RNS technikák szeminárium - kivonat. Boros Ákos 2013

RNS technikák szeminárium kivonat Boros Ákos 2013

RNS molekulák felépítése, típusai

Mi az RNS? DEFINÍCIÓ: Változó hosszúságú, foszfodiészter kötésekkel egymáshoz kapcsolt ribonukleotid-monofoszfát egységekből felépülő (általában) egyszálú polimer.

RNS-molekulalánc építőegységek (Ribonukleotid-monofoszfátok) Purin bázisok monofoszfát-csoport

Pirimidin bázisok

Bázis

5’ vég

5’ Cukor-foszfát lánc folytatása 5’ irányba. Következő ribonukleotid-monofoszfát kapcsolódási helye

1’

4’ 3’ 3’ vég

2’

5 szénatomos (pentóz) (1’ – 5’) cukor-rész Dezoxiribonukleinsav (DNS) : (OH helyett H)

Cukor-foszfát lánc folytatása 3’ irányba. Következő ribonukleotid-monofoszfát kapcsolódási helye

RNS-molekulalánc cukor-foszfát gerinc

”Lelógó” bázisok Hidrogén hidak kialakulásának kedvező sztereokémiai pozíciókban!

A lánc két vége szerkezetileg különböző! 5’ vég: foszfát-csoport 3’ vég: OH csoport

Foszfodiészter kötés: Két szomszédos ribonukleotid-molekula 3’ és 5’ szénatomját egy monofoszfát molekula kovalensen köti össze! FORRÁS: http://www.mathcell.ru/show_topic_en.php?file=rna

Nukleinsav polimerizáció I.

RNS/DNS szintézis építőkövei in vivo és in vitro is: (Dezoxi)ribonukleotid-trifoszfátok dNTPk vagy NTPk dNTP= egyenlő mennyiségű dATP, dTTP, dGTP és dCTP → (r)NTP= egyenlő mennyiségű (r)ATP, (r)UTP, (r)GTP és (r)CTP

RT és PCR reakcióban is!!!

(d)NTP

RNS szintézis - RNS polimerázok DNS szintézis - DNS polimerázok Polimeráz aktivitás: nukleinsav molekulák ”gyártása” nukleotidokból (prekurzorok/építőelemek) A nukleinsav molekula: a nukleotidok foszfodiészter kötéssel összekapcsolt lánca!

Nukleinsav polimerizáció II.

A nukleinsav polimerizáció (in vitro és in vivo) két fő követelménye: -Templát szál (sablon), amelyről az átírás történik

- Szabad 3’-OH csoport, amelyhez a következő nukleotid foszfodiészter kötéssel kapcsolódhat Primer = Láncindító, nukleinsav-molekula szabad 3’-OH-véggel! Prime = get ready, prepare PCR-ban: Oligonukleotid primer

A polimerizáció 5’ → 3’ irányú (in vivo és in vitro egyaránt) Az 5’ vég készül el először, majd csak a polimerizáció végén készül el a 3’ vég!

Nukleobázisok

Két kategória: Purin bázisok: (A, G) Pirimidin bázisok (C, T illetve U) Komplementer bázisok

2 hidrogén-kötés (-híd):

3 hidrogén-kötés (-híd):

Bázispárosodás szabálya : (“ Watson - Crick ” base-pairing): A purin- és pirimidin bázisok eltérő hidrogén-kötés kialakító tulajdonságaira épül. A hidrogén-hidak mindig komplementer bázisok között jönnek létre. (nincs pl: A-A, C-C vagy A-C kapcsolat!)

Kettős szálú nukleinsav-molekula (RNS vagy DNS) irányultsága

5’

3’

5’

3’

5’

5’

3’ 3’

Irányultságból adódó kifejezések Upstream: a referencia ponttól 5’ vég felé eső Downstream: a referencia ponttól 3’ vég felé eső ”Upstream= felfelé”

”Downstream= lefelé”

5’

3’

AUUAG szekvencia

Referencia pont (pl: START kodon)

STOP kodon szekvencia

RNS típusok  riboszómális RNS (rRNS):

 Legnagyobb mennyiségben  transzfer RNS (tRNS)  heteronukleáris RNS (hnRNS)  mRNS:

Tantárgy főszereplője!

- Legkisebb mennyiségben - Legváltozatosabb - Legnagyobb mennyiségi variabilitás sejten belül és sejtek között is! snRNS (kisméretű-sejtmagi RNS - smal nuclear RNA) scRNS (kisméretű-citoplazmatikus RNS - smal cytoplasmic RNA) miRNS (mikro RNS)...

Gén és genom szerveződése a transzkripció szemszögéből I. Prokarióta genom

Adott metabolikus út (pl.: antibiotikum szintézis) génjei egy csoportot (”génklasztert”) alkotnak. Operon: A genomiális DNS funkcionális egysége, amely egy génklasztert tartalmaz egy promóter irányítása alatt. A promóter irányításával átíródó mRNS általában ”policisztronos”, azaz több polipeptidet megszakítás nélkül (vagy rövid megszakításokkal)kódol egy mRNS. Cisztron: az egy polipeptidet/fehérjét kódoló egység Prokarióta gén expresszió kinetikája (dinamikája) A génkifejeződés (transzkripció és transzláció) olyan gyors, hogy a még félkész mRNS-ről több riboszóma is elindítja a fehérjeszintézist, miközben az mRNS eleje már degradálódik is!

Eukarióta genom Csak a TELJESEN ÁTÍRT (és ”érett”) mRNS-ről indul meg a fehérjeszintézis! Az éret mRNS-ek jelentős része monocisztronos, azaz egy fehérjét kódol. Egyszerre több riboszóma dolgozik egy adott mRNS molekulán (=Poliszóma)!

RNS molekulák lokalizációja a prokarióta sejtben – Minden egy helyen! rRNS, tRNS, mRNS... a citoplazmában: HOMOGÉN RNS-POOL, később szelektálhatóak a RNS-típusok az RNS extraktumból!

RNS molekulák lokalizációja az eukarióta sejtben Más RNS-pool a sejtmagvacskából Más RNS-pool a sejtmagból Más RNS-pool a citoplazmából

+ mitokondrium + kloroplasztisz

Eukarióta Heteronukleáris RNS-ek (hnRNS) - Primer transzkriptek - Funkcionális RNS-ek prekurzorai - Lokalizációja: csak a sejtmagban - Az érett mRNS-ek prekurzorai is!

- Nagyon heterogén csoport! - Átlagos hossz: 8-10.000 nukleotid

Érett mRNS átlagos hossza: 1.9 - 2.2 kb!

- Mérettartomány: 2000-től 14.000 nukleotidig! - hnRNS-ek többsége lebomlik mielőtt megérik! (SZABÁLYOZÁS) - Időtartomány: 1 perc és 1 óra között! - kb. 25% jut el az érett mRNS-szintre! - Egy átlagos sejt összes RNS-ének 1-3%-a mRNS!

RNS érés

Az mRNS-prekurzor heteronukleáris RNS-ek jelentős érési folyamatok egész során esnek át.

(1) Capping (2) Splicing

Az RNS szintézis közben!

(3) 3’ vég splicing - Poliadeniláció (4) RNS-szerkesztés (”editing”) (5) metiláció

Splicing Megfigyelés:

Az érett mRNS általában rövidebb, mint a DNS-genom szakasz, ami az mRNS-t kódolja!

Exon: szekvencia-szakasz, amely az érett mRNS része is! Intron: Az érés során kivágódó szekvencia-szakasz. Értelmezhető a gén és a hnRNS-szintjén is! A splicing során: az intronok kivágódnak, az exonok összekapcsolódnak A pontos folyamatot lásd genetika és mol. biol EA.

Néhány érdekesség az exonokról és intronokról Intronok az eukarióta mRNS-eken kívül a tRNS-ek és rRNS-ek prekurzoraiban is. Általánosságban, rokon gének intronjainnak pozíciója (!) általában azonos (konzervatív). Mind az intronok száma, mind a hossza változó faj, illetve gén szintjén is. Pl. Emlős DHFR gén: 6 exon, összesen 2000 bázis teljes gén: 31.000 bázis! Alfa-kollagén: 50 exon, exononként 45-249 bázis (kb. 7500 bázis) teljes gén: ≈ 40.000 bázis Nem mindig ugyanazok az exonok maradnak az érett mRNS-en! (Alternatív splicing) pl.: patkány Troponin T, RUBISCO-aktiváz Egyes fajok adott génje tartalmaz intront más fajok ugyanazon génje viszont nem! Az intronok általában mindhárom leolvasási keretben tartalmaznak több stop-kodont!

