PENENTUAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN ISOLAT RNV-1 HASIL ISOLASI DARI BATANG TANAMAN BINAHONG (Anredera cordifolia)
(Tesis)
Oleh
Ratu Dwi Gustia Rasyidi
PROGRAM PASCASARJANA JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2016
ABSTRACT
DETERMINATION OF ANTIOXIDANTS ACTIVITY ISOLATE RNV-1 OF ISOLATION OF STEM PLANT BINAHONG (Anredera cordifolia)
Oleh Ratu Dwi Gustia Rasyidi \
In this study has been conducted isolation and determination of antioxidant activity of methanol extract of the stem binahong (Anredera cordifolia). The isolation process includes stages of maceration, analysis HPLC and analysis MPLC by using eluent methanol : water (7: 3). The MPLC Results produce 19 fractions where the peak of compounds contained in fractions 4,5 and 6. The isolated Compounds a amorf crystal from fraction 5 as much as 10 mg. The structural determination is done by UV-Vis spectrophotometry with the addition of NaOH sliding reagent. The results of analysis of compounds to identify a class of flavonoids that have the skeleton of the flavon. The antioxidant activity test with cyclic voltammetry method that RNV-1 isolates produced antioxidant activity coefficient greater than the positive control ascorbic acid that is equal to 0.055 (RNV-1 crystal isolates) and 0.052 (ascorbic acid). Keywords: Anredera cordifolia, flavonoids, antioxidants, cyclic voltammetry
ABSTRAK
PENENTUAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN ISOLAT RNV-1 HASIL ISOLASI DARI BATANG TANAMAN BINAHONG (Anredera cordifolia)
Oleh Ratu Dwi Gustia Rasyidi
Dalam penelitian ini telah dilakukan isolasi dan uji aktivitas antioksidan ekstrak metanol dari batang binahong (Anredera cordifolia). Proses isolasi meliputi tahapan maserasi, analisis HPLC dan analisis MPLC dengan menggunakan eluen metanol : air (7:3). Hasil MPLC menghasilkan 19 fraksi dimana puncak senyawa terdapat pada fraksi 4,5 dan 6. Senyawa hasil isolasi merupakan suatu kristal amorf dari fraksi 5 sebanyak 10 mg. Penentuan struktur senyawa dilakukan dengan spektrofotometri UV-Vis dengan penambahan pereaksi geser NaOH. Hasil analisis senyawa mengidentifikasi suatu golongan flavonoid yang memiliki kerangka senyawa flavon. Pada uji aktivitas antioksidan dengan metode voltammetri siklik bahwa isolat RNV-1 menghasilkan nilai koefisien aktivitas antioksidan (slope) lebih besar dibandingkan dengan kontrol positif asam askorbat yaitu sebesar 0,055 (isolat RNV-1) dan 0,052 (asam askorbat).
Kata kunci : Anredera cordifolia, Flavonoid, Antioksidan, Voltammetry siklik
PENENTUAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN ISOLAT RNV-1 HASIL ISOLASI DARI BATANG TANAMAN BINAHONG (Anredera cordifolia)
Oleh
Ratu Dwi Gustia Rasyidi Tesis Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar MAGISTER SAINS Pada Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
PROGRAM PASCASARJANA JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2016
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bandar Lampung pada tanggal 1 Agustus 1989, sebagai anak kedua dari tiga bersaudara, pasangan bapak Drs. Dedi Fathoni dan Ibu Yusmanida. Penulis telah meyelesaikan mulai Pendidikan Taman Kanak-Kanak (TK) Jaga Baya II diselesaikan pada tahun 1995. Selanjutnya Pendidikan formal dimulai dengan memasuki jenjang pendidikan Sekolah Dasar (SD) di SDN 3 Perumnas Waykandis, diselesaikan pada tahun 2001. Sekolah Menengah Pertama (SMP) di SMP Negeri 19 Bandar Lampung diselesaikan pada tahun 2004, dan menyelesaikan Sekolah Menengah Atas (SMA) di SMA Negeri 15Bandar Lampung, pada tahun 2007.
Tahun 2007, penulis terdaftar sebagai mahasiswa Jurusan Pendidikan Kimia, Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan (FKIP) Universitas Lampung, melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB). Penulis mendapatkan gelar sarjana di tahun 2012 dan melanjutkan bekerja di SMAN 12 Bandar Lampung.
Persembahan Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya, sholawat serta salam kepada suri tauladan Nabi Muhammad SAW. Teristimewa untuk kedua orang tua ku tercinta Terimakasih atas kasih sayang nya. Terima kasih juga atas semua perjuangan dan pengorbanan kalian dalam membesarkan ku dan mendidikku dalam mencapai kesuksesan. Aku bangga menjadi buah hati kalian. Abang ku tersayang Tubagus Yudi Rasyidi , Teteh Silvi Noviani, Adikku Ratu Ismaya Rasyidi dan Keponakan Ku Ratu Khumaira Rasyidi Terimakasih atas keceriaan dan kebersamaan yang kalian berikan selama ini. Teman-Teman ku seperjuanagn di Magister Kimia Terima kasih atas motivasi, semangat, do’a serta bantuan yang selalu kalian berikan dalam menyelesaikan study. Sahabat-sahabat ku yang selalu memberikan dukungan dan keceriaan. Seseorang yang selalu ada disamping aku Terimakasih atas motivasi dan kasih sayang nya. Almamater Tercinta
“Sikap Anda di masa lalu, menjadikan hari ini dan sikap anda hari ini, menjadikan anda dimasa depan” ( Mario Teguh)
“Hadapilah semua masalah dengan senyuman dan kesabaran hati” ( Ratu dwi Gustia Rasyidi)
SANWACANA
Segala puja danpujisyukurhanyalahmilik Allah SWT, karenaatasrahmat, hidayah, dankehendak-Nyapenulis bisamenyelesaikantesisdenganjudul : “Penentuan Aktivitas Antioksidan Isolat RNV-1 Hasil Isolasi Dari Batang Tanaman Binahong (Anredera cordifolia)” Shalawat beriring salam selalu tercurah kepada Nabi Muhammad SAW, beserta keluarga, sahabat, dan para pengikutnya hingga akhir zaman nanti.
Bersamaan dengan selesainya tesis ini, penulis mengucapkan terimakasih kepada: 1.
Ibu Dr. Noviany, M. Si., selaku Pembimbing Utama sekaligus Pembimbing Akademik atas kesediaanya untuk memberikan ilmu, bimbingan, kritik dan saran dalam proses penyelesaian tesis ini serta bimbingan dalam penyelesaian studi.
2.
Bapak Andi Setiawan, Ph. D.,selaku pembimbing kedua yang telah memberikan bimbingan, masukandan kritikan dalam proses penyelesaian tesis ini.
3.
Bapak Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono, M. T., selaku pembahas dan sekaligus Ketua Jurusan Kimia Fakultas MIPA Universitas Lampung, yang telah banyak memberi kritikan, masukan, dan saran dalam proses penyelesaian tesis ini.
4.
Bapak Dr. Rudi TM Situmeang, M. Sc. selaku Ketua Program Pascasarjana Kimia, yang selalu memberikan motivasi dan semangat dalam proses penyelesaian tesis ini.
5.
Bapak Prof. Sutopo Hadi, Ph.D.,Selaku Pembantu Dekan 1 yang selalu memberikan motivasi dan semangat selama perkuliahan dan proses penyelesaian tesis ini.
6.
Bapak Prof. Warsito, S.Si., D.E.A., Ph. D., selaku Dekan Fakultas MIPA Universitas Lampung.
7.
Bapak Prof. Dr. Ir. H. Sugeng P. Harianto, M.S., selaku Rektor Universitas Lampung.
8.
Seluruh staf dosen dan karyawan di Jurusan Kimia Fakultas MIPA Univertas Lampung.
9.
Papa dan mamaku yang tersayang, atas curahan kasih sayang, do’a, dan bimbingan yang tak ternilai harganya.
10. Kakak dan adikku tercinta, kalian adalah inspirasi dan semangat hidupku. 11. Seseorang yang selalu ada baik suka maupun duka. Semoga kita bisa meraih kesuksesan bersama 12. Teman-teman Magister Kimia 14, Mbk Rahma, Mbk Endah, Bu Romi, Bu Iis, Bapake Basuki, Kk Nawan, Mbk Yuli, Hapin, Putri, Mbk Tini, Sinta, yang selalu memberikan motivasi dan keceriaan selama 5 semester ini. 13. Teman-teman kerja di Laboratorium Kimia Organik dan Biomass:Arif, Ningrum, Ismi, Ajeng, Susi, Purna, Miftah, Wagiran dan adik adik Peer
Organik. Terima kasih atas kebersamaan, kerja sama, keceriaan dan bantuannya. 14. Teman-teman magister kimia angkatan 2015 dan 2016. Akhir kata, penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan, akan tetapi sedikit harapan semoga tesis yang sederhana ini dapat berguna dan bermanfaat bagi kita semua. Amiin.
Bandar Lampung, Desember 2016 Penulis
Ratu Dwi Gustia Rasyidi
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR TABEL ........................................................................................ iii DAFTAR GAMBAR...................................................................................... iv I.
