Dr. Karabélyos Csaba

2013. XV. évfolyam 2. szám

FOCUS MEDICINAE Felelős szerkesztő: Dr. Szolnoky Miklós Főszerkesztő: Dr. Karabélyos Csaba Szerkesztőbizottság: Dr. Bencsik Krisztina Prof. Czirják László Prof. Horváth Örs Péter Dr. Kalmár Ágnes Dr. Mátrai Zoltán Dr. Nemes László Dr. Paál Mária Dr. Pál Katalin Prof. Zeher Margit Szerkesztőbizottság tanácsadó testülete: Prof. Fekete György Prof. Kiss Attila Prof. Kiss István Prof. Komoly Sámuel Prof. Lipták József Prof. Mándi Yvette Prof. Maródi László Prof. Medgyesi György Dr. Mészner Zsófia Dr. M. Tóth Antal Dr. Nagy Kálmán Prof. Pálóczi Katalin Prof. Perner Ferenc Prof. Pénzes István Prof. Péter Ferenc Prof. Romics Imre Prof. Rozgonyi Ferenc Prof. Sas Géza Prof. Schuler Dezső Dr. Siklós Pál  Prof. Szegedi Gyula Dr. Szita János Prof. Tekeres Miklós Prof. Tímár László Dr. Trestyánszky Zoltán Prof. Tulassay Tivadar

Focus Medicinae

Tartalomjegyzék Bevezetés........................................................................................................................... 2 /Introduction/ Dr. Karabélyos Csaba In memoriam Prof. Dr. Szegedi Gyula ....................................................................... 3 Prof. Zeher Margit Vércsoport-szerológiai módszerek változása az elmúlt 25 évben. Quo vadis immunhematológia? ................................................................................... 4 /Changes in the red serology during the recent 25 years. Quo vadis immunohematology?/ Dr. Nemes Nagy Zsuzsanna, Dr. Nagy Sándor Az elmúlt 25 év vérkészítmény előállítása ............................................................... 12 /Blood preparation in the recent 25 years/ Dr. Baróti-Tóth Klára Az aferezis szerepe a gyógyításban ........................................................................... 22 /The role of apheresis in the therapy/ Dr. Tremmel Anna Down szűrés a gyakorlatban....................................................................................... 27 /Down screening in the practice/ Dr. Török Olga ACPA: citrullinált proteinek és peptidek elleni antitestek és jelentőségük a rheumatoid arthritis laboratóriumi diagnosztikájában ..................................... 33 /ACPA: antibodies against citrullinated proteins and peptides and their importances in the laboratory diagnostics of rheumatoid arthritis/ Dr. Nagy Gábor

Alapító: Biotest Hungaria Kft. Kiadja és a nyomdai munkáért felelős: Dursusz Bt. Szerkesztőség és levelezési cím: 2045 Törökbálint, Torbágy u. 15/A ISSN: 1419-0478 Megjelenik: évente négyszer Előfizetési díj: 2014. évre 2014,- Ft + 5% áfa 1


Focus Medicinae

FOCUS MEDICINAE

Interdiszciplinális tudományos folyóírat

Tisztelt Olvasó! 15 év egy ember esetében nagy idő, 180 hónap alatt már kis híján a csecsemő is nagykorúvá cseperedik. A Biotest Hungaria Kft. a Dursusz Kiadó gondozásában 1999-ben életet adott egy kedves kisgyermeknek, akit elnevezett Focus Medicinae-nek, és amely azóta is töretlen lelkesedéssel szolgálja a tudományt és ontja a szakmai publikációkat különféle immunológiai témakörökben. Eleinte immunglobulinokkal tarkított sötétkék burkolatát keresték az érdeklődők, majd néhány éve cégünk arculatához igazodva négy évszakra színezett fehér külsőt adtunk a lapnak. Idén 2013-at írunk, jövőre a 15. életévünkbe lépünk, és nem csüggedünk, hanem mindmáig lelkesen keressük az új és érdekes szakmai témákat, hogy azok segítségével kommunikációs csatornát hozhassunk létre Nyugat- és Kelet-Magyarország valamint Észak és Dél között. Tapasztalataink alapján Olvasóink szívesen fogadják a kiadványt, és néha több kiadványon keresztüli eszmecserékkel tarkítják a színvonalat. Hirtelen elhatározástól vezérelve eme nevezetes születésnapon úgy gondoltuk, hogy segítséget kérünk a Biotest Hungaria Kft. életében szerepet játszó legfontosabb szakterületek prominens művelőitől, és az ő összefoglaló jellegű publikációival szerettük volna emlékezetessé tenni az elkövetkező 3 kiadványt. Az első jubileumi számban, azaz a jelen folyóiratban a klinikai és a preparatív transzfuziológia összefoglaló közleményei valamint a laboratóriumi diagnosztika két nagyon aktuális témája kaptak helyet. Az első két összefoglalóban szakmai és üzleti életünk egyik legfontosabb partnere, az Országos Vérellátó Szolgálat szakembereinek tollából betekintést nyerhetünk az immunhematológia elmúlt 25 évének módszertani változásaiba valamint az előző negyed század vérkészítmény-előállító eljárásainak fejlődésébe. Szintén egy emberöltőnyi pályafutása van az aferezises terápiának, erről ad egy remek összefoglalást a következő publikáció. Ezt követi napjaink egyik slágertémája, a Down-szűrés diagnosztikájának bemutatása, valamint egy sajnálatos módon egyre többször feltűnő nemkívánatos vendég, az autoantitestek által okozott rheumatoid arthritis történeti, genetikai, diagnosztikai és terápiás áttekintése. Őszintén reméljük, hogy ez, valamint az ezt követő másik két jubileumi szám (Immunterápia, illetve Mikrobiológiai diagnosztika) is el fogja nyerni Kedves Olvasóink tetszését, és ugyanolyan lelkesedéssel fogják forgatni gyermekünk izgalmas lapjait a jövőben is, mint azt eddig tették. Dr. Karabélyos Csaba

ÚTMUTATÓ SZERZŐINKNEK: A folyóiratban eredeti áttekintő jellegű közleményeket, valamint folyóiratreferátumokat jelentetünk meg. A kézirattal kapcsolatos formai követelmények (eredeti és áttekintő /review/ jellegű közlemények) a következők: A kézirat sorrendje: • magyar nyelv cím, szerzővel, intézettel együtt • magyar nyelvű absztrakt • magyar kulcsszavak • angol nyelvű absztrakt • angol kulcsszavak • szöveg (csak magyarul) • irodalomjegyzék (max. 30) • táblázat(ok) • ábrá(k), ábrajegyzék Cím: a szerzők a munkahelyük megjelölésével szerepeljenek a közlemény címét követően. Absztrakt: maximálisan 1 oldal terjedelmű legyen, az absztraktok esetén bekezdéseket ne használjunk, folyamatosan történjen a gépelés. Kulcsszavak: 5-10 jellemző kulcsszót emeljünk ki a szöveg elé, mindkét nyelven. Szöveg: (az itt felsorolt követelmények természetesen az absztraktra is vonatkoznak) 1 oldal: 27-30 sor – 1 sor: 70 leütés Betűtípus: Arial, normál 12-es méretű, (a szöveg, amennyiben lehetséges Windows XP vagy újabb változatban készüljön). Maximális oldalszám: 10 (esetenként ettől eltérés lehet a szerkesztőbizottság döntése alapján), kívánt oldalszám: 6-8 oldal (A/4).

2

Helyesírás: ahol lehet, magyar kifejezéseket és magyaros írásmódot használjunk. Irodalomjegyzék: a hivatkozások száma ne haladja meg a 30-at, a szövegben az adott bekezdés végén levő, dőlt, zárójelbe tett szám jelezze a citált publikációt, az irodalomjegyzék első szerző szerinti ABC-rendben készüljön. Formai kérések: 1. Szerzők megjelölése dőlt betűvel (elől családnév, utána keresztnév első betűje ponttal zárva). 3-nál több szerző esetén az első három szerző után et al.: álljon. 2. A cikk teljes címe 3. A folyóirat hivatalos rövidítése (pl. N. Engl.J.Med.), kötetszáma és oldalszáma, majd legvégül az évszám (pl. 73(1), 278-281, 1986) Táblázat(ok): a táblázatok Windows XP vagy újabb verzióval készüljenek, és legyenek címmel ellátva. Ábrá(k): színes ábrákat és fotókat nem áll módunkban leközölni, az esetleges színes ábrák fekete-fehér kópiában jelennek meg. Folyóiratreferátumok: Ezek esetében csak a referáló nevét és a forrást kell feltüntetni, (felül magyarra fordított cím, alatta a forrás pontos adatai, alul a referáló neve). A folyóirat-referátum a két gépelt oldal terjedelmet ne haladja meg, az előbbiekben valamint az eredeti közleményeknél említett követelmények megtartása mellett. Kérjük a szerzőket, hogy a cikkeket E-mail-en adják le szerkesztőségünknek, és amennyiben mód van rá, kinyomtatott formában is juttassák el azt a Biotest Hungaria Kft. irodájába. Cím: 2045 Törökbálint, Torbágy u. 15/A E-mail: [email protected] vagy [email protected]


Focus Medicinae

Professzor úr széleskörű tevékenységét arra az alaptételre építette, miszerint kutatás nélkül nincs egyetemi színvonalú oktatás és gyógyítás. Iskolateremtő, intézetvezetői tevékenysége alatt 25 Nagy veszteség érte a magyar tudományt, belgyógyászamunkatársa szerzett kandidátusi vagy Ph.D fokozatot, tot és klinikai immunológiát, mert 2013. október 30-án 12-en lettek az MTA doktorai, 10 tanítványa egyetemi eltávozott az élők sorából Szegedi Gyula akadémikus úr. tanár, 5 munkatársa főorvosként dolgozik, további 5 kolMint tanítványa, és a DE OEC Belgyógyászati Inléga külföldön folytat sikeres kutatómunkát. Azt vallotta: tézet III. sz. Belgyógyászati Klinikájának orvos-szakmai ahogy egy jó focicsapatban az utánpótlás jó játékosai a igazgatója szeretném méltatni professzor úr kihívásokban hosszútávú sikerek biztosítékai, úgy a klinikai csapatba is és sikerekben egyaránt gazdag pályafutását. már a tehetséges egyetemistákat, tudományos diákköröSzegedi professzor úr immunológia iránti érdeklősöket nyerte meg. Vonzóvá tette számukra a klinikát azzal, dését tanítómestere, Dr. Petrányi Gyula egyetemi tanár hogy viszonylag fiatal életkorban önálló tevékenységet keltette fel, aki hazánkban először kezdett el mélyrehabiztosított számukra emelve ezzel szakmai presztízsüket. tóan foglalkozni az akkor még „kollagén-betegség”-nek A fiatalnak mondható klinikán nagyon nevezett betegségcsoporttal. szerencsés korösszetételű csapat dolgozott, 1975-ben nyílt arra lehetőség, hogy kezés ma is törekszünk erre. Szegedi professzor detben a Tüdőgyógyászati Klinika Általános úrnak bőven jutott energiája arra, hogy számos Belgyógyászati Osztályként, majd önálló III. rangos szakmai testületben aktívan tevékenyszámú Belklinikaként jöjjön létre egy olyan kedjen. A teljesség igénye nélkül kiemelném a klinika, ahol az integratív belgyógyászat megDOTE oktatási majd klinikai rektor-helyettesi tartása mellett már a specializálódás igénye is feladatát, a DE OEC Klinikai Kutatások Doktodomináns volt. Klinikánk alapítója és első igazri Iskolájának vezetését, a szakmai kollégiumi gatója Szegedi Gyula professzor úr volt, aki és az MTA Klinikai I. Tudományos Bizottság áldozatos munkáját 26 éven keresztül végezte. elnöki funkcióját, de a felsorolást még sokáig Klinikánk története klasszikus példája a lehetne folytatni. fejlesztő, alkotó, mindig újító, megújuló, a leProf. Dr. Szegedi Gyula A klinikai immunológia művelése, hetőségeket megteremteni tudó szellemiségre. akadémikus (1936-2013) oktatása területén végzett iskolateremtő teSzegedi professzor úr tevékenységeit mindig a vékenységéért, nemzetközileg is elismert tudományos, következetesség, a fegyelem, a teljesítmény orientáltság gyógyító és oktató munkásságáért 2002-ben a Magyar és a sportszerű sikeresség jellemezte. Köztársaság érdemrend tiszti keresztjével majd 2006-ban A klinikai immunológia az orvostudomány nagyon Széchenyi-díjjal tüntették ki. fiatal területe volt Szegedi professzor úr pályájának kezVáratlan és súlyos megbetegedését hatalmas önfedetén. Hatalmas erőt fektetett abba, hogy a kezdetben gyelemmel és élni akarással viselte. Szellemi aktivitása romos épületben működő belgyógyászati osztályból a az utolsó napokig széles körű, hibátlan és eleven volt. kor színvonalánál mindig egy kicsit jobb szintű, modern Bölcs figyelemmel, megértéssel, megfontoltan, de szókiszemléletű, nagyon sok jól képzett munkatársat kibocsátó mondóan követte a körülötte zajló klinikai és országos klinikát hozzon létre. Hosszú évek kitartó munkájának eseményeket. eredményeként mind regionális, mind országos és nemKedves Professzor Úr! Ígérem, társaimmal ígérjük, zetközi kitekintésben a klinikai immunológia fellegvárát megőrizzük a fontos tanításokat, a jó és nagyszerű pélalakította ki. Az új profilok dinamikus bevezetésével a dákat, a sok-sok útmutatást! klinikán immun-hematológiai, rheumatológiai, intenzív Végül Paulo Coelho egy idézetével szeretnék búterápiás- és angiológiai, valamint geriátriai tanszékek és csúzni, mely tömörségében és megállapításaiban úgy részlegek alakultak ki. érzem, hogy tökéletesen jellemzi Professzor úr életútját: Professzor úr intenzív kutatásokat végzett a Kli„Mi ez az erő, amely messzire vezet a megszokott nikai Immunológián belül a poliszisztémás autoimmun világ kényelmétől, és rávesz, hogy inkább vállaljuk a betegségek területén. E betegségek előfázisában, a nem kihívások seregét, noha tudjuk, hogy e világ dicsősége differenciált collagenosisban leírt megfigyelései nemzetmúlandó? közileg is nagy jelentőségűek. A Magyar Tudományos Úgy hiszem, hogy ezt az ösztönző erőt úgy hívják, Akadémia levelező tagjává 1995-ben, majd rendes tagjává az élet értelmének keresése. 2001-ben választották. Szegedi professzor úr megszervezte az autoimmun Debrecen, 2013. november 29. betegek speciális gondozását, ami nagyban hozzájárult Prof. Dr. Zeher Margit MTA doktora ahhoz, hogy a magyarországi poliszisztémás autoimmun tanszékvezető egyetemi tanár, orvos-szakmai igazgató betegek életkilátásai elérik a legfejlettebb államokban DE OEC Klinikai Immunológia Tanszék tapasztaltakat. Kutatócsoportja aktív hazai és nemzetközi Belgyógyászati Intézet együttműködést épített ki, eredményes munkánkat széles ESZK Immunológiai és Allergológiai Tagozat Elnöke körben ismerik, és nagyra értékelik.

„In memoriam”

3


Vércsoport-szerológiai módszerek változása az elmúlt 25 évben...

Vércsoport-szerológiai módszerek változása az elmúlt 25 évben. Quo vadis immunhematológia? Dr. Nemes Nagy Zsuzsanna, Dr. Nagy Sándor Országos Vérellátó Szolgálat, Budapest Összefoglalás: A transzfúziók sikerét vércsoport-szerológiai kompatibilitás vizsgálatok biztosítják. A kompatibilitási vizsgálatok hagyományos módszertana a hemagglutináció, amely a vércsoport antigéneket, antitesteket és azok reakcióit mutatja ki. Az utóbbi évtizedekben a hemagglutinációs módszerekben jelentős változások következtek be (LISS, proteolitikus enzim technika, oszlop agglutináció, szolid fázis módszer, automatizáció). E beszámoló összefoglalja az immunhematológiai módszerek változásait a 20. század utolsó éveitől napjainkig, és bemutatja a jövő figyelemre méltó technikáit (molekuláris genetikai tesztek, microarray-k).

Summary: Successful transfusions are based on blood serological compatibility testing. Hemagglutination is the traditional methodology of compatibility procedure which detects blood group antigens, antibodies and their reactions. In the last decades there have been many significant developments of hemagglutination methods (LISS, proteolytic enzym test, column agglutination, solid phase methods, automatisation). This review summerizes the changes of immunohematological methods from the last years of 20th century until now and shows the considerable future technics such as molecular genetic assays and microarrays.

Kulcsszavak: antigén-antitest reakció, hemagglutináció, vércsoport-szerológiai kompatibilitás, immunhematológiai módszerek, molekuláris genetikai vércsoport meghatározás

Keywords: antigen-antibody reaction, hemagglutination, blood group serological compatibility, immunohematological methods, molecular blood grouping

Rövidítések

gekben (ÚHB) megjelenő vércsoport-specifikus antitestekkel (anti-D, anti-K, anti-Jka), vagy transzfúziókat követő, hemolitikus transzfúziós reakciók (HTR) kapcsán kimutatott antitestekkel (anti-c, anti-e, anti-Fya) újabb vércsoport-tulajdonságokat, vércsoport antigéneket lehetett meghatározni és azonosítani (9). Érdekes tény, hogy a klinikailag jelentős, legfontosabb vércsoport-rendszerek felfedezése a vércsoport-szerológiai technikák fejlesztése előtt, úgynevezett direkt agglutinációs módszerekkel valósult meg. Ezt az elsőként meghatározott antigének szénhidrát tulajdonsága (AB0, MN), valamint az érintett antitestek immunglobulin osztálya (IgM) tette lehetővé. 1945-től Coombs és munkatársai által bevezetett indirekt antiglobulin teszt (IAT) alkalmazása a vörösvérsejt-szerológiában forradalmasította a vércsoportokkal összefüggő ismereteket. Ez a módszer főleg az IgG immunglobulin osztályhoz tartozó antitesteket és azok reakcióit mutatja ki. Az IAT számos új vércsoport tulajdonság felfedezéséhez vezetett, és a későbbiekben – napjainkig – meghatározza az immunhematológiai gyakorlatot. A transzfúziók biztonsága szempontjából legfontosabb vércsoport-rendszerek antigénjeinek és antitestjeinek felfedezése az 1950-es évekig megtörtént. Ez lehetővé tette, hogy a transzfúziók a mindennapi klinikai gyakorlat részévé váljanak. A transzfúziós gyakorlat bővülése újabb és újabb vércsoport antitestek megismerését hozta, melynek kapcsán egyre újabb vércsoport antigének létére derült fény. Az 1990-es évek elejéig az új vércsoport tulajdonságokat főként hemagglutinációs technikákkal határozták meg (a vércsoportok fenotípusának vizsgálata), míg az expresszált vércsoport tulajdonságot meghatározó

AHG: anti-humán-globulin ASP: allél-specifikus primer BSA: bovin szérum-albumin DAT: direkt antiglobulin teszt (direkt Coombs-teszt) DNS: dezoxiribonukleinsav EDTA: etilén-diamin tetraecetsav ELISA: enzimhez kötött immunoszorbens módszer HTR: hemolitikus transzfúziós reakció IAT: indirekt antiglobulin teszt (indirekt Coombsteszt) LISS: alacsony ionerősségű sóoldat NAT: nukleinsav amplifikációs teszt NISS: normál (fiziológiás) ionerősségű sóoldat PBS: foszfát puffer oldat PCR: polimeráz láncreakció PEG: polietilén-glikol SNP: egy nukleotidot érintő polimorfizmus ÚHB: magzati-újszülöttkori hemolitikus betegség

Bevezetés A vércsoportok vizsgálata a XX. század elején kezdődött, Karl Landsteiner munkásságával, aki egészséges emberek vörösvérsejtjeinek és vérsavójának keresztreakcióit értékelve jutott el a később AB0 vércsoportoknak nevezett tulajdonságok leírásáig. Később már tudatosan megtervezett tudományos módszerekkel, állatok immunizációjából származó immunsavókkal történt a következő néhány vércsoport-tulajdonság keresése, majd ismertetése (MN, P1, Rh, LW). Más vércsoportok felfedezése klinikai esetekhez köthető. A magzati-újszülöttkori hemolitikus betegsé-

4


genetikai háttérre, a lehetséges, valószínű allélekre (genotípus) spekulatív úton következtettek. Napjainkban a molekuláris DNS technikákkal a vércsoport tulajdonság genotípusa is meghatározható, melyből az adott allélekhez tartozó fenotípus kikövetkeztethető (a csendes gének, és egyéb eltérések nem mindig teszik lehetővé a genotípus-fenotípus egyértelmű megfeleltetésének lehetőségét). A genetikai vércsoport meghatározás a vércsoportok vizsgálatában egyre nagyobb teret követel magának, mostanra a tudományos közlemények aránya a hagyományos technikákkal szemben a molekuláris technikák irányába tolódott el (38). Fontos azonban tudni, hogy a transzfúziók biztonságát, a vércsoport-rendszerek immunizáló hatásának kimutatását szolgáló rutin laboratóriumi vizsgálatok napjainkban is a hagyományos, egyszerű, megbízható, jól reprodukálható hemagglutinációs módszerekkel történnek, melyeket a hazai és a nemzetközi klinikai transzfúziós gyakorlat arany standardként tart számon (1). Előreláthatóan ez még hosszú évekig szolgálja a biztonságos immunhematológiai gyakorlatot.

Hemagglutináción alapuló módszerek Mottó: „A vércsoportokról szerzett ismereteink nagy részét egyszerű agglutinációs vizsgálatoknak köszönhetjük. Ismert antitest tartalmú szérumot adunk sós vörösvérsejt szuszpenzióhoz. Amennyiben a sejtek hordozzák a megfelelő antigént, agglutinálódnak; a hiányzó agglutinációból pedig a megfelelő antigén hiányára lehet következtetni.” (R.R. Race és R. Sanger 1950) (1).

Általános vonatkozások A hagyományos vércsoport szerológiai módszerek antigén-antitest reakciókon alapulnak. A vércsoport tulajdonság meghatározása során ismeretlen antigén tulajdonságú vörösvérsejtek vizsgálata történik ismert specificitású antitestet tartalmazó reagensekkel. A vércsoport specifikus antitestek keresése a vérmintákból meghatározott vércsoportú, több antigén szempontjából ismert, tipizált teszt-vörösvérsejtekkel történik. A vörösvérsejtekhez köthető antigén-antitest reakciók laboratóriumi rendszerekben hemagglutinációt vagy a vörösvérsejtek szenzitizációját okozzák. A hemagglutináció két lépésben zajlik. Először a megfelelő specificitású antitestek a vörösvérsejt felszínén lévő antigénekre kötődnek, immunkomplexek alakulnak ki. Ez a rendkívül gyorsan zajló folyamat a szenzitizálódás. Ezt követően optimális körülmények között a fedett vörösvérsejtek között kapcsolat, kötődés, jön létre, összecsapzódnak, látható agglutinátumot képeznek. Direkt agglutináció esetén a fenti két fázis látható eredményt ad, minden külső segítség nélkül, melyben a


résztvevő antitestek többnyire IgM osztályú, nagyméretű immunglobulin molekulák. Ezek méretük miatt képesek hidat képezni a negatív töltéssel rendelkező, egymást taszító vörösvérsejtek között. Indirekt agglutináció esetén a folyamat a szenzitizálódás fázisban megreked, az antigén-antitest kötődés nem válik láthatóvá. Ilyenkor a vörösvérsejtek felszínét általában kisméretű IgG molekulák fedik. Ezek nem tudják áthidalni a vörösvérsejtek közötti távolságot. A direkt vagy az indirekt agglutináció létrejöttét alapvetően a vörösvérsejtek elektronegatív töltése, a zéta potenciál, az antigének fiziko-kémiai tulajdonságai, valamint az antitestek immunglobulin osztálya határozza meg. Bizonyos feltételek biztosításával – a sejtek negatív töltésének csökkentésével, áthidaló segédmolekulák alkalmazásával – a szenzitizáció is kimutathatóvá válik.

A hemagglutinációt meghatározó tényezők és alkalmazásukban bekövetkezett változások Vérminta Az antigén-antitest reakciók kimutatásának sikere a megfelelő vérmintával kezdődik. A vizsgálatokhoz minőségileg és mennyiségileg megfelelő vérminta szükséges. A vérminta a klasszikus vércsoport vizsgálatokban natív, alvadásban nem gátolt, melyben a véralvadás tökéletesen befejeződött a vizsgálat idejére. Az alvadás közben frissen keletkező fibrin az agglutináció értékelését zavarja. EDTA-val vagy nátrium-citráttal alvadásgátolt vérminták használata az elmúlt negyedszázadban egyre inkább előtérbe került, használatuk napjainkban hazai és nemzetközi vonatkozásban is általános. Ennek alapvető oka az, hogy a vércsoport-szerológiában egyre szélesebb körben elterjedő automatizált módszerekhez ilyen vérminták szükségesek. EDTA alkalmazása esetén számolni kell azzal, hogy a kalcium ionok felhasználásával kelát-képződés indul meg a vérmintában, amely a komplementkötő antitestek kimutathatóságát csökkenti (42). A vizsgálatok sikerességét a vérminta kora is befolyásolja. A vércsoport-szerológiai reakciókhoz friss, 24 órán belüli vérminta a legmegfelelőbb. Hűtőben tárolt vérmintát 72 óráig lehet vizsgálni, de az idő múlásával számolni kell az antitestek kimutathatóságának csökkenésével (29,35). Vércsoport-szerológiai vizsgálatokhoz csak az eljárási rendek szerint megfelelően azonosított vérminta használható (22,35).

Reagensek, tesztsejtek, oldatok Specifikus antitesteket tartalmazó reagensek Poliklonális (humán vagy állati szérumok), vagy monoklonális (humán vagy állati sejtvonalakból származó) antitestek használhatók (29,42). 5



Az utóbbi negyed században elterjedtek mind a nemzetközi, mind a hazai gyakorlatban az akkreditált laboratóriumi körülmények között, ipari mennyiségben előállítható, magas titerű, jól standardizálható, állandó minőséget biztosító, kereskedelmi forgalomban kapható monoklonális antitestek (13,29,35). A napi rutin gyakorlatból szinte teljesen kiszorították az emberi vérből előállított, változó mennyiségű antitestet tartalmazó poliklonális reagenseket. A monoklonális antitestek / antitest keverékek alkalmazása esetén számolni kell azzal, hogy ezek az antitestek az érintett antigénnek csak meghatározott epitópjával, epitópjaival reagálnak, nem pedig az összessel. A szerológiai vizsgálatok biztonságát szolgálják, hogy a 80-as évektől a legfontosabb reagenseket színkóddal látják el. Az anti-A reagensek kék, az anti-B reagensek sárga színűek. A színt pontosan meghatározott fajta festékek hozzáadásával érik el a reagensek gyártása során (13,35). A színes antitestek alkalmazásakor látható, hogy a reagens bemérése a vizsgálati mintához megtörtént. Az AB0 vércsoport meghatározáshoz a nemzetközi gyakorlat (13,35) anti-A és anti-B monoklonális reagensek, míg a hazai gyakorlat anti-A, anti-B és anti-AB reagensek alkalmazását írja elő a gyenge vércsoport tulajdonságok kimutatása érdekében (26). Az RhD meghatározáshoz két monoklonális anti-D reagens szükséges (25,26,28).