Nincs szekvencia-hasonlóság az intron-szekvenciák között! DE! Az exon-intron határokon két dinukleotidos konzervatív szekvencia! Az intron 5’ vége mindig GU, 3’ vége pedig AG dinukleotid.

Exon-Intron kereső programok - GENSCAN (MIT's pattern scanning gene finder) - GeneMark (Georgia Tech's gene finder) - FGENESH (HHM-based gene finder from SoftBerry)

Eukarióta mRNS molekula toplógiája I. Szinte minden mRNS molekula alapvetően hasonló felépítésű (topológiájú) 5’ Cap A folyamat az RNS-szintézis alatt már megkezdődik (20-30 szabad bázis kell). Addig nem folytatódik az RNS-szintézis, amíg nincs CAP.

metil(n=1-4)-guanozin m(n)G

trifoszfát-csoport purin bázis

CAP

P

P

5’ hnRNS P A/G NNN30-50

DNS templát szál RNS pol. II transzkripció

Funkciók (1) Saját transzkripciójának szabályozása; fontos faktor-kötőhely (2) Exonukleázok elleni védelem (5’ → 3’ lebontás akadályozása) Prokariótáknál nincs CAP, degradálódás azonnal megindul! (3) A riboszómákhoz való kötődés, transzláció szabályozása; fontos faktor-kötőhely

Leader szekvencia A CAP és a fehérjeszintézis kezdőpontja (AUG) közötti nem kódoló szakasz! Nem kódoló régió = UnTranslated Region /Non-Translated Region = UTR/NTR Általában 30-50 bázis hosszúság Del lehet pár bázistól több száz bázisig Több fehérjeszintézist szabályozó szekvencia-motívum, faktor-kötőhely. Internal Ribosomal Entry Site = IRES ”START” kodon

CAP

m(n)G

P

P

5’ P

Kódoló régió Open Reading Frame = ORF

AUG mRNS 5’ Leader szekvencia (5’ UTR)

Kódoló régió A Leader szekvenciától downstream! Az Exonok összekapcsolódásából létrejött folytonosan kódoló szál (csak 1 keretben) Esetek döntő többségében AUG triplettel kezdődik (Metionin!) Prokariótáknál AUG illetve GUG (ritka)! Több AUG is van a kódoló szálon, melyik a kezdő? Nem mindig az első! Kozak-szekvencia Fehérjeszintézis az első STOP kodonig!

Kódoló szakasz

CAP PPP 5’ Leader szekvencia Purin bázis

START

STOP Triplet-ek = 3 szomszédos nukleotid = 1 beépülő aminosav …

STOP kodonok: -UAA -UAG -UGA

Guanozin bázis Metionint kódol! (propeptid N-terminálisa M!!!)

Trailer szekvencia = 3’ UTR

CAP

5’

Trailer szekvencia Nem kódoló szakasz 3’ UTR

Kódoló szakasz

3’ P P P 5’UTR (Leader) START

STOP

Szerepe:

Az mRNS stabilitásában kiemelt, fontos regulációs faktor kötőhely Citoplazmán belüli lokalizációt szabályozó faktorok kötőhelye ARE régió (AU-Rich Elements): RNS elbomlás szabályozása - RNS instabilitás Mikro RNS-ek célpontjai (mRNS kifejeződés szabályozás) Poliadeniláció-iniciációs hely

50-150 nt

Poliadenin farok CAP

5’

P P P 5’ UTR (Leader)

3’ Kódoló szakasz

3’ UTR (Trailer) AAAAAA 50-250

Az eukarióta mRNS-ek >99%-a 50-250 bázis hosszúságú poliA-farkos!

Poliadenilációs szignál AAUAAA (leggyakoribb) AUUAAA AAUAUA

Elengedhetetlen a nukleo-citoplazmatikus transzporthoz. Megvédi az mRNS molekulát a 3’ → 5’ degradációtól. Az mRNS kódoló génen nincs poliT-szakasz! Az RNS szintézis nem ott végződik ahol a poliA-farok kezdődik (kb. 1000 bázissal downstream). A hnRNS hasítódik annál a pontnál ahol a poliA farok kezdődni fog.

Poliadenilációs-szignál szerepe A poliA-farok templátfüggetlen módon szintetizálódik (poliA-polimerázok) Csak szabad 3’-OH csoport szükséges.

Eukarióta hírvívő (messenger) RNS (mRNS) topológiája

(!!!) CAP

5’

Transzláció iniciáció Kozak-szekvencia Tranláció termináció [A/G]ccATGG UAA,UAG,UGA

AAUAAA (polyadenilációs szignál) PoliA-farok 3’

P P P 5’UTR (Leader) START

STOP 3’UTR (Trailer) AAAAAA 50-250 Kódoló szakasz

mRNS-ek osztályozása előfordulás alapján - Nagy mennyiségű mRNS-ek: több száz kópia/sejt - Közepes mennyiségű mRNS-ek: néhány tucat/sejt - Kis mennyiségű mRNS-ek: <10/sejt

”The Devil is in the details"

RNS izolálás

RNS integritás védelem Az egyszálú RNS molekulák kémiai természetüknél fogva sokkal instabilabbak, mint a kettős szálú DNS molekulák. VESZÉLYFORRÁSOK: - Lúgos pH (>8.4 pH), magas hőmérséklet (>65oC). (Kettő együtt!) -Minta, amelyből az RNS extraktum készül,

Feltárásnál a szöveti RNS-bontó enzimek (RNÁzok) kiszabadulnak!(lásd később) - Nem megfelelően előkészített anyagok ill. eszközök (pl: pipettahegyek…) - Emberi bőr és testnedvek!

MEGELŐZŐ LÉPÉSEK: - Az extrakció fajtájának gondos kiválasztása és a protokoll betartása - A felhasznált anyagok ill. eszközök tisztaságának megőrzése

- Megfelelő, tiszta védőfelszerelés használata

RNS-bontó enzimek (ribonukleázok - RNÁzok)

Szinte minden sejtben jelenlévő enzimcsoport, amely RNS molekulákat képes bontani. Igen stabilak (különböző pufferekben),

Forralás, akár autoklávozás után is reaktiválódnak! Reverzibilisen blokkolhatóak!!! Egyes szövetek (pl.: hasnyálmirigy, érésben lévő gyümölcsök) RNÁz-gazdagok

Lehetnek endoribonukleázok (láncon belül vág) vagy exoribonukleázok

(láncvégeken vág)

Extinsic RNÁz aktivitás

Extrinsic = mintán kívüli forrásból származó Minden reagensnek, eszköznek, felszínnek RNÁz-mentesnek kell lennie! Steril ≠ RNÁz-mentes !!!

Lehetőleg külön reagensek, eszközök, munkaterület az RNS-munkáknak Legnagyobb veszélyforrás a bőrfelület! MINDIG HASZNÁLJ (ÉS GYAKRAN CSERÉLJ) KESZTYŰT

Külön figyelem az RNS izolálás végén!

Laboratóriumi eszközök/vegyszerek előkészítése RNS munkákhoz Előkészítés is kesztyűben Műanyag eszközök: Csak elősterilizált, RNS munkára alkalmas eszközök Üvegeszközök: Száraz kisütés: 2-3 óra, kb. 200oC Vegyszerek/reagensek: Készítés dátuma és a lejárati idő feljelölve!

Mikróbák!

Használj aliquot-okat!!! (kis adag vegyszer/reagens) RNÁz-mentesítés: DEPC (dietil-pirokarbonát) 0,05 %: Víz!!!, eszközök RNáz mentesítésére RÁKKELTŐ!

Autoklávban elbomlik (CO2 + Et-OH)

H2O2, (3% végkonc.): 20-30 min fürdő.

PCR Inhibitor

LEJÁRATIIDŐ!!!