PENDAHULUAN A. Latar Belakang ............................................................................... 1 B. Tujuan Penelitian ........................................................................... 3 C. Manfaat Penelitian.......................................................................... 3
II. TINJAUAN PUSTAKA A. Anredera Cardifolia ....................................................................... 4 B. Manfaat Tanaman Binahong .......................................................... 5 C. Kandungan Metabolit Sekunder pada Tanaman Binahong .......................................................................... 6 D. Flavonoid ........................................................................................ 7 E. Antioksidan..................................................................................... 10 F. Voltammetri .................................................................................... 12 G. Voltammetri Siklik.......................................................................... 15 H. Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder .............................................. 18 1. Ekstraksi...................................................................................... 18 1.1. Maserasi ............................................................................... 18 1.2. Sokletasi............................................................................... 19 1.3. Partisi ................................................................................... 19 2. Metode Pemisahan dan Pemurnian............................................. 19 2.1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ......................................... 19 2.2. Kromatografi Kolom (KK) .................................................. 23 2.3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC).......... 24 2.4. Medium Pressure Liquid Chromatography (MPLC) .......... 25 I. Spektrofotometri Ultraviolet (UV) .................................................. 26 III. METODOLOGI PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................ 29 B. Alat dan Bahan ............................................................................... 29 1. Alat – alat yang digunakan ......................................................... 29 2. Bahan – bahan yang digunakan .................................................. 30
ii
C. Prosedur Penelitian ......................................................................... 30 1. Persiapan Sampel ........................................................................ 30 2. Isolasi dan Ekstraksi ................................................................... 31 3. Pemisahan dan Pemurnian .......................................................... 31 4. Spektrofotometer UV_VIS ......................................................... 32 5. Uji Antioksidan........................................................................... 32 5.1. Pembuatan Larutan Blangko................................................ 32 5.2. Pembuatan Larutan Standar Asam Askorbat Murni ............ 32 5.2.1. Pembuatan Stok Larutan Standar ............................ 32 5.2.2. Pembuatan Larutan Kerja Standar ........................... 33 5.3. Pengukuran Aktivitas Antioksidan ...................................... 33 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Ekstraksi .......................................................................................... 35 B. Pemisahan dan Pemurnian............................................................... 36 C. Analisis Spektroskopi ...................................................................... 41 1. Analisis Spektroskopi UV-Vis.................................................... 41 D. Uji Antioksidan Menggunakan Metode Voltammetri Siklik.......................................................................... 45 1. Voltammogram Oksidasi Molekul.............................................. 46 2. Voltammogram Reduksi Oksigen............................................... 51 3. Penentuan Koefisien Aktivitas Antioksidan ............................... 54 V. SIMPULAN DAN SARAN A. Simpulan.......................................................................................... 57 B. Saran.... ........................................................................................... 57 DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN 1. Diagram alir penelitian........................................................ 65 2. Kromatogram fraksi 4, 5 dan 6............................................ 67 3. Perhitungan pembuatan larutan ........................................... 69 4. Penentuan koefisien aktivitas antioksidan........................... 71
DAFTAR TABEL
Tabel
Halaman
1.
Reaksi warna beberapa golongan flavonoid ............................................. 22
2.
Rentang serapan spektrum UV-Vis untuk flavonoid ................................ 28
3.
Kondisi pengukuran 1 (reaksi oksidasi asam askorbat Dan kondisi pengukuran 2 (reaksi reduksi oksigen)................................. 34
4.
Data spektrum dan pergeseran yang terjadi setelah diberi Pereaksi kimia pada senyawa-senyawa RNV-1........................................ 44
5.
Data arus oksidasi fraksi hasil MPLC....................................................... 48
6.
Data arus oksidasi asam askorbat ............................................................. 49
7.
Data arus oksidasi isolat RNV-1............................................................... 51
8.
Data arus reduksi oksigen isolat RNV-1................................................... 51
9.
Data arus reduksi oksigen asam askorbat ................................................. 53
10. Koefisien aktivitas antioksidan ................................................................. 56
DAFTAR GAMBAR
Gambar
Halaman
1.
Tanaman Anredera cordifolia.................................................................. 5
2.
Tiga jenis kerangka dasar flavonoid ......................................................... 7
3.
Kerangka dasar flavon .............................................................................. 8
4.
Jenis senyawa flavonoid pada daun Basella rubra Linn .......................... 9
5.
Mekanisme reaksi oksidasi radikal peroksil dengan 3’,4’ Dihidrosiflavon ......................................................................................... 11
6.
Reaksi penghambatan antioksidan primer terhadap radikal bebas ........... 12
7.
Sel Voltammetri ........................................................................................ 14
8.
Voltammogram siklik reaksi reduksi-oksidasi......................................... 16
9.
Voltammogram senyawa flavon; (1) Voltammetri diferensial pulsa,(2) Voltammetri siklik, (3) Voltammetri siklik dengan elektrolit pendukung ..................................................................... 16
10. Voltammogram senyawa flavon; (1) Voltammetri diferensial pulsa,(2) Voltammetri siklik, (3) Voltammetri siklik dengan elektrolit pendukung................................................................................................. 17 11. Kromatografi Lapis Tipis.......................................................................... 21 12. Kromatografi Kolom Gravitasi (KKG)..................................................... 24 13. Hasil KLT Ekstrak kasar Etil Asetat (a); Ekstrak Heksana (b); Ekstrak kasar Metanol (c) dengan eluen Etil Asetat : Heksana (3:7) ....... 36 14. Kolom C18 (a), Hasil ekstrak yang terbebas dari klorofil (b) .................. 37 15. Hasil KLT ekstrak kasar metanol menggunakan eluen metanol 100%.................................................................................. 37
16. Kromatogram hasil HPLC ekstrak kasar binahong .................................. 38 17. Hasil KLT ekstrak kasar binahong............................................................ 38 18. Kromatogram MPLC gradien MeOH : H2O ............................................. 39 19. KLT Fraksi 5 dengan eluen metanol 100% visualisasi CeSO4 (a) Hasil kristal fraksi 5 (b) ............................................................................ 40 20. Kromatogram HPLC kristal fraksi 5......................................................... 41 21. Spektrum UV senyawa RNV-1 dalam metanol ........................................ 42 22. Spektrum UV senyawa RNV-1 dalam metanol+NaOH ........................... 43 23. Reaksi antara Flavon dengan NaOH......................................................... 44 24. Voltammogram oksidasi molekul ekstrak kasar binahong ....................... 47 25. Voltammogram hasil MPLC..................................................................... 48 26. Voltammogram oksidasi molekul asam askorbat dengan Konsentrasi 4 ppm, 8 ppm dan 12 ppm ................................................... 49 27. Oksidasi asam askorbat menjadi dehidroaskobat...................................... 50 28. Voltammogram oksidasi isolat RNV-1 dengan Konsentrasi 4 ppm, 8 ppm dan 12 ppm ................................................... 50 29. Voltammogram reduksi oksigen isolat RNV-1 konsentrasi 4 ppm, 8 ppm dan 12 ppm........................................................................ 51 30. Voltammogram reduksi oksigen asam askorbat konsentrasi 4 ppm, 8 ppm dan 12 ppm........................................................................ 52 31. Kurva perubahan relatif densitas arus reduksi oksigen Terhadap konsentrasi antioksidan RNV-1 ................................................ 54 32. Kurva perubahan relatif densitas arus reduksi oksigen Terhadap konsentrasi antioksidan asam askorbat ..................................... 55
I.
A.
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia merupakan salah satu negara yang kaya keanekaragaman hayati. Diperkirakan sekitar 30.000 spesies tumbuhan ditemukan di dalam hutan hujan tropika, dan sekitar 1260 spesies di antaranya diketahui berkhasiat sebagai obat. Namun, baru sekitar 180 spesies yang telah digunakan untuk berbagai keperluan industri obat dan jamu (Dalimarta, 2005).
Beberapa senyawa kimia yang ada dalam berbagai tumbuhan telah banyak diidentifikasi oleh para peneliti dan beberapa di antaranya memiliki uji bioaktivitas yang positif. Senyawa-senyawa kimia yang diteliti umumnya merupakan golongan alkaloid, flavonoid, tanin, terpenoid dan steroid. Salah satu tanaman obat yang banyak tumbuh di Indonesia dan akhir-akhir ini banyak dimanfaatkan adalah tanaman binahong (Anredera cordifolia). Binahong digunakan oleh masyarakat untuk menyembuhkan luka bakar, batuk, penambah darah, radang usus, mempelancar peredaran dan tekanan darah, sembelit, sesak napas, sariawan berat, sakit perut, menyuburkan kandungan, maag, asam urat, keputihan, pembengkakan hati, meningkatkan vitalitas dan daya tahan tubuh (Manoi, 2009).
2
Skrining fitokimia mengenai kandungan metabolit sekunder pada tanaman binahong telah dilakukan oleh beberapa peneliti sejak dekade terakhir. Rochmahwati (2008) telah melakukan uji pendahuluan pada daun binahong menggunakan ekstrak n-heksana dan metanol. Dari hasil penelitiannya dilaporkan bahwa ekstrak daun binahong menunjukan adanya kandungan saponin, triterpenoid, flavonoid, fenolik serta minyak atsiri. Sementara itu, menurut Yuliastuti (2011), ekstrak etil asetat dari batang binahong mengandung polifenol, flavonoid, dan saponin. Kajian fitokimia lain dari ekstrak etanol 70% daun binahong juga mengindikasikan kandungan metabolit yang sama dengan tambahan adanya tanin dan alkaloid (Andreani, 2011; Kumalasari, 2011). Barubaru ini uji fitokimia telah dilakukan pada batang tanaman binahong. Hasil uji fitokimia tersebut mengindikasikan adanya senyawa metabolit sekunder golongan flavonoid, fenolik serta saponin (Ratu dkk., 2015).
Kandungan metabolit sekunder yang dihasilkan baik dari daun maupun batang tanaman binahong merupakan jenis-jenis senyawa yang memiliki efek farmakologis yang berguna bagi manusia seperti antioksidan, antiinflamasi serta antibakteri. Dari penelusuran literatur, sejauh ini belum ada penelitian yang intensif dan berkelanjutan mengenai kajian fitofarmakologi khususnya efek antioksidan dari batang tanaman binahong.