Antitestszűrő tesztsejt-készlet Az ellenanyagszűréshez olyan 2-3 tagú készletet kell használni, amely 0 vércsoportú, klinikailag jelentős vércsoport-rendszerek egyes antigénjeire tipizált, azokat homozigóta formában tartalmazó, egyedi donoroktól származó tesztsejtekből áll (13,29,35).

Tesztsejtek, tesztsejt-készletek Az AB0 vércsoport meghatározáshoz, antitestszűréshez, antitest-azonosításhoz, pozitív és negatív kontroll vizsgálatokhoz tesztsejt reagensek használatosak. Az állandó minőség biztosításához ajánlott a kereskedelmi forgalomban kapható, szakmai szempontok alapján standardizált tesztsejt-készlet alkalmazása. Ez az elv a nemzetközi gyakorlatban már a 80-as években általános volt (13,35), a hazai gyakorlatban pedig negyedszázad alatt egyre erősödő kívánalommá vált. A kereskedelmi forgalomban kapható AB0-tesztsejt, antitestszűrő, és antitest-azonosító panelsejt sorozatok a hazai napi rutin gyakorlatból teljesen kiszorították a helyi laboratóriumokban előállított változó minőségű tesztsejt készítményeket.

Alacsony ionerősségű oldat (LISS) A fiziológiásnál kevesebb iont tartalmazó közegben az antigén-antitest kötődés gyorsul, a reakcióidő lerövidül. A LISS oldatok hazai használata a 80-as években már elkezdődött, alkalmazásuk jelenleg a napi rutin elengedhetetlen része (56).

AB0 tesztsejt-készlet Az AB0 vércsoport meghatározás részeként az AB0-antitestek kimutatásához legalább A1 és B tulajdonságú sejtet kell használni (13,29,35). A hazai gyakorlat a négy tagból álló AB0 tesztsejt-készlet alkalmazását írja elő, amely A1, A2, B, 0 vércsoportú tesztsejteket tartalmaz (26). Ez az AB0 vércsoport meghatározás fokozott biztonságát szolgálja, melyben a gyenge A tulajdonságú sejt, a 0 tulajdonságú sejttel együtt lehetővé teszi bizonyos irreguláris antitestek kimutatását. A 0 tulajdonságú sejt a vizsgálat negatív kontrolljául is szolgál. Az AB0 tesztsejt-készlet összetételére vonatkozó hazai szabályozás nem változott az elmúlt negyedszázad során. 6

Antitest-azonosító tesztpanel sor Az ellenanyag-azonosításhoz több, általában 8-16 tagból álló, 0 vércsoportú, klinikailag jelentős vércsoport-rendszerek egyes antigénjeit homozigóta és heterozigóta formában is tartalmazó tesztsejt-készletet kell használni, melynek tagjai egyedi donoroktól származnak (13,29,35). Oldatok, érzékenyítő adalékok, segédantitestek Kereskedelmi forgalomban kapható oldatok használatát kell előtérbe helyezni a helyi laboratóriumokban készítettek helyett. Ez a kívánalom a hazai gyakorlatban mára általánossá vált. Fiziológiás sóoldat Vörösvérsejt szuszpenziók készítésére, sejtmosásra használhatók, úgynevezett normális ionerősségű oldatok (NISS). A reakciókhoz szükséges megfelelő pH-t különböző puffer-rendszerekkel lehet biztosítani (42). Általánosan elterjedt a foszfát pufferek (PBS) alkalmazása.

Makromolekulák A vörösvérsejtek negatív töltésének, a zéta potenciálnak a csökkentésével teszik lehetővé az agglutináció kialakulását. A bovin szérum-albumin (BSA) oldatok az egyes poliklonális reagensek hatásnövelő alkotórészei voltak. Lemez technikák alkalmazásakor használatuk a 80-as években előírásszerűen történt. A poliklonális reagensek háttérbe szorulásával, a vércsoport-szerológiai rutin technikák változásával hazai alkalmazása napjainkra gyakorlatilag megszűnt. A polietilén-glikol (PEG) és polybrene érzékenyítő oldatok rutin használata Magyarországon sosem terjedt el a napi gyakorlatban. Ezeket az oldatokat a nemzetközi laboratóriumokban széleskörűen alkalmazták, használatuk napjainkban már nem általános (13,29,35). Proteolitikus enzimek A proteolitikus enzimek a vörösvérsejtek felszínéről sziálsav maradékot lehasítva, csökkentik a sejtek negatív töltését, ezáltal lehetővé teszik az agglutináció kialakulását. Segítik egyes antigének felszínre kerülését


(Rh, Jk), így az antitestek könnyebben kötődnek hozzájuk. Más molekulákat eltűntetnek a sejtről (Fy, M, N, S), ezért ezek enzim technikákkal nem vizsgálhatók. A papain, a bromelin, a ficin valamint a tripszin, a kimotripszin és a neuraminidáz alkalmazása a múlt század utolsó két évtizedében széleskörű és általános volt a vércsoport-szerológia minden területén (13,29,35,49). Magyarországon elsősorban a papain és a bromelin terjedt el. Jelenleg az enzim technikák a nemzetközi gyakorlatban antitest azonosítások részeként, főleg referencia laboratóriumokban kerülnek alkalmazásra. Az enzimek használata nálunk is korlátozódott (24), az enzim reagensek helyi laboratóriumi előállítása megszűnt. Az enzimes ellenanyagszűrés azonban a kompatibilitási vizsgálatsorozat kötelező részét képezi (22). Az ellenanyag-azonosításban az enzim technika szintén a napi rutin része. Ehhez kereskedelmi forgalomban kapható, enzimkezelt sejtkészleteket használnak. Anti-humán-globulinok Az anti-humán-globulin (AHG) olyan segédantitest, amely hidat képez az antitestekkel és/vagy komplement-komponensekkel fedett vörösvérsejtek között, ezáltal a vörösvérsejtek szenzitizációja láthatóvá válik (42). Az AHG-t klasszikusan állatokban (kecske, nyúl) termeltették emberi immunglobulinok Fc része ellen. Jelenleg poliklonális (állati szérumok), vagy monoklonális (állati sejtvonalakból származó) antitestet/ antitest keveréket tartalmazó AHG reagensek használhatók. Napjaikban az AHG segédantitestek körében is a monoklonális reagensek dominálnak. Az AHG reagensek lehetnek polispecifikusak vagy monospecifikusak. A polispecifikus reagensek anti-IgG-t és anti-C3-t tartalmaznak. A monospecifikus reagensek közül leginkább az anti-IgG használata a jellemző. Vannak egyéb immunglobulin osztály illetve alosztály specifikus AHG-k is. A hazai gyakorlatban a rutin AHG technikákhoz a polispecifikus reagensek használata ajánlott. AHG reagensek zöld színűek, a színt pontosan meghatározott fajta festékek hozzáadásával érik el a reagensek gyártása során (13,35). A reagenseket a direkt antiglobulin technikához (DAT, direkt Coombs-teszt), vagy az indirekt antiglobulin technikához (IAT, indirekt Coombs-teszt) használják. A DAT a vörösvérsejtek in vivo fedettségét vizsgálja. Az IAT során a savóból/plazmából antitestek, a vörösvérsejtek felszínéről antigének kimutatása lehetséges. Az AHG-k és a hozzájuk kapcsolódó technikák használata az elmúlt negyedszázadban általánosan elterjedt, napjainkban is ajánlottak mind a hazai, mind a nemzetközi napi rutin gyakorlatban. Az IAT alkalmazása ellenanyagszűréskor és azonosításkor, valamint laboratóriumi keresztpróbák végzésekor általános követelmény (8,13,29,35).


Vércsoport szerológiai módszerek és alkalmazásukban bekövetkezett változások Lemez technika Egyszerű, könnyen kivitelezhető, klasszikusan sós közegű antigén-antitest vizsgálatokra kidolgozott módszer. Direkt agglutinációk kimutatására a legalkalmasabb. A vércsoport-szerológiai vizsgálatok kezdeteitől, de még a 80-as években is széles körben alkalmazott technika volt, bár már abban az időben a csöves metodikák kezdték kiszorítani. Mivel nem automatizálható, és viszonylag nagy minta- és reagens-igényű, ezért az alkalmazási területe egyre szűkül, de még ma is van létjogosultsága (23). Direkt agglutináló, IgM reagensek használatával elsősorban AB0 és RhD vércsoport meghatározásra, és egyéb antigének vizsgálatára, és speciális betegcsoportoknál használható. Az automata rendszerekkel történő antigén vizsgálatok diszkrepanciájának tisztázásakor is hasznos vizsgálati technika lehet. Csöves technika A csöves technikák során az agglutinációs reakciót centrifugálással teszik érzékenyebbé, illetve láthatóvá. A technika többféle hőmérsékleten végezhető, többféle közeggel, és érzékenyítő módszerrel kombinálható. A csöves módszerek alkalmazása hozzáértést és pontosságot igényel (29). Hideg típusú antitestek vizsgálatakor szobahőmérséklet (20-22oC), de ennél hidegebb inkubációs hőmérséklet is választható. Meleg típusú antitestek esetén a vizsgálatokat 37oC-on végzik. A sós közegű csöves technikák alkalmazásakor az inkubációs idő 45-60 perc. A LISS oldat az inkubációs időt 10-15 percre rövidíti, az antitestek kötődését gyorsítja. Enzimek alkalmazásakor egy- vagy kétfázisú enzimkezelésre nyílik lehetőség. AHG reagenssel csőben DAT és IAT vizsgálatok is elvégezhetők (31,12). A csöves technikákban az érzékenyítő módszerek egymással kombinálhatók. Különösen a kombinált enzim-technikáknál fordul elő, hogy a vizsgálat túlérzékennyé válik, és álpozitív reakciók jelennek meg. Az AHG tesztek alkalmazásakor kritikus pont a sejtek mosása, a kötetlen antitestek eltávolítása. Ehhez automata sejtmosókat használnak. A mosás hatékonyságát a folyamat végén kontrollálni szükséges (29,32). A csöves technikák széles körben elterjedtek a mindennapi vércsoport-szerológiai gyakorlatban. Megfelelő érzékenységet mutatnak vércsoport vizsgálatok, ellenanyag kimutatások területén. A kilencvenes években a nemzetközi és hazai gyakorlat alaptechnikájának számítottak. Napjainkban AB0, RhD vércsoport vizsgálatokban, antigén meghatározásokban, ellenanyag-azonosítási eljárásokban, antitest-titrálások esetén is létjogosultságuk van (56). 7


A microplate, a szolid fázis és az oszlop agglutinációs módszerek előretörésével az alkalmazási területük szűkül. Csöves módszerekre fél- és teljes automata rendszereket is kifejlesztettek (16,55), ezeknek elsősorban hazai alkalmazása történik. Microplate technika Folyékony vagy szolid fázis technikák, amelyekben az antigén-antitest reakció 96 lyukú microplate U vagy V alakú csövecskéiben vagy azok falához kötve játszódik le. A folyékony fázisú eljárásokban a microplate-k beszárított reagenseket tartalmazhatnak. A szolid fázisú technikák esetén a csövecskék aljához vörösvérsejt membrán darabok, vagy antitestek vannak kötve. A szerológiai reakció ezek felületén zajlik (30). A vizsgálatok IAT-tel és enzim-technikával is kombinálhatók. A módszernek kicsi a reagens igénye, és jól automatizálható (47). A folyékony fázis technika AB0, RhD vércsoport vizsgálatra, C, c, E, e, K antigének rutin meghatározására alkalmas, a szolid fázis technikát a fentieken kívül ellenanyag vizsgálatokra is alkalmazzák (55). A technika nagy mennyiségű minta egyidejű vizsgálatát is lehetővé teszi. Teljes és félautomata rendszerekben is alkalmazható, automatizált platformok egyik lehetséges vizsgálati technikája. Napjainkban a mindennapi rutin egyik alapmódszerének számít mind a nemzetközi, mind a hazai vércsoport szerológiai gyakorlatban (55). Oszlop agglutinációs technika Az oszlop agglutinációs módszereknél az antigén-antitest reakció gélt vagy üveggyöngyöket tartalmazó csövecskékben játszódik, melyek kártyához kötve helyezkednek el. A gél lehet neutrális közegű, de tartalmazhat specifikus antitesteket, valamint AHG-t is. A vizsgálatok enzim-technikával is kombinálhatók. Az antigén-antitest reakció a gél fölötti reakció kamrában játszódik. Az esetleges inkubációt követő centrifugálás után az agglutinált sejtek a gél felszínen vagy a gél mátrixban csapdába esnek, míg az agglutinálatlan sejtek a gél alján gyűlnek össze (21). A módszer kevés mintát igényel, kivitelezése és értékelése rendkívül egyszerű. Az eredmények a géloszlopban hosszú ideig stabilak maradnak, ezért az eredmények validálása később is megtörténhet. A technika érzékeny, AB0 és RhD vércsoport meghatározásra, egyéb antigén vizsgálatokra, ellenanyag-szűrésre (7) és azonosításra (18,57) és laboratóriumi keresztpróbák (33) elvégzésére is alkalmas. Kevert sejtpopulációk kimutatására optimális (29). Teljes és félautomata rendszerekben is alkalmazható, automatizált platformok egyik lehetséges vizsgálati technikája. 8


A mikrogél technika elvét a 80-as évek végén dolgozták ki (8,21). Napjainkban a mindennapi rutin vércsoport-szerológia meghatározó módszerének számít mind a nemzetközi, mind a hazai gyakorlatban. Az antitestszűrést és azonosítást, a DAT-ot (12), az IAT alapú laboratóriumi keresztpróbát döntően ezzel a módszerrel végzik (8). A hagyományos technikák összehasonlítása Számos közlemény jelent meg (7,12,15,34,55,56), amely a különböző csöves, microplate, szolid fázis, oszlop agglutinációs technikák érzékenységével, specificitásával, összehasonlításával foglalkozik az antitestek kimutatása tekintetében. Egyetlen olyan módszer sincs, amely önmagában az összes klinikailag jelentős antitestet kimutatná (29). A technikák érzékenysége LISS-, enzim-, IAT- módszerekkel fokozható (19). Az érzékenyítő ágensek használatakor a nem specifikus reakciók értékelése gondot jelenthet. A csöves IAT technikát megfelelő érzékenységűnek ítélik a vércsoport antitestek kimutatásához, azonosításához (55). A szolid fázis és mikrogél technikák érzékenysége meghaladja a csöves technikákét az antitest kimutatások területén, de több, nem jelentős antitestet is kimutatnak. Automatizálás Elsősorban a folyékony és szolid fázisú microplate technikák valamint az oszlop agglutinációs módszerek automatizálhatók jól (39,47). Ezeket kombinálva nagy teljesítményű platformok hozhatók létre, amelyekben az AB0, RhD vércsoport meghatározást és antitestszűrést megfelelő érzékenységű módszerekkel végzik (38). A teljesen automatizált rendszereknél a mintaazonosítástól, a bemérésen, a munkafolyamatokon keresztül, a leolvasást, az eredmények értékelését is automata végzi. Az automatákkal meghatározott eredményeket felelős személy általi validálást követően a laboratóriumi informatika rendszerbe küldik, ahol az eredmények a megfelelő mintához, illetve a mintaadó személyhez rendelődnek (35,46). Nagyszámú mintát vizsgáló laboratóriumokban az automaták használata az alapvető vércsoport-szerológiai vizsgálatok tekintetében szakmai elvárás, a vizsgálatok biztonságát szolgálja (13,29,35,46). A vércsoport-szerológiai automaták használata nemzetközi és hazai viszonylatban is bekerült a napi rutinba.

Nem agglutináción alapuló módszerek ELISA (enzimhez kötött immunoszorbens vizsgálat) A 80-as évek óta használják szabad vagy kötött vércsoport antitestek mennyiségi meghatározására a vércsoport-szerológiában. A reagens anti-IgG molekula, melyhez enzimet kapcsolnak. Ezt adják fixált IgG molekulákhoz, vagy vörösvérsejtekhez kötött IgG-hez.


Az enzim szubsztrátjának hozzáadását követően fotometriás módszerrel értékelik a reakciót (29,42). Hazai alkalmazásban nem terjedt el.

Áramlási citometria A 90-es évek óta alkalmazott érzékeny módszer, amely vércsoport antitestek mennyiségi meghatározására, vörösvérsejt, fehérvérsejt, thrombocyta antigének vizsgálatára, epitópok számának meghatározására is alkalmas (8,29). A vizsgálatokhoz fluoreszcens festékkel jelölt antitesteket használnak. Magyarországon hozzáférhető, de vércsoport-szerológiai rutinban elvétve alkalmazott módszer.

Molekuláris genetikai módszerek A vércsoport polimorfizmusok meghatározására időnként szükség van a tulajdonságok génszintű vizsgálatára is. A genotípusból a fenotípus az esetek jelentős részében kikövetkeztethető (20). Számos vércsoport antigén egyetlen nukleotidot érintő változás, azaz SNP (single nucleotide polimorphism) következménye. Ezek vizsgálatakor az érintett SNP jelenlétét vagy hiányát mutatják ki (FY) (10,11,20). Vannak komplex vércsoport-rendszerek, ahol egy SNP vizsgálata nem elegendő, legalább 10-15 polimorfizmust kell vizsgálni (AB0, RH) (11,38,43). A vércsoport polimorfizmusokat nukleinsav amplifikációs tesztekkel (NAT) vizsgálják, amelyek többnyire polimeráz láncreakción (PCR) alapulnak. A gyakorlatban a PCR amplifikációt egy adott génszakasz jelenlétének vagy hiányának igazolására végzik. A PCR kombinálható restrikciós enzim technikával, alkalmazható allél specifikus primerrel (ASP), megtörténhet a termék direkt szekvenálása, végezhető kvantitatív meghatározás is (real-time PCR) (53,58). A polimorfizmus genotípusának meghatározása hasznos lehet ÚHB veszélye esetén az apai RHD gén dózisának meghatározására, magzati DNS vizsgálatára anyai perifériás vérből, gyenge antigén tulajdonságok genetikai kimutatására (FY, RHD) (14,39), donor sejtek tipizálására ritka antigén tulajdonságokra, ha reagens nem áll rendelkezésre, politranszfundált beteg saját genotípusának meghatározására, DAT pozitivitás esetén, a beteg genotípusának vizsgálatára (10,11,38,43). A genotípus meghatározása és ezek alapján a lehetséges fenotípusok kikövetkeztetése nem tartozik a napi rutin vércsoport vizsgálatok közé, de referencia laboratóriumokban, valamint véradók vércsoport tulajdonságainak meghatározásában egyre szélesebb körben használják (54).

Microarray A microarray olyan biochip módszer, melyben kisméretű üveg vagy szilikon hordozóhoz térben rendezett molekulasorozatokat kötnek.


Ezekkel sok, 1000-100 000 tulajdonság szimultán vizsgálata lehetséges. A vizsgálatokhoz rendkívül kevés minta szükséges (nanoliter, pikoliter). A DNS alapú microarray-ben sok gén (40,45), a protein microarray-ben sok fehérje tulajdonság egyidejű meghatározására (48) van lehetőség. Kombinált microarray-ket is kifejlesztettek (40). Számos microarray már hozzáférhető a kereskedelmi forgalomban. Hazai alkalmazására az immunhematológiában még nem került sor.

Összefoglalás Az immunhematológiai vizsgálatok a transzfúziók biztonságát szolgálják. Az AB0 és RhD vércsoport meghatározások, az antitest kimutatások, a laboratóriumi keresztpróbák elvégzése területén a laboratóriumi vizsgálatokra és transzfúziókra vonatkozó eljárásrendekre kell hagyatkozni (22,25,26,27). A vércsoport-szerológiában a napi rutin vizsgálatok alapelve napjainkban a hemagglutináció, amely az antigén-antitest reakciók alapján a vörösvérsejt antigének fenotípusának meghatározására alkalmas. Hemagglutináció elvén alapuló módszerekkel végezzük a kompatibilitási vizsgálatsor minden elemét. Az AB0 és RhD vércsoportok meghatározásakor a lehető legbiztonságosabb technikákat kell alkalmazni, kompromisszumok ebben a tekintetben nem vállalhatók. A vizsgálatokhoz eljárásrendekben meghatározott reagenseket kell használni. Az ellenanyagszűrésnél a hazai gyakorlatban enzimes és IAT módszerek előírtak (22). Az enzim technika alkalmazása lehetővé teszi a korai antitestek, és a csak enzimben reagáló, többnyire Rh rendszerhez tartozóantitestek kimutatását is. Az ellenanyag-azonosításnál esetenként több, különböző technika alkalmazása is szükségessé válik. Nagyszámú minta esetén a biztonságot fokozza a vizsgálatok automatizációja (13,29,35,46).

A jövő lehetőségei Az immunhematológiai vizsgálatok területén mind a hagyományos, mind a molekuláris technikák területén vannak kiszámítható tendenciák (38). Számítani lehet az automatizált platformok kiterjesztésére AB0/RhD tulajdonságok, kiterjesztett fenotipizálás és az ellenanyag vizsgálatok területén a donoroknál és a betegeknél egyaránt. Újabb, hatékonyabb monoklonális antitestek (humán, murin) kerülhetnek bevezetésre. A vércsoport-szerológiában antigén meghatározásokra rekombináns immunglobulinszerű fragmentumok alkalmazása is lehetségessé válik (44). Az ellenanyag-azonosítások során továbbra is szükség lesz több, nagy érzékenységű módszer egyidejű alkalmazására. 9


Az antitestek kimutatásának biztonságát szolgálja a jövőben a genetikailag tesztelt panelsejtek alkalmazása, bizonyítottan homozigóta sejtekkel (RHD, FY). Számítani lehet a molekuláris genetikai technikák, és a microarray-k erőteljes fejlődésére. Ezek széleskörű elterjedésének gyakorlati hasznossági, valamint gazdaságossági megfontolások gátat szabnak. Összefoglalva elmondható, hogy a mindennapok vércsoport-szerológiai vizsgálataiban az alapreakció továbbra is a hemagglutináció marad, melyben új módszerek, reagensek is helyet kapnak (1,17,38). Irodalomjegyzék

1. Anstee D.J.: Goodbye to agglutination and all that? Transfusion, 45, 652-653, 2005 2. AuBuchon J.P., de Wildt-Eggen J., Dumont L.J.: Reducing the variation in performance of antibody titration. Vox Sang., 95, 57-65, 2008 3. Bognárné S. É., Csernus Z.: Azonosított irreguláris ellenanyagok számának változása az alkalmazott módszerek korszerűsödésével. Transzfúzió, 2, 44-47, 1988 4. Cartron J.P.: Blood groups: genetics and physiology. ISBT Science Series, 5, 27-45, 2010 5. Chaffin J.: Pretransfusion Testing. Basic Immunohemat., Part 2, 1-18, 2012 6. Chapman J.F., Elliott C., Knowles M. et al.: Guidelines for compatibility procedures in blood transfusion laboratories. Transf. Med., 14, 59-73, 2004 7. Cid J., Noguès-Montero R., Hurtado M. et al.: Comparison of three microtube column agglutination systems for antibody screening: DG Gel, DiaMed-ID and Ortho Bio Vue. Transf. Med., 16, 131-136, 2006 8. Daniels G., Bromilow I.: Essential Guide to Blood Groups, 1-100, 2007 9. Daniels G., Reid ME.: Blood groups: the past 50 years. Transfusion, 50, 281-289, 2010 10. Daniels G.: Blood grouping by molecular genetics. ISBT Science Series, 6, 257-260, 2011 11. Daniels G.: Molecular blood grouping. Vox Sang., 87, S63-S66, 2004 12. Dittmar K., Procter J.L., Cipolone K. et al.: Comparison of DATs using traditional tube agglutination to gel column and affinity column procedures. Transfusion, 41,1258-1262, 2001 13. Downes K.A., Shulman I.A.: Pretransfusion Testing. Technical Manual 16th edition, 15, 437-463, 2008 14. Engelfriet C.P., Reesink H.W.: Testing for weak D. Vox Sang., 90, 140-153, 2006 15. Finck R., Lui-Deguzman C., Teng S.M. et al.: Comparison of a gel microcolumn assay with the conventional tube test for red blood cell alloantibody titration. Transfusion, 53, 811-815, 2013 16. Friss Á.: Vizsgálatok Sedisoft sejtmosó és agglutináció-értékelő automatával. Transzfúzió, 4, 119-123, 1991 17. Garratty G.: Where are we, and where are we going with DNA-based approches in immunohematology? Is serology finished? Transfusion, 47, 1S-2S, 2007 10