RNAse AWAY®: Eszközök, munkafelületek RNÁz és nukleinsav-mentesítésére 0,1 N NaOH + 0,5% SDS oldat: ISMÉTELT MOSÁS,

ERŐSEN LÚGOS pH

Intrinsic RNÁz aktivitás

Intrinsic = A mintából származó A minták homogenizálásakor szabadulnak fel Az RNS-el együtt izolálódhatnak, és később aktiválódnak (”Látens RNÁzok”)

Intrinsic RNÁz aktivitás gátlása

HŰTÉS (4oC)

RNáz Inhibitorok alkalmazása (legelterjedtebb, lásd később.) Macaloidok - agyagból előállított szuszpenzió (0.015 w/v%-os koncentrációban) megköti az RNÁzokat. Centrifugálással elválasztható. Vanadil-ribonukleozid komplexek - oxovanádium (IV) ion blokkolja az RNÁzokat! Reverz transzkripciót is gátol !!! Proteináz K / Pronáz - Aspecifikus fehérjebontó enzimek, Széles pH spektrum (4,0 - 12,0) és hűmérséklet-spektrum (25-65oC) RNS-el átvihető, elbontja az enzimeket (pl. Reverz transzkriptázt)

RNS-extrakció :

Biológiai mintákból megfelelő fizikai-kémiai reakciókkal tiszta és intakt, a későbbi kísérleteknek megfelelő (!) RNS molekulák kinyerése!

Fő lépései:

(!!!)

Szövetminták előkészítése→ Sejtek feltárása (homogenizálás) Sejt/szövet lizálása (feloldása) → RNS feltárás

RNS elkülönítése a többi sejtalkotó molekuláktól (fehérjék, DNS…) RNS kicsapás/megkötés (”töményítés”) RNS szubpopuláció(k) szelektálása (OPCIONÁLIS)

RNS minta tárolása

A sejtkultúrák tulajdonságai az RNS izolálás szempontjából

-

Korlátlan mennyiségű minta

-

Általában homogén sejtpopuláció

-

Természetesen szabadabb sejtfelszín,

-

Kismértékű előkezelés szükséges a sejtfeltáráshoz (pl.: tripszines emésztés)

-

Kevés ECM

-

Jóval egyszerűbb és ismertebb protokollok

A szövetminták tulajdonságai az RNS izolálás szempontjából -

Kevés minta is megfelelő RNS mennyiséget ad (≈100 mg )

-

Heterogén sejtpopulációk → heterogén RNS-pool

-

Változó mennyiségű, minőségű ECM → változó mértékű sejtfeltárás

-

In situ vizsgálatokra alkalmas

-

Nehéz reprodukálhatóság (mintavétel, minta méret…)

Kézi sejtfeltárás (homogenizálás): - Dounce homogenizátor (”douncer”) Alexander Dounce (1909-1997) Sejtorganellumok (sejtmag és mitokondrium) izolálásával foglalkozott ”douncer”: üveg mozsár + kerámiaborítású őrlőfej hézag: 13 µm → sejtek roncsolódnak, organellumok nem!

Mechanikus sejtfeltárás (homogenizálás): Működésének alapja:

A mintát erőteljes nyíróerők hatásának tesszük ki, melyek darabokra tépik a szövetet!

Polytron® -

Általános szöveti homogenizáló (pl.: állati-, növényi, bakteriális…)

-

Cserélhető, könnyen tisztítható (autoklávozható) fej

-

A fej-egység apró, rezgő fűrészfogazott késekből áll

-

Hátrányai: - Több minta homogenizálásákor mintakeveredés esélye nagy!

- Melegedés, Habképződés - Teljes roncsolás!

Mechanikus sejtfeltárás (homogenizálás): - Bead Beater ™ technika Sejtfallal rendelkező minták homogenizálása Sejtorganellumok felszabadítása Ellenálló mintákhoz (pl.: rovarminták, porc…), Apró fémgyöngyök, vagy pengék rázása (ᴓ: 0,1-2mm)

Hátrányai:

- Gyors hőmérsékletemelkedés - Változó hatásfok

Mechanikus sejtfeltárás (homogenizálás): - Szonikálás A minták ultrahangos (20–50 kHz) kezelése Előnye: Nincs segédeszköz (pl.: gyöngyök, kések) a mintában. Alkalmas sejtmagvacskák (nukleolusz) (!) felszabadítására is.

Hátrányai: - Gyors hőmérsékletemelkedés - Lassú - Változó hatásfok

Fagyasztva-porlasztás (” Cryopulverization”) A módszer alapja, hogy a szövetek (is) törékennyé válnak extrém hidegben. Jól használható erősebb szöveteknél/mintáknál

(pl.: porc, kötőszövet-gazdag minta, növényi magvak...) Lényege: A szövetmintát folyékony nitrogénbe mártjuk, majd mechanikus úton felaprítjuk.

Hátránya: - Jelentős mintaveszteség

- Anyag/eszközigényes - Veszélyes Előnye a hatásfoka, főleg kombinálva egyéb kémiai detergensekkel.

RNS izolálás növényi mintákból

SEJTFAL: Primer sejtfal: celluóz mikrofibrillumok, pektinek, glikánok Secunder sejtfal: lignin, kutin…

Agresszívebb lépések szükségesek a sejtfeltáráshoz! KLOROPLASZTISZ: Saját RNS-ek a gélképen SZÉNHIDRÁTOK, POLIFENOLOK: RNS LiCl-os kicsapása, majd centrifugálás

A növényi RNS-ek sokkal stabilabbak, mint az állatiak! Változó RNS-tartalom 1 g Levél → 25-100µg teljes RNS 1 g Gyümölcshús →6-20µg teljes RNS

Sejtfal eliminálása: Enzimatikus úton - protoplaszt-képzés. Gyakran alkalmazott enzimek: lizozim, celluláz, mannáz, zimoláz… Előnye: Intakt (”sértetlen”) sejteket eredményez! Hátránya: Nehezen beállítható, nem mindig működik, időigényes

(pl.: Saccharomyces fajok aktív osztódásakor (érzékeny) más a sejtfal-összetétel, mint a nyugalmi szakaszban(ellenálló)

Mechanikus úton: Leggyakrabban fagyasztva porlasztás (folyékony N2, majd őrlés) Bead Beater ™

II. A megfelelő membrán-feloldási módszer kiválasztása Két fő kategória: 1. Erős denaturáló szerek: (pl. TRIzol® / TRI reagent®) Guanidin-sók (Guanidinium tiocyanate; guanidinium hydrochloride) Nátrium-dodecil-szulfát (SDS) N-Lauril-szarkozin Urea Fenol

2. Enyhe lízis-pufferek (nem-ionos, hipotóniás lízis-pufferek) Hatóanyagok (detergensek): Nonidet ™ P-40 (NP-40) (1% végkonc.) IGEPAL® CA-630 [SIGMA] Triton X ® 100 (0.1% végkonc.)

II. A megfelelő membrán-feloldási módszer kiválasztása

Erős denaturáló szerek alkalmazása: CÉL: teljes RNS extraktum készítése (rRNS, tRNS, hnRNs, mRNS…)

Az erős denaturálók a sejtmembránt és a sejtkompartmentek membránjait is teljesen feloldják. SŐT szövetminták is homogenizálhatóak benne!

Felszabadítja az összes nukleinsavat (genomiális és mitokondriális DNS-t is!) Utólagos DNS-eltávolítás szükséges (pl.: DNÁz-emésztés/ DNS kicsapás)

Denaturálódnak és INAKTIVÁLÓDNAK A FEHÉRJÉK (RNÁzok is) → szobahőmérsékleten végezhető extrakció.

II.

A megfelelő membrán-feloldási módszer kiválasztása

Enyhe lízis-pufferek alkalmazása: CÉL: a sejtmembrán feloldása mellett a kompartmentek membrán-integritásának fenntartása. A sejtmembrán és a kompartmentek membránja eltérően reagál a detergensre. Centrifugálással elválasztható a citoplazma-oldat a sejttörmeléktől. A sejtlízis után a citoplazmatikus és a sejtmagi (vagy mitokondriális…) RNS külön-külön izolálható. -NEM INAKTIVÁLÓDNAK AZ RNÁZOK, SŐT! - RNÁz inhibitorok alkalmazása elkerülhetetlen - Extrakció folyamata előfagyasztott (-20oC) eszközökkel , vegyszerekkel! -A szöveti RNÁzok is a minta-forrás maghőmérsékletén aktívak!

