalui

sel

osteoblas.

Penelitian

menunjukkan

strategi

yang

menargetkan kontrol sel osteosit dan pengaruhnya terhadap kelakuan sel osteoblas telah terbukti efektif untuk membalikkan proses berkurangnya massa tulang terkait penuaan dan dengan membantu mengkontrol proses osteogenesis.(22) Maka

8


diharapkan dengan pegagan dapat mempromosikan proses osteogenesis guna pencegahan osteoporosis. Farmakokinetik fitoestrogen dari pegagan kemungkinan dipengaruhi oleh faktorfaktor lain yang tidak diteliti seperti lama penyimpanan ekstrak atau faktor kandungan kimia lain dari pegagan yang berinteraksi dengan tubuh tikus. Hal ini membuktikan bahwa pemberian ekstrak daun pegagan pada dosis 180mg/kgBB dapat meningkatkan jumlah osteosit tulang tibia tikus Wistar pasca ovariektomi dengan risiko osteoporosis. Dari mekanisme kerja flavonoid sebagai fitoestrogen dan antioksidan yang terkandung dalam pegagan yang mengurangi stres oksidatif, pegagan dapat menghambat kenaikan jumlah osteoklas pada proses destruksi tulang tibia tikus. Namun tidak meningkatkan jumlah sel osteoblas. Perlu penelitian lebih lanjut untuk mengetahui apakah ekstrak daun pegagan dapat memberikan efek preventif pada pasien dengan risiko penyakit osteoporosis dengan jumlah sampel yang lebih banyak, durasi penelitian yang lebih lama (lebih dari 3 bulan) dan dosis yang berbeda. KESIMPULAN Dari hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat ditarik beberapa kesimpulan sebagai berikut: Pemberian ekstrak pegagan (Centella asiatica L.) pada dosis 60mg/kgBB dan 120mg/kgBB dapat menurunkan jumlah sel osteoklas tikus pasca ovariektomi secara signifikan. Ekstrak pegagan tidak memberikan peningkatan jumlah sel osteoblas yang bermakna. Pemberian ekstrak pegagan (Centella asiatica L.) pada dosis 180mg/kgBB dapat meningkatkan jumlah sel osteosit tikus pasca ovariektomi secara signifikan. SARAN Untuk tujuan pengembangan keilmuan, diperlukan penelitian lebih lanjut mengenai:

9


-‐

Diperlukan proses dekalsifikasi tulang yang lebih baik untuk mendapat sajian histologis yang lebih baik.

-‐

Perlunya waktu perlakuan terapi yang lebih panjang, misalnya 3 bulan. Dengan waktu 3 bulan akan menunjukkan hasil yang berbeda dengan penelitian yang hanya dilakukan dalam waktu 1 bulan dalam hal jumlah osteoklas, osteoblas dan osteosit.

-‐

Memperpanjang range dosis ekstrak pegagan (Centella asiatica L.) agar dapat terlihat jelas efek terapi untuk meningkatkan jumlah sel osteoblas.

-‐

Diperlukan penelitian lebih lanjut dengan bentuk sediaan ekstrak daun pegagan yang dapat diaplikasikan pada subjek manusia, misalnya dibuat teh pegagan atau bubuk.

10


DAFTAR PUSTAKA 1.

Glaser, David L, Kaplan, Frederick S. Osteoporosis: Definition and Clinical Presentation. 1997;22(24):12-6.

2.

Martono, Budi, Ghulamahdi M, Darusman L, Arifin S. Kriteria Penanda Seleksi Produktivitas Terna dan Asiatikosida Pada Pegagan (Centella asiatica {L.} Urban). Jurnal Littri. 2010;16(1):12-9.

3.

Mohd

N,

Ismal

N.

Postmenopausal

Osteoporosis:

Epidemiology,

Pathophysiology and Treatment. Malaysian Journal of Patology. 1997;19(1):215. 4.

Schart D. Phytoestrogens for Menopausal. Nutrition Action. 2000.

5.

Barnes J, Anderson L, Phillipson J. Herbal Medicines. Pharmaceutical Press. 2007;3:71-3.

6.

Zheng C, Qin L. Chemical Components of Centella asiatica and Their Bioactivities. Journal of Chinese Integrative Medicine. 2007;5(3):348-51.

7.