18. Greco Victoria A., Byrne K.M., Procter J.L. et al.: Detection of antibodies in acid eluates with the gel microcolumn assay. Transfusion, 42, 698-701, 2002 19. Grey D., Connolly M., Erber W.N.: Comparison of low ionic diluents for use with the Diamed antiglobulin gel test. Transf. Med.,12, 63-69, 2002 20. Hashmi G.: Red blood cell antigen phenotype by DNA analysis. Transfusion, 47, S60-S63, 2007 21. Hitzler W., Schömig-Breckner H., Mathias D.: Gel Centrifugation Test – a New Micro Method for Blood Group Typing and Antibody Screening. Das Ärztliche Laboratorium, 35, 89-92, 1989 22. Hoffer I. (sorozatszerk): Transzfúziós Szabályzat. OVSz Módszertani levele 2. kiadás, 4, 11-113, 2008 23. Hoffer I.: A vércsoport-szerológia elmúlt 10 éve. Focus Med., 11, 23-26, 2009 24. Hoffer I.: Laboratóriumi enzimes keresztpróba SZER04-V01. OVSz Minőségügyi Eljárás, 1-4, 2004.08.09. 25. Jakab J., Bohaty I., Csernus Z. et al.. Variáns D tulajdonság kezelése SZER-08-V03. OVSz Minőségügyi Eljárás, 1-5, 2001.07.04. 28. Jakab J., Bohaty I., Csernus Z. et al.: A donorok Rh(D) antigén vizsgálati rendje SZER-20-V01. OVSz Minőségügyi Eljárás, 1-10, 2011.01.15. 26. Jakab J., Bohaty I., Csernus Z. et al.: Betegek laboratóriumi AB0 és RhD vércsoport meghatározása SZER23-V01. OVSz Minőségügyi Eljárás, 1-4, 2012.07.01. 27. Jakab J., Bohaty I., Csernus Z. et al.: Rh (CcEe) fenotípus, Kell antigén és egyéb cél-antigének vizsgálat SZER19-V02. OVSz Minőségügyi Eljárás, 1-3, 2013.03.11. 29. Klein H.G., Anstee D.J.: Mollison’s Blood Transfusion in Clinical Medicine, 11 th edition, 8, 299-350, 2005 30. Lai M., Mavilia G., d’Onofrio G. et al.: Detection of weak D with a fully automated solid-phase red cell adherence system. Transfusion, 45, 689-693, 2005 31. Lajos J., Friss Á., Hoffer I.: Anti-humán-globulin (Coombs) teszt csöves metodika. Transzfúzió, 2, 60-63, 1987 32. Lajos J.: A sejtmosó automaták használhatósága a vércsoport-szerológiai laboratóriumokban. Transzfúzió, 3, 90-92, 1988 33. Lange J., Selleng K., Heddle N.M. et al.: Coombs’ crossmatch after negative antibody screening – a retrospective observational study comparing the tube test and the microcolumn technology. Vox Sang., 98, e269-e275, 2010 34. Lynen R., Krone O., Legler T.J. et al.: A newly developed gel centrifugation test for quantification of RBC-bound IgG antibodies and their subclasses IgG1 and IgG3: comparison with flow cytometry. Transfusion, 42, 612-618, 2002 35. Milkins C., Berryman J., Cantwell C. et al.: Guidelines for pre-transfusion compatibility procedures in blood transfusion laboratories. 1-60, 2012 36. Németh K., Fekete Gy.: Genetika, genomika, posztgenomika: múlt, jelen, jövő. Focus Med.,11, 2-7, 2009 37. Noizat-Pirenne F., Verdier M,. Lejealle A. et al.: Weak D phenotypes and transfusion safety:where do we stand in daily practice? Transfusion, 47, 1616-1620, 2007



38. Olsson M.L.: New developments in immunohaematology. Vox Sang., 87, S66-S71, 2004 39. Petri I.: Molekuláris biológiai vizsgálatok a vércsoportszerológiában, hazai lehetőségek. Hematológia-Transzfuziológia, 42, 42-47, 2009 40. Petrik J.: Microarray technology: the future of blood testing? Vox Sang., 80, 1-11, 2001 41. Poole J.: Problem-solving in antibody identification. Vox Sang., 87, S67-S69, 2004 42. Raman L., Armstrong B., Smart E.: Principles of laboratory techniques. ISBT Science Series, 3, 33-60, 2008 43. Reid M.E.: Overview of molecular methods in immunohematology. Transfusion, 47, S10-S16, 2007 44. Ridgewell K., Dixey J., Scott M.L.: Production of soluble recombinant proteins with Kell, Duffy and Lutheran blood group antigen activity, and their use in screening human sera for Kell, Duffy and Lutheran antibodies. Transf. Med., 17, 384-394, 2007 45. Robb J.S., Roy D.J., Ghazal P. et al.. Development of non-agglutination microarrey blood grouping. Transf. Med., 16, 119-129, 2006 46. Roxby D.: Current concepts in pre-transfusion serological compatibility testing. ISBT Science Series, 6, 265-269, 2011 47. Sandler S.G., Langeberg A., Avery N. et al.: A fully automated blood typing system for hospital transfusion services. Transfusion, 40, 201-207, 2000 48. Spisák S., Molnár B., Galamb O. ET AL.: Fehérjechipek elméleti alapjai és alkalmazási lehetőségük az orvosi diagnosztikában és kutatásban. Orv. Hetil., 32, 15111520, 2007

49. Szabó J. (sorozatszerk.): Ellenanyagszűrés és a laboratóriumi keresztpróba (Laboratóriumi kompatibilitás). OVSz módszertani ajánlása, 5-24, 1999 50. Tormey C.A., Hendrickson J.E.: Antibodies of undetermined significance: nuisance or near miss? Transfusion, 53, 926-928, 2013 51. Urbaniak S.J.: Alloimmunity to RhD in humans. Transf. Clin. Biol., 13, 19-22, 2006 52. Vagner M.: Az Rh vércsoportrendszer genetikája és komplexitása. Hematológia-Transzfuziológia, 38, 173-186, 2005 53. van der Schoot C.E.: Molecular diagnostics in immunohaematology. Vox Sang., 87, S189-S192, 2004 54. Veldhuisen B., van der Schoot C.E., de Haas M.: Blood group genotyping: from patient to high-throughput donor screening. Vox Sang., 97, 198-206, 2009 55. Voak D.: The status of new methods for the detection of red cell agglutination. Transfusion, 39, 1037-1040, 1999 56. Weisbach V., Kohnhäuser T., Zimmermann R. et al.: Comparison of the performance of microtube column systems and solid-phase and the tube lowionic-strength solution additive indirect antiglobulin test in the detection of red cell alloantibodies. Transf. Med., 16, 276-284, 2006 57. Weisbach V., Ziener A., Zimmermann R. et al.: Comparison of the performance of four microtube column agglutination systems in the detection of red cell alloantibodies. Transfusion, 39, 1045-1050, 1999 58. Westhoff C.M.: Molecular testing for transfusion medicine. Curr. Opin. Hemat., 13, 471-475, 2006



11

Az elmúlt 25 év vérkészítmény előállítása


Az elmúlt 25 év vérkészítmény előállítása Dr. Baróti-Tóth Klára Országos Vérellátó Szolgálat, Budapest Összefoglalás: A szerző célja, hogy bemutassa a preparatív transzfuziológiában, az elmúlt 25 évben bekövetkezett fejlődést (a vérvételtől a vérkomponens szeparáláson keresztül, azok tárolásával bezárólag) és azok hatását a hatékony betegellátásra.

Summary: The aim ofthe author is to show the development of the preparative transfusiology (from blood collection through the blood components separation until the end of the storage of them) and their effect onto the patient therapies in the last 25 years.

Kulcsszavak: preparatív transzfuziológia, vérkomponens, betegellátás

Keywords: preparative transfusiology, blood component, patient therapy

Fogalmak

biztonságosabb, kevesebb kockázatot jelentő, standard minőségű komponens terápia megvalósításához a vérkészítmények előállítása során (1. ábra). A komponens terápia iránti elvárás már a II. Világháború idején megfogalmazódott a klinikusok részéről, hiszen a keringési túlterhelés jelentette az egyik kockázatát a transzfúzióknak, azonban a technikai háttér nem volt minden esetben elérhető ahhoz, hogy előállítsák és tárolni tudják hosszan a vörösvérsejt – és plazma készítményeket. Azonban meghatározó tapasztalatokat gyűjtöttek és már akkor létrejöttek azok az „iskolák”, amelyek később a bölcsői lettek a vérkészítmény előállítás és konzerválási technikák kidolgozásának, mind Európában (Högman, Svédország), mind az USA-ban (Greenwalt). Természetesen igen korán felismerték az üzleti és szakmai lehetőségeket az egyes cégek, akiknek valamilyen korábbi érdekeltsége révén piaci szerepet kaptak a gyógyszergyártás (infúzió-, reagens-gyártás), vegyipar (műanyaggyártás, textilipar) területeken, és többnyire családi vállalkozásokból (Baxter, Biotest, Fresenius, MacoPharma) nőtték ki magukat és lettek a legnagyobb beszállítók. A komponensterápia másik célja és egyben mozgatórugója a vérrel átvihető fertőzések számának lecsökkentése lett, amit szintén tapasztalati úton bizonyítottak még a hatvanas és hetvenes években (Hepatitis B, Syphilis), azaz a fagyasztott-olvasztott vörösvérsejt készítmények transzfúzióival. Már akkor megállapították, hogy a vérkészítményekben lévő fehérvérsejtekkel magyarázhatóak a szövődmények jelentős száma, tehát elindultak azok a kutatások, technológiai változtatások, amely azt célozták meg, hogy a lehető legnagyobb mértékben eltávolítsák ezeket a sejteket (2a,2b. ábra), illetve olyan módszert alkalmazzanak, amelyek megakadályozzák a proliferációjukat.

bc =

Buffy coat (Határréteg, fehérvérsejtben és thrombocytában gazdag) GMP = Helyes Gyógyszergyártási Gyakorlat (Good Manufacturing Practice) GVH = Graft versus Host IT = Informatical Technology S/D = Solvens/Detergens módszer

Bevezetés A XX. század a medicina valamennyi területén óriási fejlődést tudhat be magának, hiszen mindkét világháború és a hidegháborús történelmi időszak számos tudomány alapkutatási eredményeit építette be, sőt fejlesztette tovább az alkalmazott kutatásaiban. A felsoroltakat mind bevezették a rutin gyakorlatba a hatékonyabb és biztonságosabb betegellátás érdekében (tároló oldatok, műanyag és teflon vérvételi, és egyéb zsákok, ionizáló sugárzás, gépesítés, stb.). Ezek a fejlesztések jelentős iramban jelentek meg az ún. interdiszciplináris területeken, mint immunológia, immunhematológia és preparatív transzfuziológia (utóbbi a donorkivizsgálással kezdődik a vérvételen át a vérkészítmények előállításával, és azok tárolásával bezárólag értendő). Jelen írás azt a célt tűzte ki, hogy áttekintést adjon az elmúlt évtizedek technológiai változásairól, új eszközök és technikák bevezetéséről, amelyek hozzájárultak a

Az 1980-as évek

1. ábra: Mérföldkövek a vérkészítmény-előállítás és -konzerválás történetében

12

Már a 70-es években kifejlesztették azokat a műanyag vérvételi zsákokat, összetett zsákrendszereket, amelyek tartalmazták a steril alvadásgátló oldatot (CPD, CPDA-1), azonban a humán teljesvér szeparálási eljárás az ún. thrombocyta dús módszerrel történt. Ennek következtében a vörösvérsejteket plazmában reszuszpendálták, ami a tárolhatóságot korlátozta, aminek az

2013. XV. évfolyam 2. szám 2. ábra: Vérkészítmény előállítás gyakorlata/ Fehérvérsejt eltávolítás lehetőségei

2/a. ábra: Buffy coat-os technika (LD = leukocyte depletion = fehérvérsejtmentesítés szűrővel, a zsák konfigurálásakor a vörösvérsejt szűréséhez használt szűrő beépíthető gyárilag a rendszerbe, ez opcionális, de elvégezhető egy laboratóriumi szűrő-zsák szetben is a thrombocytához hasonlóan)

2/b. ábra: Inline szűrővel ellátott zsákrendszerből előállítható vérkészítmények

oka a készítmény jelentős fehérvérsejt és thrombocyta tartalma miatt a mikroaggregátum-képződés, valamint a fehérvérsejtekből felszabaduló enzimek voltak. Európában jelentős iramban megindultak a buffy coat eltávolítására tett próbálkozások, aminek hazai vonatkozású eredményei is megjelentek (29,33,35,40,65). A módszer széleskörű elterjedéséhez azonban néhány feltételnek teljesülnie kellett, azaz olyan steril, összetett zsákrendszerek (2-, 3-, vagy 4- részes Top-Top) bevezetése, ami már nemcsak az alvadásgátló, hanem a reszuszpendáló (CPD, SAG-M, ADSOL) oldatot is tartalmazza (28,34). Ekkorra datálható az a nemzetközi konszenzus, amely kimondta, hogy vörösvérsejt tartalmú készítményeket csak PVC alapú DEHP-tal (diethyl-hexyl-ftalát) lágyított zsákban szabad tárolni. A thrombocyta készítmények pH-ja azonban túlságosan lecsökkent az ilyen zsákokban, mivel a széndioxid nem tud kidiffundálni a környezetbe, szénsavvá alakul és a pH alacsonyabb lesz, mint 6,4 ez pedig a sejtek funkcióvesztését okozza. A thrombocyták tárolhatóságát csak lágyítót nem tartalmazó zsákban (pl. poliolefin), vagy trimellitáttal


(TOTM) kezelt zsákban lehet biztosítani (32,55,63,59). Ebben az időben fejlesztették ki azokat a thrombocyta rázó készülékeket is, amelyek közül az ún. síkágyas (flat bad típusú) mozgatással működő eszközzel lehetett leghatékonyabban megőrizni a sejtek funkcióit (+20) – (+24)°C-on (74). A plazma készítményeket elsődlegesen transzfúziós céllal alkalmazták, másrészről vérbanki körülmények között előállított kryoprecipitátum alapanyagául szolgált, bár a fokozott vírusátviteli kockázat miatt előtérbe került az ipari frakcionálás, vírusinaktiválás, azaz a labilis faktorkészítmények (FVIII) nagyüzemi szintű előállítása (62). A fejlesztések középpontjába került a teljes vér komponensekre történő szétválasztásának tökéletesítésére való törekvés, hiszen az alapanyagnak mennyiségileg és minőségileg is javulni kellett. Még mindig a 80-as években járunk, amikor a vérellátóban is megjelenik az igény a „Helyes Gyógyszergyártási Gyakorlat” (GMP) alapelveinek lefektetésére és szemléletváltásra (72). Megfogalmazódott, hogy nem szabad pusztán laboratóriumi körülmények között, intuíciókon, előírások és ellenőrzések nélkül vérkészítményeket előállítani, hiszen igen nagy kihívást jelent a terápiás hatásosság elérése miatt a minőség szűkebb határokon belülre szorítása, ami üzemesítés-, gyógyszerészi szemléletet kíván/kívánt a biológiai eredetű termékek esetében is. Megszülettek azok a publikációk, amelyek elsődlegesen alkalmazott kutatásokra épültek és bemutatták a vérkészítmények előállítására vonatkozó standardizálási feladatokat. Vizsgálták a jobb kinyerés, a sejtek túlélési esélyeit, ezek ellenőrzésére módosításokkal ugyan, de bevezettek olyan laboratóriumi diagnosztikai módszereket, amivel igazolták az elgondolásukat (3,42,45,46,76,80). A teljes vér szétválasztásának hatékonyságát egy határon túl azonban nem lehetett manuális technikákkal javítani. Bizonyítást nyert, hogy kihat a mennyiségre, minőségre a vérvétel és a szétválasztás között eltelt időtartam hossza, a teljes vér hőmérséklete, a centrifugálás paraméterei, de óriási hatással bír az asszisztencia szeme és manualitása (30,52,58). A standardizálás jelentős mérföldköve az ún. Amsterdami technika, ami ugyan kézi módszer, de behatárolta a kritikus előállítási lépéseket és korlátozta a szabad, kézi technológiát (11,12,57). A módszer megfelelt annak a célnak, hogy megfelelő minőségű plazma-előállítás történjen, akár ipari céllal és egyúttal a lehető legjobb minőségű egyedi thrombocyta koncentrátum és vörösvérsejt készítmény álljon a betegek rendelkezésére. Megjelentek az első félautomata vérkomponens szeparáló készülékek, amelyek kiváltották a kézi technológia első szeparálási lépését, azaz a 3 alap vérkomponens (plazma, vörösvérsejt, buffy coat) egymástól történő elválasztását (14,19,47,67,78). Magyarországon ebben az időben még mindig az általános vérvételi- és tároló-edényzet az üvegpalack volt, csak a központi intézetben használtak egyrészes PVC vérvételi zsákot, amit az intézet gyógyszertárában CPD oldattal töltöttek meg és sterilizáltak. Az aszepszist a komponensekre történő szétválasztáskor lamináris 13



fülkében biztosították és a Medicor által gyártott egyszer használatos szerelékekkel csatlakozatták az üres transzferzsákot a 400 ml teljes vért tartalmazó zsákhoz. Ha a klinikum igényelte a thrombocyta készítményt, akkor a készítménynek 4 egység bc-ból történt az előállítása, és azt közvetlenül a kiadás után kellett transzfundálni. Az alkalmazott technológia hátránya az volt, hogy mielőtt ismertek lettek volna a szűrővizsgálati eredmények, megtörtént a poolozás, ha egy tag reaktív lett, akkor a készítményt meg kellett semmisíteni. A 90-es évek elején történt meg az országos szintű 4 részes top-top vérvételi zsákrendszer bevezetése (11,12,56,57,58). A preparatív transzfuziológia újabb és újabb elvárásoknak kellett, hogy megfeleljen, mivel ebben az időben már ismert volt a HIV és CMV vírus vérrel való átvitelének lehetősége is. Megfogalmazódtak a vérkészítményekkel szemben támasztott minőségi elvárások a transzplantációra váró, illetve azon átesett betegeknél, ahogyan a neonatológiai betegek speciális igényei is. Diepenhorst és munkacsoportja (21) valamint Kikugawa és Minoshima (38) munkásságának eredményeként 1978-ban vezették be az egyszer használatos fehérvérsejt-mentesítési eljárást (gyapot oszlopszűrő) a vérbanki technikák közé. Prins és mts-i 1978-ban (54) buffy-coat-mentesített vörösvérsejt koncentrátumok Cellselect-ATM -val végzett szűrések hatékonyságát mutatta be. 1250 szűrésből 60,6%-ban 99,9%-kal csökkent a vörösvérsejt koncentrátumnak a leukocyta tartalma. A felhasználói igények növekedésével és a vegyipar fejlődésének eredményeként 1985 óta a kereskedelmi forgalomban elérhető szűrők mind méretükben, mind fehérvérsejt-eltávolítási hatékonyságuk alapján jelentős változáson mentek át (1. táblázat). Magyarországon már az 1960-as években kipróbálták a gyapot töltetű oszlopszűrőket Langfelder Mária és mtsai (40), valamint Prof. Gál György. Aferezises technikát már ebben az időben, hazánkban is alkalmazták pl. Réti Marienn cyta- és terápiás plazmaferezisre (aferezis technika változásaira a szerző nem fókuszál jelen írásban). A számítógépes adatnyilvántartást szintén bevezették az USA-ban, Európában és hazánkban is.

Az 1990-es évek A fehérvérsejt-mentesítési technika csak az 1990-es évektől terjedt el hazánkban a vérbanki gyakorlatban, a Nemzedék

Eltávolítandó célsejt

Szűrő anyaga

első

mikroaggregát

screen filter (pórusátmérő:170-240 m)

második

mikroaggregát

screen filter (kb.40 m ) vagy/és mélységi szűrő

harmadik

leukocyta

finom rostok (rostátmérő: 10-20 m)

negyedik

leukocyta

nem szőtt ultrafinom rostok (rostátmérő: 1-2 m)

1. táblázat: Fehérvérsejt mentesítő szűrők

14

szakmai támogatást a laboratóriumi szűrők kapták, bár az ún. ágy melletti szűrőket a negatív irodalmi adatok (5,15,24,36,64,69,75,81) ellenére (hirtelen vérnyomásesés, vörös szem effektus) sem lehetett könnyen kiszorítani a kórházi beszerzésekből több mint 15 éven át. Miután a négyrészes zsákrendszerrel egy új technológia került bevezetésre az így előállított vörösvérsejt koncentrátumok fehérvérsejt tartalma 0,4 - 0,8 x 109-ra csökkent. Pietersz és munkacsoportja (51) > 99%-os fehérvérsejt csökkenést állapított meg a Cellselect-ATM szűrő alkalmazásakor. Vakkila és Myllylä kimutatták, hogy a buffy-coat mentesített SAGM-ben reszuszpendált vörösvérsejt Cellselect gravityTM-mel történt szűrésekor 99,9%-os fehérvérsejt eltávolítást eredményezett (77). A végtermékben maradt sejtek granulocytákból és T-sejtekből álltak. A poliészter „flat-bed” szűrők napjainkban is alkalmazott eszközei a fehérvérsejt-mentesítéseknek. A szűrők általában tartalmaznak a tárolás során kialakuló mikroaggregátumok kiszűrésére, szőtt vagy nem szőtt szálakból álló előszűrő réteget és egy nem szőtt szövedéket az ún. fő szűrőréteget, amely a leukociták eltávolítására szolgál. A fő szűrő szálakat szintetikus rostokból, mint poliészter, polietilén, polipropilén, polimetil-metakrilát, polisztirén, polifluoroklóretilén (59), készítették. A rostok nedvesíthetőségét kémiai és ionizációs eljárásokkal érik el. A leukocyták eltávolítását a sejtek felülethez történő kötődéssel, valamint kiszűréssel végzik. Jelenleg igen sokféle „flat-bed” szűrőt forgalmaznak a gyártók (pl. Sepacell RZ200, Pall BPF4 stb.). Ezek a szűrők a rostok anyagában, az előszűrők rétegeinek számában, a fő szűrő rétegeinek számában, a rostok átmérőjének, a keresztező szálak távolságában, a szűrő vastagságában és felületük nagyságában térnek el egymástól. Sok tanulmány jelent meg, a szűrés hatásmechanizmusáról és hatékonyságáról (39,53,70,71). A szűrők hatékonyságát vizsgáló mérések eredményei sok szempont miatt nehezen összehasonlíthatóak, mivel a legkülönbözőbb szűrőkkel (általában 24-48 órás vörösvérsejt készítményt), eltérő hőmérsékleten (+4 vagy +22°C) fehérvérsejt-mentesített terméket állítottak elő. A sejtszennyezettséget nem egységes módszerrel történt fehérvérsejt-számolással végezték. Wenz és Burns (80) poliészter szűrővel szerzett tapasztalatai (maradék fehérvérsejt: monocyták 1925%, T-sejtek 21-27%, B-sejtek 6-27%) nem különböztek Vakkila és Myllylä (77) cellulóz acetát szűrővel kapott tapasztalataitól. Al és mtsai (3) összehasonlították a Cellselect gravity oszlopszűrőt egy poliészter „flat bed” szűrővel és megállapították, hogy az előbbi alkalmazásakor főleg lymphocyták, az utóbbi szűrő estén granulocyták jutottak a filtrátumba, ha buffy-coat mentesített vörösvérsejtet szűrtek. Ezek az adatok azt sugallták, hogy eltérő mechanizmusokkal működnek a különböző alapanyagú szűrők. Az irodalmi adatok alapján a szűrést lehetőleg a vérvétel után 24-48 órán belül célszerű végrehajtani, ennek következtében csökken a vírusátvitel (25,61), szignifikánsan alacsonyabb a szűrt készítményekben


az IL-6, IL-8, hisztamin koncentráció (17,22,23) valamint csökken az aktív sejtek sérülése (6,73) a tárolás során, azonban nem mentesek teljesen a fehérvérsejtektől és fragmentektől (60) ezek a készítmények. A 90-es évek közepén egy újabb bumm történt Nagy Britanniában, a prion okozta vCJ megbetegedés diagnosztizálása, aminek a rutinszerű szűrőtesztjének a bevezetése gyakorlatilag napjainkig nem megoldott, viszont kevés számban, azonban dokumentált a vérrel való átvitel valószínűsítése (31,41). Mint az egyetlen megoldás az átvitel csökkentésére a fehérvérsejt-mentesítő szűrők alkalmazása. Ennek és más egyéb kedvező transzfuziológiai hatás (thrombocyta refrakterállapot, alloimmunizáció, vírus, bakteriális átvitel, immunmoduláció kialakulásának csökkentése, azaz a szövődmények visszaszorítása) érdekében az EU tagországok közel 100%-a csak szűrt vérkészítménnyel transzfundál, aminek költséghatékony eredményességét mára már néhány ország kimutatta (16,49,50,68) az ápolási napok, a szövődmények kezelésére fordított költségek csökkenésének elemzésével. Hazánkban azonban csak a korábban említett betegcsoportok számára készülnek szűrt készítmények. Az 1990-es években a vérellátós tevékenység elmozdult a gyógyszergyártás felé, a folyamatok standardizálása, validálása megkezdődött, csak kvalifikált eszközökkel kezdtek dolgozni, a minőségügyi rendszer kiépítése minimum elvárás lett. Még igazából hiányzott a vérellátási GMP ebben az időben. A történéseket a gyógyszeripar, és a transzfuziológiai kérdésekkel foglalkozó nemzetközi szakmai szervezetek (pl. Európa Tanács, WHO) generálták, hiszen a plazma gyógyszeralapanyag lett. Ezeknek a változásoknak köszönhetően megkezdődtek az egységesítések, azaz a véradók vérvétel előtti kivizsgálásával (donorkérdőív, hemoglobinmérés, előzetes vércsoport meghatározás, stb.), egységes vérvételi mennyiség gyűjtésével, amit vérvételi rázómérleg alkalmazásával biztosítottak megszületett az az alapelv, ami a vérkomponensek szétválasztásával folytatódhatott. Van der Meer és mtsai (79) standardizálták a hőmérsékleti viszonyokat a vérvételtől a teljes vér elválasztásáig, kidolgozták a bután-1,4-diol hűtőközeg alkalmazását, amivel optimálisan megőrizhetőek a plazma labilis alvadásfaktorai és az előállításra kerülő thrombocyta készítmények funkciói is. A teljes vér tárolása (+20) – (+24)°C-on szükséges, amelyet egy speciálisan erre a célra kifejlesztett rendszerrel (1. kép) (Compocool®, Fresenius Kabi, Németország) lehet megvalósítani a komponensek szétválasztását megelőzően, maximum a vérvételt követő 24 órán belül. A vérkomponensek előállításánál fokozódott az igény az automatizálásra, bár többnyire még mindig a 4 részes összetett, top-top zsákrendszert alkalmazták, ami annyit jelentett, hogy a diafragmás nyílások és a zsáktagokat összekötő csőszakaszok csatlakozásai a zsák felső részén helyezkedtek el. Az automata vérkomponens lenyomók a manuális lenyomás elvét ültették át a gépi rendszerbe. A szétválasztása az egyes határrétegeknek a sűrűségeltéréseken alapult, előtérbe


1. kép: Compocool rendszer

került a centrifugálási paraméterek módosítása, mivel a készülékek a túl tömény, magas hematokritú buffy coat-okat nem tudták megfelelően átnyomni a transzferzsákba. Ennek következtében módosította az Európa Tanács (26) a plazmakészítmény sejtszennyezettségét 50.000 thrombocyta/ml-re 25.000 thrombocyta/ml-ről, másrészt előírták, hogy a készítmény maghőmérsékletének 60 percen belül el kell érnie a (-30)°C-ot (1,2,48). Ezt a gyors sebességű fagyasztást csak erre a célra gyártott készülékekkel lehet a mai napig elérni, ennek teljesülését dokumentáltan kell bizonyítani a hatósági ellenőrzések és a vevői auditok során. Alkalmaztak olyan készülékeket, amelyekben a hűtőközeg (szilikon olaj) keringett a zsebekben elhelyezett plazmazsákok körül, másokban a hideg levegővel történő kontaktérintkezéssel fagy le a plazma és egy mechanikai préselés révén érik el a megfelelő készítmény vastagságot a fagyasztási folyamat előtt. Az alapkészítmények között az egyedi buffy coat-ból egyedi thrombocyta koncentrátumot állítottak elő (14,56), amit csak a transzfúziós igény kézhezvételekor pool-oztak össze, általában 10 donortól, egy zsákba. A módszer előnyének számított, hogy minimalizálni lehetett azokat a selejteket, amelyek abból származtak, hogy a szűrővizsgálatuk valamelyike (HBsAg, anti-HIV, anti-HCV, TP) reaktívnak bizonyult. A fehérvérsejt szennyezettséget 107/egység alá lehetett szorítani, azonban előfordult, hogy 108/egységet is elérte, ami fokozott transzfúziós kockázatot jelentett, bár az átlagos thrombocytaszám nagyobb, mint 0,5 x 1011/egység. 15


