Univerzita Pardubice Fakulta chemicko-technologická
Analýza vlivu rizikových faktorů na profilu mastných kyselin membrán erytrocytů při zánětlivé reakci po implantaci koronárního stentu u nemocných s ischemickou chorobou srdeční Mgr. Jiří Handl
ICHS a stenty • onemocnění srdečního svalu •
nedostatečná dodávka okysličené krve při onemocnění věnčitých tepen
• hlavní příčina ICHS = ateroskleróza • léčba - perkutánní koronární intervencí • •
balónková angioplastika implantace koronárních stentů – biologicky přijatelná výztuž holé kovové stenty stenty uvolňující léky biodegradabilní stenty 2
Zánět a mastné kyseliny •
zánětlivá reakce po implantaci stentu • zvýšení rizika komplikací – restenózy • intenzita zánětlivé reakce – dynamika hladin zánětlivých markerů C-reaktivní protein interleukin-6 sérový amyloid A
•
mastné kyseliny – energetický substrát • pozitivní i negativní vliv v organismu • •
•
zvyšování kardiovaskulárního rizika – trans mastné kyseliny snižování kardiovaskulárního rizika, zánětu – N-3 PUFA
účast v zánětlivé reakci - kyselina arachidonová (eikosanoidy - mediátory zánětu)
3
Výběr pacientů •
spolupráce s Kardiologickým oddělením Nemocnice Pardubického kraje pacienti s významným zúžením koronárních tepen, kterým byla provedena perkutánní koronární intervence s následnou implantací koronárního stentu
• •
47 pacientů (34 mužů, 13 žen) bez nevyhovujících (např.: vysoké CRP před implantací) tři vzorky žilní krve (EDTA) – před, 24 a 48 hodin po implantaci stentu
medián body mass indexu 28,56 kg/m2 30 % pacientů - diabetes mellitus 67,5 % pacientů - hypertenze 22,5 % pacientů - kuřáci 4
Stanovení MK •
Plazma • tenkovrstvá chromatografie s následnou analýzou jednotlivých lipidových frakcí pomocí GC-FID •
frakce fosfolipidů, diacylglycerolů, volných mastných kyselin, triacylglycerolů a esterů cholesterolu
•
deproteinace (2-propanol, n-heptan, H3PO4) extrakce (methanol-toluen 1:4) tenkovrstvá chromatografie (hexan, diethylether, kys. octová) derivatizace na těkavější methylestery (acetylchlorid)
Membrány erytrocytů separace membrán erytrocytů deproteinace; extrakce; derivatizace 5
Měřené parametry •
Markery zánětu - před, 24 a 48 hodin po implantaci stentu • • •
•
Parametry lipidového metabolismu • • •
•
C-reaktivní protein interleukin-6 sérový amyloid A
triacylglyceroly LDL cholesterol HDL cholesterol
Marker oxidačního stresu •
malondialdehyd – produkt lipoperoxidace 6
Kanonická korelační analýza • •
zkoumá závislost mezi dvěma skupinami proměnných či znaků kvantifikuje sílu vztahu = korelace R mezi dvěma skupinami •
hledá: • lineární kombinaci výběrů mastných kyselin, které nejlépe korelují s lineární kombinací zadaných markerů • vyjadřuje sílu závislosti znaku skupiny vůči skupině protilehlých znaků • první skupina – pět vybraných markerů • druhá skupina – výběr mastných kyselin (bylo vytipováno několik skupin MK) 7
Kanonická korelační analýza
Nejlepší pár kanonických korelačních proměnných U1 a V1 popisuje závislost šesti znaků, vybraných N-3 PUFA, proti pěti markerům Δ CRP 24, Δ MDA 24, HDL chol., LDL chol. a TAG. Velikost parametru a a b udává sílu závislosti dotyčného znaku na celé skupině protilehlých znaků. 8
Kanonická korelační analýza
Nejlepší pár kanonických korelačních proměnných U1 a V1 popisuje závislost šesti znaků, vybraných MK dle nejzápornějších hodnot a, proti pěti markerům Δ CRP 24, Δ MDA 24, HDL chol., LDL chol. a TAG. Velikost parametru a a b udává sílu závislosti dotyčného znaku na celé skupině protilehlých znaků. 9
Vícenásobná lineární regrese •
• •
analyzuje vztah mezi skupinou nezávisle proměnných a jedinou závisle proměnnou technika regresního tripletu – kritika dat, kritika modelu a kritika užité matematické metody vliv koncentrace 37 vyšetřovaných MK na čtyři vybrané biologické markery
•
navýšení C-reaktivního proteinu po 24 hodinách navýšení interleukinu-6 po 24 hodinách navýšení sérového amyloidu A po 24 hodinách navýšení malondialdehydu po 24 hodinách
kvantitativně nalezla míru vlivu mastné kyseliny na zvyšování či snižování plazmatických koncentrací vybraných markerů 10
Vícenásobná lineární regrese y Δ CRP 24 = β0 + β1 x1 + β2 x2… + β37 x37 Regresní model závislosti Δ CRP 24 na koncentraci 37 MK pro 40 pacientů. Nejvýznamnější mastné kyseliny se záporným a kladným odhadem β Kritéria: R = 0,9999; R2 = 0,9999; MEP = 0,013; AIC = -531,44; RSC = 6,71E-06; s(e) = 0,003
11
Exploratorní analýza dat • •
předcházela lineární regresi a kanonické korelační analýze vyšetřila předpoklady kladené na zdrojovou matici dat: • • • •
Krabicový graf – ukazuje koncentrační proměnlivost mastných kyselin v plazmě pacientů Ikonový graf – interpretuje proměnlivost 37 MK u vyšetřovaných pacientů Korelační matice – ukazuje vzájemné skryté vnitřní vztahy mezi mastnými kyselinami Analýza hlavních komponent, faktorová analýza, analýza shluků: A) vyšetřují vzájemné vnitřní vztahy mezi MK (koncentrační proměnlivost, přírodní zdroj, lokalizace odbourávání v buňce) B) rozčlení soubor pacientů do shluků podobných vlastností (příbuznost přidružených onemocnění – hypertenze, psoriáza, dyslipidémie, diabetes mellitus) 12
Exploratorní analýza dat Ikonový graf hvězdiček pacientů. Paprsky představují jednotlivé mastné kyseliny, ve zdrojové matici. P1 až P48 jsou pacienti.