Berdasarkan uraian di atas, pada penelitian ini akan dilakukan isolasi senyawa metabolit sekunder dari batang tanaman binahong menggunakan pelarut metanol dan dilanjutkan analisis potensi antioksidannya dengan membandingkan larutan standar asam askorbat murni secara voltammetri. Arus reduksi oksigen yang
3
dihasilkan akan semakin berkurang seiring dengan bertambahnya konsentrasi antioksidan. Perbandingan antara arus reduksi oksigen dengan luas permukaan elektroda yang digunakan akan diperoleh nilai densitas arus reduksi oksigen. Dengan menggunakan hubungan antara densitas arus reduksi oksigen dengan konsentrasi antioksidan maka nilai koefisien aktivitas antioksidan dapat ditentukan.
B.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah 1.
Mengisolasi senyawa metabolit sekunder dari batang tanaman binahong
2.
Menguji aktivitas antioksidan senyawa hasil isolasi dari batang tanaman binahong menggunakan teknik voltammetri siklik
C.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai kandungan senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan dari batang tanaman binahong serta dapat memberikan wawasan atau pengetahuan mengenai sumber antioksidan alami di alam.
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Anredera cordifolia (Binahong)
Anredera cordifolia atau yang lebih dikenal dengan nama binahong adalah tanaman yang termasuk dalam family Basellaceae. Tanaman ini berasal dari dataran Cina
kemudian menyebar ke Asia Tenggara. Sesuai dengan tempat asalnya dataran cina tanaman binahong dikenal dengan nama Dhengshan chi, sedangkan di Inggris
tanaman ini disebut madeira vine. Di Indonesia tanaman binahong ini memilik inama daerah gondola (Sundadan Bali), lembayung (Minangkabau), uci-uci (Jawa), kandula (Mandura) dantatabuwe (Sulut) (Manoi,2009).
Morfologi tanaman binahong adalah sebagai berikut memiliki daun tunggal, bertangkai sangat pendek (subsessile), tersusun berseling, berwarna hijau, bentuk jantung, panjang 5-10 cm, lebar 3-7 cm, helaian daun tipis lemas, ujung runcing, pangkal berlekuk (emerginatus), tepi rata, permukaan licin dan bisa dimakan. Selain itu bunganya majemuk berbentuk tandan, bertangkaipanjang, muncul di ketiak daun, mahkota berwarna krem keputih-putihan berjumlah lima helai tidak berlekatan, panjang helai mahkota 0,5-1 cm, berbau harum. Tanaman binahong diperbanyak secara generatif (biji), namun lebih sering berkembang atau dikembangbiakan secara vegetatif melalui akar rimpangnya (Khunaifi, 2010). Secara lengkap tanaman binahong dapat dilihat pada Gambar 1
5
Gambar 1. Tanaman Anredera cordifolia
Dalamtaksonomi, tanaman binahong ini diklasifikasikan sebagai berikut : Kingdom
: Plantae
Subkingdom : Tracheobionta (berpembuluh) Superdivisio : Spermatophyta (menghasilkanbiji) Divisio
: Magnoliophyta (berbunga)
Kelas
: Magnoliopsida (berkepingdua / dikotil)
Subkelas
: Hamamelidae
Ordo
: Caryophyllales
Familia
: Basellaceae
Genus
: Anredera
Species
: Anredera cordifolia
(Cronquist,1981)
B. Manfaat Tanaman Binahong
Hampir semua bagian tanaman binahong diambil untuk berbagai keperluan khususnya dalampengobatan, bagian tanaman yang digunakan dapat berasal dari
6
batang, daun, dan umbi yang menempel pada ketiak daun tanaman binahong. Dari beberapa kajian penelitian yang telah dilakukan tanaman ini menunjukan aktivitas antioksidan tinggi dan antibakteri (Manoi,2009).
Prayudi pada tahun 2009 menyatakan bahwa seluruh bagian tanaman binahong mulai dari akar, umbi, batang, daun dan bunga sangat mujarab untuk obat dalam penyembuhan (terapi herbal). Menurut Manoi (2009) manfaat utama tanaman binahong adalah mempercepat pemulihan kesehatan setelah operasi, setelah melahirkan, khitan, bermacam luka dalam, luka luar dan radang usus, melancarkan, menormalkan peredarandan tekanan darah, mencegah stroke, maag dan asamurat, menambah dan mengembalikan vitalitas daya tahan tubuh, wasir (ambeien), melancarkan buang air, diabetes, sariawan berat, pusing, serta sakit perut.
C. Kandungan metabolit sekunder pada tanaman binahong
Senyawa metabolit sekunder merupakan senyawa pertahanan tumbuhan yang dihasilkan dari jaringan tumbuhan dan dapat bersifat toksik. Beberapa studi mengenai kandungan metabolit sekunder telah dilakukan pada tanaman binahong. Untuk mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder biasanyadilakukandengan uji pendahuluan terlebih dahulu menggunakan pereaksipereaksi yang sesuai seperti pereaksi dengan Meyer. Adapun ekstrak etanol 70% daun binahong diketahui mengandung polifenol, flavonoid, tanin, saponin, dan alkaloid (Andreani, 2011), sedangkan ekstrak etanol 70% batang binahong mengandung polifenol, flavonoid, dan saponin (Kumalasari, 2011).
7
D. Flavonoid
Flavonoid mempunyai kerangka dasar karbon yang terdiri dari 15 atom karbon. Atom karbon ini membentuk dua cincin benzena dan satu rantai propana dengan susunan C6-C3-C6 . Susunan ini dapat menghasilkan tiga jenis struktur, yaitu flavonoid (1,3-diaril propana) (1) , isoflavonoid (1,2-diaril propana) (2), neoflavonoid (1,1-diaril propana) (3) (Achmad, 1986).
(1)
(2)
(3)
Gambar 2. Tiga jenis kerangka dasar flavonoid
Terdapat orto-hidroksilasipada cincin B dari senyawa flavonoid, gugus hidroksil bebas, ikatan rangkap C2-C3 di cincin C, atau terdapat gugus 3-OH yang merupakan suatu antioksidan dan antiradikal (Bors et al, 1990).
Istilah flavonoid yang diberikan untuk senyawa fenolik ini berasal dari kata flavon, yaitu nama dari salah satu jenis flavonoid yang terbesar jumlahnya dan yang paling umum ditemukan. Flavon (4) mempunyai tingkat oksidasi yang terendah sehingga senyawa ini dianggap sebagai senyawa induk dalam tata namasenyawa-senyawa turunan flavon.
8
(4) Gambar 3. Kerangka dasar flavon (Manitto, 1992)
Flavonoid terdistribusi secara luas dalam tanaman dan memiliki berbagai fungsi. Flavonoid merupakan pigmen yang paling penting untuk menghasilkan warna bunga kuning, merah atau biru dalam pigmentasi kelopak bunga. Senyawa ini juga melindungi tanaman dari serangan mikroba dan serangga. Flavonoid telah disebut sebagai "respon biologis pengubah alami" karena bukti eksperimental kuat melekat pada kemampuan untuk memodifikasi reaksi tubuh terhadap alergen,virus, karsinogen, serta menunjukkan anti-alergi,anti-inflamasi, antimikroba dan anti-kanker (Filippos, 2007).
Nirmala dkk. (2009) menyebutkan bahwa kandungan kimia daun Basella rubra Linnmengandung senyawa flavonoid. Menurut ilmu kemotaksonomi, hubungan kekerabatan yang dekat antara tanaman binahong dengan tanaman Basella rubra Linn yang berfamili Basellaceae memungkinkan memiliki kandungan kimia yang sama. Jenis senyawa flavonoid yang sudah ditemukan dalam daun Basella rubra Linn yaitu kaemferol (5) (Yang dkk., 2008) dan apigenin (6) (Realease, 2007).
9
OH
O
HO
OH
O
(5)
(6)
Gambar 4. Jenis senyawa flavonoid pada daun Basella rubra Linn
Dalam penelitian sebelumnya daun binahong diduga mengandung flavonoid jenis 4’,6,7-trihidroksiauron (7) (Susmayanti, 2011) dan 8-glukopiranosil-4’,5,7trihidroksiflavon (8) dalam ekstrak metanol (Djamil dkk. 2012).
(7)
(8)
Flavonoid merupakan senyawa turunan benzo-Ɣ-piran yang terdapat dibeberapa tumbuhan seperti tanaman binahong (Anredera cordifolia). Berdasarkan literatur bahwa senyawa Flavonoid memiliki sifat menghambat reaksi autoksidasi dan peredaman radikal bebas. Flavonoid memiliki beberapa gugus untuk peredaman reduksi oksigen dan nitrogen (Jovanovic et al, 1994).
10
E. Antioksidan
Antioksidan adalah sifat suatu senyawa yang dapat menghambat reaksi radikal bebas dalam tubuh yang dapat menyebabkan penyakit yang bersifat karsinogenik, kardiovaskuler dan penuaan.Antioksidan diperlukan karena tubuh manusia tidak memiliki sistem pertahanan antioksidan yang berlebihan, sehingga apabila terjadi paparan radikal berlebihan, maka tubuh akan membutuhkan antioksidan eksogen (berasal dari luar) (Rohman dan Riyanto, 2005).
Antioksidan dalam pengertian kimia, merupakan senyawa pemberi elektron. Antioksidan bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepadasenyawa yang bersifat oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut bisa terhambat. Antioksidan menstabilkan radikal bebas dengan melengkapi kekurangan elektron yang dimiliki radikal bebas, dan menghambat terjadinya reaksi berantai dari pembentukan radikal bebas. Secara fisiologis senyawa fenolik mempunyai beberapa aktivitas biologis, seperti antialergi, antiinflamasi, antimikroba, antioksidan, antitrombotik dan kardioprotektif (Aberoumand &Deokule, 2008).