Az optimális kinyerés, az új terápiás lehetőségek előtérbe helyezték a thrombocyta készítmények adását, egyre nagyobb igény merült fel a cytaferezissel előállított készítményekre is, bár ekkor még nem minden esetben teljesítették a szűrt minőségű készítmény paramétereit, azonban óriási előnnyel bírt, hogy csak egy donortól származik a terápiás értékű készítmény. Elsődlegesen csontvelőtranszplantáltakat és onkohematológiai betegeket látták el ezzel a készítménnyel. Az aferezis készülék újabb generációi már lehetőséget adtak őssejt- és fehérvérsejt (neutrofil granulocyta) készítménygyűjtésre is, sőt a terápiás igények növekedésével kifejlesztették az ún. multikomponens aferezis készülékeket (44,82). Ez utóbbi legalább kétféle eltérő típusú vérkészítmény előállítására alkalmas. Ez időben jelent meg az első generációja a sterilen hegesztő (SCD/TSCD, Terumo, Japan) készüléknek, amely lecsökkentette a lamináris fülkében történő készítmény előállítás számát, hiszen az egyes csőszakaszokat képes volt úgy összeilleszteni, hogy azok belső része vizsgálatokkal igazoltan sterilen maradtak (2. kép). A készülék mind folyadékkal, mind levegővel telt csőszakaszokat képes volt egymásba illeszteni, kellő erősségű varratot kialakítani a most már egy csőszakaszon. Ezzel az eszközzel lehetővé vált, hogy az egyetlen nyitott rész a zsákrendszerrel csak a vérvételi csőszakasz, tehát a kontamináció leginkább innen származhat. A vérvételi zsákrendszereket előállító gyárak megoldották, hogy a rendszerbe beillesztettek

2. kép: Vérvételnél és a vérkészítmény előállítás, tárolásnál alkalmazott készülékek

16


a vakuumos vérvételre alkalmas harangot, másrészt tűvédők fejlesztésével lecsökkentették a munkahelyi balesetek számát (3. kép). 3. kép: Vérvételi zsákrendszerek

3/a. Mintavételi kis zsákkal együtt, jelenleg alkalmazott zsákrendszer

3/b. Az első, Magyarországon bevezetésre került zsákrendszer

A vérkészítmény előállítási lépések során egy-egy csőszakaszt le kell zárni, ehhez csőhegesztőket fejlesztettek ki, még pedig olyan hegesztési varratok kialakítására, amely tépőszakaszt is készít, amivel a dolgozók vérrel való kontaminációját lehetett visszaszorítani. Ebben az évtizedben már rutinszerűen alkalmazták azokat a vérbesugarazó készülékeket, amelyek zárt sugárforrással (pl. Cs137) rendelkeztek és alkalmasak arra, hogy 25-50 Gy (min. – max.) sugárdózissal elérjék, hogy a vérkészítményekben maradó lymphocyták proliferációját felfüggesszék. Az eljárás képes meggátolni a transzfúzióhoz köthető GVHD kialakulását (8,9,26,27,43). A módszer hatásosságát már kb. két évtizeddel korábban leírták, azonban csak ebben az időszakban született konszenzus, hogy a vörösvérsejt tartalmú készítményeket a fokozott K+ ion koncentráció extracellularis térben történő megnövekedése miatt, a vérvételt követő 14 napon belül szabad az eljárással kezelni, és maximum utána 14 napig lehet transzfundálni, míg a neonatológiai felhasználásnál ez az időtartam 48 óra. Ehhez hasonló korlátozás nem vonatkozik sem a plazmakészítményekre, sem pedig a thrombocyta koncentrátumokra. A kilencvenes évek végére a világ elfogadta, hogy standardizált módon kell dolgozni, hogy a vérből előállított vérkészítmények speciális gyógyszerek, amelyek előállítása szigorúan ellenőrzött és tervezett módon kell, hogy megtörténjenek. Az előállítás valamennyi részletét, ami a minőségre és mennyiségre kihat regisztrálni kell és visszakereshetővé kell tenni, aminek a legegyszerűbbnek tűnő módja a megfelelő informatikai háttér. A készülékeket, amelyek a vérkomponensek szeparálását végzik, számítógépes programokkal is lehet üzemeltetni az adatgyűjtés érdekében (4. kép). Hatékonyabb buffy coat kinyerés céljából felülvizsgálták a teljes vér szétválasztásának lehetőségét, és kialakították az ún. top-bottom vérvételi zsákrendszert, aminek 3 tagja van. A nevét onnan kapta a rendszer, hogy a vérvételi zsák alján lévő csövön keresztül tudja a vérkomponens szeparáló automata átnyomni a vörösvérsejteket a reszuszpendáló oldatot tartalmazó zsákba, míg a buffy coat az eredeti zsákban marad és a plazma az üres zsáktagba kerül (3. kép). A szeparáló automata regisztrálja a kezelőt, a készítmények tömegét és a vérvételt jelentő sorszámot, természetesen a lenyomás időpontjával és időtartamával együtt, és képes a csőszakaszokat lehegeszteni.


4. kép: Automata vérkomponens szeparáló készülékek

A 2000-es évek Az előbb bemutatottakból érezhető, hogy a véradó és a beteg biztonságára kell a teljes folyamat során törekedni, miközben időben és gazdaságilag a lehető leghatékonyabban történjenek a lépéssorozatok. A vérvételi zsákrendszerek konfigurációjában lényeges változások nem következtek be, inkább további biztonsági elemek jelentek meg pl. a tűvédő kivitelében. Bizonyítást nyert, hogy a thrombocyta koncentrátumok a legérzékenyebbek a bakteriális kontaminációra, amit elősegít a plazmás közeg és a (+20) – (+24)°C-os tárolási hőmérséklet. Ez a kockázat lecsökkenthető, ha a vérvétel során az első 1030 ml teljes vért a zsákrendszerbe illesztett mintavételi zsákocskába gyűjtik (3. kép). Az univerzális fehérvérsejt-mentesítési (szűrési) törekvés egy-egy országban átrendezte a vérkészítmény előállítási gyakorlatot. Megjelentek azok a zsák konfigurációk, amelyekbe beillesztették a szűrőt (in line), és ily módon mielőtt a komponensekre történő szeparálás megtörtént volna, előtte a teljes vért átengedték a szűrőn. Ilyenkor csak szűrt minőségű plazma és vörösvérsejt koncentrátum készült. Ha szükség van a teljes vérből előállítható thrombocytára is, akkor a szűrőt úgy építették be a zsákrendszerbe, hogy a teljes vérből képesek legyenek az alapkészítményeket előállítani és csak a vörösvérsejt legyen 1 x 106-nál kevesebb fehérvérsejttel szennyezett. Mindkét eljárásnál fontos, hogy a vérvételt követően maximum 48 órán belül elvégezzék a szűrést. Az eljárások előnye, hogy az aszepszis megtartott, ahogy a lejárati idő sem módosul (3. ábra). A thrombocyta koncentrátumok esetében gazdálkodási szempontok miatt néhány éven át előtérbe került a 7 napos tárolás, amelyre a tároló zsák okán lehetőséget adtak néhány országban, ha a transzfúzió előtti bakteriológiai vizsgálat negatív eredményt ad.


Mindezt a gyakorlatot támogatta, hogy kifejlesztettek olyan kristályos oldatokat (pl. Composol, PAS, stb.), amelyekben a vörösvérsejtek reszuszpendáló oldatához hasonlóan a sejtek megőrzik a funkciójukat, ha 20-30%ban tartalmaznak plazmát is. A tárolási vizsgálatok kedvező eredményekről számoltak be, aminek hatásaként az időközben megjelent ún. véres direktívában (4,7,37) eltörölték a maximált pH = 7,4 értéket. A hazai vérkészítmény előállítás valamennyi technikát, eszközt alkalmazza, és ami a minőséget erősíti más országokhoz képest, hogy egységes alapelveket, módszereket, egységes informatikai rendszerrel támogatja. Jelenleg 4 egységes buffy coat-os módszerrel történik a thrombocyta előállítás, nem plazmás közegben. A neonatológiai betegek számára valamennyi készítmény típust ki tudjuk szerelni 4 részre. Speciális igényre az ún. mosott vörösvérsejt koncentrátumot teljesen zárt rendszerben állítjuk elő, majd reszuszpendáló oldatban vesszük fel, ennek eredménye a 48 órás felhasználhatóság (10,13). Az elmúlt évtizedek egyre inkább arra fókuszáltak, hogy a vérkészítmények a lehető legbiztonságosabbak legyenek a betegek számára, azaz a fehérvérsejt csökkentésen (3. ábra) kívül a készítményben lévő, ismeretlen mikrobiológiai szennyeződés kockázat lehetőségét is minimalizálni kell. A 90-es évek óta a plazmafaktorok előállításánál kezdték meg alkalmazni a vírusinaktiválási eljárásokat (solvens-detergens = SD), amelyre ma már számos országban a rutin vérellátós gyakorlatban is alkalmaznak vírus redukciós módszereket (18,20,66). Napjainkban már számos vérellátóban használnak patogén redukciós módszert a thrombocyta – és plazma készítmények esetében. Mindkét készítmény típusnál valamilyen kémiai anyaggal hozzák össze a terméket (thrombocyta és plazma esetében psoralen (S59), vörösvérsejteknél (S303) riboflavin (vitaminB2), majd eltérő hullámhosszúságú UV fénnyel sugarazzák be. Ennek eredményeként a patogén DNS-ében, vagy RNS-ében visszafordíthatatlan (irreverzíbilis) kötések alakulnak ki, így a nukleinsavak replikációja véglegesen gátolt lesz (4. ábra). A segédanyagot speciális szűrővel eltávolítják, amivel a készítmény biztonságát növelik. A módszer alkalmas HIV, HCV, HBV, CMV és HTLV vírusok, valamint mind Gram-negatív, mind Gram-pozitív baktériumok esetében, ahogyan képes megelőzni a HLA alloimmunizációt is. Bár ez már számos intézetben része

3. ábra: Vérkészítmények fehérvérsejt szennyezettsége és klinikai kockázatuk

17



a fejlődésről, amely az elmúlt 25 évben bekövetkezett a nemzetközi – és hazai vérkészítmény előállítás terén, a biztonságos betegellátás egyik pillérében (5. ábra). Kronológiai sorrendben bemutatta a fehérvérsejt csökkentési technológiákat, amelyek a legnagyobb hatékonysággal képesek megelőzni a transzfúzióhoz kapcsolódó szövődmények kialakulásának valószínűségét, azonban soha nem szabad megfeledkezni arról, hogy ezeknek a lépéseknek „ára van”, együtt járnak hatóanyag-veszteséggel. Ennek egyik tipikus jövőképe a vérbanki patogén redukciós eljárások. Irodalomjegyzék

4. ábra: Patogén redukciós eljárás sematikus folyamata

a rutin eljárásoknak, biztosan nem tudunk még mindent a módszer működéséről, nagyon sok ország mérlegelte a transzfúzió kockázatát és bevezette az eljárást egyes betegcsoportokba kötelezően (pl. Svájc, Franciaország).

Összefoglalás Az elmúlt 26 év a preparatív transzfuziológiában, szűk értelmezésben a vérkészítmény előállításban óriási fejlődésen ment át. Ehhez hozzájárultak azok a társtudományok, amelyek képesek voltak megteremteni az anyagokat és eszközöket, az IT-t, amelyek alkalmazásával egy fokozottabban biztonságos betegellátást tudtunk kialakítani, miközben a véradók és a dolgozók kockázatát is minimalizálni lehetett. A technológiák kialakításával tervezhető, jól definiálható és mérhető módszereket fejlesztettek ki, amelyek alkalmasak a szigorú gyógyszergyártási (GMP) elvárásoknak is megfelelni. Jelen dokumentum áttekintést adott arról

4. ábra: Biztonságos transzfúzió pillérei

18

1. 2001/83/EC Directive GMP 2. 44/2005. (X. 19.) EüM rendelet az emberi alkalmazásra kerülő gyógyszerek gyártásának személyi és tárgyi feltételeiről. 3. Al E.J.M., Visser S.C.E., Prins H.K.: A flow cytometeric method for determination of white cell subpopulations in filtered red cells. Transfusion, 31, 835-842, 1991 4. Alhumaidan H., Sweeney J.: Current status of additive solutions for platelets. J. Clin. Apher., 27(2), 93-98, 2012 5. Alonso-Echanove J., Sippy B.D., Chin A.E. et al.: Nationwide outbreak of red eye syndrome associated with transfusion of leukocyte-reduced red blood cell units. Infect. Control Hosp. Epidemiol., 11, 1146-1152, 2006 6. Andreu G.: Early leukocyte depletion of cellular blood components reduces red blood cell and platelet storage lesions. Semin. Hematol., 28, 22-25, 1991 7. Ashford P., Gulliksson H., et al.: Standard Terminology for Platelet Additive Solutions. Vox Sang., 98, 577-578, 2010 8. Baróti K., Rácz Z., Pintér J. et al.: Are 15-50 Gy sufficient to abrogate the proliferation of lymphocytes in blood components? Blood, 86, 853, 1995 9. Baróti K., Rácz Z., Járosi Jné: Mekkora sugárdózis kell a vérkészítményekben levő lymphocyták proliferációjának megszüntetéséhez? 12. Magyar Belorvosi Archivum, 48, 41, 1995 10. Barótiné Tóth K., Pintér J., Hoffer I. et al.: Quality control of washed red blood cells. Transf. Clin. Biol., 8, 222a, 2001 11. Barótiné Tóth K., Rácz Z., Járosi Jné: Vérkészítmény előállítás négyrészes zsákrendszerben „buffy coat technikával” (gyomorfogó segítségével). Transzfúzió, 26, 24-30, 1993 12. Barótiné Tóth K., Rácz Z., Járosi Jné: Vérkészítmény előállítása négyrészes zsákrendszerben „buffy coat technikával” (klammer segítségével). 5 napig tárolható thrombocyta koncentrátum előállítása egyedi buffy coatból. Transzfúzió, 26, 111-120, 1993 13. Baróti-Tóth K., Kramer J., Pintér J. et al.: IgA content of washed red blood cell concentrates. Vox Sang, 74, 13-14, 1998


14. Baróti-Tóth K., Pintér J., Hoffer I. et al.: Comparison of two different whole blood separation method., Vox Sang., 78S1, 2000 15. Belloni M., Alghisi A., Bettini C. et al.: Hypotensive reactions associated with white cell-reduced aphresis platelet concentrates in patients not receiving ACE inhibitors (letter). Transfusion, 38, 412-413, 1998 16. Blumberg N., Fine L., Gettings K.F. et al.: Decreased sepsis related to indwelling venous access devices coincident with implementation of universal leukoreduction of blood transfusions. Transfusion, 45, 1632-1639, 2005 17. Bowden R.A., Slichter S.J., Sayers M.H. et al.: Use of leucocyte-depleted platelets and cytomegalovirusseronegative red blood cells for prevention of primary cytomegalovirus infection after marrow transplant. Blood, 78, 246-250, 1991 18. Butler C., Doree C., Estcourt L.J. et al., Pathogenreduced platelets for the prevention of bleeding. Cochrane Database Syst. Rev., 3, 2013 19. Cid J., Claparols M., Pinacho A. et al.: Comparison of blood component preparation methods from whole blood bags based on buffy coat extraction, Transf. Aph. Sci., 36, 243-247, 2007 20. Custer B., Agapova M., Martinez R.H.: The costeffectiveness of pathogen reduction technology as assessed using a multiple risk reduction model. Transfusion,. 50, 2461-2473, 2010 21. Diepenhorst P., Sprokholt R., Prins H.K.: Removal of leukocytes from whole blood and erythrocytes suspensions by filtration through cotton-wool. I. Filtration technique. Vox Sang., 23, 308-320, 1972 22. Frewin D.B., Dyer S.M., Haylock D.N. et al.: A comparative study of the effect of three methods of leukocyte removal on plasma histamine levels in stored human blood. Semin. Hematol., 28, 18-21, 1991 23. Frewin D.B., Jonsson J.R., Frewin C.R. et al.: Influence of blood storage time and plasma histamine levels on the pattern of transfusion rections. Vox Sang., 56, 243-246, 1989 24. Fried M.R., Eastlund T., Christie B. et al.: Hypotension reactions to white cell-reduced plasma in a patient undergoing angiotensin-converting enzyme inhibitor therapy. Transfusion, 36, 900-903, 1996 25. Gilbert G.L., Hayes K., Hudson I.L. et al.: Prevention of transfusion-acquired cytomegalovirus infection in infants by blood filtration to remove leucocytes. Lancet, i, 1228-1231, 1989 26. Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components. Recommendation No. R (95) 15. ed. European Directorate for the Quality of Medicines & Healthcare, Strasbourg. 27. Guidelines on gamma irradiation of blood components for the prevention of transfusion-associated graft-versus-host disease. Transfus. Med., 6(3), 261-271, 1996 28. Gulliksson H., Karleman G., Segerlind A. et al.: Preservation of red blood cells: Content of micro-


29.

30.

31.

32.

33. 34.

35.

36.

37.

38.

39.

40.

41.

42.

43.

44.

aggregates and di-2-ethylhexylphthalate (DEHP) in red blood cells stored in saline-adenin-glucosemannitol (SAGM) medium. Vox Sang., 50, 16, 1986 Hegedűs E., Rácz Z.: Higher ATP level and reduced glucose consumption of red cells stored in PVC bags compared to glass bottles. Vox Sang., 53, 23, 1987 Hess J.R.: On behalf of the BEST collaborative: The overnight warm hold of whole blood before processing into components. Transfusion, 51. No.1S, 2011 Hewitt P.E., Llewelyn C.A., Mackenzie J. et al.: Creutzfeldt–Jakob disease and blood transfusion: results of the UK transfusion medicine epidemiological review study. Vox Sang., 91, 221-230, 2006 Holme S., Heaton W.A., Courtright M.: Platelet storage lesion in second –generation containers: Correlation with platelet ATP levels. Vox Sang., 53, 214-220, 1987 Högman C.L.: Leucocyte depletion of blood components. VU University Press., 1994 Högman C.L., Eriksson L., Hedlund K., et al.: The bottom and top system. Vox Sang., 55, 211-217, 1988 Högman C.L. Hedlund K., Akerblom O. et al.: Red blood cell preservation in protein-poor media. I. Leukocyte enzymes as a cause of hemolysis. Transfusion, 18, 233-242, 1978 Hume H.A., Popovsky M.A., Benson K. et al.: Hypotensive reactions: a previously uncharacterized complication of platelet transfusion? Transfusion, 36, 904-909, 1996 Kacker S., Ness P.M., Savage W.J.: The cost-effectiveness of platelet additive solution to prevent allergic transfusion reactions. Transfusion, 53, 2609-2613, 2013 Kikugawa K, Minoshima K.: Filter columns for preparation of leukocyte-poor blood for transfusion. Vox Sang., 34, 281-290, 1978 Koerner K., Sahlmen P., Zimmerman B.: Preparation of leukocyte-poor red cell concentrates: comparison of five different filters. Vox Sang., 60, 61-62, 1991 Langfelder M., Jakschitz M., Jánossy A.: Comparison of different methods used in the preparation of leucocyte-free whole blood and erythrocyte concentrates. Vox Sang., 19, 57-63, 1970 Llewelyn C.A., Hewitt P.E., Knight R.S.G. et al.: Possible transmission of variant Creutzfeldt–Jakob disease by blood transfusion. Lancet, 363, 417-421, 2004 Masse M., Andreu G., Anque M.: A multicenter study on the efficiency of white cell reduction by filtration of red cells. Transfusion, 31, 792-797, 1991 Massey E., Paulus U., Doree C. et al.: Granulocyte transfusions for preventing infections in patients with neutropenia or neutrophil dysfunction. Cochrane Database Syst. Rev., 21(1), 2009 Mattes G., Moog R., Implementation of preparative haemapheresis in the production of blood derived 19


45.

46.

47.

48.

49.

50.

51.

52.

53.

54.

55. 56.

57.

58.

59. 60.

20

concentrates recommendations on preparative haemapheresis of the German society of transfusion medicine and immunohaematology (DGTI). Transfus. Med. Haemother., 37, 367-374, 2007 Meryman H.T.: The preparation of red cells depleted of leukocytes-review and evaluation. Transfusion., 26, 101-106, 1986 Mijovic V., Brozovic B., Hughes A.S.B., et al.: Leukocyte-depleted blood-A comparison of filtration techniques. Transfusion., 23, 30-32, 1983. Mondéjar H., Bonanad S., Soler M. A. et al.: Quality analysis of blood components obtained by automated buffy-coat layer removal with a top and bottom system., Haematologica, 85, 390-395, 2000 Monograph on Human Plasma for Fractionation 0853, European Pharmacopoeia, 5th ed. Strasbourg, France, Council of Europe, 2005 Nathens A.B., Nester T.A., Rubenfeld G.D. et al.: The effects of leukoreduced blood transfusion on infection risk following injury: a randomized controlled trial.Shock, 26, 342-347, 2006 Phelan H.A., Sperry J.L., Friese R.S.: Leukoreduction before red blood cell transfusion has no impact on mortality in trauma patients. J. Surg. Res., 138, 3236, 2007 Pietersz R.N.I., Dekker W.J.A., Reesink H.W.: A new cellulose-acetate filter to remove leukocytes from buffy-coat-poor red cell concentrates. Vox Sang., 56, 37-39, 1989 Pietersz R.N.I., de Korte D., Reesink H.W. et al.: Storage of whole blood for up to 24 hours at ambient temperature prior to component preparation. Vox Sang., 56, 145-150, 1989 Pikul F.J., Farrar R.O., Boris M.B.: Effectiveness of two synthetic fiber filters for removing white cells from AS-1 red cells. Transfusion, 29, 590-595, 1989 Prins H.K., Henrichs H.P., Conemans J.M.H.: Preparation of leukocytes-poor red cell suspensions from buffy-coat-free red cell concentrates by simplified cotton-wool filtration (abstract). 17th congress of Int Soc Hemath and 15th congress of Int. Soc. Blood Transf., Paris, I, 147, 1978 Rácz Z., Baróti K.: Effect of DEHP plasticizer on stored platelets. Vox Sang., 68, 197-200, 1995 Rácz Z., Baróti K.: Storage of platelet concentrates from overnight-stored blood and overnight-stored buffy coat: in vitro studies.Vox Sang., 68, 160-163, 1995 Rácz Z., Baróti K.: Technical aspects of buffy coat removal from whole blood and those of platelet production from single buffy coat unit. Biomed. Techn., 38, 266-269, 1993 Rácz Z., Baróti K., Hidvégi T.: Quality of plasma separated from (buffy coat+plasma). An alternative way of blood processing. Acta Haemat. Polon., 25, 47-53, 1994 Rácz Z, Barótiné Tóth K.: A műanyagok transzfuziológiai felhasználása. Transzfúzió, 1, 2-10, 1995 Ramos R.R., Curtis B.R., Duffy B.F. et al.: Low retention of white cell fragments by polyester fiber


61.

62. 63.

64.

65.

66.

67.

68.

69.

70.

71.

72.

73.

74.

