BIM SB 2008
FOGALMAK:
STERILEZÉS STERILITÁS
--
STERILITY
ASZEPTIKUSSÁG -- ASEPTICITY ELSZIGETELÉS, IZOLÁLÁS -- CONTAINMENT Mikrobák elpusztítása Mikrobák távoltartása a környezettől
Mikrobák távoltartása a rendszertől aszeptikus működés=steril működés
GMO
I.: kis rizikó
Patogének vakcinatermelés Vírusok GMO-k rDNS termeléssel kapcsolatos problémák OECD 1986 – Recombinant DNA Safety Considerations EC 1990 Council Directive on the Contained use of GMOs
II.: a többi
BIM SB 2008
FERTŐZÉS
Extra munka, pénz
STERILEZÉS HOZAM CSÖKKENÉS FOLYAMAT VISELKEDÉS (KINETIKA) VÁLTOZÁS PLUSZ STERILEZÉSI IGÉNY TELJES SARZS TÖNKREMEHET (LÉPTÉKFÜGGŐ KÁR) PROBLÉMA A DOWN-STREAM-NÉL
1
I. A fertőtlenítő hatás fokozatai: Csíraszámcsökkentő hatás (szanációs effektus) Baktériumszaporodást gátló hatás (bakteriosztatikus hatás) Baktériumölő hatás (baktericid effektus) Spóraölő hatás (sporocid effektus) Vírusinaktiváló hatás (virucid effektus) Gombaelemeket pusztító hatás (fungicid effektus) Parazitákat pusztító hatás (paraziticid effektus) II. A fertőtlenítő eljárás csoportosítása: Kémiai Fizikai Kombinált fertőtlenítő eljárások
STERILEZÉS Csíramentesítés, pusztítás ill növ. gátlás módszerei : Fizikai mechanikai módszerek: szűrés, elektromágneses besugárzás: UV, röntgen , gammasugár hőhatás. Kémiai módszerek: dezinficiálás
Mikrobák hőpusztulásának törvényszerűségei
2
BIM SB 2008
STERILEZÉS MIKROORGANIZMUSOK szaporodási hőfok tartományai
µ
BIM SB 2008
STERILEZÉS - a hőérzékenység függ a mikroba fajtájától - vegetatív sejtek sokkal érzékenyebbek a hőhatásra, mint a “kondenzált létformájú"(csökkent szabad víztartalmú) baktériumspórák 1
Vegetatív baktérium és élesztõsejtek
Fonalas gomba konidiospórák
Baktérium spórák
Vírusok-bakteriofágok
2-10
∼10-6
1-5
3
BIM SB 2008
STERILEZÉS
-a hőérzékenység még adott spéciesz esetén is több tényezőtől függ: a sejt előéletétől, korától (így az exponenciális növekedési fázis sejtjei érzékenyebbek a stacionárius fázis sejtjeinél) -valamennyi sejt szenzitívebb nedves hővel szemben, mint száraz hővel szemben -a hőérzékenység (a hőpusztulás) nő a hőmérséklet emelkedésével,
-a hőérzékénység függ a mikrobasejtet hordozó közegtől tápoldat pH-jától, viszkozitásától, ozmózis nyomásától, védőanyagok jelénlététől, edény falától
BIM SB 2008
STERILEZÉS HŐPUSZTULÁS KINETIKÁJA ÁLLANDÓ HŐMÉRSÉKLETEN
dN = − kN dt N élő csíraszám [db/cm3] k hõpusztulási sebességi állandó [min-1].