Subban R, Veerakumar A, Manimaran R. Two New Flavonoids from Centella asiatica (Linn.). Journal of Natural Medicines. 2008;62:369-73.

8.

Nancy E, Lane. Epidemiology, Etiology and Diagnosis of Osteoporosis. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 2006;194:3-11.

9.

Guo. Kaempferol as a Flavonoid Induces Osteoblastic Differentiation Via Estrogen Receptor Signaling. Chinese Medicine. 2012;7(10).

10.

Endang L. Fitoestrogen: Senyawa Alami yang Aman Sebagai Pengganti Hormon Estrogen Pada Wanita. Yogyakarta: Universitas Gajah Mada; 2011.

11.

Choi E, Hwang J. Effects of Catechin on the Function of Osteoblastic Cells. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 2003;26(4):523-6.

11


12.

Yang Y, Yang Z, Wang D, Xiao X, Li P. Comparative Study on Effects of Rutin and Quercetin on Metabolism

in Osteoblast Cells. Zhong Yao Cai.

2006;5(4):67-70. 13.

Nakamura T, Imai Y, Matsumoto T, Sato S. Estrogen Prevents Bone Loss via Estrogen Receptor α

and Induction of Fas Ligand in Osteoclasts. Cell.

2007;130:811-23. 14.

Susan K, Gustavo A, Miranda C, Peter H, Carroll J, Timothy F, et al. Estrogen protects bone by inducing Fas ligand in osteoblasts to regulate osteoclast survival. The EMBO Journal. 2008;27:535-45.

15.

Simone C, Neale M, Cristiana R, Noriyuki N, Deborah N, Jessica W, et al. Estrogen Deficiency Induces Bone Loss by Enhancing T-cell Production of TNF-α. The Journal of Clinical Investigation. 2000;106(10):1229-337.

16.

Skibola C, Smith M. Potential Health Impacts of Excessive Flavonoid Intake. Free Radic Biol Med. 2000;29(3-4):375-83.

17.

Maria A. Estrogens Attenuate Oxidative Stress and the Differentiation and Apoptosis of Osteoblasts by DNA-binding-independent actions of the ERα. Journal of Bone and Mineral Research. 2010;25(4):769-81.

18.

Wattel. Potent Inhibitory Effect of Naturally Occuring Flavonoids Quercetin and Kaempferol on In Vitro Osteoclastic Bone Resorption. Biochemical Pharmacology. 2003;65:35-42.

19.

Bakhsh A, Mustapha N, Mohamed S. Catechin-rich Oil Palm Leaf Extract Enhances Bone Calcium Content of Estrogen-Deficient Rats. Nutrition. 2013;29(4):667-72.

20.

Dang Z, Lowik C. Dose-Dependent Effects of Phytoestrogens on Bone. Trends Endocrinol Metab. 2005;16(5):207-13.

12


21.

Umland E, Cauffield J, Kirk J, Thomason T. Phytoestrogens as Therapeutic Alternatives to Traditional Hormone Replacement in Postmenopausal Women. Pharmacotherapy. 2000;20(8):981-90.

22.

Ramiya S. Osteocytes: Key to Increasing Bone Mass. Medical Tribune. 2012.

13


Gambar 1. Diagram rerata dan standar deviasi jumlah sel osteoklas tikus K-

: Kelompok Kontrol Negatif (akuades)

K+

: Kelompok Kontrol Positif (vitamin E)

P1

: Kelompok Perlakuan 1 (Pegagan 60mg/kgBB)

P2


P3


14


Gambar 2. Diagram rerata dan standar deviasi jumlah sel osteoblas tikus K-


K+


P1


P2


P3


15


Gambar 3. Diagram rerata dan standar deviasi jumlah sel osteosit tikus K-


K+


P1


P2


P3


16


Gambar 4A. Tampilan osteoklas pada potongan memanjang tulang tibia tikus dengan pewarnaan HE

Gambar 4B. Tampilan osteoblas pada potongan memanjang tulang tibia tikus dengan pewarnaan HE

Gambar 4C. Tampilan osteosit pada potongan memanjang tulang tibia tikus dengan pewarnaan HE

17


Effects of Centella asiatica L. Towards Number of Osteoclasts, Osteoblasts and. Osteocytes in Tibiae of Ovariectomized Rats (Rattus norvegicus)

Recommend Documents