Senyawa antioksidan diantaranya adalah asam fenolik, flavonoid, karoten, vitamin E, tokoferol), vitamin C, asam urat, bilirubin, dan albumin (Gheldof, et.al., 2002). Menurut Moein et al. (2007), senyawa antioksidan alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang dapat berupa golongan flavonoid. Flavonoid berperan sebagai antioksidan dengan cara mendonasikan atom hidrogennya atau melalui kemampuannya mengkelat logam, berada dalam bentuk glukosida (mengandung rantai samping glukosa) atau dalam bentuk bebas yang disebut aglikon (Cuppett et al.,1954). Aktivitas antioksidan senyawa Flavonoid
11
dapat dilihat dari struktur utamanya yang terdapat gugus hidroksi substitusi pada cincin aromatik A dancincin B serta substitusi dari cincin C (Tsimogiannis, 2004).
Reaksi oksidasi dua elektron yang ditunjukan dalam mekanisme reaksi radikal peroksil dengan 3 ', 4' dihidroksiflavon (Uri, N., 1961). Mekanisme reaksi ditunjukan pada Gambar 5 :
+ RO●
+ RO●
Gambar 5. Mekanisme reaksi oksidasi radikal peroksil dengan 3 ', 4'dihidroksiflavon
Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan memiliki dua fungsi. Fungsi utama antioksidan yaitu sebagai pemberi atom hidrogen. Antioksidan disingkat (AH) yang sering juga disebut sebagai antioksidan primer. Senyawa ini dapat memberikan atom hidrogen secara cepat ke radikal lipida (R*, ROO*) atau mengubahnya ke bentuk lebih stabil, sementara turunan radikal antioksidan (A*) tersebut memiliki keadaan lebih stabil dibanding radikal bebas. Fungsi kedua merupakan fungsi sekunder, yaitu memperlambat laju autooksidasi dengan berbagai mekanisme diluar mekanisme pemutusan rantai autooksidasi dengan
12
pengubahan radikal bebas kebentuk lebih stabil dapat dilihat pada Gambar 6(Gordon, 1990) Inisiasi
: R*
Propagasi
: ROOH*
+ AH------------------------ RH + A* + AH---------------------------- ROOH + A*
Gambar 6. Reaksi penghambatan antioksidan primer terhadap radikal bebas (Gordon, 1990) Berdasarkan fungsinya, antioksidan dikelompokkan menjadi tiga golongan, yaitu antioksidan primer, sekunder, dan tersier. Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa radikal bebas baru. Contoh antioksidan ini adalah enzim superoksida dismutase (SOD) yang berfungsi sebagai pelindung hancurnya sel-sel dalam tubuh serta mencegah proses peradangan karena radikal bebas. Antioksidan sekunder berfungsi menangkap senyawa serta mencegah terjadinya reaksi berantai. Contoh antioksidan sekunder adalah vitamin E, vitamin C, dan β-karoten. Antioksidan tersier berfungsi memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang disebabkan radikal bebas. Sebagai contoh adalah metionin sulfoksidan reduktase, enzim yang memperbaiki DNA pada inti sel. Adanya enzim yang dapat memperbaiki DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker (Antholovich, 2002). F. Voltammetri Pengujian anti radikal bebas senyawa bahan alam/sintesis dapat dilakukan secara voltammetri. Analisis voltammetri sangat murah, sensitif serta efektif untuk penentuan aktivitas antioksidan dengan merekam reduksi oksigen elektrokimia pada elektroda film merkuri (atau elektroda gelas karbon) (Korotkovaet al.,2002).
13
Voltammetri adalah metode elektrokimia dengan pengukuran arus sebagai fungsi potensial. Metode voltammetri mengaplikasikan suatu potensial pada sebuah sel elektrokimia dan arus yang mengalir melalui sel diukur sebagai fungsi dari potensial. Plot arus sebagai fungsi potensial disebut voltammogram. Voltammogram menampilkan informasi kualitatif dan kuantitatif tentang spesi yang terlibat pada reaksi oksidasi dan reduksi (Harvey, 2000).
Dalam voltametri, potensial divariasikan secara sistematismenggunakan potensiostat sehingga zat kimia mengalami oksidasi atau reduksi dipermukaan elektroda. Salah satu elektroda pada sel elektrolisis mengalami polarisasi. Metode ini umum digunakan untuk menentukan komposisi dan analisiskuantitatif larutan. Hasil voltamogram identik dengan hasil polarogram, tetapi voltametri tidak menggunakan elektroda tetes merkuri. Oleh karena voltametri tidak dibatasi untuk elektroda Hg, teknik ini bermanfaat untuk analisis reduksi atau oksidasi pada potensial yang lebih positif (Wang, 2000).
Dalam teknik voltammetri, potensial yang diberikan dapat diatur sesuai keperluan. Kelebihan dari teknik ini adalah sensitifitasnya yang tinggi, limit deteksi yang rendah dan memiliki daerah linier yang lebar. Selama proses pengukuran, konsentrasi analit praktis tidak berubah karena hanya sebagian kecil analit yang dielektrolisis. Potensial elektroda kerja diubah selama pengukuran, dan arus yang dihasilkan dialurkan terhadap potsensial yang diberikan pada elekroda kerja. Arus yang diukur pada analisis voltammetri terjadi akibat adanya reaksi redoks pada permukaan elektroda (Burns et al., 1981).
14
Gambar 7. Sel Voltammetri, W: Elektroda kerja, R : Elektroda pembanding, A : Elektroda bantu (Monk, 2001).
Sel voltammetri (Gambar 7) terdiri dari tiga elektroda, yaitu elektroda kerja, elektroda pembanding, dan elektroda bantu. Metode voltammetri secara umum dilakukan
dengan menggunakan dua elektroda. Namun, metode voltammetri modern yang berkembang menggunakan tiga elektroda. Sinyal eksitasi dari potensial diaplikasikan pada elektroda kerja, mengubah potensialnya relatif terhadap potensial tetap dari elektroda rujukan. Arus yang dihasilkan antara elektroda kerja dan pembantu diukur. Elektroda pembantu yang digunakan secara umum adalah kawat platina dan elektroda SCE, serta Ag/AgCl adalah elektroda rujukan yang sering digunakan (Harvey, 2000).
Kelebihan analisis menggunakan metode voltammetri antara lainsensitif danselektif, sederhana dan mudah. Sedangkan kelemahan analisis menggunakan metode voltammetri adalah hanya dapat diterapkan untuk analisis reduksi dan oksidasi pada potensial positif saja.Terdapat beberapa aplikasi voltammetri dimana salah satunya adalah menentukan aktivitas antioksidan dan nilai koefisien antioksidan (Harvey, 2000).
15
G. Voltammetri Siklik
Voltammetri siklikumumnya digunakan dalam teknik elektrokimia, dan berdasarkan pada kelinieran potensial dari kurva. Sehingga perubahan potensial sebagai fungsi linier dari waktu. Tingkat perubahan potensial dengan waktu mengarah pada scan rate.
Kelebihan metoda voltametri siklik dihasilkan dari kemampuannya menyediakan informasi termodinamik dari proses-proses redoks, kinetika reaksi transfer elektron yang heterogen, dan reaksi kimia berpasangan atau proses-proses adsorpsi. Pada teknik aliran arus diantara elektroda yang menarik (potensialnya yang dimonitor dengan nilai pada elektroda pembanding) dan elektroda berlawanan yang diukur dibawah kontrol dari potensiostat (Debnath, 2008).
Voltammetri siklik merupakan teknik voltammetri berdasarkan pengukuran arus selama penyapuan potensial dari potensial awal ke potensial akhir dan kembali lagi ke potensial awal atau disebut juga penyapuan (scanning) dapat dibalik kembali setelah reduksi berlangsung. Dengan demikian arus katodik maupun anodik dapat terukur. Arus katodik adalah arus yang digunakan pada saat penyapuan dari arus yang paling besar menuju arus yang paling kecil dan arus anodik adalah sebaliknya (Khopkar, 2002).
Hasil dari voltammetri siklik ini adalah hubungan antara arus dan potensial disebut voltammogram siklik. Pada kurva voltammogram siklik Gambar 11, memiliki puncak arus katoda Ipa dan puncak arus anoda Ipc.
16
Gambar 8.Voltammogram siklik reaksi reduksi–oksidasi Voltammogram dari voltammetri siklik dan voltammetri diferensialpulsa dalam larutan flavonoid dengan elektroda pembantu Pt, elektrolit pendukung asetonitril disajikan dalam Gambar 9.
Gambar 9. Voltammogram senyawa flavon; (1) Voltammetri diferensial pulsa,(2) Voltammetri siklik, (3) Voltammetri siklik dengan elektrolit pendukung.
17
Gambar 10. Voltammogram senyawa Xanton; (1) Voltammetri diferensial pulsa, (2) Voltammetri siklik, (3) Voltammetri siklik denganelektrolit pendukung.
Voltammogram pada voltammetri siklik dan voltammetri diferensial pulsa senyawa flavon (Gambar 9) menunjukan adanya dua puncak yang merupakan karakteristik reaksi elektrooksidasi senyawa flavon dengan potensial berkisar antara 0.4-0.8 V. Puncak pertama senyawa flavon terjadi pada potensial 0.4 V. Sedangkan untuk senyawa xanton (Gambar 10) menunjukan adanya 3 puncak yang merupakan karakteristik reaksi elektrooksidasi senyawa xanton dengan nilai potensial berkisar antara 0.38-1.35 V. Puncak pertama senyawa xanton terjadi pada potensial 0.38 V (Masek et al, 2011).
Kemampuan senyawa Flavonoid dalam meredam radikal bebas dapat ditentukan dengan koefisien aktivitas antioksidan dari tingkat interaksi senyawa / substrat dengan superoksida radikal anion. Konstanta koefisien aktivitas antioksidan didefinisikan sebagai rasio nilai densitas dengan dan tanpa penambahan substrat untuk radikal bebas.