ln
N = −kt N 0
N dN N t ⎧ ∫ N = ∫ dlnN = − ∫ kdt → ⎨ ⎩ N N 0 0 0 N = N e−kt 0
4
BIM SB 2008
STERILEZÉS
N/No
N
1
No
MÓDSZER k meghatározására
10-1
tgα=k 10-2
α
10-3
t
BIM SB 2008
t
STERILEZÉS
MITŐL FÜGG k? Mikroba ....fajta és „forma” Közeg
hőmérséklet Arrhenius-egyenlet
ln k
E − a k = A.e RT E 1 lnk = lnA − a R T A empirikus állandó; (G.st.:9,5*1037 min-1) Ea- hőpusztulás látszólagos aktiválási energiája [KJ/mol] (G.st.: 70 kcal/mol)
ln A
tg α=-E a /R
T-1(oK-1) Módszer a meghatározásra
5
BIM SB 2008
STERILEZÉS
Mikroba Bacillus subtilis (vegetatív) Bacillus subtilis (spórák) Bacillus stearothermophilus (spórák)
T[oC ]
k[min-1]
110
27
310
3
-
121,1
Clostridium botulinum (spórák) Hemoglobin (hõdenaturáció)
Ea [KJ/mol]
104 125 130
0,051 6,06 17,52
283 283 283
104
0,42
344
68
6,3·10 -3
312
Tápoldat komponensek hõbomlásának látszólagos aktiválási energiája [kJ/mol] Szénhidrátok és fehérjék közötti reakció B1 vitamin bomlása B2 vitamin bomlása
BIM SB 2008
1 =t k
130,6 87,9 98,8
STERILEZÉS
Átlagos élettartam
2,3 = D k
Tizedelési idő= decimal reduction time lg
N0 N
1000 100 10 1
k (T +10 o C ) = Q10 .k T
D
t
6
BIM SB 2008
STERILEZÉS
A hőpusztulás valószínűségi értelmezése Kinetikai leírás ha No>>1 JÓ! Ha nem, egyre rosszabb!!! EZ IS sztohasztikus folyamat, Definíció: egy csíra élettartama alatt azt az adott hőfokon értelmezett időtartamot értjük, amely alatt a csíra még életben marad. populáció átlagélettartama N0 élő csírák kezdeti száma Ni a ti élettartamú csírák száma
− 1 ∞ t= ∑Nt N0 i =1 i i
1 =k t
Átlagos hőpusztulási sebességi állandó
BIM SB 2008
Life span
STERILEZÉS
Ha a hőmérséklet mindenütt azonos, növekedés nincs, az egyes csírák sorsa független a többi csíráétól. annak valsége, hogy adott t időpontban a túlélők száma éppen N (ahol N= 0,1,2,...No), binomális eloszlást követ:
Pn ( t ) =
⎛ N0⎞ ⎜ ⎟ ⎝ N⎠
[ p(t)]N [1 − p(t)]( N − N) 0
p( t ) = e − kt az adott t idõpontban még túlélő annak a valsége, hogy egy csíra
PN ( t ) =
( )(
N 0! e − kt ( N 0 − N )!N!
N
1 − e − kt
)
( N0 − N)
7
BIM SB 2008
PN ( t ) =
STERILEZÉS
( ) (1 − e )
N 0! e − kt ( N 0 − N )!N!
N
− kt
( N0 − N )
Mi annak a valsége, hogy valamennyi mikrobasejt elpusztult egy t idõpontban?
(
P0 ( t ) = 1 − e − kt
)
N0
<1
Mindíg 0-nál nagyobb annak a valószínűsége, hogy legalább egy túlélő csíra marad:
(
1 - P0 ( t ) = 1 − 1 − e − kt Sterilezésnél N0 >>1
1 − P0 (t ) ≅ 1 − e
−N
)
N0
= 1 − e − N 0e
amelyben N = N 0 e − kt .
BIM SB 2008
>0 − kt
≈ N 0 e − kt
e-x ~ 1-x+...sorfejtés szerint
STERILEZÉS
Mit jelent tehát a sterilezés biztonsága? Pl .: 99,9%
P0(t)=0,999
1-P0(t)=0,001=10-3
Annak valsége, hogy a sterilezés nem sikerült, azaz maradt (legalább 1 túlélő:10-3 ) Annak valsége, hogy a sterilezés sikerült, azaz nem maradt 1 túlélő sem :0,999 Minden ezredik sterilezésnél megengedett egy sikertelen sterilezés Valószínűleg ezer sterilezésből egy nem sikerül Sterilezés után a rendszerben maradt élő csírák száma (db)
8
BIM SB 2008
Technikai megvalósítás: Száraz hővel hőlégsterilizátor Nedves hővel (telített vízgőz) autokláv szakaszos to. sterilezés folytonos to. sterilezés
BIM SB 2008
9
BIM SB 2008
STERILEZÉS Fermentációs tápoldatok szakaszos sterilezése
gõz hûtõvíz
gõz
víz
víz kondenz
direkt gõz
BIM SB 2008
kondenz
hûtõvíz
STERILEZÉS Hőpenetrációs görbe
Összemérhető szakaszok!