75.

white cell-reduction platelet filters. Transfusion, 34, 31-34, 1994 Rebulla P., Porretti L., Bertolini F. et al.: White cellreduced red cells prepared by filtration: A critical evaluation of current filters and methods for counting residual white cells. Transfusion, 33, 128-133, 1993 Robinson H.J. Blood separation and plasma fractionation. Wiley-Liss, Inc. p. 241-259, 1991 Rock G., Tocchi M., Ganz P.R. et al.: Incorporation of plasticizer into red cell during storage. Transfusion, 24, 493, 1984 Sano H., Koga Y., Hamasaki K. et al.: Anaphylaxis associated with white-cell reduction filter (letter). Lancet, 347, 1053, 1996 Schrier S.L., Hardy B., Bensch K. et al.: Red blood cell membrane storage lesion. Transfusion, 19, 158-165, 1979 Seghatchian J., Putter J.S.: Pathogen inactivation of whole blood and red cell components: An overview of concept, design, developments, criteria of acceptability and storage lesion. Transfus. Apher. Sci., 17, S1473-0502, 2013 Semple E., Bowes-Schmidt A., Yi Q. L., et al.: Transfusion reactions: a comparative observational study of blood components produced before and after implementation of semiautomated production from whole blood, Transfusion, 52, 2683-2691, 2012 Shander A., Hofmann A., Gombotz H. et al.: Estimating the cost of blood: past, present, and future directions Best Pract. Res. Clin. Anaesth., 21, 271-289, 2007 Shiba M., Tadokoro K., Sawanobori M. et al.: Activation of the contact system by filtration of platelet concentrates with a negatively charged white cell removal filter and measurement of venous blood bradykinin level in patients who received filtered platelets. Transfusion, 37, 457-462, 1997 Sirchia G., Rebulla P., Parrvicini A.: Leukocyte depletion of red cell units at the bedside by transfusion through a new filters. Transfusion, 27, 402-405, 1987 Sirchia G., Wenz B., Rebulla P.: Removal of white cells from red cells by transfusion through a new filter. Transfusion, 30, 30-33, 1990 Smit-Sibinga C., Th. Das H-J. Heiniger P.C.: Good Manufacturing Practice in Transfusion Medicine: Proceedings of the Eighteenth International Symposium on Blood Transfusion, Groningen, Organized by the Red Cross Blood Bank GroningenDrenthe, 1993 Snyder E.L., Mechanic S., Baril L. et al.: Removal of soluble biologic response modifiers (complement and chemokines) by a bedside white cell-reduction filter. Transfusion, 36, 707-713, 1996 Snyder E.L., Pope C., Ferri P.M. et al.: The effect of mode of agitation and type of plastic bag on storage characteristics and in vivo kinetics of platelet concentrates. Transfusion, 26, 125-130, 1986 Sweeney J.D., Dupuis M., Mega A.J.: Hypotensive reactions to red cells filtered at the bedside, but not to



those filtered before storage, in patients taking ACE inhibitors (letter). Transfusion, 38, 410-411, 1998 76. Treleaven J.G., McGregor M., Blagdon J.: An evaluation of some methods currently available on the production of leukocyte-poor blood. Clin. Lab. Haematol., 6, 45-49, 1984 77. Vakkila J., Myllylä G.: Amount and type of leukocytes in „leukocyte-free” red cell and platelet concentrates. Vox Sang., 53, 76-82, 1987 78. Van der Meer P.F., Pietersz R.N.I., Hinloopen B. et al.: Automated separation of whole blood in top and bottom bags into components using the Compomat G4. Vox. Sang., 76, 90-99, 1999

79. Van der Meer P.F., Pietersz R.N.I.: Overnight storage of blood: a comparison of two designs of butane1,4-diol cooling plates. Transfusion, 47, 2038-2043, 2007 80. Wenz B., Burns E.R.: Phenotypic characterisation of white cells in white cell-reduced red cell concentrates using flow cytometry. Transfusion, 31, 829834, 1991 81. Yenicesu I., Tezcan I., Tuncer A.M.: Hypotensive reactions during platelet transfusions (letter). Transfusion, 38, 410, 1998 82. Zingsem J.: Multicomponent apheresis. Vox Sang., 5, 83-87, 2010

Megrendelőlap (Focus Medicinae)

Alulírott, postai úton megrendelem a Focus Medicinae című kiadványt 2014. évre, ............ példányban. A folyóirat éves előfizetési díja: 2014,- Ft + 5% Áfa. Megrendelő neve: Címe:

Megrendelését az alábbi címre kérjük elküldeni: Dursusz Bt. 1106 Budapest, Juhász u. 47/A. Telefon/Fax: (1) 262-8688 Mobil: (06-30) 223-0629 E-mail: [email protected]

21


Az aferezis szerepe a gyógyításban

Az aferezis szerepe a gyógyításban Dr. Tremmel Anna Semmelweis Egyetem I. sz. Belgyógyászati Klinika Aferezis laboratórium, Budapest Összefoglalás: Aferezis = apheresis: a görög eredetű aphairesis szóból származik és kivonást jelent. A terápiás aferezis a medicina egy olyan területe, mely nem szűkíthető le egyetlenegy tudományágra: az aferezis interdiszciplináris. A terápiás aferezis többféle mechanizmuson keresztül fejti ki jótékony hatását. A legalapvetőbb, amikor egy, a vérben található, kóros keringő faktort távolítunk el. Ez lehet antitest, monoklonális protein, alloantitest, keringő immunkomplex, endo és exotoxinok, gyulladásos mediátorok, triglicerid, koleszterin stb. A hatást immunadszorpcióval növelni lehet. A másik mechanizmus, amikor plazma-faktorok pótlását, a reticuloendothelialis rendszer működésének javítását érjük el. Az antigén antitest arányának eltolásával az immunkomplexeket még szolubilisebbé teszi, stimulálja a lymphocyta klónokat. A thrombocyta és fehérvérsejt deplécióval csökkenti a nagyszámú sejt szétesésből származó toxikus reakciók számát, és ezáltal hatékonyabbá válik a citotoxikus terápia. A terápiás aferezis segítségével lehetőség nyílik extracorporalis kemoterápiás kezelésre is, ez a fotoferezis. Perifériás CD34+ sejtek gyűjtésével allogén illetve autológ sejt terápia, hematopoetikus őssejt (stem cell) átültetés végezhető. A terápiás aferezisek egy jó része életveszélyes krízis szituációkban kerül alkalmazásra. A hazai gyakorlatban gyerek- és felnőttkori terápiás aferezis kezelések indikációja során törekszünk a legkorszerűbb, nemzetközileg is elfogadott ajánlásokat követni.

Summary: The apheresis derive from the Greek ’aphairesis’ and means ’to take out’. The therapeutic apheresis is not only one discipline, but an interdisciplinary medicine. The therapeutic apheresis explicate a positive effect through multiple mechanisms. The most general one is when an in the blood circulating, pernicious factor gets removed. This can be for example antibodies, monoclonal proteins, alloantibodies, circulating immuncomplexes, endo- and exotoxins, inflammatory mediators, triglycerides, cholesterols, etc. The effect of the factor removal can be increased with immunoadsorption. An other mecahnism is the supplement of the plasma factors, the reparation of the operation of the reticulo endothelian system. It also makes the immuncomplexes more soluble through the shift of the antigens and antibodies proportion. It stimulates the lymphocyte clones. It decreases the number of the toxic reactions caused by the numerous cell disintegration with the depletion of the platelets and white blood cells. By this the cytotoxic therapy becomes more effective. The therapeutic apheresis incorporates the Photopheresis, which is an extracorporal chemotherapeutic treatment. With peripheral stem cells (CD34+) collection it is possible to perform allo and auto cells therapy, a hematopoetic stem cell transplantation. Several therapeutic apheresis are applied in emergency, at critical situations. The aim of Hungarian national exercise of the indication of therapeutic apheresis for pediatric and adult patiens to be the most up-to-date and to follow the accepted international guidelines.

Kulcsszavak: terápiás aferezis, plazmacsere (plazma exchange: PEX), fotoferezis (photoapheresis: PAP vagy extracorporalis photopheresis: ECP), immunadszorpció (IA), antitest (AT)

Keywords: therapeutic apheresis, plasma exchange (PEX), photoapheresis (PAP), immunoadsorption (IA) , antibody

Bevezetés

zus: 60-115/ perc, de gyerekeknél ez felemelkedhet 145/ percre. Kezelés előtt célszerű az ionháztartás rendezése. Ki kell számolnunk a páciens keringő plazmavolumenét, amit már a mai korszerű készülékek a Htk, testsúly és testmagasság beprogramozása után kiszámolnak. Az aferezis terápia kivitelezéséhez antikoagulációra van szükség, ami általában citrát (ACD-A), ami kálciumot köt meg és ezáltal fejti ki antikoaguláns hatását. Aferezis terápia során gondoskodnunk kell a folyadékpótlásról.

Az aferezis interdiszciplináris tudományág, hazánkban minden gyakorló klinikus számára elérhető terápiás módszer. Az indikációs kör a nemzetközileg elfogadott, s Magyarországon is alkalmazott American Society for Apheresis (ASFA) irányvonalak szerint történik, mely ötvöződik az OEP finanszírozással és a különböző szakmai kollégiumok ajánlásaival. Mindig lehetőség nyílik azonban egyedi elbírálásra is. Ezeknél a kórképeknél az aferezis kezelés nemzetközileg elfogadott terápia, de Magyarországon az OEP még nem fogadta be a finanszírozott indikációk sorába. Az aferezis kezelés gyakorlati kivitelezése eszközös felszereltséget és szakmai felkészültséget igényel. Az aferezis terápia elvégzéséhez a páciensnél minimál klinikai laboratóriumuidiagnosztikai paraméterek szükségesek: fehérvérsejt: 1,0 G/l, hemoglobin(Hgb): 60-80 g/l,hematokrit(Htk): 0,20 l/l (20%), thrombocyta (PLT): 20 G/l. Megfelelő vérnyomás (RR): 90-160/70-100 Hgmm és pul22

Az aferezis terápia indikációi ABO inkompatibilis szolid szerv vese, máj, tüdő, szív transzplantáció során a plazmacsere része a prekondicionális protokollnak, ahol a szubsztitúciós folyadék az 5% Human Albumin és legalább másfélszeres teljes plazma volument cserélünk le. A kezelés célja alacsony antitest titer elérése a transzplantációra. Vese transzplantációt követően antitest indukálta rejekció terápiája a plazmacsere, önmagában vagy im-


munglobulinnal, illetve Rituximab (anti-CD20)-al kombinálva, első héten naponta, majd minden második nap. ANCA-asszociált rapid progresszív glomeruloneph ritis (Wegener granulomatosis). A kórképhez gyakran társul Henoch-Schönlein purpura, IgA nephropathia, cryoglobulinaemia, lupus nephritis, pulmonalis (diffúz alveolaris hemorrhagia) folyamat. 5%-os albuminnal szubsztituálunk, a tüdőt érintő folyamatban friss fagyasztott plazmát használunk. Dialízis dependens formánál a plazmacserének jó hatásfoka van. Rapidan progrediáló glomerulonephritis (RPGN) esetén azotemia, proteinuria, hematuria, crescent képződés meghaladja a 70%-t, és szteroid és cyclophosphamid terápiára nem javul, akkor PEX javasolt. Focalis segmentalis glomerulosclerosis (FSGS), szövettani diagnózis, s amennyiben féléves standard kezelés mellett nem csökken a proteinuria, plazmacsere javasolt. Immunadszorpciós technikával (staphylococcus protein A oszloppal) a terápiás hatás fokozható. (Magyarországon ez még nem terjedt el, a kezelés nincs befogadva az OEP-által.) Renopulmonaris szindróma (Goodpasture szindróma), anti-glomerular basal membran (anti-GBM) betegség: hemaptoe, anti-GBM antitest (crescent képződés). Típusos klinikai kép esetén, ha nincs javulás, plazmacsere elvégzése szükséges. Akut tubulointestinalis nephritisben, amennyiben a szövettan anti-TBM pozitív, a plazmacsere hatékony terápia. Panarteritis nodosa: ha a rapidan progrediáló glomerulonephritis szteroid és cyclophosphamid kezelés ellenére romlik, illetve más szerveket is, mint például az idegrendszert is érintik az elváltozások, a plazmacsere jó hatásfokkal alkalmazható terápia. Guillain-Barré szindróma: GBS, (acut inflammatory demyelinating polyneuropathy: AIDP) felszálló parestesia és paresis. PEX kezeléssel az izom-idegvégződéseket blokkoló ellenanyagot távolítjuk el. Általában négy kezelést követően a tetrapleg beteg fel tud állni. Súlyos légzésbénulással járó esetekben több kezelésre van szükség. Krónikus inflammatorikus demyelinizációs polyneuro pathia (CIDP): szimmetrikusan a distalis és proximalis izmokat érintő paresis, ami kettő hónapnál régebben fennáll. Terápia: kortikoszteroid, plazmacsere, intravénás immunglobulin. Négy-hat plazmacserére a betegek jól reagálnak. Szubsztitúcióként 5% Human Albumint kell adni, és egy vagy másfélszeres plazma volument célszerű cserélni. Myasthenia gravis (MG): autoimmun betegség, ptosis, diplopia, mimikátlan arc, izom-gyengeség stb. jellemzi. 20-40 év közötti nők betegsége általában. Acetylcholin receptor ellenes antitest felelős a tünetekért. A plazmacserét alkalmazzuk myasthenias krízis prevencióként, krízis állapotban és thymectomia előtt jó hatásfokkal. Neuromyelitis optica (NMO, Devic szindróma): Gyulladásos demyelinizációs folyamat a gerincoszlop és a nervus opticus területén, ennek megfelelően a kli-


nikai tünetek is igen változatosak: neuritis optica, akut myelitis, spinálisan három vagy annál több vertebralis szegmensben látható eltérés, a koponya MRI nem mutatja a sclerosis multiplex képét. NMO szeropozitív, azaz NMO-IgG blokkolja az aquaporin-4 (AQP4) csatornát. Akut fellépésnél nagy dózisú intravénás szteroid és plazmacsere jó hatásfokkal távolítja el a keringő antitesteket, általában hét kezelés elegendő. Számos nemzetközi felmérés mutatja, hogy a plazmacsere hatékony terápia NMO-ban, hazánkban az OEP nem fogadta még be a finanszírozott diagnózisok sorába, vagyis engedély köteles. Krónikus fokális encephalitisben (Rasmussen’s encephalitis), amikor is a cerebrospinalis folyadék vizsgálata során mérsékelt lymphocytosist és protein emelkedést találunk, a betegnek epilepsziás görcsei vannak, ami a státus epilepticus-ig fokozódhat. A folyamatért a glutamat receptor (GluR3) blokkoltsága, vagyis az anti-GluR3 felelős. A kezelés célja az epilepsziás rohamok csökkentése, szanálása. A PEX nemzetközileg gyakorolt terápia, Magyarországon engedély szükséges ebben a kórképben a PEX kezelés elvégzéséhez. A plazmacsere önmagában, vagy intravénás immunglobulin adásával kombinálva csökkenti a rohamok számát és nincs szükség a hemisferectomiára. Stiff Person szindróma (SPS): paroxismalis rigiditás, izom spasmus az alsó végtagokon és a háton. A tünetekért az anti-GAD65 (glutamic acid decarboxylase) antitest felelős. A plazmacsere azoknál a betegeknél hatékony, akik az első vonalbeli terápiára nem reagálnak. Magyarországon OEP által nem befogadott diagnózis, engedély köteles. Definitív thrombocytosisról akkor beszélünk, amikor a vérben keringő thrombocyta szám meghaladja a 450-500 G/l-t. Esszenciális thrombocytosisban, amenynyiben a thrombocyta szám 1000 G/l feletti és manifest trombózis és/vagy vérzés fenyeget, citaferezis, azaz thrombocytaferezis kivitelezése szükséges. A kezelés lényege buffy coat létrehozása és a magas thrombocyta szám lecsökkentése közel normálisra. A kezelés akkor hatékony, ha az eltávolított thrombocyta masszában a plazma és vörösvérsejt mennyisége minimális. Thromboticus thrombocytopenias purpura (TTP) és haemolyticus uraemias szindróma (HUS). Mindkét esetben microvascularis thrombocyta aggregációról van szó, melynek eredménye microthrombusok keletkezése, következményes szöveti ischémiával és microangiopathias hemolízissel. A TTP esetében a központi idegrendszer, a HUS esetében a vese érintett elsősorban. Az alvadási faktorok elhasználódnak, tehát a plazmacsere célja egyben ezek pótlása is, vagyis a szubsztitúció friss fagyasztott plazmával történik. Ennek mértékét a komplement rendszer vizsgálata, genetikai vizsgálatok és az ADAMTS13 szintje határozza meg. Thrombocyta adása kontraindikált, kivéve akut életveszély. A halálozási arány igen magas e kórképekben, ezért a betegség alapos gyanúja is kellő indok a kezelés megkezdéséhez, amit naponta kell ismételni. Súlyos esetben, amikor a PEX nem elégséges szteroid, cyclophosphamid, rituximab adása szükséges, és ezt protokoll szabályozza. 23


Haemolysis-elevated liver enzymes-low platelet count: HELLP szindróma: szülészeti komplikáció, azonnali plazmacsere szükséges. Szubsztitúciós oldat, friss fagyasztott plazma és 5% Human Albumin. A páciens intenzív ellátást igényel. Masszív intravasalis hemolízis esetén, amikor veseelégtelenség fenyeget, szükséges a plazmacsere kezelés. Autoimmun haemolyticus anaemia: Hideg típusú keringő antitest (IgM) normál testhőmérsékleten a keringésben van, tehát PEX kezeléssel eltávolítható. Haemolyticus krízisben a PEX a választandó terápia. Cryoglobulinaemia: a krioglobulin egy monoklonális immunglobulin, mely a testhőmérséklet csökkenése során kitapad az erek falára és keringési elégtelenséget idéz elő. Ennek eredménye a Rauynaud szindróma, vasculitis, nekrotizáló bőr-vasculitis. Következményes cryoglobulinaemia például Hepatits C vírus fertőzés után. Társulhat Waldenström macroglobulinaemiához, Rheumatoid arthritishez. A plazmacsere kezelés célja a cryocrit 1% alá való csökkentése, a tünetek mérséklése. Gammopathiák: Waldenström macroglobulinaemia, Myeloma multiplex, Hyperviscositas monoklonális gammopathiában, Paraproteinaemiás polyneuropathia, Nem definiált gammopathia: monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS). A szérum összfehérje meghaladhatja a 100 g/l-t, hyperviscositas, szorító mellkasi fájdalom, hallás problémák, szédülés, fejfájás, veseelégtelenség, polineuropathia. Már az egyszeri plazmacsere is hatékonyan csökkenti, esetleg szanálja a tüneteket. Immunadszorpciós oszloppal a kezelés hatékonysága növelhető. Hyperleukocytosis kórképekben leukocytaferezist, azaz sejtdepléciót végzünk. Krónikus myeloid leukémiában (CML), ahol a fehérvérsejt szám meghaladja a 300G/l-t, krónikus limfoid leukémiában, ahol a fehérvérsejtszám több, mint 500 G/l. Magas perifériás sejt szám esetén, ahol organomegalia okozta kompressziós tünetek fenyegetnek. Fenyegető leukostasis esetén. Akut leukémia kemoterápiás kezelése során várható toxikus cytolisis reakció megelőzésére. Haemopoeticus őssejt terápia része az őssejt gyűjtés. Az őssejt gyűjtés feltétele, gyermek és felnőtt esetén egyaránt, hogy a perifériás vérben keringő CD34+ sejtek száma meghaladja a 10/mikrolitert. A terápiához szükséges sejtmennyiséget mindenesetben a recipiens testsúlyára kell kiszámolni, ezért a CD34+ sejtek aferezisét több lépcsőben végezzük. Autológ esetben maximum négy, allogén donáció esetén öt citaferezis elvégzése engedélyezett az erre kijelölt intézményekben. Allogén haemopoeticus őssejt terápiát követően akut és krónikus GVHD (graft-versus-host disease) léphet fel. Az extracorporalis photopheresis (ECP), ami citaferezis és UV fény terápia kombinálva 8-metoxypsoralen citotoxikus kezeléssel extracorporalisan. A kezelés lényege röviden, hogy a GVHD-ért felelős „T” lymphocyták periférián történő keringési idejét lerövidíti és az opszonizácón, fagocitózison keresztül erősíti az immunrendszert. Az ECP kezelés bőr-GVHD-ban a leghatékonyabb, de bél-, máj-GVHD-ban is alkalmazzák. 24


Tüdő és ízületeket érintő GVHD folyamatokban az ECP kezelés nem hatékony. Tüdő és szív transzplantációt követő graft rejekció gyanúja esetén az ECP hatékony terápia lehet. Magyarországon az ECP ezekben az esetekben nem befogadott eljárás, engedély köteles. Pemphigus vulgaris: a bőr/nyálkahártya hólyagos autoimmun megbetegedése. A plazmacsere intravénás immunglobulin terápiával kombinálva jó hatásfokú. Nemzetközi gyakorlatban az ECP kezelést is alkalmazzák, hazánkban ez még nem befogadott kezelési módszer. Mycosis fungoides (MF), leukémiás variánsa a Sézary szindróma (SS) a Cutan T sejtes lymphoma (CTCL) csoportba tartoznak. Azok a betegek, ahol erythroderma is jelen van az ECP kezelés hatékonyabb, mint a non-erythrodermás formáknál. Az ECP terápiát eleinte hetente két alkalommal, majd két hetente két alkalommal, utána havonta két alkalommal öt-hat hónapig végezzük. Progresszív szisztémás sclerosis (PSS): összetett autoimmun megbetegedés, ahol az immunszuppresszív terápia kiegészül plazmacserével, illetve ECP kezeléssel, megfelelő protokoll szerint. Szisztémás lupus erythematosus (SLE): Krónikus gyulladásos folyamat, ahol auto-antitestek, immunkomplexek keringenek és komplement depositumok keletkeznek. A plazmacsere kezelés javasolt szteroid és/ vagy cyclophosphamid terápiára nem javuló formákban. Agyi vasculitisben, lupus nephritisben, vérzéssel vagy agyi thrombosissal járó antiphospholipid szindrómában. Primer antiphospholipid katasztrófa szindróma (APS): Három vagy több szerv párhuzamos vagy rövid időn belül bekövetkező thromboticus érintettsége. Igen magas a mortalitás. Lupus antikoaguláns, anticardiolipin, béta2 glikoprotein kimutatható. Azonnali plazmacsere kombinálva szteroid, cyclophosphamid, intravénás immunglobulin, azaz immunszuppresszív terápiával. A beteg intenzív ellátást igényel. Rheumatoid arthritis (RA): Etiológia nem ismert, krónikus, multiszisztémás autoimmun megbetegedés, ahol a plazmacsere, szteroid és cyclophosphamid terápia mellett progrediáló esetekben, vasculitisben, hyperviscositas szindrómában, cryoglobulinaemiában segít a kezelésben. Immunadszorpciós oszloppal kombinálva a kezelés hatékonysága növelhető. Hypertriglyceridaemia: A vérzsír szint meghaladja gyermekben: 25 mmol/l, felnőttben: 40 mmol/l szintet, illetve ha a recidív pancreatitis hátterében a magas vérzsír szint áll, plazmacsere kezelést végzünk. Súlyos hyperlipidémiában LDL-aferezist alkalmazunk. Akut nekrotizáló pancreatitis: A PEX kezelést naponta végezzük két-három napig, majd kettő-négy hétig hetente, hogy a vérzsír szint rendeződjön. Hypercholesterinaemia homo- és heterozigóta esetben folyamatos plazmacsere kezelésre van szükség. A kezeléseket 14 naponta célszerű végezni. Dilatatív cardiomyopathia: a plazmacserét öt egymást követő napon kell végezni. Immunadszorpciós osz-


Az aferezis szerepe a gyógyításban Irodalomjegyzék

loppal végezve a kezelés hatékonyabb, ami hazánkban még nincs befogadva az OEP által. Fulminans májelégtelenség (Wilson kór, toxikus májkárosodás): Hazánkban a MARS (Molecular Adsorbents Recirculating System) és a PROMETHEUS műmáj kezelések kerültek befogadásra. A MARS kezelés alkalmas kis súlyú (pl. 10 kg) betegek kezelésére is. Mivel a kezelés során folyamatosan használ Human Albumint a volumen pótlására, ezáltal drágább terápiás módszer. A máj regenerációja szempontjából nincs különbség a két kezelés között. A hagyományos plazmacsere friss fagyasztott plazmával történik a prothrombin érték függvényében. a fulminans májelégtelenség kezelésére a MARS és a PROMETHEUS kezelés egyaránt használhatóm azonban a betegeknél hemodinamikai stabilitást csak a MARS monitor alkalnazásával sikerült elérni. A MARS rendszerben van csak 25 kg alatti test-tömegű gyermekek kezelésére alkalnas mini kit. Hazánkban a májpótlás 550.000 Ft/kezelés finanszírozással került befogadásra. Mind a MARS, mind a PROMETHEUS májpótló kezelés elvileg elérhető, a finanszírozás a költségek teljes mértékét nem fedezi. Thyreotoxikus krízis: A plazmacserét alkalmazzuk thyreoidectomia előtt, amikor a szérum T4 szintje magas, thyreotoxikus krízisben, ha az additív terápiára nem javul. Különböző mérgezésekben (gyógyszer, Lyell szindróma, gomba, kígyó stb.): A beteg intenzív ellátást igényel, s a plazmacsere hatékonyan detoxikálja a szervezetet. Sepsis: a gyulladásra adott, kontroll alól kicsúszott generalizált válasz, mely érinti az immunrendszert, keringést, mikrocirkulációt (capillar leak), a plazmacsere kezelés javítja a beteg státuszát, engedélyhez kötött beavatkozás. Intenzív betegellátást igényel.

1. Bien C.G., Granata T., Antozzi C. et al.: Pathogenesis, diagnosis and treatment of Rasmussen encephalitis. Brain,128, 454-471, 2005 2. Domján Gy., Gadó K.: A plazmaferezis felnőttkori indikációi. Focus Med., 2-3, 18-24, 2012 3. Kallenberg C.G., Tadema H.: Vasculitis and infections contibution to the issue of autoimmunity reviews devoted to „autoimmunity and infection”. Autoimmun Rev., 8(1), 29-32, 2008 4. Kaynar L., Altuntas F., Aydogdu I. et al.: Therapeutic plasma exchange in patients with neurologic diseases: retrospective multicenter study. Transf. Apher. Sci., 38(2), 109-115, 2008 5. Réti M.: A thromboticus thrombocytopeniás purpura és haemolyticus uraemias szindróma. Focus Med., 2-3, 38-46, 2012 6. Scully M., McDonald V., Cavenagh J. et al.: A phase 2 study of the safety and efficacy of rituximab with plasma exchange in acute acquired thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood, 18, 118(7), 1746-1753, 2011 7. Soltész P., Bedő Z., Veres K. et al.: Plazmaferezis terápia a Debreceni Egyetem III. számú Belklinikáján az elmúlt 30 évben, Focus Med., 2-3, 32-37, 2012 8. Special Issue Abstracts from the 34th Annual Meeting of the American Society for apheresis, May 22-25, 2013 Denver, Colorado. J. Clin. Apher., 21272, 2013 9. Szczepoirkowski Z.M., Winters J.L., Bandarenko N. et al.: Guidelines on the Use of Therapeutic Apheresis in clinical Practice-Evidence-Based Approach from the Apheresis Applications Committee of the American Society for Apheresis, J. Clin. Apher., 25, 83-177, 2010 10. Taylor C.M., Machin S., Wigmore S.J. et al.: Workingparty from the Renal Association, the British Committee for Standars in Haematology and the British Transplantation Society: Clinical Practice Guidelines for the management of atypical Haemolytic Uraemic Syndrome in the United Kingdom. Br. J. Haemat., 148, 37-47, 2009 11. Túri S., Bereczki Cs., Haszon I. et al.: Terápiás aferezis gyermekkorban. Focus Med., 2-3, 25-31, 2012 12. Weiss I.P.F., Klink A.J., Friedmann D.F. et al.: Pediatric therapeutic plasma exchange indication and patterns of use in US childrens hospitals. J. Clin. Apher., 21242, 2012

Konklúzió A terápiás aferezis a medicina különböző területein hatékony terápiás módszer, önállóan vagy gyógyszeres terápiával kiegészítve. Interdiszciplinális tudomány, mely újabb technikai lehetőségeket von be a terápiás hatás növelése érdekében (Immunadszorpció, MARS, PROMETHEUS), és ezáltal bővül a kezelhető kórképek száma is.



25

Focus Medicinae


Ferezisgépek minden

Amicus

26

COM.TEC


Down szűrés a gyakorlatban

Down szűrés a gyakorlatban Dr. Török Olga Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika, Debrecen Összefoglalás: A Down-szindrómára magas kockázatú terhességek korai felismerését az utóbbi években hatékony szűrővizsgálatok teszik lehetővé. A szűrőprogram során kiemelt pozitív esetekben a betegség biztos igazolására vagy kizárására eddig csak a vetélés kockázatával járó invazív diagnosztikus módszerek révén volt lehetőség. A prenatális diagnosztikában napjainkban azonban egy paradigmaváltás zajlik. Az anyai vérben keringő szabad magzati DNS vizsgálatán alapuló ún. non-invazív prenatális tesztek (NIPT) ma még ugyan meglehetősen drágák, de szerte a világon folyamatosan növekszik az igény irántuk, hiszen a 21-, a 18- és a 13-as triszómiára csaknem 100%-os szenzitivitásúnak és specificitásúnak bizonyultak. Egyelőre azonban csak az emelkedett kockázatú esetek további vizsgálatára, ún. másodlagos szűrővizsgálatként ajánlhatóak az invazív beavatkozások számának csökkentése érdekében, és a tesztet megelőző és követő felvilágítás kizárólag genetikai tanácsadás keretében történhet.