III. A nukleázok aktivitásának gátlása A választott módszer kompatibilis az alkalmazott pufferekkel? Munkafolyamat: 4oC !!! Ribonukleáz inhibitorok: - Speciális fehérjecsoport (enzimek) - Humán placentából ill. patkány májból izolált enzimek - Szelektíven kötnek egy-, vagy többféle RNÁz enzimet (inaktivál) DE NEM MINDET - Kompetitív, nem-kovalens kötés - A legtöbb enzimes módszerrel kompatibilis (pl.: cDNS-szintézis…)

- Széles választék (pl.: RNaseOUT™ , SUPERaseIn™, RNAsin®, RiboLock®… ) - Különbség az inhibitorok szelektivitásában, pufferigényében, hőstabilitásában! - Alkalmazásakor kerülni kell: erős só konc., magas hőm., magas urea konc.

IV. A megfelelő fehérje-mentesítési módszer kiválasztása

CÉL: A sejtlizátum teljes fehérje-mentesítése (RNÁzoktól is) A mintából átvitt fehérjék erősen csökkentik (akár fel is függeszthetik) az enzimatikus reakciókat, . pl.: hiszton-fehérjék.

Alkalmazható módszerek: - Proteináz K emésztés (aspecifikus fehérjebontó, SDS, Urea és EDTA jelenlétében is) - Szerves oldószerrel történő ismételt extrakció (pl.: fenol-kloroform) - Guanidin-extrakció alkalmazása - Fehérje-kisózás (kicsapás) - Fizikai szeparáció szilika-oszlopokkal (kit-ek, lásd később)

- Ezek kombinációi

V. A megfelelő nukleinsav ”töményítési” módszer kiválasztása Meghatározó jelentőségű a további reakciók sikeressége szempontjából, hogy mekkora a kópiaszáma a vizsgálni kívánt RNS-nek (előző e.a anyag).

Lehetőségek: RNS precipitáció (kicsapás) különböző só és alkohol kombinációjával Magas só koncentrációjú oldatban a nukleinsavak rosszul oldódnak. RNS-kicsapódás hőmérsékletfüggő (-20oC – akár egész éjjel!) RNS - méretfüggő

A sós-alkoholos kicsapás határértékei: DNS: 50 ng/ml RNS: 100 ng/ml !!!

RNS precipitáció (kicsapás) különböző só és alkohol kombinációjával

Só

Törzsoldat konc.

Szükséglet

végkoncentráció

NaOAc

3M (pH 5.2)

0,1 vol.

300 mM

NaCl

1M

0,1 vol.

200 mM

LiCl

8M

0,1 vol.

800 mM

NH4OAc

10M

0,2 vol.

2M

Glikogén

10mg/ml

0,01 vol.

0.1 mg/ml

Alkohol

Szükséges térfogat a sóoldat hozzáadása után

Etanol (95-100%)

2,2-2,5 vol.

Izopropanol (100%)

0,6-1,0 vol.

V. A megfelelő nukleinsav ”töményítési” módszer kiválasztása Egyéb lehetőségek: - Vákuum-centrifugálás Hátrány: magas hőmérséklet, sókoncentráció ! TÚLSZÁRADÁS - Liofilizálás (fagyasztva- szárítás) Hátrány: drága gép, sókoncentráció ! - Szilika-oszlop alapú töményítés (nukleinsav-izoláló kittek) Hátrány: Behatárolt megkötési mennyiség Adott minimum elúciós térfogat. Lásd.: GYÁRTÓI PROTOKOL (!)

VI. A kész RNS-extraktum tárolási formái Minta (RNS-extrakció előtt): - Intakt szövetminta vagy sejtkultúra -80oC-on, vagy folyékony nitrogénben - Guanídium-só oldatban (pl.: TRIzol®) homogenizálás után -80oC-on

- RNAlater®: Szövetmintán belül ható RNS stabilizáló (Terepen is használható) Tisztított RNS-extraktum a legstabilabb, ha alkoholos csapadékként -80oC-on tároljuk. Rövid ideig (< 1 hét): Nukleáz-mentes vízben /TE pufferben oldva -20oC-on.

vagy alkoholos csapadékként -20oC-on. Hosszabb ideig (2-6 hónap): Nukleáz-mentes vízben/TE pufferben oldva -80oC-on. Hosszú távú tárolás

Tiszta formamid (100%) FORMAzol®: >2 év (!) után is stabil az RNS (-20oC-on) RNAlater® TE puffer: 10 mM Tris; 0.1 mM EDTA; pH 7,5

RT előtt tisztítani kell!

Szilikát-filteres oszlopok

Számos különböző gyártó, még több különféle termék Nem csak RNS extrakcióra, RNS tisztításra, DNS extrakció/ PCR termékek tisztítása… Működésük alapja azonos: A nukleinsav erősen kötődik a szilika-membránhoz magas só koncentráció, és erős denaturáló szerek (Pl.: guanidium-sók) jelenlétében. Mosási és centrifugálási lépések után a nukleinsav lemosható alacsony só koncentrációjú vizes oldattal!

A kitt-hez mellékelt lízis puffer határozza meg, hogy DNS-t vagy RNS-t izolálunk! Az oszlopok ugyanazok, még ha más-más színűek is 

”The Devil is in the details"

RNS szubpopuláció-szelektálás, integritás, mennyiség

RNS izolálás – Affinitás mátrixok

poliA+ mRNS felszaporítása Módszerek csoportosítása: - pozitív szelekció (mRNS-t szelektáljuk)

- negatív szelekció (rRNS-t/tRNS-t szelektáljuk)

A pozitív szelekció: Lényege, hogy a vizsgált molekulát (poliA-mRNS) különítem el a környezetétől.

Módszerek alapja: A mátrix poliT és a minta poliA szekvenciáinak bázis-párosodása A kapcsolódás magas ion-koncentráció jelenlétében!

RNS izolálás – Affinitás mátrixok poliA+ mRNS felszaporítása (pozitív szelekció)

Típusai: - poliT-borított cellulóz/polisztirén gyöngyök (mátrix) gyöngyök: kis méret (Ø: 1,1 µm), nagy felület! - biotinilált-OligodT próba + avidin-borított mátrix

poliT-borított cellulóz/polisztirén gyöngyök pl.:

Oligotex® mRNA Kit- Qiagen ™ MicroPoly(A)Purist™ Kit - Ambion® (Life Technologies ™) Poly A+ RNA - Clontech ™

Kiindulási minta: - tisztított teljes RNS-izolátum (rRNS, tRNS, mRNS...) - sejtlizátum Szeparálás: - centrifugálással (pellet összegyűjtése, majd reszuszpenzió) - mágneses módszerrel (pellet szeparálása erős mágnesekkel)

(pl.: Magnetic mRNA Isolation Kit ™ – New England Biolabs.) Eluálás: Alacsony só koncentrációjú pufferrel,

előmelegítés (≈55oC) hatásfoknövelő

biotinilált-oligodT próba + avidin-borított mátrix pl: mRNA Capture Kit - Roche®

A módszer működésének alapja A poliT és a poliA szekvenciák bázis-párosodása (oligodT-próba + minta poliA) Az avidin erős és magas specificitású kötődése a biotinhoz. 1 avidin : 4 biotin

biotinilált-oligodT próba + avidin-borított mátrix pl: mRNA Capture Kit – Roche ® Kiindulási minta: - tisztított teljes RNS-izolátum - sejtlizátum Próba:

biotin-jelölt oligodT20 molekulák

Felszín:

Avidin-borított felszínű PCR csövek

A módszer előnye: Az izolálás végén a lekötött mRNS tovább vihető RT-PCR reakciókra ugyanabban a csőben! Bármilyen nukleinsav-molekula biotinilálható! rRNS-szelekció hnRNS-szelekció...

RNS izolálás – Affinitás mátrixok poliA+ mRNS felszaporítása Módszerek csoportosítása: - pozitív szelekció (mRNS-t szelektáljuk)

- negatív szelekció (rRNS-t/tRNS-t szelektáljuk)

A negatív szelekció: A vizsgált molekulákon (mRNS) kívül lehetőleg minden mást kivonok a mintából.

Főleg prokariótáknál, mivel nem jellemző a poliA-farok az mRNS-eken.

Prokarióta mRNS felszaporítás – ”rRNS kifogás” A teljes RNS-pool jelentős része 16S és 23S rRNS A szelekció lényege: rRNS-szekvencia specifikus nukleinsav-próbák szilárd felszínen (pl.: PCR-cső, ELISA lemez, mágneses gyöngyök...) A teljes RNS izolátumból a hibridizált rRNS-ek elválaszthatóak

rRNS, tRNS szelektív lebontása: A legtöbb bakteriális mRNS 5’ végén trifoszfát (5’PPP) csoport rRNS és tRNS molekulák 5’ végén monofoszfát (5’P) csoport 5’P-specifikus 5’ → 3’ exonukleáz (RNÁz) alkalmazása Az rRNS és tRNS 10-20%-át távolítja el!