18
Koefisien aktivitas antioksidan dapat dihitung dengan persamaan berikut (Korotkova et al. 2005).
Keterangan: Δj jor jres Δc
K=
(j
Δj − j )Δc
: perubahan densitas arus reduksi oksigen : densitas arus limit dari reduksi oksigen tanpa antioksidan (blangko) : densitas arus residual tanpa oksigen : perubahan konsentrasi antioksidan
H. Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder
1.
Ekstraksi
Ekstraksi merupakan proses penarikan komponen atau senyawa aktif pada suatu simplisia dengan menggunakan pelarut tertentu. Prinsip ekstraksi didasarkan pada distribusi senyawa yang terlarut (Khopkar,2002). Menurut Steve and Russell (2008) bahwa metode ekstraksi yang umum digunakan maserasi, sokletasi, refluks, dan ekstraksi cair – cair (partisi). Metode ekstraksi yang dilakukan pada penelitian ini merupakan metode ekstraksi maserasi.
1.1. Maserasi Maserasi merupakan metode ekstraksi dengan perendaman sampel menggunakan pelarut organik pada suhu ruang. Metode ekstraksi ini sangat menguntungkan dalam proses isolasi senyawa organik bahan alam karena struktur senyawa dari suatu sampel tidak mudah rusak. Prinsip metode maserasi didasarkan bahwa sampel yang direndam dengan menggunakan pelarut organik akan terjadi pemecahan dinding dan membran sel akibat dari perbedaan tekanan yang terdapat
19
di luar dan di dalam sel sehingga metabolit sekunder yang terkandung di dalam sitoplasma akan terlarut kedalam pelarut organik (Yeon Ju et al., 2014)
1.2. Sokletasi Sokletasi adalah metode penyaringan secara berulang- ulang senyawa bahan alam dengan menggunakan alat soklet. Sokletasi merupakan teknik penyarian dengan pelarut organik menggunakan alat soklet. Pada cara ini pelarut dan sampel ditempatkan secara terpisah.
1.3. Partisi Partisi (ekstraksi cair-cair) merupakan metode pemisahan berdasarkan sifat kelarutan komponen target dan distribusinya di dalam dua pelarut yang saling tidak bercampur. Senyawa yang bersifat polar akan tertarik ke pelarut polar, senyawa semipolar akan tertarik ke pelarut semipolar dan senyawa nonpolar akan tertarik ke pelarut nonpolar (Khopkar, 2002).
Pemisahan senyawa yang bersifat polar, semipolar dan nonpolar dapat dilakukan dengan metode partisi menggunakan corong pisah. Syarat pelarut untuk metode partisi adalah memiliki kepolaran yang sesuai dengan bahan yang diekstrak dan harus terpisah setelah pengocokan (Harvey, 2000).
2. Metode Pemisahan dan Pemurnian
2.1. Kromatografi Lapis Tipis ( KLT ) Kromatografi Lapis Tipis pada plat berlapis yang berukuran lebih besar, biasanya 5x20 cm, 10x20 cm, atau 20x20 cm. Biasanya memerlukan waktu pengembangan 30 menit sampai satu jam. KLT digunakan untuk mengidentifikasi komponen dan
20
mendapatkan eluen yang tepat untuk kromatografi kolom dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Pada hakikatnya KLT melibatkan dua fase yaitu fase diam
atau sifat lapisan, dan fase gerak atau campuran pelarut pengembang. Fasa diam (penyerap) dapat dibagi dua, jenis polar dan non polar. Penyerap polar meliputi berbagai oksida organik seperti silika, alumina, magnesia, magnesia silikat. Penyerap non polar yang biasa digunakan adalah arang. Fasa diam ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisahkan berupa larutan yang ditotolkan berupa bercak atau pita. Setelah plat diletakkan didalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fasa gerak), pemisahan terjadi selama pengembangan. Selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan/dideteksi (Gritter, dkk, 1991).
Pada KLT yang penting diperhatikan dari penyerapnya adalah ukuran partikel dan homogenitasnya. Ukuran partikel yang biasa digunakan adalah 1-25 mikron. Partikel yang butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang memuaskan dan salah satu alasan untuk menaikkan hasil pemisahan adalah menggunakan penyerap yang butirannya halus. Beberapa contoh penyerap yang biasa digunakan untuk pemisahan dalam KLT adalah silika gel, alumina, selulosa, dan pati (Sastrohamidjojo, 1990).
Pada kromatografi lapis tipis, fasa diam (adsorben) yang sering digunakan adalah serbuk silika gel, alumina dan selulosa yang mempunyai ukuran butir sangat kecil, yaitu 0,063-0,125 mm. Fasa diam yang umum digunakan adalah silika gel
21
yang dapat dipakai untuk memisahkan campuran senyawa lipofil maupun campuran senyawa hidrofil (Hostettman et al, 1995). Komponen-komponen senyawa yang dianalisis dapat dipisahkan dan dibedakan berdasar harga Rf (Retention Factor/Faktor retensi). Faktor retensi didefinisikan sebagai perbandingan jarak perjalanan suatu senyawa dengan jarak perjalanan suatu pelarut (eluen) pada suatu waktu yang sama. Jarak perjalanan suatu senyawa Rf = Jarak perjalanan suatu eluen Harga Rf ini bergantung pada beberapa parameter yaitu sistem pelarut, adsorben (ukuran butir, kandungan air, ketebalan), jumlah bahan yang ditotolkan pada plat, dan suhu (Khopkar, 2002). Proses elusi pada kromatografi dapat dilihat pada Gambar 11
Gambar 11. Kromatografi Lapis Tipis Sumber : (Khopkar, 2002) Menurut Damayanti (2001), secara teori senyawa flavanoid akan menghasilkan bercak warna kuning pada hasil penotolan apabila diamati pada sinar tampak dan akan menghasilkan noda kuning yang berfluorens apabila dideteksi menggunakan sinar UV 254 dan bercak warna kuning pada sinar UV 360. Nilai Rf dari senyawa flavonoid yaitu antara 0,2 –0,75 (Mursidi, 1990).
Berikut ini merupakan urutan eluen pada kromatografi berdasarkan tingkat kepolarannya:
22
Air Metanol Asetonitril Etanol n-propanol Aseton Etil asetat Kloroform
kepolaran meningkat
Metilen klorida Benzena Sikloheksana n- heksana Sumber: Gritter dkk. (1991).
Identifikasi senyawa flavonoid dengan KLT dilakukan dengan mengamati warna bercak sebelum dan sesudah di beri Serium sulfat dengan dibandingkan dengan literatur (Tabel 1) (Markham,1998).
Tabel 1. Reaksi warna beberapa golongan flavonoid (Venkataraman, 1962) Jenis Flavonoid
Reaksi warna NaOHSerium sulfat
Khalkon
Jingga merah
Jingga merah
Dihidrokhalkon
Agak kuning
Agak kuning
Auron
Merah-ungu
Merah magenta
Flavanon
Kuning jingga
Jingga
Flavon
Kuning
Kuning jingga
Flavonol
Kuning-jingga
Kuning jingga dengan fluoresensi
Katekin
Kuning
Merah
Isoflavon
Kuning
Kuning
23
2.2. Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom adalah kromatografi serapan yang dilakukan di dalam kolom, merupakan metode kromatografi terbaik untuk pemisahan campuran dalam jumlah besar. Campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita dibagian atas fase diam yang berada pada tabung kaca. Fase gerak dibiarkan mengalir melalui kolom yang disebabkan oleh gaya grafitasi. Pita senyawa yang terlarut bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi-fraksi pada saat keluar dari bawah kolom (Gritter, 1991).
Fase gerak yang digunakan pada kromatografi kolom haruslah sudah ditentukan sebelumnya agar didapatkan pemisahan yang diinginkan. Hal ini disebabkan karena kromatografi kolom memerlukan waktu lama dan bahan yang cukup banyak. Ada tiga pendekatan yang digunakan untuk memecahkan masalah ini yaitu dengan penelusuran pustaka, menerapkan data KLT dan pemakaian elusi landaian
umum
mulai
dari
pelarut
non
polar
sampai
pelarut
polar
(Sastrohamidjojo, 1990).
Menurut Gritter (1985) bahwa berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak, kromatografi kolom dapat dibedakan menjadi 2 tipe, yaitu : a. Kromatografi kolom fasa normal (Normal phase) Pada kromatografi ini, fasa diam yang digunakan bersifat polar sedangkan fasa gerak bersifat non polar, sehingga komponen yang memiliki kepolaran paling rendah akan terelusi lebih dulu.
24
b. Kromatografi kolom fasa terbalik (Reversed phase) Pada kromatografi ini, fasa diam yang digunakan bersifat non polar sedangkan fasa gerak bersifat polar, sehingga komponen yang memiliki kepolaran paling tinggi akan terelusi lebih dulu.
Gambar 12. Kromatografi Kolom Gravitasi (KKG)
2.3.High Peformance Liquid Chromatography (HPLC)
High Peformance Liquid Chromatography(HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak. cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya (Hostettmann et al., 1998; Johnson and Stevenson, 1991).Kelebihan itu antara lain:
mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
mudah melaksanakannya
kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
dapat menghindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
resolusi yang baik
dapat menggunakan bermacam-macam detektor
25
kolom dapat digunakan kembali
mudah melakukan "sample recovery"
Metode analisis sampel yang paling umum digunakan adalah HPLC fasa terbalik (fasa geraklebih polar dari fasa diam), meskipun mekanisme pemisahan HPLC fasa normal (fasa diam lebih polar dari fasa gerak) juga bisa digunakan (Aguilar, 2008).