120-130 oC
fermentáció hõmérséklete
20-25 oC
MÉRETFÜGGŐ
t1
t2
tv
10
BIM SB 2008
STERILEZÉS
N0 ln = N
hőpusztulás a fűtés alatt:
hőpusztulás a hőntartás alatt:
ln
hőpusztulás a hűtési szakasz alatt:
N1 N2
ln
t1 ∫ k d t = ∇ fû té s 0
= k tartás . ( t 2 − t1 ) = ∇ tartás
N2 = Nv
tv ∫ k d t = ∇ h û té s t2
∇ = ∇ fûtés + ∇ tartás + ∇ hûtés
ln
⎛N N N ⎞ N0 N N N = ln ⎜ 0 1 2 ⎟ = ln 0 + ln 1 + ln 2 Nv N1 N2 Nv ⎝ N1 N 2 N v ⎠ Például: 0,20
BIM SB 2008
0,75
0,05
STERILEZÉS
faktor
10-3
100 liter 10 m 3 100 m 3
= ln
N0
Méretérzékeny!
N N0 = 105 / ml
105.105 = 1013 ∇ = 32,2 −3 10 105.10 4.103 = 1015 ∇ = 36,8 −3 10 105.105.103 = 1016 ∇ = 39,2 −3 10
10x-enként 2,3-mal nő
11
BIM SB 2008
STERILEZÉS
Fermentációs tápoldatok folytonos sterilezése Fermentor méret határ Kihasználtság: (kg termék/fermentor.m3.év). Folytonos művelet előnyei: -nagyobb hőmérsékleten (135-150 oC) végezhető -a rövidebb idejű sterilezés -sterilezés biztonsága nő, egyenletes: st-st-ben működik -kisebb a tápoldat komponensek hőbomlása -nem kell keverni a st. alatt (nem lev. kev telj. nagyobb) -fehérjéket, cukrokat külön lehet sterilezni és keverőtartályban egyesíteni -a folytonos folyamat reprodukálható, -egyforma minőségű steril tápoldatot szolgáltat ez növeli a fermentációs hozamot, -a folytonos sterilező berendezések, a művelet könnyen szabályozhatók, automatizálhatók.
BIM SB 2008
STERILEZÉS
Műveleti megoldások: GŐZINJEKTOROS gõz oC
2-3 min
tápoldat vákuum
tartási szakasz
idõ expanziós szelep
steril tápoldat
12
BIM SB 2008
STERILEZÉS LEMEZES HŐCSERÉLŐS tartási szakasz
elõhûtés
steril tápoldat
gõz felfûtés
hûtés
elõmelegités
tápoldat oC
2-3 min
20s
20s
idõ
BIM SB 2008
STERILEZÉS
SPIRÁLHŐCSERÉLŐS
13
BIM SB 2008
STERILEZÉS
BIM SB 2008
STERILEZÉS
14
BIM SB 2008
STERILEZÉS
BIM SB 2008
STERILEZÉS
Folytonos sterilező állomás kapcsolása STERIL TÁPOLDAT
BYPASS TARTÁSI SZAKASZ 30 s 140 o C
TÁPOLDAT
TISZTITÓ KÖR
REGENERÁLÓ BYPASS
HÛTÕVIZ gõz
FÛTÕ REGENERÁLÓ FÛTÕ-HÛTÕ
VIZ TISZTITÓSZEREK
HÛTÕ
MÉRÉSI PONTOK
15
BIM SB 2008
STERILEZÉS Folytonos tápoldat sterilezõk (tervezési) számitása
A tartási szakaszra:
ln
N0 L = k ∆t = k w Nv q
L - tartási szakasz hossza (m) w -tápoldat térfogatárama (m3/min) q - tartási szakasz csõ keresztmetszete (m2)
Dugóáram (plug flow)
u = umax
DE!!!
Turbulens áramlás
u = 0,82 * u max Lamináris áramlás
u = 0,5*umax
BIM SB 2008
STERILEZÉS
N( L) = N0
4Da ⎞ ⎛ y = ⎜1 + ⎟ ⎝ Pe ⎠
4y.exp( Pe / 2) yPe yPe (1 + y)2 exp⎛⎜⎝ ⎞⎟⎠ − (1 − y)2 exp⎛⎜⎝ − ⎞⎟⎠ 2 2
1/ 2
Da = kL / u
Damköhler szám vagy reakciószám,
Pe = uL / D
Peclet szám.