RNS izolátumok minőségi vizsgálatai

Mikor végezzük el? - Az RNS izolálás után (főleg szöveti RNS) - Hosszú ideig tárolt, ismeretlen minőségű RNS-minta esetén

- Ha valami nem működik, aminek működnie kéne

Minőségellenőrző vizsgálatok – UV spektrofotometria

UV abszorpciós (elnyelési) vizsgálatok A vizsgálat alapja: Tiszta nukleinsav-oldatnak karakterisztikus abszorbancia-profilja van!

230-320 nm-es fényhullámhossz-tartományban. Elnyelési maximum: 260 nm

Nukleinsav abszorbancia-profil elemzése

Az abszorbancia-profilból (spektrum) megállapítható a minta ”tisztasága”/minősége A profil eltérése a ”tiszta nukleinsav-oldat” profiljától jelzi a szennyezés természetét.

Spektrumon azonosítható szennyeződések típusai: Fehérje

abszorbancia maximuma: 280 nm

Sók

abszorbancia maximuma: 240 nm

Szerves vegyületek

abszorbancia maximuma: 230 nm

RNS/DNS

abszorbancia maximuma: 260 nm

A szennyezés mértékének megállapítása: A különböző abszorbancia-maximumok arányának elemzésén alapul

(!!!)

A260/A280 < 1.8

Fehérje-szennyezés (mintából)

A260/A230 <1.8

Szerves vegyületek jelenléte (pl.: fenolát, tiocianát – RNS izolálásból) növényi RNS-nél: akár poliszaharidok!

A260/A240 <1,4

Ionos (só) vegyületek (RNS izolálásból) jelenléte

Optimális arányok:

DNS

RNS

Tiszta nukleinsav A260/A280

RNS-nél:≈ 2.0,

DNS-nél: ≈1.8

Fontos tudnivalók a nukleinsav-minta UV spektrumáról!

- A nukleinsavak A260 értéke nem pH-függő, DE - A fehérjék A280 értéke, és így az A260/A280 arány pH-függő!!!

pH 5,4 → 8,5

RNS A260/A280 : 1,5 → 2.0 !!!

A pH 8.0 oldat mért értéke a releváns!

A nukleáz-mentes desztillált víz pH-ja ≈ 6.0!

Ne használj NFW-t, használj inkább TE puffert (pH 8.0)

- A 260:280 arány eltolódása érzéketlen a fehérjeszennyezés mértékére! - Kis eltolódás is nagy szennyezésre utal! % nukleinsav

% fehérje

260:280 arány

100

0

2.00

95

5

1.99

90

10

1.98

70

30

1.94

Tiszta nukleinsav A260/A280 RNS-nél:≈ 2.0, DNS-nél: ≈1.8

Fontos tudnivalók a nukleinsav-minta UV spektrumáról! FENOL SZENNYEZÉS - A fenolnak (TRIzol/TRI Reagens alkotóelem) abszorpciós maximuma: 270 nm ! - Csúcs A270-nél fenol szennyezésre utal! FIGYELJ RÁ! - A fenol jelenléte a nukleinsav-koncentráció jelentős túlmérésével jár!

AZ ALKOHOL SZENNYEZÉS jelenléte a abszorbancia-spektrumon Nem kimutatható!

Spektrofotometriás mérések - Figyelmeztetések Ha lehetséges ”scanning” spektrofotométert használj (230-350 nm hullámhossz tart.)

Nem elég csak a 260 nm-es érték, kell az egész spektrum!

Lehetőleg ne NFW-ben oldott nukleinsavat mérj

Az NFW enyhén savas pH-ja (6,0) befolyásolja a mérést

Mindig ugyanaz a pufferrel legyen a ”vak”, mint amivel a nukleinsavat feloldottad.

Nukleinsav mennyiségi meghatározása spektrofotometriás módszerrel Mikor szükséges: - Reverz transzkripció: megfelelő hatásfokhoz enzim : primer : RNS-templát arány szükséges - Expressziós vizsgálatok: templát mennyiség normalizációhoz

A mérés alapja:

A nukleinsavak A260 értéke [RNA]ng /µl = A260 × hígítás × 40 [dsDNA]ng /µl = A260 × hígítás × 50 [ssDNA]ng /µl = A260 × hígítás × 33

Oligonukleotidok – primerek Ahol: (Egyedi ext. koeficiens) A260: abszorbancia/optikai denzitás 260 nm-en (OD 260 ) 40: Az RNS átlagos extinkciós koeficiense (1 OD = 40μg RNS) 50: A dupla szálú DNS átlagos extinkciós koeficiense (1 OD = 55μg dsDNA) 33: Az egyszálú DNS átlagos extinkciós koeficiense (1 OD = 33μg ssDNA)

Minőségellenőrző vizsgálatok – Nem spektrofotometria módszerek

RNS elektroforézis RNS minta molekuláinak méret szerinti szétválasztása. Előnyei: Nem eszközigényes Egyszerűen elvégezhető RNS-degradáció kimutatható DNS kontamináció kimutatható Hátránya: Nem olyan érzékeny a szennyező anyagokra, mint a spektrofotometria Nem lehet azonosítani a szennyező anyagokat

Mintaigényes

RNS elektroforézis Intakt, tiszta RNS karakterisztikus elektroforézis-profil Intakt az RNS, ha a 28S rRNS : 18S rRNS arány 2:1 (vagy 2,5 : 1) EUKARIÓTA Minél jobban eltér az arány annál használhatatlanabb az izolátum.

Intakt RNS elektroforetikus profilja: - Minimális ”smear” (maszat) a 18S és 28S rRNS-ek körül

- az 5S, 5.8S rRNS és a tRNS-ek diffúz sávként a gél alján

Minőségellenőrző vizsgálatok – Nem spektrofotometria módszerek

Ellenőrző RT-PCR reakció Általában sorozatos kudarcok esetén! Lehetséges-e az RNS mintából sikeres RT-PCR reakciót végrehajtani? Elég tiszta/intakt-e a minta ?

Standard RT-PCR reakció egy jól működő primer-párral pl: β-aktin, GAPDH (glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz)

Ha nincs eredmény →

KUKA és új RNS izolálás

”The Devil is in the details"

Reverz transzkripció

A reverz transzkripció célja:

- A target RNS molekula DNS-re történő átírása (transzkripciója)! - Eredmény: cDNS (c = complementary/komplementer) Kulcsenzim:

- RNS-függő DNS polimeráz Szinonimák: RT, RTáz, revertáz, RdDp(=RNA-dependent DNA polymerase) NEM: rt (=real time)

RT-PCR≠ rt-PCR

Forrás: - Retrovírusok (= Retrográd információáramlás ) pl.: HIV Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) (Moloney = Az első leírójának a neve) Avian Myeloblastosis Virus (AMV) Ezek rekombináns variánsai!

Az RT enzimek általános tulajdonságai I: - Mezofil enzimek (működési tartomány: 25-45oC) Magas hőfokon inaktiválhatóak! (>75-85oC) - Nem amplifikálnak! - Szabad 3’ OH-függő polimerizáció Csak szálfolytatásra képesek

→

Oligonukleotid (primer)

A polimerizáció nukleinsav-típus független: bármilyen RNS molekulát képesek átírni komplementer DNS-re. (cDNS)!! részlegesen lebomlott RNS-t is (!) - CSAK 5’

→

3’ irányú átírás!

Az RT enzimek általános tulajdonságai II: - ”Lassú” átírás DNS-polimerizáció sebessége: kb. 1-1,5 nt/ sec (in vitro) Taq polimeráz: ≈ 10-16 nt/ sec - ”Magas” hibaarányú átírás (High error rate/Low Fidelity) 1 / 17.000 (AMV) 1 / 30.000 (M-MLV-RT)

cDNS klónozásnál gond lehet!!!

Nincs 3’ → 5’ exonukleáz aktivitása (proofreading)!

Az RT enzimek általános tulajdonságai IV. RT-típusok: - AMV-RT és változatai: Felhasználás: rövidebb templátok átírására (≈ 2.000 nt) Eredetileg is magasabb hőfokon (50oC) is aktív. Jobb hatásfok, mint az M-MLV-RT.