2.4. Medium Pressure Liquid Chromatography (MPLC)
MPLC merupakan salah satu teknik kromatografi yang umum digunakan dalam isolasi senyawa bahan alam dan uji kemurnian senyawa hasil isolasi. Pada dasarnya MPLC memiliki prinsip yang sama dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), seperti yang terlihat pada Gambar 14, tetapi besarnya tekanan yang digunakan berbeda. MPLC menggunakan tekanan antara 5-20 bar sedangkan KCKT menggunakan tekanan yang lebih tinggi yaitu >20 bar (Claeson et al., 1993).
Morfologi partikel dalam kolom MPLC didesain untuk memiliki kapasitas muatan yang besar serta mampu memisahkan senyawa hingga menghasilkan senyawa dengan kemurnian yang lebih tinggi baik menggunakan metode fasa terbalik atau pun fasa normal. Metode pemisahan sampel yang paling umum digunakan adalah fasa terbalik (fasa gerak lebih polar dari fasa diam), meskipun mekanisme pemisahan fasa normal (fasa diam lebih polar dari fasa gerak) juga bisa digunakan (Aguilar, 2008).
26
I.
Spektrofotometri Ultraviolet (UV)
Spektrofotometri UV adalah pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar ultraviolet yang diabsorbsi oleh sampel.
Sebagai sumber cahaya biasanya
digunakan lampu hidrogen. Panjang gelombang dari sumber cahaya akan dibagi oleh pemisah panjang gelombang seperti prisma atau monokromator. Ketika suatu atom atau molekul menyerap cahaya maka energi tersebut akan menyebabkan elektron terluarnya tereksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi (Dachriyanus, 2004).
Energi keseluruhan dari suatu molekul adalah jumlah energi elektroniknya, energi getar dan energi rotasi.
Energi yang diserap dalam transisi elektronik suatu
molekul dihasilkan dari transisi elektron valensi dalam molekul-molekul tersebut. Transisi ini terdiri dari eksitasi dari suatu elektron suatu orbital yang ditempati ke orbital berikutnya yang berenergi lebih tinggi. Hubungan antara energi yang diserap dalam transisi elektronik dinyatakan dengan: ΔE = h v = hc / λ dimana ΔE = energi yang diserap -27 h = tatapan Planck (6,6 x 10 erg detik) 8 c = kecepatan cahaya (3 x 10 m/s) v = frekuensi (Hz) λ = panjang gelombang
Energi yang diserap bergantung pada perbedaan energi antara tingkat dasar dan tingkat tereksitasi. Semakin kecil perbedaan energi semakin besar panjang gelombang dari serapan. Kelebihan energi dalam tingkat tereksitasi dapat dihasilkan dalam disosiasi atau ionisasi dari molekul-molekul atau mungkin dipancarkan sebagai panas atau cahaya (Silverstein, 1986).
27
Daerah yang paling berguna dari spektrum UV adalah daerah dengan panjang gelombang di atas 200 nm. Transisi berikut menimbulkan absorpsi dalam daerah 100-200 nm yang tak berguna: π→π* untuk ikatan rangkap menyendiri dan σ→σ* untuk ikatan karbon-karbon biasa. Transisi yang berguna (200-400 nm) adalah π→π * untuk senyawa dengan ikatan rangkap berkonjugasi serta beberapa transisi n→σ* dan n→π * (Fessenden dan Fessenden, 1982). Noerdin (1985) memberikan aturan panjang gelombang maksimum untuk mengidentifikasi jenis kromofor dan memperkirakan adanya konjugasi dalam molekul yang tidak diketahui sebagai berikut: a) Jika spektrum senyawa yang diberikan memperlihatkan satu pita serapan dengan intensitas sangat rendah (є= 10-100) di daerah 270-350 nm dan tidak ada pita serapan lain di atas 200 nm, maka senyawa ini diharapkan mengandung kromofor tak terkonjugasi sederhana yang mempunyai elektronelektron-n. Pita lemah terjadi oleh transisi n→π *. b) Jika spektrum memperlihatkan beberapa pita serapan diantaranya terdapat di daerah tampak, maka senyawa itu diharapkan mengandung rantai panjang terkonjugasi dan kemungkinan mempunyai paling tidak 4-5 kromofor terkonjugasi dan gugus-gugus auksokrom (pengecualian beberapa senyawa yang mengandung nitrogen, seperti nitro, azo, senyawa nitroso, alfa-diketon, glioksal dan iodoform).
Struktur senyawa flavonoid terdiri dari dua cincin aromatik dan ikatan terkonjugasi , sehingga dapat menunjukan pita serapan pada spektrum UV dan serapan sinar tampak (Vis). Senyawa flavonoid biasanya memberikan 2 serapan
28
puncak pada pita I panjang gelombang maksimum berada dikisaran 310-580 nm pada cincin B, dan pita II di panjang gelombang maksimum antara 245-295 nm pada cincin A (Pinheiro dan Justino, 2012).
Metode spektroskopi UV –Vis berguna untuk mengetahui sifat dari flavonoid dengan melihat letak dan serapan pita. Rentang mengenai pita serapan maksimum dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Rentang serapan spektrum UV-Vis untuk flavonoid (Markham,1988). Pita II
Pita I
Jenis Flavonoid
250-280
310-350
Flavon
250-280
330-360
Flavonol (3-OH tersubstitusi)
250-280
350-385
Flavonol (3-OH bebas)
245-275
310-330
Isoflavon
275-295
300-390
Flavanon dan dihidroflavon
230-270
340-390
Calkon
230-270
380-430
Auron
270-280
465-560
Antosianidin dan Antosianin
Senyawa flavon dan flavonol dalam metanol memberikan spektrum UV dengan serapan panjang gelombang maksimum pada Pita I 300-380 nm dan pada pita II 240-280 nm. Penambahan basa menyebabkan pergeseran yang khas pada senyawa flavonoid yaitu pergeseran batokromik. NaOH merupakan basa kuat yang dapat mengionisasikan gugs OH pada inti flavonoid. Penambahan NaOH pada senyawa flavon dan flavonol dalam metanol menyebabkan pergeseran batokromik pada pita 1 terjadi pergeseran panjang gelombang berkisar antara 40-65 nm dengan penurunan intensitas disebabkan oleh adanya 3-OH bebas.
III. METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini akan dilakukan pada bulan April- Oktober 2016, bertempat di Laboratorium Kimia Organik Jurusan Kimia dan UPT Laboratorium Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi Universitas Lampung, Universitas Lampung. Analisis
spektroskopi ultraungu-tampak (UV-Vis) akan dilakukan di UPT Laboratorium Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi Universitas Lampung.
B. Alat dan Bahan
1. Alat-alat yang digunakan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas, satu set alat destilasi, satu set alat kromatografi kolom (KK), pengukur titik leleh, lampu UV, plat KLT, vacum rotator evaporator, pipet kapiler, HPLC (Shimadzu/LC-20A Prominence), MPLC (Medium Pressure Liquid Chromatography) (Buchi/Sepacoterm) dengan kolom C18 dan dilengkapi dengan detektor photo diode
array (PDA), satu set alat potensiostat (eDAQ Pty Ltd) yang terdiri dari elektroda kerja glassy carbon, elektroda referensi Ag/AgCl, elektroda bantu platina, dan sel elektrokimia berukuran 2,5 mL, spektrofotometer ultraungu-tampak (UV-Vis), dan spektofotometer resonansi magnetik inti (RMI).
30
2. Bahan-bahan yang digunakan Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah batang Anredera cordifolia yang telah dikeringkan dan dihaluskan, diperoleh dari pekarangan perumahan Kompleks Perumnas Way Kandis Bandar Lampung pada bulan Agustus 2015. Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi dan kromatografi berkualitas teknis yang telah didestilasi sedangkan untuk analisis spektrofotometer berkualitas proanalisis (p.a). Bahan kimia yang dipakai meliputi akuades, etil asetat, metanol, diklorometana, n-heksana, aseton, serium sulfat 1,5% dalam asam sulfat 2N, silika gel Merck G60 KK, silika gel Merck 60 (35-70 Mesh) untuk KKG, untuk KLT digunakan plat KLT silika gel Merck kiesegal 60 F254 0,25 mm, Cosmosil 75C18 - OPN, silika, plat KLT C18, plat KLT silika, alumunium foil. Pereaksi geser untuk analisis spektrofotometer ultraungu-tampak adalah Natrium Hidroksida (NaOH). Untuk uji antioksidan dengan teknik voltammetri digunakan asam askorbat murni (merck KGaA, Darmstadt Germany), aquades, gas nitrogen dan elektrolit pendukung KCl 0,1 M.
C. Prosedur Penelitian
1. Pengumpulan dan persiapan sampel Batang tumbuhan A. cordifolia (3 kg) dibersihkan dari kotoran yang menempel, kemudian dikering-anginkan dan dihaluskan hingga menjadi serbuk.
31
2. Isolasi dan Ekstraksi
Sebanyak 2 Kg serbuk batang A. cordifolia yang telah dihaluskan , dimaserasi dengan pelarut non polar n-heksana terlebih dahulu selama 3x24 jam kemudian dilanjutkan dengan menggunakan pelarut etil asetat selama 3x24 jam dan terakhir maserasi menggunakan pelarut polar metanol selama 24 jam dengan tiga kali pengulangan. Ketiga ekstrak yang diperoleh disaring kemudian dipekatkan dengan menggunakan penguap putar vakum (rotary evaporator).