A dugóáramtól való kis eltérés esetén (1/Pe kicsi)
⎛ N( L) Da 2 ⎞ = exp⎜ − Da + ⎟ N0 Pe ⎠ ⎝
Ha Pe=∞ , dugóáram jellemzi az áramlási viszonyokat
N( L) ⎛ L⎞ exp( − Da ) = exp⎜ − k ⎟ = exp( − kt ) ⎝ N0 u⎠
16
BIM SB 2008
STERILEZÉS
FORRÓ PONTOK
KEVERŐ TENGELY TÖMÍTÉS
ALSÓMEGHAJTÁS
ELEKTRÓDOK
BIM SB 2008
STERILEZÉS KEVERŐ TENG. TÖMÍTÉS INOKULUM
FORRÓ PONTOK FELSŐMEGHAJTÁS
LEVEGŐ EL
SAV,LÚG,HBG
LEVEGŐSZŰRŐ
AEROSOL
MINTAVEVŐ
ÜRÍTÉS
17
BIM SB 2008
STERILEZÉS KEVERŐTENGELY BE-,KI-LEVEGŐ ADALÉKOK: CSÖVEK SZELEPEK INOKULUM VONAL SZENZOROK SZIVATTYÚK
DOWN-STREAM:
BIM SB 2008
STERIL NEMSTERIL
STERILEZÉS DUPLA CSÚSZÓGYŰRŰS TÖMÍTÉS CSÚSZÓ FELÜLET
STERIL VÍZ - KENÉS
18
BIM SB 2008
A csúszógyűrűk kenése kondenzvízzel
BIM SB 2008
STERILEZÉS
STERIL OLTÁS
19
BIM SB 2008
STERILEZÉS
STERIL OLTÁS 2
BIM SB 2008
STERILEZÉS TERMODINAMIKUS KONDENZEDÉNY
20
BIM SB 2008
STERILEZÉS
MEMBRÁNSZELEPEK
VISSZACSPÓSZELEP
BIM SB „A 2008
gőzsterilezés alapjai jól ismertek, de egy aktuális, jól működő rendszert megtervezni mégis nagy kihívás” 30 év, W.D.Wise (Eli Lilly), ChemicalProcessing.com
Mit tegyünk? -légtelenítés (telített gőz!), a levegő „higítja” a gőzt, légzsákok pre-vákuum ciklusok:csövekből, porózus alkatrészekből, vattadugó, géz -minden alacsonyan lévő ponthoz kondenzedény, v. k-lefúvató. csövek a legalacsonyabb pont felé lejtsenek, hőmérők az alacsony pontokra -A túlnyomás nem elég: ha lyuk van pl. steril levegővezetékben, be fog fertőződni ( Venturi effektus beszívja a nem st. levegőt) -St után, ellennyomás st.levegővel vákuum elkerülésére (gőz kondenzál vákuum!) --Könnyen tisztítható kivitelek Mit ne tegyünk? -Légzsákok „6D szabály”, ma inkább 2,5D a mérvadó -Ne használjunk közös elvezető csöveket -Ne legyen stagnáló felső szakasz -Ne hidd, hogy a levegő leszáll, mert nehezebb a gőznél
21
BIM SB 2008
BIM SB 2008
22
BIM SB 2008 LEVEGŐSZŰRÉS
rögzítő vitorlák
Sokrétrgű hajtogatott szűrőanyag Folyadék elvezetéssel
ráolvasztott sapka
STERILEZÉS
PALL
EMFLONR
Erős külső ház
Nyomásálló belső henger
O-gyűrűk
Csavaró zár
BIM SB 2008
gőz lefúvató gőz
szűrőgyertya
levegő be
levegő ki
gőz be kondenzátum
23
BIM SB 2008
A gázszűrő sterilezése.
A tápoldattal egyszerre, vagy külön. fontos: hőmérséklet monitorálása, integritástesztek!!