- M-MLV-RT és változatai: Felhasználás: hosszabb templátok átírására (≈ 5.000 nt), ”full- length cDNA” Eredetileg alacsonyabb hőfokon aktív (37-42oC),

DE számos mesterséges ”hőstabil” változat! Az RT enzimek ”fejlesztésének” egyik iránya a hőstabilitás növelése!

RT enzimek RNS-bontó aktivitása (Ribonukleáz H aktivitás) Az RT enzim felbontja a foszfodiészter-kötéseket az RNS szálon! Exo-, és endonukleáz funkció (szálon belül, és szálak végén is bont).

Kettős szálhoz kötött aktivitás: pl.: Templát RNS:primer, vagy RNS:DNS hibrid a polimerizáció lelassulásakor Rontja a reakció hatásfokát, specificitását!

NEM MINDIG ROSSZ!

Az AMV-RT-nek erősebb, mint az M-MLV-RT-nek! Az RT enzimek ”fejlesztésének” másik iránya az RNAseH-aktivitás csökkentése/kiütése! Teljes hosszas cDNS szintézisnél probléma!!!

RT reakciót követő RNAseH emésztés (!) Külön kapható RNAse H enzimmel (endoribonukleáz) végezhető (!) Nagyméretű terméket produkáló, ún. Long Range RT-PCR reakciók előtt Felszabadítja a PCR primerek tapadási helyeit a cDNS-en.

Növeli a PCR reakció hatásfokát. 4-8 bázisonként felbontja a foszfodiészter-kötéseket az RNS:DNS hibrid RNS szálán DE NEM BONTJA EL AZ RNS-t.

Bizonyos száljelölő reakciók (pl.: TdT) előtt kötelező!

5’ 3’

3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 6-8 nt RNS cDNS

3’ 5’

3’

6-8 nt 5’

RT emelt hőfokon (>50oC) - Csak hőstabil RT enzimekkel - Csak szekvencia spec. primerrel (Tm !!!)

- Hosszabb cDNS-t eredményez (másodlagos struktúrák) - Az RT-t követő PCR specificitását növeli Hődenaturált RNS-hez előmelegített puffer+RT enzim

(Lásd később)

Reverz transzkripció - Oligonukleotid primertípusok: (A) Oligo dT12-18 (B) Oligo dT-Anchor

(C) szekvencia-specifikus reverz primer (D) random hexamer (NNN NNN)

Oligo dT-Anchor:

Kevert bázisok kódszótára primer mix: 3’ 5’ 1.2.3….. ATTTTTTTTTTTTT CTTTTTTTTTTTTT GTTTTTTTTTTTTT

Anchor-rész (horgony) 5’

VTTTTTTTTT 3’ Oligo dT-rész

Az oligonukleotid primer

Oligo dT-Anchor

a target RNS tapadási helyének lehetőleg PONTOS reverz komplementere!

Kritikus az első 6-8 nukleotid! RT-enzim dokkolási helye!

RNS

RNS RNS

Random hexamer

Tm alacsony → 25oC előinkubáció → NE >42oC RT hőmérséklet

- NNN NNN (N= bármely nukelotid)

- Templát-független kötődés (rRNS, tRNS, hnRNS, mRNS...) - Több letapadási hely a templátokon - Több, különböző hosszúságú, RÉSZLEGES cDNS termék

- Nincs szál ligálás! - Másodlagos struktúrák kikerülhetőek

A reverz transzkripció limitáló tényezői! - RNS templát mennyisége és minősége, tisztasága! (pl.: poliszaharidok, proteázok...)

- A target RNS hossza, bázisösszetétele (GC-gazdag-, illetve homopolimer szakaszok) - Másodlagos struktúrák! - Reakciókörülmények!

RT reakcióelegy összetétele 0,5 ml-es vagy 0,2 ml-es, steril, zárható tetejű csőben! Hűtött tartóban (”hűtőrack”) kb. 4OC-on! Nukleáz-mentes deszt. víz

Puffer (10x vagy 5x töménységű) dNTP oldat (dATP, dGTP, dCTP és dTTP mix) Reverz primer /Oligo dT (Anchor) / rand. hex. RNáz Inhibitor (pl.: RNAsin®) Reverz transzkriptáz enzim +RNS extraktum

Hőstabil RT → Hőstabil RNáz Inhibitor !

RT reakcióelegy összeállítása – mintaprotokoll Több minta esetén készíts RT-mastermixet! Sok minta (>10) esetén számolj rá 10%-ot! → Pipettázási hiba Összetevők

1 csőre

Steril dH2O (NFW) 6µl dNTP (10mM)

1µl

Primer (20µM)

1µl

∑

8µl

Ne melegítsd az RNS-t pufferált közegben

+ 2μl (50 – 1000 ng) of RNS templát Hődenaturálás: 70oC – 5 perc, majd azonnal jégbe (min. 2 percre) Összetevők

1 csőre

Steril dH2O (NFW)

6µl

10X Puffer (pH ≈ 8,3)

2µl

RNÁz Inhibitor (20U/µl)

1µl

RT enzim (20U/µl)

1µl

∑

10µl

Hőstabil RT-enzim: + Előmelegített (RT optimum hőm.) Mastermix 2

Reverz transzkripciós hőprogram Reverz transzkriptáz mezofil enzim Optimum hőmérséklet RT-enzim függő, általában 42OC

Magas hőfokon (>75oC) inaktiválhatóak. Az átírási idő függ a target RNS mennyiségétől, hosszától, az alkalmazott RT-enzimtől

Klasszikus hő program: 25OC – 5 min

Primer tapadás (random hexamer)

42OC – 10 min -1 h

Lánchosszabbítás (Elongáció)

85OC – 5-15 min Enzim inaktiválás (Termináció) 4OC – ∞ HA struktúrált az 5’ vég: 50-55oC – 5 min

RT adalékanyagok - Glicerol (max. 20 v/v%) - DMSO (Dimetil Szulfoxid, max 10 v/v%)

- Zselatin (max 10 μg/ml végkonc.) - Acetilált BSA (Bovine Serum Albumin)

RNS strukturáltság csökkentése DE, PCR inhibitor (>0,4 v/v%)

Stabilizálja az RT enzimet Az RT-PCR érzékenységét növeli

Tth RNS/DNS polimeráz - Thermus thermophilus termofil DNS polimeráz enzimje - 74oC-on aktív, Fél életidő: 95oC-on 20 perc (hőstabil) - 5’ → 3’ DNS polimeráz aktivitás DNS templátról (Mg2+ függő) - 5’ → 3’ DNS polimeráz aktivitás RNS templátról (Mn2+ függő) Ugyanaz az enzim használható az RT-hez és a PCR-hez is!

Hátrányai: - Rossz hatásfokú cDNS szintézis - Mn2+ eltávolítása - Mn2+ rontja a PCR érzékenységét

- 5’ → 3’ DNS exonukleáz aktivitás (szálbontó)

Kiegészítő szál szintézis Az RT reakció (cDNS szintézis) eredménye: kettős szálú RNS:DNS hibrid A kiegészítő szál szintézis célja: DNS:DNS kettős szálú molekula Leggyakoribb: PCR (az első ciklusban elkészül a kiegészítő szál) (ha van ismert primer hely a cDNS 3’ végén)

Egyéb módszerek: - SMART ™ cDNS szintézis (Clontech) - ”Self-priming” módszer - Szálcsere módszer

”The Devil is in the details"

RT-PCR első rész

PCR – Áttekintés Lényege: Egy (vagy több) célzott DNS molekula in vitro enzimatikus úton történő felszaporítása! Kulcsenzim: Hőstabil (hipertermofil; > 60oC) DNS polimeráz enzim (pl.: Taq polimeráz)

A nukleinsav polimerizáció (in vitro és in vivo) két fő követelménye:

2. EA

- Templát szál (sablon), amelyről az átírás történik DNS extraktum / cDNS / ”nyers DNS minta” (pl.: Baktérium telep, fág plakk) - Szabad 3’-OH csoport, amelyhez a következő nukleotid foszfodiészter kötéssel kapcsolódhat

PCR-ban: Oligonukleotid primer

PCR alapja: A hőmérséklet ciklikus változtatása: Fűtés-hűtés ciklusok sorozata a DNS disszociációja és az oligonukleotid primerek enzimatikus meghosszabbítása a célpont DNS felsokszorozása érdekében.