3. Pemisahan dan Pemurnian Ekstrak pekat metanol yang telah kering ditimbang massanya, lalu difraksinasi dengan menggunakan kromatografi kolom C 18 dengan menggunakan eluen metanol : air ( 7: 3 ) kemudian dilakukan pemisahan antara filtrat dan klorofil. Selanjutnya di KLT menggunakan plat preparatif C 18 untuk melihat pola pemisahan komponen-komponen senyawa yang terdapat dalam filtrat hasil fraksinasi. Filtrat yang didapat, dikeringkan menggunakan rotary evaporator. KLT dilakukan sebelum dan sesudah dilakukan fraksinasi menggunakan sistem campuran eluen menggunakan pelarut diklorometana dan metanol. Hasil kromatogram tersebut kemudian disemprot menggunakan larutan serium sulfat untuk menampakkan bercak/noda dari komponen senyawa tersebut. Setiap fraksi yang menghasilkan pola pemisahan dengan Rf (Retention factor) yang sama pada kromatogram (Khopkar, 2002).
Fraksi ekstrak kental yang didapatkan dilarutkan menggunakan metanol kemudian sebanyak 1 ml didentifikasi menggunakan HPLC dengan gradien
32
pelarut metanol : air (7 : 3). Dilanjutkan identifikasi MPLC dengan menginjeksi 1 ml fraksi ekstrak menggunakan kolom C18 dielusi secara gradien dengan eluen MeOH : H2O.
4. Spektrofotometer UV–Vis Sebanyak 0,0001 gr senyawa isolat dilarutkan dalam 10 mL metanol. Larutan ini digunakan sebagai persediaan untuk beberapa kali pengukuran. Pertama, sampel diukur serapan maksimumnya dalam metanol. Selanjutnya dibagi lagi dari larutan persediaan kemudian larutan persediaan ditambah dengan pereaksi Natrium Hidroksida (NaOH). Kemudian larutan diukur serapan maksimumnya.
5. Uji aktivitas antioksidan
5.1
Pembuatan Larutan Blangko
Larutan blangko dibuat dengan mencampurkan 2 mL metanol dan 1 mL elektrolit pendukung KCL 0,1 M. Larutan blangko dibuat duplo yaitu tanpa dan dengan kandungan oksigen. Larutan blangko tanpa oksigen dideaerasi dengan mengalirkan gas nitrogen selama kurang lebih 1 menit. Saat pengukuran, gas nitrogen tetap dialirkan di atas larutan blangko.
5.2
5.2.1
Pembuatan Larutan Standar Asam Askorbat Murni
Pembuatan Stok Larutan Standar
Larutan stok asam askorbat dibuat dengan konsentrasi 20 ppm. Pembuatan larutan stok dilakukan dengan menimbang 0,002 gram asam askorbat (Mr = 176,12)
33
kemudian dilarutkan dengan metanol ke dalam labu ukur 100 mL, diencerkan sampai tanda batas labu ukur.
5.2.2 Pembuatan Larutan Kerja Standar Larutan kerja standar asam askorbat murni dibuat dengan mengencerkan larutan stok asam askorbat 20 ppm. Variasi konsentrasi larutan kerja yang dipakai yaitu (ppm): blangko; 4; 8;12.
5.3 Pengukuran Aktivitas Antioksidan
Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan teknik voltametri siklik. Pengukuran dilakukan menggunakan potensostat-galvanostat dari sel elektrokimia berukuran 2,5 mL dengan elektroda emas sebagai elektrode kerja, platina sebagai elektrode pembantu, dan elektrode Ag/AgCl sebagai elektrode pembanding. Ketiga jenis elektroda tersebut dilakukan polishing sebelum pengukuran voltammetri dilakukan. Elektroda kerja dihubungkan pada kabel berwarna hijau, elektroda acuan dihubungkan pada kabel berwarna kuning, dan elektroda bantu dihubungkan pada kabel berwarna merah. Alat diatur dengan beberapa kondisi pengukuran reduksi oksigen dan oksidasi asam askorbat. Ada dua kondisi pengukuran pada penelitian ini, yaitu kondisi 1 dan kondisi 2. Berikut uraian kondisi 1 dan kondisi 2 yang dapat dilihat pada Tabel 3
.
34
Tabel 3. Kondisi pengukuran 1 (reaksi oksidasi Asam askorbat) dan kondisi pengukuran 2 (reaksi reduksi oksigen) Kondisi 1
Kondisi 2
Mode
: cyclic
Mode
: cyclic
Initial E
: 0 mV
Initial E
: 0 mV
Final E
: 0 mV
Final E
: 0 mV
Rate
: 100 mV/detik
Rate
: 100 mV/detik
Range Arus
: 200 µA
Range Arus
: 200 µA
Upper E
: 1600 mV
Upper E
: 0 mV
Lower E
: 0 mV
Lower E
: - 1300 mV
pada penelitian ini menggunakan Voltammetriessay guide, langkah pertama larutan standar dan larutan sampel yang telah disiapkan, masing–masing dipipet sebanyak 2 mL dan dimasukkan ke dalam wadah pada sel elektrokimia berukuran 2,5 mL kemudian ditambahkan 1 mL elektrolit pendukung KCl 0,1 M. Wadah ditutup rapat kemudian dilakukan pengukuran.
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Berdasarkan pembahasan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka diperoleh simpulan sebagai berikut: 1. Pada penelitian ini telah berhasil diisolasi senyawa flavonoid golongan flavon dan flavonol dari batang binahong (Anredera cordifolia). 2. Senyawa RNV-1 kristal dari fraksi 5 yang didapatkan sebanyak 10 mg memiliki sifat antioksidan yang tinggi dibandingkan fraksi-fraksi lain. 3. Isolat RNV-1 pada penelitian ini memiliki nilai koefisien aktivitas antioksidan lebih besar (0.055) dibandingkan dengan aktivitas antioksidan dari asam askorbat (0.052).
Saran
1. Penelitian terhadap bagian lain tumbuhan binahong serta penggunaan pelarut yang berbeda pada saat maserasi atau partisi diharapkan memperoleh senyawa lain yang memiliki potensi antioksidan. 2. Tingginya potensi aktivitas antioksidan dari ekstrak metanol memerlukan Penelitian lebih lanjut perlu untuk mengetahui struktur senyawa penyusunnya.
DAFTAR PUSTAKA
Aberoumand, A. and S. S. Deokule. 2008. Comparison of Phenolic Compound of Some Edoble Plant of Iran and India. Pakistan J. of Nutrition. 4. 582585.
Adrienko, D. 2008. Cyclic Voltammetry. http://mpip-mainz.mpg.de/~andrienk/ journal_club/cyclic_voltammetry.pdf. diakses tanggal 8 Februari 2013.
Aguilar, M.I.. 2008. Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography. Pp 9-22 In: HPLC of Peptides and Proteins:Methods and Protocols. M.I. Aguilar (ed). Springer-Verlag. New York. Pp 395.
Andreani,Rizky D. 2011.Uji Aktivitas Ekstrak Etanol 70% Daun Binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steen) Terhadap Bakteri Shigella flexneri Dan Skrining Fitokimianya. Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan. Yogyakarta.
Anita.2007. Identifikasi Flavonoia Hasil Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom Vakum Ekstrak Metanol-Air Herba Pegagan Embun (Hydrocotyle Sibthorpiodes Lmk.). Skripsi. Fakultas Farmasi. Universitas Sanata Darma. Yogyakarta. Antolovich, M., P. D. Prenzler., E. Patsalides., S. McDonald., and K. Robards. 2002. Methods for Testing Antioxidant Activity. Analyst. 127: 183–198. Aprianti, I. 2015. Validasi Metode Analisis Aktivitas Antioksidan Pada Fraksi Air Dari Dunaliella sp Dengan Teknik Linear Sweep Voltammetry. Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung. Lampung.
59
Bohm, B.1998. Extraction, Purification and Identification of Flavonoids. Introduction to Flavonoids; Harwood Academic Publishers: Amsterdam The Netherlands. pp. 200-204.
Bors , W., Heller, C., Michel and M. Sara. 1990. Flavonoids as Antioxidants : Determination On Radical Scavenging. Methods enzmol. 1986:343-355.
Claeson, P., P. Tuchinda, and V. Reutrakul. 1993. Some Empirical Aspect Use of Flash Chromatography and Medium Pressure Liquid Chromatography for the Isolation of Biologically Active Compounds from Plants. J.Sci.Soc.Thailand. 19:73-86.
Creswell, J. R., Clifford, O. A., Runquist, M. M., Campbell. 1982. Analisis Spektrum Senyawa Organik. Bandung. ITB.
Cronquist, A.1981. An Intergrated System of Clasification of Flowering Plants. New York: Columbia University Press.
Cuppett, S., M. Schrepf and C. 1954. Natural Antioxidant – Are They Reality. Dalam Foreidoon Shahidi: Natural Antioxidants Chemistry Health Effect and Applications. AOCS Press Champaign Illinois. Hal.3,12-24.
Dalimarta S. 2005. Atlas Tumbuhan Obat Indonesia Jilid 1. Trubus agriwidya. Jakarta. Hal.170, 198, 214.
Debnath, C and Astrid, O. 2008. Metello-Phthalocyanine Modified Carbon Paste Electrodes for Determination of Antimalarial Artemisinin. 12th International Conference on Electroanalysis : s62-s160.
Dachriyanus. (2004). Analisis Struktur Senyawa Organik Secara Spektroskopi. Cetakan I. Padang: Andalas University Press. Hal.39.
Devyana dkk. 2011. Voltammetric Determination of Antimalaria Alkaloid Compound. https://devyanablog.wordpress.com/2011/03/09/hello-world/
Djamil, R., Wahyudi. P.S., Wahono.S., dan Hanafi. 2012. .Antioxidant Activity of Flavonoid From Anredera Cordifolia (Ten) steenis Leaves, Journal of Pharmacy
60
Fessenden, R.J. dan J. S. Fessenden. 1999. Kimia Organik Jilid I. Alih Bahasa Hadyana Pujaatmaka. Penerbit Erlangga. Jakarta. 525 hlm.