BIM SB 2008
Incinerator: elmenő gáz sterilezése
24
BIM SB 2008
STERILEZÉS
CIP (CLEANING IN PLACE)
BIM SB 2008
Szórófejek és elhelyezésük B) Keverős reaktor két szórófejjel
A) Szórófej 360o –os szórással, 1-15 m3/h;
C) Szóró szelep; a) szórófej kilépés; b) tartályba szerelés; c) kondenz el; d) Pneumatikus aktuátor; e) tisztító detergens vagy gőz; f) tisztító detergens kilépés
D) szórószelepek közvetlenül a isztítandó kritikus felületre irányítva
25
BIM SB 2008
Action
The CIP Skid controls the cleaning (“T.A.C.T.”) parameters of Temperature, Action (velocity/pressure), Chemical concentration and Time ofexposure.
26
Kémiai sterilezés = dezinficiálás A legfontosabb hatóanyagok: Etilénoxid Ózon Alkoholok Fenol Formaldehid Glutáraldehid Guanidinek Hidrogén peroxid Jodofórok Klór és klórvegyületek Kvaterner ammónium vegyületek Ortoftálaldehid Perecetsav
Gázsterilezés: Eti Etilén oxid (ETO) forráspont 10.4ºC azaz gáz halmazállapotú szobahőmérsékleten EtO reagál aminosavakkal, proteinekkel, DNS-sel reprodukciót megakadályozza. Sterilezés után kilevegőztetés a gáznyomok eltávolítására, Műanyagba csomagolt edények:Petri csészék, pipetták, injekciós fecskendők, -tűk, egyéb orvosi felszerelés
gázsterilező
27
Ózon sterilizáció: O2
elektromos mező O atomok O3 víz (ivó és szennyvíz) és élelmiszerek (hús, tojás)dezinficiálása
Mind folyadék mind gáz formában Los Angeles a világ legnagyobb ózonos víz-kezelő üzemét üzemelteti Uszodák, palackozott vizeek konténereinek sterilezése
Antiszeptikum: olyanok, amelyek kevéssé veszélyesek: bőr, nyálkahártya, de nem megehetők!!! alkoholok, Hg, ezüstnitrát, I2-oldat,detergensek
Dezinficiálószer: megölik a mikrobákat de spóráikat nem feltétlenül. Nem biztonságosak emberi szövetekre Élettelen felületek, padló, fal…. hipokloritok, CuSO4, kvaterner ammónium vegyületek, formalin, fenolok
28
Dezinficiálás: Cu, Hg, Ag történeti, alkoholok, szerves savak ( tartósítás: tejsav, ecetsav,szalicilsav, benzoesav) Klór-leadó vegyületek: NaOCl pH> 9 Na.diklór-izocianurát pH=7 0,5-1% H2O2 : 4% oldat Perecetsav : 3% oldat
H2O +O2
biocidok
Evetsav+O2
Kvaterner ammóniumvegyületek: min 0,2 % benzalkónium klorid, Alkil-dimetilbenzil-ammónium kloridok keveréke; alkoholos polivinilpirrolidon-iodid (10% w/v, szappan) Na- lauryl ether szulfát (25 % w/v); Glutáraldehid : baktericid, sporocid, virucid,fungicid 2% , lúgos pH:8,3 oldatban
Klórhexidin: kémiai antiszeptikum. Klórhexidin-diglukonát Elpusztítja a (baktericid) a gram-pozitív és gram-negativ mikrobákat, bakteriosztatikum is. 0,05% Mechanizmus: membrán roncsolás. Klorhexidin termékek nagy cc-ban szemtől és fültől távoltartani , de kontaktlencse is:0,005-0,006 %os cc.ben
Formaldehid: sporocid, virucid,fungicid
0,5-1% vizes oldat, v gőzök ill gáz.
Etanol, izopropanol : 70%, nem sporocid! Csak a csírázó spórákat pusztítja
29
Table I: Methods of sanitization and sterilization.
Method
Concentration of Active Ingred.
Temperature (F/C)
Contact Time (min)
Effective Against Live Bacteria
Effective Against Spores
Boiling
heat
>175/80
15-30
+
-
Autoclave/ pressure cooker
heat
250/121
15-30
+
+
Dry heat/ Oven
heat
350/177
60-180
+
+
Incinerator
heat
>700/370
<0.1
+
+
UV radiation
400 W/cm2
10-30
+
+/-
Detergent
1% (v/v)
5-30
+/-
-
Chlorine
0.01-5% (v/v)
10-30
+
+
Alcohol
70-85% (v/v)
10-30
+
-
30