13
Exploratorní analýza dat Krabicový graf vyšetří proměnlivosti 37 mastných kyselin ve frakci fosfolipidů v plazmě [µmol/l].
14
Faktorová analýza a analýza shluků Graf faktorových vah pro faktor 1 a faktor 2 Dendrogram shluků podobných MK 15
Faktorová analýza a analýza shluků Graf faktorového skóre pro faktor 1 a faktor 2 Dendrogram shluků podobných pacientů 16
Shrnutí závěrů 1) kanonická korelační analýza nalezla vztah vybraných skupin MK v membránách ERY vůči souboru pěti markerů (CRP 24 hod., MDA 24 hod., TAG, HDL chol. LDL chol.) negativní korelaci s vybranými markery vykazuje zejména kyselina α-linolenová, eikosapentaenová a dále kyseliny pentadekanová, dokosatetraenová, behenová, sapienová, 12-methyltridekanová pozitivní korelaci s vybranými markery vykazuje kyselina arachidonová, lignocerová, stearidonová, 14-methylhexadekanová, palmitová a trans vakcenová 17
Shrnutí závěrů 2) v nejsilnějším vztahu ke všem zvoleným skupinám MK byl marker zánětlivé reakce C-reaktivní protein ostatní markery byly v desetkrát slabším vztahu k jednotlivým skupinám MK
3) vícenásobná lineární regrese odhalila, že: nejsilněji podporuje plazmatický nárůst CRP (24 hod.) kyselina cerotová, v negativním vztahu vůči CRP je zejména kyselina eikosatetraenová, nárůst malondialdehydu (24 hod.) byl spojen s vyššími koncentracemi kyseliny cerotové a 12-methyltridekanové, naopak negativní vztah vůči nárůstu MDA měly kyseliny tetrakosatetraenová a nonadekanová 18
Shrnutí závěrů 4) vícenásobná lineární regrese odhalila: pozitivní vztah na zvyšování hladiny sérového amyloidu A (24 hod.) kyselinou trans vakcenovou a naopak snižování hladiny kyselinou 12-methyltetradekanovou pozitivní vztah na nárůst interleukinu-6 (24 hod.) kyselinou pentadekanovou a naopak snižování hladiny kyselinou α-linolenovou 5) exploratorní analýzou koncentrací MK v plazmatické frakci fosfolipidů a v membránách ERY byly prokázány silné skryté vnitřní vztahy mezi mastnými kyselinami 19
Shrnutí závěrů 6) krabicový graf ukázal na mastné kyseliny s největší proměnlivostí koncentrací ve frakci fosfolipidů plazmy a také nejvyšší proměnlivostí procentuálního zastoupení v membránách ERY: mastné kyseliny linolová, palmitová, olejová, stearová, arachidonová, dihomo γ-linolenová, dokosahexaenová, nervonová a eikosapentaenová 7) PCA, FA a analýza shluků rozčlenily MK dle podobných vlastností (koncentrační proměnlivost, přírodní zdroj, lokalizace odbourávání v buňce) do shluků s podobnou charakteristikou byli tříděni také pacienti (přidružená onemocnění – hypertenze, psoriáza, dyslipidémie, diabetes mellitus) 20
Děkuji za pozornost
Zdroje Garg S, Serruys PW: Coronary stents: Looking forward. Journal of the American College of Cardiology (2010) 56 (10 Suppl): S43-78. Rinfret S, Baron SJ, Cohen DJ: Percutaneous coronary intervention. Journal of the American College of Cardiology (2015) 65(23):2508-2510. Mikolášková M, Sepši M, Špinar J: Náhlá srdeční smrt. Kardiologická revue - Interní medicína (2015) 17(2):106-111. Trojan, S. a kol.: Atlas biologie člověka; Obrázek - Erytrocyty, Scientia, 2002 IFAUNA [online]. [cit. 2016-05 30]. Obrázek - Zkumavka - odběr krve. Dostupné z: http://www.ifauna.cz/kone/clanky/r/detail/ 5002/jak-funguje-kun-cast-25-co-umi-krev/