A reakció egy PCR készülékben (”thermal cycler”) ciklusosan zajlik: 1. DNS denaturációja (95oC)

2. Primer tapadás (Annealing) a célmolekulára (42-65oC) 3. Primer meghosszabbítása (72oC)

Ez a ciklus 30-35x ismétlődik

PCR – Eredmény Igen kis mennyiségű kiválasztott templát DNS több milliószoros (!) mennyiségben felsokszorozható viszonylag rövid időn belül. Fontos fogalmak - Szenzitivitás: minél kevesebb kiindulási DNS - Szelektivitás: csak a kívánt DNS - Produktivitás (”hozam”): kívánt mennyiségű felszaporítás

Egy optimalizált PCR nagyon szenzitív (akár 1 db DNS molekula) és nagyon produktív (akár 109-1012 db)

Kontamináció – Megelőző lépések I. ”Carryover” (amplikon) kontamináció: Egy előző PCR reakció terméke akaratlanul (kontrollálatlanul) átkerül a következő reakcióba. (Vigyázz, nem konzekvens jelenlét!!!) A reakcióelegy összeállításának bármely pontján Ragályos, ”szétterjed” a laborban (!)

L

1.

2.

-K

+K 3. 4.

Jobb megelőzni, mint megszüntetni

Megelőző lépések - A labor saját eljárás utasításai (Standard Operating Procedure – SOP) - Lehetőleg minél kevesebb lépés - Munkafolyamatok szétválasztása (Labor tervezés) - Egyirányú anyagáramlás - UV megvilágítás alkalmazása

Kontamináció – Megelőző lépések II. - Munkafolyamatok szétválasztása (Labor tervezés) - Lehetőleg külön helyiség (vagy legalább külön asztal) - Külön eszközök (pipetta, hegy, tartók, köpeny...) NINCS CSEREBERE! - Anyagáramlás a legtisztábbtól, nincs visszaút! - Legveszélyesebb: Gélelektroforézis Reagens előkészítő (PCR mastermix) nukleinsav-mentes

Templát (nukleinsav) előkészítő

(!!!) PCR termék vizsgálat (gélelektroforézis)

PCR amplifikáció (PCR készülék)

Kontamináció – Megelőző lépések III.

- Fő veszélyforrás: Aeroszol (pipetta-kontamináció) - Filteres pipettahegyek alkalmazása (legalább a templát bemérésénél) - Mindig csak egy cső nyitva a templát bemérésénél (PCR reamplifikációnál !) - Negatív kontroll - Uracil-N-glikoziláz (UNG) alkalmazása PCR reakcióelegy: dTTP helyett dUTP

Templát inkubálása UNG-vel Az UNG-kezelt templát hozzáadása a reakcióelegyhez

RT-PCR – Áttekintés Két lépéses folyamat: (1) Az RNS molekulák átírása cDNS-re (cDNS szintézis) (2) target-cDNS felszaporítása PCR módszerrel.

cDNS szintézis / Reverz transzkripció: Adott RNS molekula komplementer DNS-re (cDNS) történő in vitro enzimatikus átírása

Szabad 3’-OH függő (Primer-függő) átírás, általában alacsony hőmérsékleten (42-55oC)

RT primerek: specifikus Oligo(dT )

random hexamer

Kétlépéses RT-PCR (Two-tube / Two-step RT-PCR) - Az RT és a PCR térben és időben is elkülönülve, külön csőben.

- Egy cDNS termék több PCR-t is kiszolgálhat RT reakcióelegy összetétele

PCR reakcióelegy összetétele

Nukleáz-mentes deszt. víz

Nukleáz-mentes deszt. víz

Puffer (10x vagy 5x töménységű)

Puffer (10x vagy 5x töménységű)

dNTP oldat

dNTP oldat

Reverz primer

Reverz primer

RNáz Inhibitor (pl.: RNAsin®)

Forward primer

Reverz transzkriptáz enzim

Hőstabil DNS polimeráz enzim (Taq)

+RNS templát

+(c)DNS templát

RT: 42oC

PCR: 55-95oC

Egylépéses RT-PCR (Single-tube / One-step RT-PCR) - Az RT és a PCR csak időben elkülönülve, ugyanabban a csőben. - Főleg diagnosztikai vizsgálatokhoz - Megoldandó probléma: mezofil RT (cDNS szintézis) vs. hipertermofil PCR

Alapja a termostabil polimeráz választása - Tth RNS / DNS polimeráz - ”Hot start” DNS polimerázok: Konvencionális Taq DNS polimeráz, antiTaq antitesttel inaktiválva (RT alatt) RT után hődenaturáció (95oC-10 min), RT inaktiválás és Taq aktiválás

Termostabil (hipertermofil) DNS polimerázok I. Alapvető különbségek:

 hőstabilitás (féléletidő 95oC-on) (Mennyi ciklust bír ki?)  átírási sebesség

(Milyen gyorsan képes dNTP-ket beépíteni?)

 átírási kapacitás

(Mekkora terméket képes átírni?)

 száljavító aktivitás (”proofreading”) 3’

→

5’ exonukleáz aktivitás

Termostabil (hipertermofil) DNS polimerázok II. Alapvető jellemzők:

3’

5’

- Száljavító (+) enzimek (pl.: Pfu, VentR)

5’

3’

- Hőstabilabbak - Hosszabb templátokat képesek átírni (≈ 10.000 bp)

- Nincs T túlnyúlás a lánc 3’ végén (”Tompa vég” / ”Blunt end”) - Lassabb átírás: ≈ 2 min / 1000 bp ELBONTJÁK A SZABAD PRIMEREKET (!) → A templát után jön az enzim (!)

- Száljavító (-) enzimek (pl. Taq, Tth) - Rövidebb templátokat képesek átírni (≈ 5.000 bp) - Van T túlnyúlás a lánc 3’ végén

(”Ragadós vég” / ”Sticky end”)

- Gyorsabb átírás: ≈ 1 min / 1000 bp 3’

T 5’

5’ T

3’

Termostabil (hipertermofil) DNS polimerázok II. Enzim mixek (Enzyme blends): A száljavító (-) enzimek átírási sebességét és a száljavító (+) enzimek átírási kapacitását egyesíti!

(Gyorsan sokat)

A két enzim (Taq + Pfu) együttműködve végzi az amplifikálást A Taq végzi az átírás dandárját A Pfu pedig a hibajavítást

Akár 40.000 bp termékek is amplifikálhatók

A nagyobb ciklusszámú (>35) PCR reakcióknál az utolsó ciklusokban csak a Pfu dolgozik, a Taq kiég!

Enzimválasztás megfontolások

- Rövid termékekhez (<1500 bp): ”Sima” Taq polimeráz Egylépéses RT-PCR is lehet - Közepes termékekhez (1500-4000 bp): Pfu vagy proofreading (+) polimeráz - Hosszú termékekhez (>4000 bp): Long Range Enzim mixek (Taq + Pfu)

Oligonukleotid primerek - A sikeres PCR amplifikáció alapja KÉT jól megtervezett oligonukleotid primer (!) - A polimeráz a primer 3’ végét folytatja templát-függő módon.

Kódoló szál (ekvivalens: mRNS)

Templát szál (ekvivalens:cDNS)

5’ primer Upstream primer Forward primer Sense primer (+) primer Watson

3’ primer Downstream primer Reverse primer Antisense primer (-) primer Crick

Oligonukleotid primerek – nukleotid sorrend

Tapadási hely

Kódoló szál mRNS

Forward

Tapadási hely

Reverz

Forward primer nukleotid sorrendje: Megegyezik a kódoló szálon (mRNS-en) lévő tapadási hely szekvenciájával. Reverz primer nukleotid sorrendje: A kódoló szál (mRNS) tapadási helyének komplementere fordított irányban.

Oligonukleotid primerek tervezése – Alapszabályok I.