Fessenden, R.J. dan J.S. Fessenden.1982. Kimia Organik Jilid 2. Alih bahasa Aloysius Hadyana Pudjaatmaka. Penerbit Erlangga. Jakarta.
Filippos, V. 2007. Flavonoid. Http://www.wikipedia.com/flavonoid/ translate_p.htm /2010/Februari/21/12:32 WIB.
Gheldof N and Engeseth N J. 2002. Antioxidant Capacity of Honeys From Various Floral Sources Based On The Determination of Oxygen Radical Absorbance Capacity And Inhibition of In Vitro Lipoprotein Oxidation In Human Serum Samples. J Agric Food Chem. 50:3050-3055.
Gritter, R.J. J.M. Bobbitt. dan A.E. Schwarting. 1991. Pengantar Kromatografi. Alih Bahasa Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB. Bandung. 266 hlm.
Gordon, M.H.1990. The Mechanism of Antioxidants Action In Vitro. Di dalam: B.J.F. Hudson, editor. Food Antioxidants. London: Elsivier Applied Science. Harborne, J.B. 1984. Metode Fitokimia: Penentuan Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Alih bahasa oleh K. Padmawinata dan I. Soediro. Penerbit ITB. Bandung. 354 hlm. Harvey, D. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York. McGraw-Hill Comp. Hostettman, K., Hostettman, M dan Marston, A. 1995. Cara Kromatografi Preparatif. Alih Bahasa Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB. Bandung. Hal. 1-38 (ICH) International conference on Harmonization. 1995. Validation of Analitical Procedures : Methodology Q2B. www.ich.org/ 12 Januari 2011. Johnson, E. L. dan R.Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Diterjemahkan oleh K.Padmawinata. Penerbit ITB. Bandung. 365 Hal.
61
Jovanovic, S., Steeden S., Mihajlo, T., Marjanovic B, and Michael, G.1994. Flavonoid as Antioxidant. J. Am. Chem. SOC.116 : 4846-4851. Khopkar, S.M. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. Diterjemahkan oleh A.Saptorahardjo. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta. Hal.84-311 Khunaifi, M. 2010. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun Binahong (Anredera Cordifolia) (Ten) Steenis Terhadap Bakteri Staphylococcus Aureus dan pseudomonas Aeroginosa. Skripsi. Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim. Malang : Tidak Diterbitkan Korotkova, E.I., Y. A. Karbanov., and A. V. Shevchuk. 2002. Study of Antioxidant Properties by Voltammetri. Journal of Electronical Chemistry. Korotkova, E.I., O.A.Avramchik., E.V. Plotnikov., A. N. Lukina., Y.A. Karbainov. 2005. Antioxidant And Electrochemical Properties of Calcium And Lithium Ascorbates. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 37:1149–1154.
Kumalasari, Eka. 2011. Uji Aktivitas Antifungi Ekstrak Etanol Batang Binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steen) Terhadap Candida albicansSerta Profil Kromatografi Lapis Tipisnya. Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan. Yogyakarta. Manitto, P. 1992. Biosintesis Produk Alami. Alih Bahasa Koensoemardiyah. IKIP Semarang Press. Semarang. 235 hlm.
Manoi, F. 2009. Binahong (Anredera Cordifolia) (Ten) Steenis Sebagai Obat. Jurnal Warta Penelitian Dan Pengembangan Tanaman Industri. Vol.15, No.1:3.
Markham, K. 1988. Techniques of Flavonoid Identification. Diterjemahkan oleh Kosasih Pandawinata. 15-27,32-53. Penerbit ITB .Bandung.
Mega dkk. 2010. Pengujian Senyawa Santon Sebagai Antimalaria Dengan Metode Voltametri Siklik . Prosiding Skripsi ITS. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Institut Teknologi Sepuluh Nopember.
62
Masek, A., Zaborski, M., Chrzescijanska., E. 2011. Electrooxidation of Flavonoids at Platinum Electode Studied By Cyclic Voltammetry. J.Foodchem. 127(2):699-704.
Moein M.R., Dehghani V.O., Tabibnejad N., Vahidi S. 2007. Reactive Oxygen Species (ROS) Level in Seminal Plasma of Infertile Men and Healthy Donors. Iranian Journal of Reproductive Medicine. 5(2):51-55.
Mursidi, A. 1990. Analisis Metabolit Sekunder. Cetakan I, 171-187. PAO Bioteknologi. Universitas Gadja Mada. Yogyakarta.
Nirmala, W., Budiyanto, E., Ardi, Y.W., Hendry, S.2009. Pemanfaatan Ekstrak Daun Kemangi (Ocinum canum) Sebagai Permen Herbal Pencegah Bau Mulut. Jurusan Pendidikan Kimia. FMIPA UNY Yogyakarta, 55281.Yogyakarta.
Noerdin, 1985. Elusidasi Struktur Senyawa Organik. Bandung : Penerbit Angkasa.
Orozco, M. N., et al. 2010. Antioxidant-Rich Oral Supplement Attenuate The Effects of Oral Iron On In Situ Oxidation Susceptibility of Human Feces. J. Nutr. 140, 1105.
Pinheiro, P.F., Justino, G.C. 2012. Structural Analysis of Flavonoids And Relate Compounds A Review Of Spectroscopic Applications (Clinical Review). University of Lisbon, Portugal. Portugal. p33.
Prior, R.L., Wu X., Schaich, K. 2005. Standardized Method For The Determination Of Antioxidant Capacity And Phenolics In Food And Dietary Supplements. J Agric Food Chem 55:2698 A-J. Rachmawati, S. 2008. Study Makroskopi, Mikroskopi dan Skrining Fitokimia Daun Anredera cordifolia (Ten.) Steenis. Thesis. Airlangga University. Surabaya.
Ratu, D., Arif, N., dan Ayu, S. 2015. Skrining Fitokimia Dan Uji KLT Ekstrak Metanol Beberapa Tumbuhan Yang Berpotensi Sebagai Obat Tradisional Lampung. Prosiding Nasional Satek VI Unila. LPPM Universitas Lampung. Lampung.
63
Realease. 2007. USDA Database For The Flavonoid Content of Selected Foods. Agricultural Research Service. Beltsville. Maryland
Rohman, A. dan Riyanto, S. 2005. Daya Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Kemuning (Murraya paniculata (L) Jack) secara in vitro. Majalah Farmasi Indonesia. 16 (3), 136–140.
Sarker, S.D., Latif, Z. and Gray, A.I. 2006. Method In Biotechnology Natural Product Isolation Second Edition. Humana Press, New Jersey.
Sastrohamidjojo, H. 2002. Kromatografi. Liberty. Yogyakarta. Hlm 35-36. (Poaceae). International Journal of Pharmacy & Life Sciences. 3 (8). Hlm 1909-1916. Silverstein, R.M., F. X. Webster, dan D. J. Kiemle. 2005. Spectrometric Identification of Organic Compounds. John Wiley & Son, Inc. New York. Hlm 316-340.
Singariyan, P., P. Kumar., dan K. K. Mourya. 2012. Identification of Steroid Compound Using Preparative Thin Layer Chromatography, GC-MS And Antimicrobial And Antioxidant Properties of Cenchrus Setigerus Skoog. 2007. Spektroskopi Ultraviolet-Tampak. Http://www.wikipedia.com/ spektroskopi-ultraviolet-visible/translate_p.htm. Diakses tanggal 7 April 2014 pukul 13.35 WIB.
Steve, M.C. and Russell, J.M. 2008. Bioactive Natural Products. 2nd edition. CRC Press.
Sudjadi. 1983. Penentuan Struktur Senyawa Organik. Ghalia Indonesia. Jakarta. 283 hlm. Susmayanti, W. 2011. Isolasi, Identifikasi dan Uji Toksisitas Senyawa Flavonoid Dari Ekstrak Daun Binahong (Anredera cordiforlia (Tenns) Stennis). Skripsi. Fakultas Ilmu Pengetahuan Alam dan Matematika. Universitas Diponegoro.
64
Tsimogiannis, D.I., Oreopoulou, V. 2004. Free-Radical Scavenging and Antioxidant Activity of 5,7,3΄,4΄-hydroxy-Substituted Flavonoids. Innov. Food Sci. Emerg. Technol. 5 : 523-528.
Uri, N. 1961. In Autoxidation and Antioxidants. Lundberg, W. O., Ed. Interscience: London. pp : 133-69. Vankatarman, K. 1962. Methods of Determining The Structure of Flavonoid Compound. In Geissman TA. (ed) 70-75. The Chemistry of Flavonoid Compound.
Wang, S.Y. 2001. Antioxidant Activity and Phenolic Compound In Selected Herbs. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 49:5165-5170 hlm.
Wikanta, T., H.D. Januardan., M. Nursed. 2005. Uji Aktivitas Antioksidan, Toksisitas dan Sitotoksisitas Ekstrak Alga Merah Rhodymenia Palmate. Jurnal Penelitian Perikanan Indonesia. Vol.11(4): 12-25.
Yang, R.Y., Shou Lin., dan George Kuo.2008. Content And Distribution of Flavonoids Among 91 Edible Plant Species, Asia Pac J Clin Nutr 2008;17(S1):275-279s. Yeon-Ju, L., Jeong-Woo, L., Dong-Geun, L., Hyi-Seung, L., Jong, S.K. and Jieun, Y. 2014. Cytotoxic Sesterterpenoids Isolated from the Marine Sponge Scalarispongia sp. J. Molecular Science, 15(11): 20045-20053. Yuliastuti, Definingsih. 2011. Uji Aktivitas Antibakteri Etil Asetat Batang Binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steen) Terhadap Salmonella thypi Dan Skrining Fitokimianya. Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan. Yogyakarta.