Summary: Early detection of high risk pregnancies for Down syndrome has become available by effective screening programs. To date, in the screen positive cases the diagnosis of trisomy-21 could be excluded or confirmed only by invasive diagnostic methods with a risk of spontaneous abortion. Recently, we are witnessing a paradigm shift in prenatal diagnosis. In spite of the relatively high price of the different commercially available cell-free fetal DNA based non-invasive prenatal tests, their utilization is continuously growing world-wide, due to the almost 100% sensitivity and specificity for the prediction of trisomy 21, 18 and 13. Nowadays NIPTs can be offered only as advanced screening tests for the further evaluation of high risk pregnancies. The need of invasive testing can significantly be decreased this way, but detailed pre- and post-test genetic counselling is strictly recommended.

Kulcsszavak: Down-szindróma, aneuploidiák, prenatális diagnosztika, szűrővizsgálatok, non-invazív DNS alapú tesztek, NIPT

Key words: Down syndrome, aneuploidies, prenatal diagnosis, screening methods, non-invasive DNA based testing, NIPT

Bevezetés

szágon a 21-es triszómiás esetek megközelítőleg 60%-a kerül prenatálisan felismerésre (2010-ben 68%), és ez az eredmény nem marad el az európai átlagtól EUROCAT (a veleszületett rendellenességek európai regisztere).

A Down-kór a leggyakoribb, súlyos szellemi és testi fogyatékossággal járó veleszületett genetikai betegség, amely az esetek többségében az élettel jól összeegyeztethető. Hátterében a 21-es kromoszóma triszómiája áll, azaz a 21-es kromoszómából eggyel több, összesen 3 kópia található valamennyi sejtben (21es triszómia) vagy a sejtek bizonyos részében (mozaik 21-triszómia), ez utóbbi esetekben a klinikai tünetek általában kevésbé súlyosak. A súlyos vagy igen súlyos fokú mentális retardáció miatt a Down-kórosok többsége önálló életvitelre nem képes, ezért Magyarországon a prenatális szűrő és diagnosztikus módszerek igénybevételével a betegség méhen belüli felismerésére nagy a társadalmi igény. Amennyiben ezek a vizsgálatok az intrauterin magzat 21-es triszómiáját igazolják, a hazai jogszabályok értelmében a szülők a terhesség 20. hetéig, illetve a diagnosztika elhúzódása esetén legkésőbb a 24. hétig kérhetik a terhesség befejezését. Irodalmi adatok szerint prenatális diagnosztika alkalmazása nélkül a Down-kór születéskori gyakorisága 1:600-1:750-re tehető, ami Magyarországon évi 90100 ezer szülést számolva 150-190 Down-kóros magzat születését jelentené. A Veleszületett Rendellenességek Országos Nyilvántartása (VRONY) hazánkban 1970-től gyűjti és elemzi a bejelentett veleszületett és 1985-től a prenatálisan diagnosztizált rendellenességeket is. A VRONY adatai szerint az utóbbi években Magyaror-

A prenatális felismerés lehetőségei A vizsgálatok két nagy csoportba sorolhatók. A szűrővizsgálatok alkalmazása valamennyi terhességben ajánlható, ezek révén lehetségessé válik azoknak az eseteknek a kiemelése, amelyekben a 21-triszómia kockázata az átlagosnál magasabb. A szűrővizsgálat pozitív eredménye esetén további, diagnosztikus vizsgálat alkalmazása indokolt. Az utóbbiak azonban a spontán vetélés kockázatával járó invazív intrauterin beavatkozás útján történő mintavételt igényelnek, ezért a vizsgálatról történő döntés során mindig alapos mérlegelést igényel a betegség súlyosságán túl az előfordulás aktuális esélye és a szóba jövő invazív beavatkozás kockázata (13).

Diagnosztikus módszerek Napjainkban a kromoszóma-rendellenességek diagnosztikájának hazánkban leggyakrabban alkalmazott módszere a 15-20. terhességi hét között végzett amniocentesis. Ennek során ultrahang ellenőrzés mellett vékony tűvel az anya hasfalán át történik 15-20 ml magzatvíz vétele az amnionüregből. A beavatkozás vetélési kockázata nagy esetszámon alapuló prospektív tanulmányok alapján 0,5-1% közé tehető. A magzatvíz27


ben levő sejtek a magzat testfelületéről válnak le, ezért valamennyi, a magzatra jellemző genetikai információt hordozzák. Spontán azonban már nem osztódnak, és a hagyományos citogenetikai vizsgálathoz szükséges, metafázisban levő kromoszómák nyerése érdekében, megfelelő laboratóriumi körülmények között, 7-14 napig tenyésztést igényelnek, ezt követően válik lehetségessé a kromoszómák preparálása, sávozása és értékelése. A vizsgálat eredménye 2-3 hét múlva várható. Molekuláris genetikai módszerekkel (FISH, fluoreszcens PCR, CGH) tenyésztetlen mintából is történhet citogenetikai vizsgálat. Ez utóbbi vizsgálatok gyors diagnózist eredményeznek, de elsősorban a leggyakoribb számbeli kromoszóma rendellenességek felismerését vagy kizárását teszik lehetővé. A tenyésztett mintákon történő, hagyományos kromoszóma analízis során felmerülő mozaikosságok (egyidejűleg szabályos és kóros kromoszóma összetételű sejtvonalak jelenléte a mintában) esetén a molekuláris genetikai módszerek alkalmazásának előnye, hogy jóval nagyobb számú sejt vizsgálatát biztosítják (13). Beteg magzat esetén a kétségtelenül kisebb kockázattal járó első trimeszteri terhesség-megszakítás előnyei vitathatatlanok. A korai felismerést a chorionboholy mintavétel (chorionic villus sampling-CVS) teszi lehetővé. A beavatkozás ugyancsak ultrahangvezérléssel történhet, és bár technikailag már a 7. hét után kivitelezhető, a 10. hét előtt nem javasolt, ugyanis a túl korai mintavételek emelik a magzati végtagredukciós rendellenességek kockázatát. A mintavételt az amniocentesishez hasonlóan transabdominalis, ritkábban vékony katéter segítségével transcervicalis úton végezzük a chorion frondosumból, a beavatkozást követő vetélés kockázata kb. 1%. A bolyhoknak az anyai deciduától történt megtisztítása után nyert minta sejtjei ugyancsak hordozzák a magzatra jellemző genetikai információt, ezért a citogenetikai vizsgálatokon túl egyéb genetikai betegségek vizsgálatára is alkalmasak. A chorionbolyhok felszínén elhelyezkedő syncytiotrophoblast sejtek magas mitotikus aktivitása tenyésztés nélkül is lehetővé teszi nagyszámú, metafázisban levő sejt preparálását karyotipizálás céljából, biztosítva a magzat kromoszóma rendellenességének a mintavételt követő 24-48 órán belül történő kizárását vagy felismerését. Ennek az ún. direkt preparátumnak a hátránya, hogy a gyorsan osztódó syncytiotrophoblast sejtekben nagyobb eséllyel keletkeznek aneuploidiák (számbeli kromoszóma-rendellenességek), és ezért a direkt preparálás során gyakrabban találunk ún. placentaris mozaicizmust. Ez többnyire posztzigotikus nondiszjunkció eredménye, és nem érinti a magzati sejteket, tehát ezekben az esetekben a preparátum nem a magzat valós karyotípusát tükrözi. Ezért, továbbá a kromoszóma preparátumok jobb minősége érdekében citogenetikai vizsgálat céljából a direkt preparálással párhuzamosan a chorion minta tenyésztése is indokolt. Ez esetben a bolyhok mesenchymalis eredetű sejtjeiből végezzük a kromoszóma analízist, az így nyert preparátumok a kromoszómák szerkezeti rendellenességeinek felismerését is megkönnyítik. A tenyésztés eredményének bármilyen bizonytalansága 28


esetén magzatvízből is el kell végezni a citogenetikai vizsgálatot (13). Napjainkban a kromoszóma rendellenességek diagnosztikájában egyre ritkábban végezzük magzati vérmintavétel céljából az ultrahangvezérelt köldökzsinór punkciót (chordocentesis).

Szűrővizsgálatok Anyai életkor Hosszú múltja van annak a megfigyelésnek, hogy a Down-szindróma előfordulási gyakorisága az anyai életkor előre haladtával minden populációban növekszik. Ugyanez igazolódott az egyéb aneuploidiákról, amelyek születési prevalenciája viszont sokkal alacsonyabb, mint a 21-triszómiáé és nagy többségük már a korai intrauterin élettel is összeegyeztethetetlen. A 18-as és 13-as triszómiás magzatok élve születhetnek, azonban a tünetek jóval súlyosabbak, a korai postnatális életben halálozáshoz vezetnek. A 21-es triszómia szűrővizsgálata során alkalmazott módszerekkel a 18-as (Edwards-kór) és 13-as (Patau-kór) triszómia kockázatbecslése is lehetséges, és a méhen belüli diagnosztika is ugyanolyan módon történhet. A 70-es, 80-as években a számbeli kromoszóma rendellenességekre magas kockázatú esetek kiválasztásának egyetlen lehetőségét az anyai életkor jelentette, és mivel a rizikó 35 éves kor felett exponenciális növekedést mutat, a 35 évnél idősebb várandósoknak ajánlották az amniocentesist. Ezzel a módszerrel azonban a 21-triszómiás eseteknek csak kb. 25-30%-a volt prenatálisan diagnosztizálható, hiszen a fiatalabb korcsoportba tartozó nők, akiknek az egyéni kockázata ugyan jóval kisebb volt, tették ki a szülőnők mintegy 95%-át. Napjainkban a fejlett országokban a terhesség vállalásának időpontja egyre későbbre tolódik, egyes területeken már a 20%-ot is eléri a 35 év felettiek aránya, de ha mindegyik esetben megtörténne a prenatális kromoszóma vizsgálat, az összes 21-triszómiás esetnek akkor is mindössze kb. 50%-a kerülhetne felismerésre. Érthető tehát az igény hatékonyabb szűrőmódszerek alkalmazására (9,13). A szűrővizsgálatok fejlesztésnek két alapvető irányát eddig az anyai vérben vizsgálható biokémiai markerek kutatása, továbbá az első és második trimeszteri ultrahangszűrés során felismerhető major és minor magzati rendellenességek vizsgálata jelentették. Ezekről összességében elmondható, hogy valamennyi esetben a kockázat számításának az alapját a gravida életkori kockázata jelenti. Az életkori kockázat ugyanakkor függ a terhességi kortól is. Jól ismert ugyanis az a tény, hogy a terhességi kor előrehaladásával az aneuploid magzatok spontán bekövetkező intrauterin szelekciójának (pl. a 21-triszómiás magzatok kb. 40%-a a terhesség 12-40. hete között intrauterin elhal) eredményeként csökken az aneuploidiák gyakorisága. Az életkor és az aktuális terhességi kor alapján várható kockázatot az anamnézisben előfordult triszómiás magzat vagy újszülött kb. 0,75%-kal növeli (9).



Biokémiai szűrővizsgálatok

Ultrahangszűrés

A magzat ún. velőcsőzáródási rendellenességeinek szűrésére a 70-es években javasolt, Magyarországon a 80-as évek elején bevezett alfa-fetoprotein (AFP) szűrés tapasztalatai és az így gyűjtött szérum minták retrospektív vizsgálatai vezettek ahhoz a felfedezéshez, hogy a 21- és 18-triszómiás magzatot viselő anyák szérumában nemcsak az AFP, de egyéb lepényi hormonok és fehérjék (béta hCG, PAPP-A, nem konjugált ösztriol, inhibinA, SP1, stb.) koncentrációjának eloszlása is eltér az egészséges magzatot viselő terhesekétől. A kiváló felbontóképességű ultrahangkészülékek birtokában egyébként az anyai szérum AFP szűrővizsgálatnak napjainkban már egyáltalán nincs létjogosultsága, és Magyarországon az új várandósgondozási protokollban kikerült a kötelezően ajánlott szűrővizsgálatok sorából. A biokémiai markereknek a szérum szintje a terhességi kortól függően változik, ezért az aktuálisan mért koncentrációt az euploid magzatot viselő terhességeknek az adott terhességi korra jellemző median értékéhez viszonyítva MoM (multiple of median) adják meg. Az euploid és aneuploid terhességekben is a log MoM értékek Gauss féle eloszlást mutatnak, és egy adott MoM értéknél az eloszlások magasságának aránya alapján kalkulálható a 21-triszómia valószínűségi hányadosa (likelihood ratio-LR), amivel azután az aneuploidiák ún. „a priori” anyai életkori kockázata módosítandó. Az egyes markerek koncentráció változása egymástól független, éppen ezért több marker kombinációja nagyobb hatékonysággal képes a magzat 18- és 21-triszómiáját jelezni. Az anyai életkort, a terhességi hetet és a biokémiai szűrővizsgálat különböző paramétereinek eredményét együttesen értékelő, tapasztalati adatok alapján készült számítógépes program segítségével kiszámítható az adott terhességben a 21- és 18-triszómia ún. individuális kockázata. Ezt a kockázatot egy arányszámban szokás megadni. Tetszőlegesen választható meg az a kockázati küszöbérték, amely felett invazív vizsgálat végzése jön szóba. Minél alacsonyabb kockázati értéknél húzzák meg ezt a határt, annál nagyobb eséllyel sikerül az átlag populációból kiemelni azokat a terhességeket, amelyekben a magzat kromoszóma-rendellenességgel sújtott, tehát nő a szűrővizsgálat szenzitivitása. Ezzel egyidejűleg azonban nő az ún. fals pozitív eseteknek a száma, amelyekben feleslegesen történik vetélés esélyével járó invazív diagnosztika. A terhesség második trimeszterében, 1:250 kockázati küszöb esetén, az ún. hármas teszt (AFP, hCG és szabad ösztriol) érzékenysége 5% fals pozitív ráta mellett 60-65%, a négyes teszté (AFP, hCG, szabad ösztriol és inhibin-A) 65-70%, ami legfeljebb 5%kal emelhető az intakt hCG helyett a szabad beta hCG mérésével. Az első trimeszterben a két leghatékonyabb biokémiai markernek a szabad béta hCG és a PAPP-A bizonyult, de a biokémiai szűrés az első trimeszterben az önmagában is hatékonyabb ultrahangszűrés szenzitivitásának további javítására kiegészítő módszerként terjedt el (12).

A Down-kór újszülött korban és később észlelhető morfológiai jegyeinek nagy része, mint például a laza, tarkótájon ráncba emelhető bőr (cutis laxa), orrcsont hypoplasia, lapos arc, vitium, duodenum atresia, stb. az esetek bizonyos százalékában ultrahangvizsgálat során már a terhesség első felében is észlelhető. Ez teszi lehetővé a 21-triszómiás magzatok bizonyos hányadának méhen belüli felismerését ultrahangvizsgálattal. Ezeknek a major és minor rendellenességeknek a kimutatása nem jelent biztos diagnózist, csak a 21-es triszómia gyanúját vetik fel. 1. trimeszteri jelek A terhesség 11-13. hetében történő ún. első trimeszteri ultrahangszűrés elsődleges célja a magzat struktúrális malformációinak a felismerése. A veleszületett major rendellenességek jelentős része ugyanis a terhességnek már ebben az időszakában észlelhető. Minden magzatnál megfigyelhető azonban az első trimeszterben a tarkótájon bizonyos mennyiségű, illetve vastagságú folyadékgyülem is. A Down-kóros magzatok nagy többségében ennek a mennyisége lényegesen megnő. Erre az összefüggésre a világon elsők között magyar szerzők (Szabó és Gellén) hívták fel a figyelmet. Az elmúlt 20 év vizsgálatainak eredményeként ma már bizonyított, hogy ennek a folyadékgyülemnek a mérete, amelynek az angol irodalomban használt megnevezését (nuchal translucency NT) használják legtöbben a magyar gyakorlatban is, összefüggést mutat a magzati aneuploidia kockázatával. A tarkóredő mérete a magzat fejtető-farok távolságának (CRL) emelkedésével növekszik az euploid magzatok 95%-ában, de a 21-trisomiás magzatoknak csak 5%-ában. A mért tarkóredőnek a terhességi kor alapján várható normál median értéktől való eltérése alapján egy ún. mixture modell segítségével lehet kalkulálni azt a valószínűségi hányadost, amellyel meg kell szorozni az anyai életkor és terhességi kor alapján várható a priori kockázatot (15). A mérés a terhesség 11-13. hete (11 hét 0 nap - 13 hét 6 nap) között javasolt, ekkor a magzat ülőmagassága (CRL) 45-84 mm között van. A kiszélesedett tarkó redő egyéb számbeli kromoszóma-rendellenességekre (18-,13-triszómia, 45X0, stb.), veleszületett szívfejlődési rendellenességekre és számos, ritka, monogénes szindrómára ugyancsak emelkedett kockázatot jelent. Minél vastagabb a folyadékgyülem, annál nagyobb a kockázat, továbbá egyéb terhességi komplikációk (vetélés, méhen belüli elhalás) is gyakoribbak (9,13). Nagy esetszámú, prospektív vizsgálatok során nyert tapasztalatok lehetővé tették olyan számítógépes programok kidolgozását, amelyek segítségével az anyai életkorból kiindulóan a terhességi kor és a tarkótáji folyadékgyülem mérete alapján minden egyes terhességben kiszámítható a magzat 21-, 18- és 13-triszómiájának az esélye. A tarkó redő mérését a magzat neutrális helyzetében (a magzati fej ne legyen se hátrafeszített, sem előrehajtott), a median-sagittalis síkban, megfelelő

29


nagyításban, tizedmilliméteres pontossággal kell végezni. Ezeknek az előírásoknak a betartásával végzett mérések alapján történő kockázatbecslés, a választott küszöbértéktől függő szenzitivitással és fals pozitív rátával (ld. biokémiai szűrésnél) képes jelezni a 21-triszomiás esetek 70-80%-át. További, első trimeszteri ultrahangszűrés során vizsgálható minor és major jelek (orrcsont hiánya vagy hypoplasiaja, a magzati szív tricuspidalis billentyűjén a vér regurgitatioja, kóros áramlási görbe a ductus venosusban, lapos arc, stb.) segítségével tovább javítható a felismert gyanús esetek aránya a tévesen pozitívnak minősített esetek számának egyidejű csökkentésével (9). 2. trimeszter Bizonyos major anomáliák, amelyek viszonylag gyakrabban szövődnek kromoszóma-rendellenességekkel (duodenum atresia, szívfejlődési rendellenességek, hernia diaphragmatica, omphalocele, ventriculomegalia, stb.) többnyire csak a második trimeszteri ultrahang-szűrővizsgálatok során kerülnek felismerésre. Ezek azonban olyan mértékben növelik a magzati kromoszóma-rendellenességek esélyét, hogy izolált előfordulásuk esetén is indokolják a magzat kromoszóma vizsgálatának elvégzését. A második trimeszterben egészséges magzatokban is viszonylag gyakran láthatunk bizonyos minor eltéréseket (echogén belek, kétoldali pyelectasia, rövid humerus, rövid femur, echogén fókusz a szív papillaris izomban), amelyek önmagukban nem, de egymással vagy egyéb, csak célzott vizsgálat során felismerhető minor eltérésekkel (clinodactylia, szandál ujj, brachycephalia, stb.) társulva ugyancsak emelik a kromoszóma-rendellenességek előfordulásának esélyét. Ezeket a leleteket célszerű úgy értékelni, hogy az első trimeszteri szűrés során számított kockázat mértékét módosítjuk azzal a valószínűségi hányadossal, amennyivel egyegy ilyen jelnek a megléte, illetve hiánya módosítja a korábbi kockázatot. A magzat kromoszóma vizsgálatát lehetővé tevő invazív beavatkozás elvégzéséről a döntéshozatalt az így végzett kockázatbecslésre indokolt alapozni (9, 13). Kombinált teszt Amennyiben az NT mérésen alapuló kockázatbecsléshez az első trimeszterben leghatékonyabbnak bizonyult két anyai szérum marker (szabad béta hCG és PAPP-A) vizsgálatát is hozzáadjuk, a módszer érzékenysége 90%-ra emelhető. Ez az ún. első trimeszteri kombinált szűrővizsgálat (9,12). Jelentős esetszámokat elemző prospektív tanulmányok bizonyítják, hogy a Down-szindrómára emelkedett kockázatú esetek felismerésére napjainkban ez a leghatékonyabb szűrőmódszer. Az is bizonyítottnak tekinthető azonban, hogy ezek a szűrőprogramok csak azokban az országokban működnek megfelelő hatékonysággal, amelyekben mind az ultrahang-, mind a biokémiai vizsgálatokat a megfelelő minőségbiztosítási kritériumok szigorú betartásával, azonos elvek szerint 30


végzik, pl. Dánia (6). Ezzel szemben, ahol a különböző szűrőmódszerek párhuzamosan működnek, megemelkedik a kiemelt, további invazív vizsgálatokat igénylő esetek száma. A Magyar Szülészeti és Nőgyógyászati Ultrahang Társaság (MSZNUT) 2004. január 1-től emelte be a magzati tarkó redő vastagságának első trimeszteri mérését az ajánlottan végzendő mérések sorába. A prenatálisan felismerésre került esetek arányának az emelkedése Magyarországon az utóbbi években nem kis mértékben ennek köszönhető. További jelentős előrelépést azonban a megfelelő minőségbiztosítási kritériumok betartásával, folyamatos audit mellett végzett első trimeszteri kombinált szűrővizsgálat széleskörű alkalmazása jelenthetne. Mivel a Fetal Medicine Foundation (FMF) által kidolgozott minőségbiztosítási rendszer az egész világon elfogadott és a rendszerhez történő csatlakozás ingyenesen lehetséges, a MSZNUT az FMF rendszerhez történő csatlakozást javasolja tagjai számára. Az FMF licence birtokában minden vizsgáló használhatja a kockázatbecslésre a folyamatosan újított és módosított szoftvert, amelybe az FMF által akkreditált biokémiai módszerek kerültek beépítésre (9,12). Az FMF elsőként az idén 25. születésnapját ünneplő Biotest Hungaria Kft. által forgalmazott Kryptor tesztet akkreditálta.

Non-invazív diagnosztika A molekuláris genetikai diagnosztika fejlődésével párhuzamosan az elmúlt évtizedekben intenzív kutatások folytak az anyai vérben keringő magzati eredetű sejtek prenatális diagnosztikában történő felhasználására annak reményében, hogy azok célzott vizsgálatával ki lehet majd váltani az invazív mintavételeket. A sejtek izolálása, dúsítása, a módszer automatizálása azonban számos nehézségbe ütközött, és a kérdést tovább bonyolítja, hogy nemcsak a folyamatban levő, de korábbi terhességből származó sejtek is perzisztálhatnak az anyai keringésben. Ez az irány tehát, bár jelenleg is kutatják, egyelőre zsákutcának tekinthető. A non-invazív magzati diagnosztikában mérföldkőnek bizonyult D. Lo és munkatársainak felfedezése 1997-ben, akik az anyai vérplazmában fiú magzatból származó szabad DNS molekulák jelenlétét igazolták. Ez a sejtmentes szabad magzati DNS (cell free fetal DNA: cffDNA) frakció a terhesség alatt az anyai vérplazmában keringő összes szabad DNS 3-20%-át (függően a terhességi kortól és számos anyai tényezőtől, pl. testsúly) teszi ki, elsősorban a lepény sejtjeinek apoptosisa révén kerül az anyai keringésbe, és a szülést követően gyorsan kiürül a vérből. A magzatra specifikus DNS szekvenciák azonosításával nemcsak a magzat nemének meghatározása, de rövidesen a magzat RhD genotípusának a kimutatása is lehetségessé vált. Napjainkban egyes országokban az Rh negatív terhesek gondozása és célzott immunprofilaxisa már ezen a módszeren alapul. További kutatások eredményeként rövidesen megoldották a leggyakoribb kromoszómális aneuploidiák diagnosztikáját is, ami ma már a klinikai gyakor-


latban egyre szélesebb körben kerül alkalmazásra (3,4). A közelmúltban egy kutatócsoportnak sikerült az anyai plazmában keringő DNS-ből az egész magzati genom szekvenálása, és ez megnyitotta a monogénes öröklődésű betegségek non-invazív prenatális diagnosztikájához vezető utat (7,8), továbbá lehetővé vált az összes számbeli és a nagyobb szerkezeti kromoszóma rendellenességek felismerése (2,8). Elmondható tehát, hogy a prenatális diagnosztikában elindult egy paradigma váltás. Az aneuploidiák non-invazív vizsgálata A magzati kromoszóma rendellenességek non-invazív diagnosztikájának alapvető feltétele olyan módszer alkalmazása, amely egy specifikus kromoszómára jellemző DNS szekvenciák rendkívül kismértékű emelkedésének érzékelésére képes. A multiplex paralell szekvenálás (multiple paralell sequencing: MPS) egyetlen futtatás során a DNS fragmentumok milliárdjainak egyidejű analízisét teszi lehetővé (1). Ezzel a módszerrel az anyai plazma DNS szekvenálását követően igen fejlett bioinformatikai rendszerek segítségével a humán referencia genommal történik az összevetés. Az egyes fragmentumok egymáshoz viszonyított arányának kromoszómánként történő feltérképezése során, ha a magzat triszómiás, a triszómás kromoszómából statisztikailag szignifikánsan több fragmentum lesz jelen a mintában, összehasonlítva egy diploid magzattal. Mivel azonban például a 21-es kromoszómához köthető szakaszok egy egészséges, diszómiás magzatban a szekvenált DNS fragmentumok kevesebb, mint 1,5%-át teszi ki, sok millió DNS fragmentum szekvenálása szükséges ahhoz, hogy annyi 21-es kromoszómára jellemző DNS szakasz analízise történjen meg, ami már statisztikailag szignifikánsan különbséget jelez az egészséges és triszómiás magzatok között. Az új generációs szekvenáló berendezések mindezt csaknem diagnosztikus értékű pontossággal tették elérhetővé a mindennapi gyakorlat számára is. A módszer technológiájának kidolgozását követően az első meggyőző eredmények birtokában 2008ban megkezdődtek a prospektív klinikai vizsgálatok, amelyek bizonyították, hogy egy rendkívül megbízható módszerről van szó. A részben prospektív, részben kohort tanulmányok szerint, amelyekben a vizsgált esetek száma 119-3228 között mozgott, a 21-triszómiás esetek felismerésének aránya 98,6-100%, a specificitás 97,999,97% közöttinek bizonyult. A későbbi vizsgálatok a bioinformatikai analízisek továbbfejlesztésével hasonló szenzitivitásúnak és specificitásúnak találták a módszert a 18- és 13-as triszómiára is (14). A legnagyobb esetszámú multicentrikus kínai tanulmány 11.105 aneuploidiára vegyes kockázatú terhességben tesztelte a módszert, és a 21-es és 18-as triszómiára a szenzitivitás 100%-nak, a specificitás 99,96%-nak bizonyult (5). Költség-hatékonysági szempontból a szimultán vizsgálható minták száma, valamint a még biztonsággal minimalizálható leolvasások száma fontos kérdés. Miután a teljes genom szekvenálás során számos olyan