 Méret: 19-24 nukleotid (méret ↑ akkor specificitás ↑)  3’ vég bázispárosodása elengedhetetlen (legalább az első 6-8 nt)  5’ vég permisszív, ”túlnyúló” szekvenciát is tartalmazhat (pl.: Adapter)  Magas GC tartalom kerülendő (40-55% ideális)

 GC eloszlás egységes legyen  Kerülendő az ismétlődés (pl.: CGT CGT CGT CGT)  Max két darab G vagy C legyen a 3’ vég utolsó 6 bázisán

Oligonukleotid primerek tervezése – Alapszabályok II.  Intramolekuláris hibridizáció Nem specifikus ”leverődés” Hozamcsökkenés (akár jelentős)  Intermolekuláris kapcsolat (3’ – 3’ végek között) Primer-dimerek, hozamcsökkenés

Specifikus termék

100 bp

Aspecifikus termék (primer-dimer)

Olvadáspont (Tm) Az a hőmérséklet ahol a reakcióközegben lévő egyazon oligonukleotidok fele hibridizálva van a célpont DNS-hez, a másik fele szabadon van  Függ a primer hosszától és a bázisösszetételétől (hossz ↑ akkor Tm ↑; GC tartalom ↑ akkor Tm ↑)  Valamint a puffer mono- és divalens kation mennyiségétől (Na+ ↑ és Mg2+ ↑, akkor Tm ↑) Tm kiszámítása (hozzávetőleges)

ATG TGC ACA 2+2+4 +2+4+4 +2+4+2 = 26oC

Tm = 2ox(A+T)+ 4ox(G+C) Csak 11-28 nt hosszúságú primereknél Max 68oC-os számított értékig alkalmazható Nem veszi figyelembe a szabad Mg2+ koncentrációt (!) 5’ túlnyúlást (pl. adaptert) tartalmazó primereknél a primernek csak a hibridizáló része vesz részt a Tm számításban (!)

Az olvadáspont és az annealing (TA ) viszonya Az alkalmazott primerek Tm értéke határozza meg a PCR reakció TA hőmérsékletét.

TA = Tm - 5oC

Tm hatása a PCR reakció kimenetelére PCR reakciók esetében fontos, hogy lehetőleg azonos vagy közel azonos Tm-el rendelkező primereket használjunk.

Ha különbözik a két primer Tm-je, akkor alacsonyabb Tm-es primer alapján határozzuk meg az annealing hőmérsékletet.

”Degenerált” oligonukleotid primerek I.

Kevert bázisok kódszótára

Primer mixek (!), ahol az egyes primerek szekvenciái közel azonosak, adott pozícióban viszont különböző, meghatározott bázisok lehetnek. 6. 12. 5’ CCT CCY GCA ATW 3’

5’ CCT CCC GCA ATA 3’ 5’ CCT CCT GCA ATA 3’ 5’ CCT CCC GCA ATT 3’ 5’ CCT CCT GCA ATT 3’

25% 25% 25% 25%

Hasznosak, ahol  Nem ismert a modellorganizmus cél-nukleinsav szekvenciája  Rokon célmolekulákat együtt szeretnénk amplifikálni (pl.: duplikált gének mRNS-ei, Single nucleotide polymorphism - SNP)

”Degenerált” oligonukleotid primerek II.

A primer(-mix) degeneráltsági fokát növelve a primer(-mix) szelektivitása csökken (!) Max. 4-5 degenerált pozíció legyen.

Degeneráltsági fok csökkentése: Inozin: Mind a négy bázissal képes kapcsolódni.  Ne legyen a primer 3’ végén (!)  Egyes enzimeknél (Pfu) ne használd (!) 6. 12. 5’ CCT CCY GCA ATI 3’ 5’ CCT CCC GCA ATI 3’ 5’ CCT CCT GCA ATI 3’

”The Devil is in the details"

RT-PCR második rész

Oligonukleotid primer tervezése I. - Ismert szekvenciára (a modellorganizmus cél-mRNS szekvenciája ismert) - Ismert rokon szekvenciára, (lehetőleg közeli) rokon modellorganizmus - A cél mRNS által kódolt ismert aminosav szekvenciára – ”Backward seqencing” pl. rövid neuropeptid-szekvenciák, shotgun-sequencing

Oligonukleotid primer tervezése I. Ismert szekvenciára (a modellorganizmus cél-mRNS szekvenciája ismert) Teljesen szekvencia-specifikus, optimális primerek tervezhetőek ”full match primer pairs” Érdemes online primer tervező programok használata pl:Primer Blast

Oligonukleotid primer tervezése II. Ismert rokon szekvenciára, (lehetőleg közeli) rokon modellorganizmus A vizsgált organizmus célpont mRNS szekvenciája nem ismert,

DE rokon modellállatok célpont mRNS szekvenciái igen. 1. célpont mRNS szekvenciák legyűjtése GenBank adatbázisból 2. A szekvenciák illesztése (pl.: ClustalW / Omega...)

3. Konzervatív régiók azonosítása

(általában degenerált primer lesz) Transferrin mRNS

Oligonukleotid primer tervezése III. - A cél mRNS által kódolt ismert aminosav szekvenciára – ”Backward seqencing” - Cél: A rendelkezésünkre álló peptidet kódoló mRNS(ek) ”kifogása” RT-PCR-el. Törekedjünk egy triplet-es (Met, Trp) aminosavakban gazdag régiót találni Kodon preferencia táblázat alapján szelektálhatóak a preferált triplet-ek

6x triplet-es aminosavak (pl.: Leu, Arg) kerülendők

Primerek feloldása Rendelt primer liofilizálva érkezik

Feloldás (NFW-ben, SOP alapján): - tömeg alapján (µg) - molekula mennyiség alapján (mol)

1. Törzsoldat készítése (100µM vagy 1 µg/µl) 2. Munkahígítás készítése (20µM vagy 0,1 µg/µl)

5’ RACE Lényege: a tisztított cDNS 3’ végére poliA-szakaszt szintetizálok Kulcsenzim: Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) szabad 3’ OH végekre dNTP-ket épít be, templát-független módon. Ha csak dATP van a jelen akkor poliA szakaszt szintetizál A kapott poliA-szakasz primer tapadási helyül szolgál, hasonlóan a 3’ RACE-hez.

Több lépéses folyamat 3db. (!) szekv.spec. REVERZ primer és a 3’ RACE-ben használt

horgonyzott Oligo (dT)-AD + ”sima” AD

5’ RACE hatásfoka Függ: RT reakció hatásfoka → célpont mRNS : mennyisége, strukturáltsága, tisztasága RT enzim RNÁzH +/-? ”célpont-RNS”

Hatásfok növelés érdekében: - RNS integritás védelem - poliA-szelekció (OPCIONÁLIS) - Magas Tm RT-primer tervezése

Adapter-ligált 5’ RACE Lényege: a tisztított cDNS 3’ végére egy ismert szekvenciájú primert (Adapter) ligálok. Kulcsenzim: T4 RNS ligáz Szabad 3’ OH végeket 5’ monofoszfát-végekkel köt össze, ATP (!) jelenlétében, templát-független módon.

A ligált oligonukleotid (ADAPTER) a cDNS 3’ végén később primer-tapadási helyül szolgál.

Több lépéses folyamat 2db. (!) szekv.spec. REVERZ primer (R4 és R5) 5’ monoP – ADAPTER – 3’ blokk

Adapter reverz komplementere (!) ADAPTER 5’ CTA GTG GCA ACT TCG GTC ACA CGT 3’ 5’ ACG TGT GAC CGA AGT TGC CAC TAG 3’ ADAPTER reverz komplementere

Long Range PCR Enzim: Általában enzim-mix (Taq + Pfu, Bővebben lásd 6. EA anyaga) dNTP:

”ultratisztított” dNTP-k, emelt végkoncentrációban (300-500 µM)

Mg 2+ koncentráció: Optimalizáció szükséges (1,5-2,5 mM) Templát: Lehető legtisztább, legintaktabb DNS (cDNS) Reakció kondíciók: Hot start PCR Elongáció: 68oC, 1min/kb (Tovább életképes az enzim) Primerek: Általában két primer-pár (Külső és belső primer-pár)

NESTED PCR

Primer Tm > 65oC, Tm különbség max 1-2 oC Szekvencia specifikus ”full-match primerek” minimum 27-36 nt

Long Range PCR Gélelektroforézis Termék méret függő gél-sűrűség és futtatási feszültség Futtatási feszültség alapja az elektródák távolsága (cm) Nagyobb méretű (>7 kb) termékeknél hűtés ajánlott VIGYÁZZ: 0,7%-os gél könnyen szakad (!)

Hot start PCR Megoldás: Hot start enzimek alkalmazása (anti-Taq antitesttel blokkolt Taq, lásd 6. EA) A reakciócsövet visszatartod amíg a blokk el nem éri a 94oC-ot A reakcióelegy egyik komponensét (pl. dNTP) csak 94oC-os reakcióelegyhez adod A reakcióelegy komponenseit hőre lágyuló inert viasz (Pl.: AmpliWax®) választja el.