információ is keletkezik, amelyek a leggyakoribb aneuploidiák kimutatását célzó vizsgálatok során nem kerülnek felhasználásra, több kutatócsoport kezdte vizsgálni az ún. célzott szekvenálást. Ennek során bizonyos kromoszóma szakaszok szelektív amplifikációját követően végzett MPS útján a célzottan vizsgált kromoszómák számbeli rendellenességeinek felismeréséhez szükséges leolvasások száma lényegesen csökkenthető (szelektált régiók digitalis analízise DANSR). A módszer előnyei egyelőre nem tekinthetőek bizonyítottnak, különös tekintettel arra, hogy a teljes genom szekvenálással nyerhető információ egyéb, nem várt kromoszóma rendellenességek felismerését is lehetővé teszi. Egyelőre további kutatás tárgyát képezi a digitalis PCR és a metilált DNS immunprecipitációs módszerrel kombinált real-time quantitatív PCR módszerek alkalmazása a non-invazív vizsgálatokban, amelyeknek a hatalmas gyakorlati előnyét ugyancsak a költségek csökkentése jelentené (1). A napjainkban kereskedelmi forgalomban levő tesztek mindegyike multiplex parallel szekvenálás módszerén alapszik, az USA-ban a Verinata és Sequenom, továbbá Kínában a BGI teljes genom szekvenálással végzi a vizsgálatokat, míg az ugyancsak Egyesült Államokban működő Ariosa és Natera célzott szekvenálást végez. Az árak 500-1700 USD között változnak, és egyelőre a teljes genom szekvenálás költsége magasabb. A végső ár azonban nem kizárólag a laboratóriumi költségeket tükrözi, országonként változik, és változó az is, hogy tartalmazza-e az alkalmazást megelőző és követő genetikai tanácsadást. Mindenesetre a tesztek ára minden valószínűség szerint jelentős mértékben fog csökkenni a közeljövőben, várhatóan az invazív vizsgálat költségei alá (14). Magyarországon jelenleg két teszt van forgalomban, 2012. októberétől a Németországban működő Lifecodexx által végzett PrenaTest és a BGI által végzett NIFTY teszt, az áruk, amely tartalmazza a tesztet megelőző és követő genetikai tanácsadást, amely az érvényben levő genetikai törvény értelmében minden genetikai tesztvizsgálat előtt és az eredmény közlésekor kötelező, 235.000, illetve 180.000 Ft. A klinikai gyakorlat szempontjából fontos kérdés a módszer helye a kromoszóma rendellenességek prenatális diagnosztikájában. Az orvostudományban alkalmazható új módszerek társadalmi következményeit elemző „California Technology Assesment Forum (CTAF) eredményei meghatározó jelentőségűek a biztosító társaságoknak a vizsgálatok finanszírozására vonatkozó döntéseiben. A CTAF a rendelkezésre álló irodalmi adatok alapján részletesen megvizsgálta ezt a kérdést, és arra a következtetésre jutott, hogy a módszer, mindenekelőtt a 21-es és 18-as triszómia prenatális felismerésére, a klinikai gyakorlatban nagy biztonsággal ajánlható. Egyelőre elegendő bizonyíték azonban csak az emelkedett kockázatú esetekben történő alkalmazás egyértelmű előnyeire vonatkozóan van. A hagyományos szűrővizsgálatokkal emelkedett kockázatú esetekben ugyanis a módszer alkalmazásával a felismert 21-tri31


szómiás esetek arányának növelésével egyidejűleg lényeges mértékben csökkenthető a vetélés kockázatával járó invazív beavatkozások száma. Az elsődleges szűrővizsgálatként történő ajánláshoz - annak ellenére, hogy a módszernek a szenzitivitása és specificitása is lényegesen magasabb bármelyik hagyományos szűrő módszernél-, nincs elegendő adat. Az aneuploidiákra átlagos kockázatú populációban ugyanis a betegség prevalenciája alacsonyabb, ezért a fals pozitív arány magasabb lenne, és a módszer pozitív prediktív értéke alacsonyabb (14). Egyelőre mindössze egy kohort tanulmány vizsgálta 2049 átlagos kockázatú, összesen 10 triszómiás esetet tartalmazó csoportban a módszer alkalmazását, és ebben a tanulmányban a fals pozitív ráta <0,1%-nak bizonyult (10). Nemcsak az USA-ban, de mindazokban az országokban, amelyekben a Down-szindróma szűrését szakmai irányelvek szabályozzák, a módszert ennek alapján egyelőre ún. fejlett vagy másodlagos szűrővizsgálatként ajánlják az egyéb szűrővizsgálatokkal kiemelt vagy az életkor és előzményi adatok alapján eleve emelkedett kockázatú esetek további vizsgálatára. A teszt pozitív eredménye esetén annak megerősítése a gold standard módszernek tekinthető invazív beavatkozás útján nyert mintából történő hagyományos citogenetikai vizsgálattal, feltétlenül indokolt. A módszer tehát továbbra sem tekinthető diagnosztikus értékűnek, ezért az irodalomban a megnevezését a korábbi non-invazív prenatális diagnosztika (NPD) helyett non-invazív prenatális tesztelés (NIPT), illetve a hagyományos non-invazív szűrővizsgálatoktól történő egyértelmű megkülönböztetés érdekében DNS alapú non-invazív prenatális teszt váltotta fel (3,14). Az eddigi tanulmányok eredményei alapján kb. 1:200 gyakorisággal várható diszkordancia a NIPT és a hagyományos, invazív mintavételt követő megerősítő citogenetikai vizsgálat eredménye között. A háttérben álló okok között leírtak placentáris mozaikosságot, anyai mozaikosságot, koraterhességben felszívódott ikerpárt, sőt anyai szolid tumort is, ami arra utal, hogy valójában nem fals pozitív esetekről van szó, hanem a nem várt eredmények a módszer nagyobb szenzitivitásának a következményei (3). Az anyai plazmában keringő magzati eredetű szabad DNS szakaszok szekvenálásával technikailag lehetővé vált a teljes magzati genom rekonstrukciója is. Sok házaspár számára, akiknek az előzményében ismeretlen eredetű magzati veszteségek, fejlődési rendellenességek szerepelnek, ez a módszer jelenthet majd előrelépést. A vizsgálat eredményeként azonban számos olyan információ birtokába juthatunk majd, amelynek klinikai következményei jelenlegi ismereteink alapján biztonsággal nem megítélhetőek, másrészt a terhesség sorsáról történő döntéshozatalra gyakorolt hatásuk jogos etikai aggályokat vet fel. Emiatt már most sürgető az igény olyan szakmai protokollok kidolgozására, amelyek az alkalmazás javallatait a kérdéssel kapcsolatban jelenleg felmerülő technikai és etikai kérdések alapos mérlegelésével állítja össze (11). 32

Down szűrés a gyakorlatban Irodalomjegyzék

1. Boon E.M., Faas B.H.: Benefits and limitations of whole genome versus targeted approaches for noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidies. Prenat. Diagn., 33(6), 563-568, 2013 2. Chen S., Lau T.K., Zhang C., et al.: A method for noninvasive detection of fetal large deletions/duplications by low coverage massively parallel sequencing. Prenat. Diagn., 33(6), 584-590, 2013 3. Chitty L.S., Bianchi D.W.: Noninvasive prenatal testing: the paradigm is shifting rapidly. Prenat. Diagn., 33(6), 511-513, 2013 4. Chiu R.W., Lo Y.M.: Clinical applications of maternal plasma fetal DNA analysis: translating the fruits of 15 years of research. Clin. Chem. Lab. Med., 51(1), 197-204, 2013 5. Dan S., Wang W., Ren J. et al.: Clinical application of massively parallel sequencing-based prenatal noninvasive fetal trisomy test for trisomies 21 and 18 in 11,105 pregnancies with mixed risk factors. Prenat. Diagn., 32(13), 1225-1232, 2012 6. Ekelund C.K., Jørgensen F.S., Petersen O.B. et al.; Danish Fetal Medicine Research Group.: Impact of a new national screening policy for Down’s syndrome in Denmark: population based cohort study. BMJ, 27, 337, a2547, 2008 7. Lench N., Barrett A., Fielding S. et al.: The clinical implementation of non-invasive prenatal diagnosis for single-gene disorders: challenges and progress made. Prenat. Diagn., 33(6), 555-562, 2013 8. Liang D., Lv W., Wang H. et al.: Non-invasive prenatal testing of fetal whole chromosome aneuploidy by massively parallel sequencing. Prenat. Diagn., 33(5), 409-415, 2013 9. Nicolaides K.H.: Screening for fetal aneuploidies at 11 to 13 weeks. Prenat. Diagn., 31(1), 7-15, 2011 10. Nicolaides K.H., Syngelaki A., Ashoor G. et al.: Noninvasive prenatal testing for fetal trisomies in a routinely screened first-trimester population. Am. J. Obstet. Gynecol., 207(5), 374, e1-6, 2012 11. Snyder M.W., Simmons L.E., Kitzman J.O. et al.: Noninvasive fetal genome sequencing: a primer. Prenat. Diagn., 33(6), 547-554, 2013 12. Spencer K.: Aneuploidy screening in the first trimester. Am. J. Med. Genet. C. Semin. Med. Genet., 15, 145C(1), 18-32, 2007 Review 13. Török O.: Prenatális diagnosztika. In: A szülészet-nőgyógyászat egyetemi tankönyve. Szerk.: Pál A. Medicina, 145-152, 2012 14. Walsh J.M., Goldberg J.D.: Fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing: a technology assessment. Prenat. Diagn., 33(6), 514-520, 2013 15. Wright D., Kagan K.O., Molina F.S. et al.: A mixture model of nuchal translucency thickness in screening for chromosomal defects. Ultrasound Obstet. Gynecol., 31(4), 376-383, 2008


ACPA: citrullinált proteinek és peptidek elleni antitestek ...

ACPA: citrullinált proteinek és peptidek elleni antitestek és jelentőségük a rheumatoid arthritis laboratóriumi diagnosztikájában Dr. Nagy Gábor Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Belgyógyászati Intézet, Klinikai Immunológiai Tanszék, Regionális Immunológiai Laboratórium, Debrecen Összefoglalás: Az ACPA egy olyan heterogén autoantitest család, amely különböző, poszttranszlációs módosítás során képződött citrullinált antigén elleni ellenanyagot foglal magában. Rheumatoid arthritis-es betegek egy jelentős részében kimutathatók, míg egészségesekben és más betegségben szenvedőkben alig. Egyértelmű diagnosztikai és prognosztikai jelentőségük mellett a személyre szabott kezelés kialakításában is szerepet kaphatnak. Az egyre gyűlő kutatási eredmények a betegség kialakításában betöltött szerepüket is tisztázzák fokozatosan. Megtudtuk, hogy a citrullinációt környezeti tényezők, többek között a dohányzás fokozzák, valamint hogy genetikai eltérések is hozzájárulnak a citrullinált antigének prezentációjához. A folyamatban egy sor citrullinált antigén elleni ellenanyag képződik, és nagy valószínűséggel nincs olyan az epitópok között, amely a betegségben domináló, kitüntetett jelentőségű lenne. A háttérben meghúzódó autoreaktív T- és B-sejtek ugyan nehezen vizsgálhatók, de a keletkező ACPA autoantitestek kiválóan használhatók biomarkerként a rheumatoid arthritis laboratóriumi diagnosztikájában.

Summary: ACPA is a heterogeneous autoantibody family, which includes different antibodies against citrullinated antigens, synthetised by posttranslational modification. They are detectable in a significant part of rheumatoid arthritis patients, in contrast with healthy people or patients with other diseases. They can be important near their clear diagnostic and prognostic role in the development of personalized treatment as well. Due to the increasing number of research results, their importance of the evolution diseases will be gradually clear. We have known, that the environmental factors, like smoking raise the citrullination and also genetic deviations contributes the presentation of the citrullinated antigens. In the procedure a lot of antibodies are synthetised against citrullinated antigens and most likely does not exist such an epitope, which one has dominance or special importance respect of the disease. The autoreactive T and B cells in the background are difficult to be tested, but the nascent ACPA autoantibodies can be used properly as biomarker in the laboratory diagnostics of rheumatoid arthritis.

Kulcsszavak: autoantitest, rheumatoid arthritis, citrullináció, autoreaktív sejtek, biomarker

Keywords: autoantibody, rheumatoid arthritis, citrullination, autoreactive cells, biomarker

Bevezetés

játossága, hogy bizonyos fehérjék citrullint tartalmazó epitópjait ismerik fel, és együttesen anti-citrullinált fehérje antitest vagy anti-citrullinált peptid antitest (ACPA) néven terjedtek el.

Az autoantitestek (a szervezet saját összetevőit felismerő immunglobulin molekulák) meghatározása döntő jelentőségűvé vált az autoimmun betegségek felismerésében, követésében, kezelésében. Az autoantitestek kimutatása az autoimmun betegségek négy posztulátuma között szerepel (azonosított autoantigén, kimutatható autoantitest, állatkísérletes modell, átvihetőség), a humán orvoslás napi gyakorlatában, ebben a betegségcsoportban az autoantitest meghatározás a legtöbbször kért laboratóriumi vizsgálat. Egy jól karakterizált, „könnyen” kimutatható antitest újradefiniálja akár a kórkép határait, a jól ismert jéghegy modellre utalva a vízfelszín felé emeli a fel nem ismert esetek nem egyszer jelentős részét. Gondoljunk például a lisztérzékenységre, melynek prevalenciája (természetesen a felismert) a transzglutamináz elleni ellenanyag szerepének tisztázása után többszörösére növekedett, felszívódási zavarból komplex tüneteket okozó, sokszor nehezen felismerhető „kaméleon” betegséggé változott. Ehhez hasonló jelentőséget kapott a rheumatoid arthritis (RA) laboratóriumi diagnosztikájában az autoantitesteknek az a csoportja, melyeknek közös sa-

Az ACPA története Természetesen a történet kezdetén ebből még semmi nem látszott: csak az igény volt meg, hogy a rheumatoid arthritis-es betegek ne abban a fázisban kerüljenek felismerésre, amikor az ízületi károsodás már jelentős funkcióvesztést okoz, megnehezítve a páciens mindennapjait, és társadalmi szinten is érzékelhető károkat okoz táppénzben, egészségügyi kiadásban és kiesett munkaórában számolva. Ebben az időben laboratóriumi szempontból a fegyvertárat a vörösvértest süllyedés, a CRP és a rheumatoid faktor (RF) alkotta (55). Az első kettő a gyulladás mértékére adott választ, így a betegségre jellemző, igaz korlátozott specificitású teszt csak a RF volt. Az RF az immunglobulin G Fc része ellen termelődött ellenanyag, lehet IgG, IgA és IgM izotípusú is, gyakorlatban mégis az RF-IgM bizonyult leghasznosabbnak, legelterjedtebben ezt határozzák meg. Szenzitivitása 60-80% közé tehető, specificitása azonban csak 80% körüli. Számos más 33


szisztémás autoimmun betegség esetén kimutatható, ez korlátozza legnagyobb mértékben a hasznosságát. Mindezek ellenére az RA 1987-es ACR (American College of Rheumatology) kritériumrendszerében szerepel. A kritériumrendszernek pont az a gyengesége, hogy nem alkalmas korai diagnosztikára, igaz nem is erre, hanem klinikai tanulmányokhoz homogén betegcsoport kialakítására alkották meg. A RF helyett kezdetben ígéretes laboratóriumi markernek tűnt az anti-perinukleáris faktor (APF). Ez a buccalis nyálkahártya sejteken indirekt immunfluoreszcens módszerrel végzett kimutatás azonban technikailag nehéz, értékelése szubjektív. Ezen kívül a szöveti szubsztrát (nyálkahártya kaparék) beszerzése körülményes és nagy egyéni ingadozást mutat: a teszt szenzitivitása jelentősen függ a „donor” személyétől (33). Kissé egyszerűbb a kivitelezése az anti-keratin antitest (AKA) vizsgálatnak, ez ugyan szintén indirekt immunfluoreszcens módszer, a szubsztrát itt bőr, haj vagy nyelőcső, annak hámjában mutatható ki a pozitivitás (56). A történet folytatását nem is maguk a tesztek jelentették, hanem, hogy sikerült megtalálni az antigént, azaz a filaggrint, ezáltal megjelentek a filaggrin elleni ellenanyag meghatározások. Nyilvánvaló volt azonban, hogy a döntően az ízületekben zajló gyulladás esetén nem a bőrben előforduló filaggrin játssza a fő szerepet. Sikerült azonosítani, hogy az epitóp a filaggrin poszttranszlációs módosítása során, arginin deiminációjával keletkező citrullin aminosavmaradékot tartalmaz. Döntő jelentőségű volt, hogy Schellekens és munkatársai be tudtak azonosítani olyan citrullinált filaggrin peptid szakaszokat, melyek felhasználásával magas specificitású ELISA tesztet tudtak létrehozni. A lineáris peptidek ciklikussá tételével még jobban tudták imitálni a valós epitópot (mimotóp), ezzel megszületett az 1. generációs anti-ciklikus citrullinált peptid (anti-CCP) meghatározás. Nagy mennyiségű ciklikus citrullinált peptid szűrésével pedig olyan peptideket tudtak kiválasztani, melyekkel a teszt szenzitivitása is magasabb lett. Az ezen a peptid mixen alapuló vizsgálatot nevezzük 2. generációs anti-CCP-nek (41,42). Már itt fontos kiemelni, hogy a pontos összetételt szabadalom védi, az egyes gyártók által anti-CCP néven árult tesztek nagyon különböző diagnosztikus mutatókkal jellemezhetők. A filaggrin mellett természetesen sok más fehérjéről sikerült kimutatni, hogy citrullinálódik. A citrullináció döntő jelentőségűnek bizonyult az RA kialakulásában. Mai tudásunk szerint az RA-s ízületben leginkább a citrullinált fibrinogénnek és alfa-enoláznak lehet szerepe, de ez a kérdés még nem eldöntött. Mindenesetre a különböző citrullinált fehérjéken (fibrinogén, fibrin, alfa-enoláz, vimentin, vírus kapszid fehérjék) és peptideken alapuló tesztek biztosítják az ACPA és ezzel a rheumatoid arthritis korszerű diagnosztikáját.

A citrullináció A citrullináció az a reakció, amikor a fehérjében előforduló arginint a peptidil-arginin deimináz (PAD) 34


enzim átalakítja citrullinná, azáltal, hogy az arginin aldimin csoportját keto-csoportra cseréli (1. ábra). A PAD enzimnek öt izoformája ismert, melyek közül a PAD 2 és 4 expresszióját mutatták ki RA-s ízületi felszínen és folyadékban. Az intracelluláris enzim működéséhez Ca2+ ionokra van szükség, olyan koncentrációban, ami csak elhaló, apoptotikus sejtben, illetve extracellularisan fordul elő (46).

1. ábra: Az arginin deiminációja citrullinná

A citrullináció természetes poszttranszlációs modifikáció, számos fehérje citrullinációját kimutatták, pl.: keratin, filaggrin, hiszton fehérjék, fibrin, vimentin. Élettani szerepe van az apoptosisban, a keratinizációban, a központi idegrendszer működésében, a génexpresszió szabályozásában. Az elszarusodó bőrben a keratin és a filaggrin is citrullinálódik, elősegítve a bőr barrier funkcióját. A myelinhüvelyben található MBP (myelin bázikus protein) is citrullinált, ami segíti az idegsejtek elszigetelését a környezetüktől és a többi idegsejttől. A hajtüsző fő fehérjéjének, a trichohyalinnak a modifikációja fokozza a rigiditást (13,14,21,50). Az arginin pozitív töltésével szemben a citrullin semleges, ez szerkezeti változást idéz elő a fehérjében, ami a funkcióját is módosíthatja. Kórosan felhalmozott citrullinált fehérjéket találtak Alzheimer és Parkinson betegségben (17). Az MBP kóros citrullinációját mutatták ki sclerosis multiplexben, ami feltehetően a myelinmembrán destabilizációjához vezet (26). Az aminosav csere a fehérje antigenitását is megváltoztatja, RA esetén az így keletkezett neoantigén a kulcsszereplő. Számos citrullinált fehérjét mutattak ki ízületekben és nem kizárólag RA esetén, így ma már azt is tudjuk, hogy ez nem specifikus az RA-ra, inkább más tényezők, pl. a gyulladás következménye. Az ACPA magas specificitását tehát a citrullinált antigén elleni immunológiai válasz fajlagossága biztosítja.

Genetikai tényezők szerepe A genetikai tényezők szerepe régóta ismert az autoimmun betegségekben és a RA esetén is, ide sorolhatjuk akár a női dominanciát is: a betegség 2-3-szor gyakoribb nőkben a férfiakhoz képest. Genetikai tanulmányok eredményei számos gén szerepét felvetették, melyek elsősorban az immunrendszer különböző receptorait, jelátviteli útjait, szabályozó molekuláit kódolják


(PAD4, PTPN22, CTLA4, stb.). Gyakorlati szempontból jelentőségük egyelőre kisebb, a fogékonyság kimutatása inkább a patomechanizmus megértése, mint a napi diagnosztikai haszna miatt fontos. Legnagyobb jelentősége az MHC-II molekulának van, bizonyos HLA-DRB1 allélok kimutathatósága a genetikai determináltság jelentős hányadát adja. Az ún. shared epitope (SE) azt jelenti, hogy az MHC molekula béta lánc harmadik hypervariábilis szekvenciájának bizonyos aminosavai hasonlóak egyes allélok esetén. Ez a szakasz a negyedik peptidkötő zsebet alkotja, és felelős azért, hogy bizonyos antigénekből származó peptideket sokkal hatékonyabban köt, így azok erőteljesebben prezentálódnak az adaptív immunrendszer felé, kiváltva a kóros immunreakciót (15).

Környezeti hatások A genetikai fogékonyság önmagában azonban nem elegendő a betegség kialakulásához, ahhoz olyan triggerek is kellenek, amelyek beindítják a folyamatot. RA esetén a legtöbbet tanulmányozott ilyen hatás a dohányzás. Régóta ismert volt, hogy a dohányzás hajlamosít RA-re, azt azonban csak az ACPA felfedezése után lehetett vizsgálni, hogy a dohányzás és az ACPA termelődés között összefüggés van, sőt a dohányzás fokozza a citrullinációt. A környezeti rizikótényezők különböznek az ACPA pozitív és negatív RA esetén (36).

Patognomonikus vagy patogén az ACPA? Egy autoantitest akkor is lehet kóros, ha a patomechanizmusban nem vesz részt, csak jellemzően megjelenik a betegségben (patognomikus). Az ACPA magas specificitása és szenzitivitása felveti, hogy patogén, azaz a betegség kialakításában is részt vesz. Erre utal, hogy az ACPA pozitivitás rossz prognosztikai jel: jelzi a súlyosabb lefolyású betegséget, az ilyen betegeknél az ízületi károsodás progressziója gyorsabb, annak minden radiológiai és klinikai jeleivel. Szerepét állatkísérletekben direkt módon is igazolták. A kollagén indukált enyhe arthritist a bejutatott monoklonális ACPA súlyosbította, igaz egészséges állatban önmagában nem váltott ki betegséget. Citrullinált peptiddel kiváltott tolerancia esetén pedig enyhébb arthritis alakult ki (22). In vitro modellben igazolták, hogy ACPA tartalmú immunkomplexek tumor necrosis faktor termelésre serkentik a makrofágokat. Az ACPA képes a komplement rendszer aktiválására a klasszikus és az alternatív úton is (11,51). Összességében tehát feltételezhetünk egy olyan „ördögi kört” az RA patogenezisében, melyben a citrullináció és az ACPA jelentős szerepet tölt be. A környezeti trigger (pl. dohányzás, fertőzés) enyhe gyulladást okoz az ízületben, mely apoptosissal, sejtek szétesésével jár. Ennek hatására a PAD enzim aktívvá válik és különböző fehérjéket citrullinál. A genetikailag fogékony egyénben (SE hordozó) ez a neoantigén hatékonyan bemutatásra kerül az adaptív immunrendszer felé és ACPA termelődését indítja be. Így ACPA tartalmú immunkomplexek keletkeznek, amelyek aktiválják a komplement


rendszert és proinflammatiricus citokinek termelődését váltják ki. Ezzel tovább erősödik a gyulladás, a kör bezárul és a betegség progresszívvá, önfenntartóvá válik.

Az ACPA kimutatás laboratóriumi módszerei Ezek alapján természetes, hogy az ACPA meghatározások száma folyamatosan emelkedik világszerte és Magyarországon is. Jogos igénye a klinikusnak, hogy a teszt könnyen elérhető legyen, ma már ACPA meghatározást az ország számos laboratóriuma végez. Nem árt azonban, ha az elérhető módszerekkel is tisztában vagyunk. A legelterjedtebb módszer kezdetben az ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) volt. Több gyártó készített rutin diagnosztikai célra használható gyári kit-et, azonban ezek diagnosztikai mutatói nagyon változóak. A laboratórium döntése és felelőssége, hogy melyiket választja, és ez a döntés nem egyszerű, mivel az egyes reagens készleteket összehasonlító tanulmányok ritkák. Saját kipróbálást nagyon nehéz végezni, mivel ehhez nagy létszámú, klinikailag jól definiált beteg, beteg kontroll és egészséges kontroll csoportok kellenek. A legjobb módszer azonos csoportokon összehasonlítani adott szinten (95%, 98%, 99%) rögzített specificitás mellett a szenzitivitást. Nem azonos specificitás mellett az érzékenység nem vethető össze, nem azonos betegcsoport esetén az érzékenység függ a földrajzi, életkori, nembeli, aktivitásbeli eltérésektől és főként a betegség fennállásának időtartamától. Ismert, hogy a betegség korai szakaszában az ACPA pozitivitás aránya kisebb, mint előrehaladottabb stádiumú páciensek esetén. Nagyon jelentős, hogy ismerjük a felhasznált antigént, amennyiben a gyártó publikálja. A legtöbb teszt ma a 2. generációs CCP peptid mixet használja, de elérhető mutált citrullinált vimentint (MCV), citrullinált vírusfehérjét, citrullinált IgG Fc szakaszt, citrullinált filaggrint vagy más citrullinált peptidet/fehérjét alkalmazó kit is. A meghatározott ACPA döntő többsége IgG izotípusú, bár IgA, IgM sőt IgE osztályú ellenanyag is kimutatható. Az IgA osztályú ellenanyag sok esetben jelen van, de általában az IgG típusúval együtt fordul elő, így a rutin diagnosztikában jelentősége csekély. Az egyre növekvő igényt követve megjelentek ACPA tesztek a különböző zárt rendszerű immunkémiai automaták palettáján is. Ezek előnye, hogy nem kell az ELISA lemez vályulatszámának megfelelő mintát összevárni, rövidebb a mérési idő. Hátrányuk, hogy jelenleg drágábbak a hagyományos ELISA méréshez képest. A módszer elve általában lumineszcens immunassay. Lehetséges beteg közeli módszerekkel is találkozni, LFIA (lateral flow immunoassay) elvű eszközt forgalmaz az Eurodiagnostica (CCPoint) és az Orgentec (RheumaCheck). Az előbbi anti-CCP-t, az utóbbi anti-MCV-t és RF-t mutat ki. Alkalmazásukra elsősorban háziorvosi rendelőkben, illetve a betegek otthonában kerülhet sor, hátrányuk, hogy jelentősen többe kerülnek egy laboratóriumi meghatározásnál, egyszerűségük ellenére kivitelezésük tartalmaz szubjektív elemeket. 35


Diagnosztikai jelentőség Diagnózis Az ACPA meghatározás legfontosabb indikációja a RA diagnózis felállításának támogatása (anti-CCP: szenzitivitás=67%, pozitív valószínűségi arány, LR+=12,5; anti-MCV: szenzitivitás=77%, LR+=7,2). Magas specificitása (anti-CCP: 95%, anti-MCV: 89%) kiváló tesztté teszi, nagy jelentősége van a betegség korai felismerésében és ezáltal a hatékony kezelésében (34,37). A negatív eredmény csökkenti ugyan az RA fennállásának esélyét, de önmagában a betegség kizárására nem alkalmas. A patomechanizmusban betöltött szerepe bizonyította, hogy az ACPA pozitív esetek az RA egy külön csoportjának tekintendők. Mára a szeropozitív RA fogalmat felváltotta az ACPA pozitív RA. RA-s betegcsoportot vizsgálva álnegatív eredményt elsősorban más feltételezett patomechanizmus(ok) miatt kapunk (ACPA negatív RA), mely további kutatásokra sarkall. Korai fázisú betegségben a pozitivitás aránya alacsonyabb, mint későbbi stádiumban. Fals pozitív eredményt egészséges egyének körében 1-3%-ban, más (elsősorban autoimmun és fertőző) betegségben szenvedőknél ennél magasabb százalékban is kaphatunk. Ennek oka lehet, hogy az ACPA (és az RF is) már évekkel a tünetek megjelenése előtt jelentkezhet. Különösen igaz ez más autoimmun betegségben szenvedők esetén, ahol overlap-szindrómára hívhatja fel a figyelmet. Legnagyobb arányban találtak pozitív eredményt arthritis psoriatica, scleroderma és CREST szindróma, SLE, juvenilis idiopathiás arthritis, Sjögren-szindróma és vasculitis esetén (1). ACPA pozitivitást írtak le aktív tuberculosisos betegeknél (akár 37%), előrehaladott HIV fertőzésben és Down-szindróma (52%) fennállásakor is (12,18,49). A valódi álpozitív esetek oka lehet, hogy az antitest nem az antigén citrullinált részéhez kapcsolódik, hanem más területéhez. Ebben az esetben segíthet, ha ugyanannak az antigénnek a nem citrullinált változatával is elvégezzük a meghatározást (ha a gyártó ezt biztosítja). A diagnózis felállításában kivívott szerepét mutatja, hogy 2010-ben az ACR/EULAR új klasszifikációs rendszert alakított ki, mely felváltotta az 1987-es ACR követelményeket. Az új rendszerben klinikai jelek mellett laboratóriumi tesztként szerepel a vörösvértest süllyedés és a CRP (gyulladás követésére), valamint az ACPA és az RF. Az ACPA meghatározás esetén magasabb pontszámot kap a beteg, ha a titer meghaladja a referencia tartomány felső határának háromszorosát, mintha határérték feletti ugyan, de a háromszoros értéket nem éri el.

Prognózis Az ACPA kimutatása jól korrelál a későbbi progresszióval, súlyosabb lefolyású betegséget jelez, mely gyorsabb radiológiai progressziót is mutat (3,27,38,43). A korai, nem differenciált fázisban jelzi a betegség prog36


resszióját RA-ba (53). A szeropozitivitás asszociálódik a perzisztens aktív gyulladással, gyorsult vörösvértest süllyedéssel és betegség aktivitási pontszámmal járó esetekkel is (19,31,45). Egyes extraarticularis tünetekkel is kapcsolatba hozható, pozitív ACPA teszt esetén a klasszikus cardiovascularis rizikófaktoroktól függetlenül nagyobb az esély ischaemiás szívbetegségre, valamint emelkedett a halálozási arány is (24).

Betegségaktivitás, követés Az ACPA mennyisége nem függ össze egyértelműen a betegség aktivitás változásával, a gyulladás mértékével. Követésre alkalmasabbak a különböző klinikai pontrendszerek, illetve a laboratóriumi tesztek közül a vörösvértest süllyedés és a CRP. A szerokonverzió előfordul, kezdetben negatív eredmény később válhat pozitívvá az esetek kis részében, hiszen a hosszabb ideje fennálló betegség esetén a pozitivitási arány nagyobb. Ezzel szemben a pozitív eredmény ritkán válik negatívvá, enyhe csökkenés vagy ingadozás a titerben viszont gyakran megfigyelhető (4,54). A legtöbb autoantitesttel ellentétben az ACPA tehát nem aktivitási marker, mind a státusza, mind a szintje stabilabb, mint a rheumatoid faktoré (29).

Terápia választás és a terápiás válasz előrejelzése A RA kezelésére több terápiás lehetőség áll rendelkezésre, sok tanulmány foglalkozik azzal, hogy előre jelezze egy adott szer hatásosságát, hatástalanságát, és ezáltal hatékonyabb, kevesebb mellékhatással járó terápiát tegyen lehetővé. A terápia megválasztásában a prognosztikai faktorokat figyelembe kell venni, és ezek között szerepel az ACPA és az RF pozitivitás (44). ACPA pozitív esetben a legtöbb klinikus erőteljesebb kezelésre törekszik és hamarabb történik gyógyszerváltás/kiegészítés is a várhatóan rosszabb lefolyás ismeretében. Az anti-CCP2, anti-CCP3, MCV és az RF tesztek közül a második generációs CCP tesztet találták leginkább alkalmasnak arra, hogy előre jelezze a DMARD-mentes remisszióba nem kerülés esélyét (52). Az egyes szerek hatásosságának előrejelzésében az eredmények kevésbé egyértelműek, leginkább az anti-CD20 kezelést írják le következetesen hatékonynak ACPA pozitív esetekben, rituximab kezelésre az ACPA pozitív betegek nagyobb javulást mutatnak, mint a negatív esetek (10,23).

Terápia követése A már megkezdett terápia követésével kapcsolatosan az adatok ellentmondásosak. Több tanulmány arról számolt be, hogy a kezelés hatására az ACPA szint csökkent, egyesek arról is, hogy a csökkenés összefüggést mutatott a terápia hatásosságával. Mások viszont nem vagy csak enyhén csökkenő szinteket írtak le. Az ACPA és RF összehasonlításakor több esetben az utóbbi még jobbnak bizonyult monitorozásra (2,6,8,28).


Előrejelzés tünetmentes egyénekben Az ACPA jóval a betegség klinikai megnyilvánulása előtt megjelenhet. Egészséges véradóknak azt a csoportját vizsgálva, akiknél később RA alakult ki az anti-CCP-t már több mint egy évtizeddel a tünetek előtt ki lehetett mutatni. A preklinikai fázisban az egyének 30-40%-a ACPA pozitív lehet. Az antitest idősebb korban kezdődő betegség esetén korábban jelentkezik, a tünetmentes, de szerológiailag pozitív szakasz hosszabb (25,32).

Szűrés magas rizikójú csoportokban Az ACPA magas diagnosztikai hatékonysága és prediktív ereje akár azt is lehetővé tenné, hogy magas rizikójú csoportokban tünetek hiányában, szűrő jelleggel végezzük el. Olyan ACPA pozitív egyéneknél, akiknek családjában legalább két elsőfokú rokon szenvedett RAban, a RA 5 éven belüli megjelenésének valószínűsége kb. 70%, szemben az átlagos ACPA pozitív személyek kb. 5%-os értékével (32). Természetesen ilyen szűrésnek csak akkor van létjogosultsága, ha hatásos megelőző kezelés már létezik, vagy a beteg az időben való felismerésből más módon profitál. Jelenleg több olyan prospektív tanulmány van folyamatban, amelyekben egészségeseket szűrnek és vizsgálják a RA kialakulását (pl. Vienna preRA Initiative).


reagenskészlettel történt a mérés. Az anti-CCP tesztek többsége második generációs, de még ezen belül is jelentősen különbözhetnek az eredmények. A kvalitatív értékelés általában jobban összevethető, a különbözőségeket kiegyenlíti a kit-re specifikus referenciatartomány. A mennyiségi értékelés azonban nagyon eltérő lehet, ugyanis minden gyártó saját kalibrátort használ, aminek az értékét önkényes egységekben (arbitrary unit) adja meg. Az ACR/EULAR klasszifikációs rendszerben is különbözik az alacsony és magas pozitivitás megítélése. Eltérő antigént használó két teszt tekintetében (pl.: anti-CCP2 vs. anti-MCV) a kvantitatív eredmények szinte összevethetetlenek. A megoldást nemzetközi referencia kalibrátor bevezetése hozhatja meg, mely folyamatban van, a publikált eredmények a variációs koefficiensek szignifikáns csökkenését mutatják (5). A preparátum jelenleg már elérhető, a gyártók feladata, hogy minél hamarabb erre visszavezethetően adják meg a standardjaik értékét. Addig is a referenciatartomány felső határához viszonyítva lehet valamelyest összevetni az eredményeket. Egy beteget pedig azonos laboratóriumba érdemes küldeni, ha több időpontban szükséges ACPA tesztet végeztetnünk.

Magyarországi sajátosságok

Felvetődött, hogy az ACPA olyan helyzetben felváltsa a RF kimutatást, amikor azt a RA kizárására használjuk más, ízületi érintettséggel járó betegségekben. Ilyen például az arthritis psoriatica, aminek kritériumrendszerében szerepel a negatív RF (39). Egyelőre azonban nem igazolódott, hogy az ACPA ekkor megfelelőbb lenne, psoriasisos betegek között az RF és ACPA pozitivitás arányát hasonlónak találták (7,20).

Az OENO törzs a 2655Q kódon „Filaggrin elleni autoantitest meghatározása, immunoassay-vel” néven tartalmazza azt a vizsgálatot, melyen a laboratóriumok jelentik az ACPA meghatározásokat. A szabálykönyv megjelenése óta eltelt több mint tíz év alatt két változás történt összesen. 2004. februártól 1, azaz egy ponttal növelték a pontértéket, 2006. március 1-től pedig szűkült a rendelhetősége: „A járóbeteg-szakellátás és a fekvőbeteg-gyógyintézet szakorvosa járóbetegszakellátási tevékenységi körében rendelheti”. Az ACPA meghatározásokat végző, általában immunológiai laboratóriumok/részlegek helyzetét nem javítja, hogy a vizsgálat pontértéke jelenleg 939. Ez ELISA meghatározás esetén azt jelenti, hogy az átlagos 0,7 Ft/pont értékkel számolva, 50%-os reagens költséghányadot feltételezve az egy reagenskészlettel elvégezhető vizsgálatokért összesen kb. 30.000 Ft-ot fizet az egészségpénztár. Ennyiért nem lehet ELISA kitet vásárolni Magyarországon, az ACPA vizsgálat – sok másikkal együtt – a beteg és a kezelőorvos számára is egyértelműen hasznos, csak az elvégző laboratóriumnak nem éri meg… Sajnos az idei év elején hatályba lépett OENO revízió sem változtatta meg a mára már teljesen elavult elnevezést, pedig a nemzetközi karrierje alapján igazán megérdemelné a „Citrullinált peptid/fehérje elleni autoantitest meghatározása” névváltoztatást, melyet több immunológiai laboratórium támogatott és benyújtott.

Standardizálás

Irodalomjegyzék

A sokféle elérhető ACPA teszt azzal a hátránnyal jár, hogy a klinikus nem tudja pontosan, hogy melyik

1. Aggarwal R., Liao K., Nair R. et al.: Anti-citrullinated peptide antibody assays and their role in the diag-

Jelentősége nem rheumatoid arthritis esetén Még nem RA-es betegek körében is lehet jelentősége az ACPA kimutatásnak: SLE, scleroderma, Jo-1 pozitív myositis fennállásakor a pozitívoknál magasabb arányban találtak erozív ízületi gyulladást (9,16,30,47,57). ACPA pozitív primer Sjögren-szindróma mellett RA kialakulása valószínűbb, mint negatív eredmény esetén (40). Juvenilis idiopathiás arthritis-es gyermekeknél nagyobb arányban találhatók ACPA pozitívak a polyarticularis, mint a többi formában. Ezen túl az anti-CCP korrelációt mutatott a Sharp pontszámmal és a CRP szinttel is (35), valamint ACPA pozitívak között a betegség alacsonyabb életkorban indult (48).

Más betegség diagnózisának kizárása

37


2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

38

nosis of rheumatoid arthritis.. Arthr. Rheum., 15, 61(11), 1472-1483, 2009 Alessandri C., Priori R., Modesti M. et al.: The role of anti-cyclic citrullinate antibodies testing in rheumatoid arthritis. Clin. Rev. Allergy Immunol., 34(1), 45-49, 2008 Alexiou I., Germenis A., Ziogas A. et al.: Diagnostic value of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies in Greek patients with rheumatoid arthritis. BMC Musculoskelet. Disord., 20, 8, 37, 2007 Barra L., Pope J., Bessette L. et al.: Lack of seroconversion of rheumatoid factor and anti-cyclic citrullinated peptide in patients with early inflammatory arthritis: a systematic literature review. Rheumatology (Oxford), 50(2), 311-316, 2011 Bizzaro N., Pregnolato F., van Boekel M.A. et al.: Preliminary evaluation of the first international reference preparation for anticitrullinated peptide antibodies. Ann. Rheum. Dis., 71(8), 1388-1392, 2012 Bobbio-Pallavicini F., Alpini C., Caporali R. et al.: Autoantibody profile in rheumatoid arthritis during long-term infliximab treatment. Arthr. Res. Ther., 6(3), R264-272, 2004 Bogliolo L., Alpini C., Caporali R. et al.: Antibodies to cyclic citrullinated peptides in psoriatic arthritis. J. Rheumatol., 32(3), 511-515, 2005 Caramaschi P., Biasi D., Tonolli E. et al.: Antibodies against cyclic citrullinated peptides in patients affected by rheumatoid arthritis before and after infliximab treatment. Rheumatol. Int., 26(1), 58-62, 2005 Cavagna L., Fusetti C., Montecucco C. et al.: Anticyclic citrullinated peptide antibodies as markers of erosive arthritis in antisynthetase syndrome. J. Rheumatol., 37(9), 1967, 2010 Chatzidionysiou K., Lie E., Nasonov E. et al.: Highest clinical effectiveness of rituximab in autoantibody-positive patients with rheumatoid arthritis and in those for whom no more than one previous TNF antagonist has failed: pooled data from 10 European registries. Ann. Rheum. Dis., 70(9), 1575-1580, 2011 Clavel C., Nogueira L., Laurent L. et al.: Induction of macrophage secretion of tumor necrosis factor alpha through Fcgamma receptor IIa engagement by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies to citrullinated proteins complexed with fibrinogen. Arthr. Rheum., 58(3), 678-688, 2008 du Toit R., Whitelaw D., Taljaard J.J. et al.: Lack of specificity of anticyclic citrullinated peptide antibodies in advanced human immunodeficiency virus infection. J. Rheumatol., 38(6), 1055-1060, 2011 Gyorgy B., Toth E., Tarcsa E. et al.: Citrullination: a posttranslational modification in health and disease. Biol., 38, 1662-1677, 2006 Harauz G., Musse A.A.: A tale of two citrullines–structural and functional aspects of myelin basic protein deimination in health and disease. Neurochem. Res., 32, 137-158, 2007 Hill J.A., Southwood S., Sette A. et al.: Cutting edge: the conversion of arginine to citrulline allows for a


16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25.

26.

27.

28.

high-affinity peptide interaction with the rheumatoid arthritis-associated HLA-DRB1*0401 MHC class II molecule. J. Immunol., 15, 171(2), 538-541, 2003 Ingegnoli F., Galbiati V., Zeni S. et al.: Use of antibodies recognizing cyclic citrullinated peptide in the differential diagnosis of joint involvement in systemic sclerosis. Clin. Rheumatol., 26(4), 510-514, 2007 Ishigami A., Maruyama N.: Importance of research on peptidylarginine deiminase and citrullinated proteins in age-related disease. Geriatr. Gerontol. Int., 10 Suppl 1, S53-58, 2010 Kakumanu P., Yamagata H., Sobel E.S. et al.: Patients with pulmonary tuberculosis are frequently positive for anti-cyclic citrullinated peptide antibodies, but their sera also react with unmodified arginine-containing peptide. Arthr. Rheum., 58(6), 1576-1581, 2008 Kastbom A., Strandberg G., Lindroos A. et al.: Anti-CCP antibody test predicts the disease course during 3 years in early rheumatoid arthritis (the Swedish TIRA project). Ann. Rheum. Dis., 63(9), 1085-1089, 2004 Korendowych E., Owen P., Ravindran J. et al.: The clinical and genetic associations of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies in psoriatic arthritis. Rheumatology (Oxford), 44(8), 1056-1060, 2005 Kizawa K., Takahara H., Troxler H. et al.: Specific citrullination causes assembly of a globular S100A3 homotetramer: a putative Ca2+ modulator matures human hair cuticle. J. Biol. Chem., 283, 5004-5013, 2008 Kuhn K.A., Kulik L., Tomooka B. et al.: Antibodies against citrullinated proteins enhance tissue injury in experimental autoimmune arthritis. J. Clin. Invest., 116(4), 961-973, 2006 Lal P., Su Z., Holweg C.T. et al.: Inflammation and autoantibody markers identify rheumatoid arthritis patients with enhanced clinical benefit following rituximab treatment. Arthr. Rheum., 63(12), 36813691, 2011 López-Longo F.J., Sánchez-Ramón S., Carreño L.: The value of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies in rheumatoid arthritis: do they imply new risk factors? Drug News Perspect, 22(9), 543-548, 2009 Majka D.S., Deane K.D., Parrish L.A. et al.: Duration of preclinical rheumatoid arthritis-related autoantibody positivity increases in subjects with older age at time of disease diagnosis. Ann. Rheum. Dis., 67(6), 801-807, 2008 Mastronardi F.G., Wood D.D., Mei J. et al.: Increased citrullination of histone H3 in multiple sclerosis brain and animal models of demyelination: a role for tumor necrosis factor-induced peptidylarginine deiminase 4 translocation. J. Neurosci., 1, 26(44), 11387-11396, 2006 Meyer O., Labarre C., Dougados M. et al.: Anticitrullinated protein/peptide antibody assays in early rheumatoid arthritis for predicting five year radiographic damage. Ann. Rheum. Dis., 62(2), 120-126, 2003 Mikuls T.R., O’Dell J.R., Stoner J.A. et al.: Association of rheumatoid arthritis treatment response and di-


29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36.

37.

38.

39.

40.

41.

sease duration with declines in serum levels of IgM rheumatoid factor and anti-cyclic citrullinated peptide antibody. Arthr. Rheum., 50(12), 3776-3782, 2004 Mjaavatten M.D., van der Heijde D.M., Uhlig T. et al.: Should anti-citrullinated protein antibody and rheumatoid factor status be reassessed during the first year of followup in recent-onset arthritis? A longitudinal study. J. Rheumatol., 38(11), 2336-2341, 2011 Nagashima T., Sato H., Minota S.: Destructive arthropathy associated with dermatomyositis sine myositis positive for anti-Jo-1 and anti-cyclic citrullinated peptide antibodies. J. Rheumatol., 36(9), 2133-2134, 2009 Nell V.P., Machold K.P., Stamm T.A. et al.: Autoantibody profiling as early diagnostic and prognostic tool for rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis., 64(12), 1731-1736, 2005 Nielen M.M., van Schaardenburg D., Reesink H.W. et al.: Specific autoantibodies precede the symptoms of rheumatoid arthritis: a study of serial measurements in blood donors. Arthr. Rheum., 50(2), 380-386, 2004 Nienhuis R.L.F., Mandema E., Smids C.: New Serum Factor in Patients with Rheumatoid Arthritis: The Antiperinuclear Factor. Ann. Rheum. Dis., 23(4), 302-305, 1964 Nishimura K., Sugiyama D., Kogata Y. et al.: Meta-analysis: diagnostic accuracy of anti-cyclic citrullinated peptide antibody and rheumatoid factor for rheumatoid arthritis. Ann. Intern. Med., 5, 146(11), 797-808, 2007 Omar A., Abo-Elyoun I., Hussein H. et al.: Anti-cyclic citrullinated peptide (anti-CCP) antibody in juvenile idiopathic arthritis (JIA): correlations with disease activity and severity of joint damage (a multicenter trial). Joint Bone Spine, 80(1), 38-43, 2013 Pedersen M., Jacobsen S., Klarlund M. et al.: Environmental risk factors differ between rheumatoid arthritis with and without auto-antibodies against cyclic citrullinated peptides. Arthr. Res. Ther., 8(4), R133, 2006 Qin X., Deng Y., Xu J. et al.: Meta-analysis: diagnostic value of serum anti-mutated citrullinated vimentin antibodies in patients with rheumatoid arthritis. Rheumatol. Int., 31(6), 785-794, 2011 Quinn M.A., Gough A.K., Green M.J. et al.: Anti-CCP antibodies measured at disease onset help identify seronegative rheumatoid arthritis and predict radiological and functional outcome. Rheumatology (Oxford), 45(4), 478-480, 2006 Rudwaleit M., Taylor W.J.: Classification criteria for psoriatic arthritis and ankylosing spondylitis/axial spondyloarthritis. Best Pract. Res. Clin. Rheumatol., 24(5), 589-604, 2010 Ryu Y.S., Park S.H., Lee J. et al.: Follow-up of primary Sjogren’s syndrome patients presenting positive anti-cyclic citrullinated peptides antibody. Rheumatol. Int., 33(6), 1443-1446, 2013 Schellekens G.A., de Jong B.A., van den Hoogen F.H. et al.: Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthri-


42.

43.

44.

45. 46.

47.

48.

49.

50.

51.

52.

53.

54.

55.

tis-specific autoantibodies. J. Clin. Invest., 1, 101(1), 273-281, 1998 Schellekens G.A., Visser H., de Jong B.A. et al.:The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide. Arthr. Rheum., 43(1), 155-163, 2000 Shankar S., Grover R., Handa R.: Role of anti cyclic citrullinated peptide antibodies in erosive disease in patients with rheumatoid arthritis. Ind. J. Med. Res., 124(6), 689-696, 2006 Singh J.A.: 2012 update of the 2008 American College of Rheumatology recommendations for the use of disease-modifying antirheumatic drugs and biologic agents in the treatment of rheumatoid arthritis. Arthr. Care Res., (Hoboken), 64(5), 625-639, 2012 Skogh T.: Does a positive anti-CCP test identify a distinct arthritis entity? Arthr. Res. Ther., 7(6), 230-232, 2005 Suzuki A., Yamada R., Yamamoto K.: Citrullination by peptidylarginine deiminase in rheumatoid arthritis. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1108, 323-339, 2007 Taraborelli M., Inverardi F., Fredi M. et al.: Anti-cyclic citrullinated peptide antibodies in systemic lupus erythematosus patients with articular involvement: a predictive marker for erosive disease? Reumatismo, 11, 64(5), 321-325, 2012 Tebo A.E., Jaskowski T., Davis K.W. et al.: Profiling anti-cyclic citrullinated peptide antibodies in patients with juvenile idiopathic arthritis. Pediatr. Rheumatol. Online J., 29, 10(1), 29, 2012 Nisihara R.M., Skare T.L., Silva M.B. et al.: High positivity of anti-CCP antibodies in patients with Down syndrome. Clin. Rheumatol., 26(12), 2031-2035, 2007 Tarcsa E., Marekov L.N., Mei G. et al.: Protein unfolding by peptidylarginine deiminase. Substrate specificity and structural relationships of the natural substrates trichohyalin and filaggrin. J. Biol. Chem., 271, 30709–30716, 1996 Trouw L.A., Haisma E.M., Levarht E.W. et al.: Anti-cyclic citrullinated peptide antibodies from rheumatoid arthritis patients activate complement via both the classical and alternative pathways. Arthr. Rheum., 60(7), 1923-1931, 2009 van der Linden M.P., van der Woude D., Ioan-Facsinay A. et al.: Value of anti-modified citrullinated vimentin and third-generation anti-cyclic citrullinated peptide compared with second-generation anti-cyclic citrullinated peptide and rheumatoid factor in predicting disease outcome in undifferentiated arthritis and rh. Arthr. Rheum., 60(8), 2232-2241, 2009 van Gaalen F.A., Linn-Rasker S.P., van Venrooij W.J. et al.: Autoantibodies to cyclic citrullinated peptides predict progression to rheumatoid arthritis in patients with undifferentiated arthritis: a prospective cohort study. Arthr. Rheum., 50(3), 709-715, 2004 van Venrooij W.J., van Beers J.J., Pruijn G.J.: Anti-CCP antibodies: the past, the present and the future. Nat. Rev. Rheumatol., 7, 7(7), 391-398, 2011 Waaler E.: On the Occurrence of a Factor in Human Serum Activating the Specific Agglutination of She39



ep Blood Corpuscles. Acta Pathol. Microbiol. Scand., 17 (2), 172, 2009 56. Young B.J., Mallya R.K., Leslie R.D. et al.: Anti-keratin antibodies in rheumatoid arthritis. Br. Med. J., 14, 2(6182), 97-99, 1979

57. Zhao Y., Li J., Li X.X. et al.: What can we learn from the presence of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies in systemic lupus erythematosus? Joint Bone Spine, 76(5), 501-507, 2009

Anti-CCP a rheumatoid arthritis diagnózisának szerológiai markere. Anti-CCP ELISA - magas specificitás - magas szenzitivitás - prognosztikus marker korai RA detektáláshoz Anti-CCP point of care - az első ágy melletti RA diagnosztika - ELISA szintű specificitás és szenzitivitás 40

Dr. Karabélyos Csaba

Recommend Documents