Chem. Listy 93, 120 - 127 (1999)
PEPTIDOVE MAPY
1. Uvod
HANA VAŇKOVA Ustav patologické fyziologie, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova, U nemocnice 5, 128 53 Praha 2 e-mail: hvank@ lfl.cuni.cz Došlo dne 11.XII. 1997
Obsah 1. Úvod 7 Štěpení bílkovin 2.1. Štěpení pomocí enzymů 2.1.1. Trypsin (EC 3.4.21.4) 2.1.2. Staphylococcal proteinasa - strain V8 (EC 3.4.21.19) 2.1.3. a-Chymotrypsin (EC 3.4.21.1) 2.1.4. Thermolysin (EC 3.4.23.4) 2.1.5. Lysin specifická proteinasa z Lycobacter enzymogenes (EC 3.4.?.?.) 2.1.6. Subtilisin (EC 3.4.21.14) 2.1.7. Papain (EC 3.4.22.2) 2.1.8. Pepsin(EC 3.4.23.1) 2.2. Štěpení specifickými chemickými metodami 3. Separace peptidů po hydrolýze 3.1. Elektromigrační metody 3.1.1. Zónová elektroforéza 3.1.2. Zónová elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu (SDS-PAGE) 3.1.3. Kapilární zónová elektroforéza (CZE) 3.2. Chromatografické metody 3.2.1. Chromatografie na měničích iontů 3.2.2. Vysoce účinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi (RP-HPLC) 3.3. Dvojrozměrné metody 4. Detekce peptidů 4.1. Absorbční spektrometrie v ultrafialové oblasti 4.2. Hmotnostní spektrometrie 4.3. Fluorescenční emisní spektrometrie 4.4. Autoradiografie a kapalinová scintilační spektrometrie 4.5. Detekční chemická činidla
Peptidové mapování představuje velmi účinnou metodu pro analýzu struktury bílkovin. Technika peptidového mapování se skládá z několika kroků. Nejprve je určitá bílkovina specificky štěpena na řadu peptidových fragmentů. Poté jsou tyto fragmenty vhodnou metodou separovány a následuje jejich detekce. Tak vznikne peptidová mapa, která je pro danou bílkovinu charakteristická (tzv. fingerprint). První peptidové mapy stanovil Ingram1, již v roce 1956. Jednalo se o tryptické štěpy hemoglobinu separované chromatografií na tenké vrstvě. V současné době si peptidové mapování získává stále větší oblibu a to hlavně díky nově vyvinutým separačním i detekčním technikám, jenž mají nejen vysoký stupeň rozlišení, ale mohou být snadno automatizovány. Peptidové mapování je velmi citlivá metoda, s jejíž pomocí je možné určit i tak nepatrné změny jako je substituce jediné aminokyseliny v molekule bílkoviny a proto se používá ke studiu struktury bílkovin. Je nutné, aby srovnávané bílkoviny vykazovaly vysokou homologii, tzn. aby obsahovaly určité identické sekvence. Je-li homologie v aminokyselinové sekvenci menší než 80 %, peptidové mapy vykazují velmi malou podobnost a nelze studovat rozdíly v bílkovinné struktuře. Srovnáním map bílkovin, pocházejících z různých živočišných či rostlinných druhů, můžeme určit rozdíly v jejich aminokyselinové sekvenci a struktuře. Získanými údaji můžeme pak vysvětlit nejen rozdíly v biologické funkci těchto bílkovin, ale i danou bílkovinu taxonomicky (evolučně) zařadit. Peptidové mapy slouží i k identifikaci izoenzymů, tj. enzymů, které mají stejnou biologickou funkci, ale různou aktivitu a složení. Izoenzymy se většinou liší stupněm postranslační modifikace (glykosylace, fosforylace, sulfatace apod.), která se při peptidovém mapování projeví. Postranslační fosforylace bílkovin slouží často jako regulační prvek různých biologických pochodů. Její narušení může vést k onemocnění (například nádorová onemocnění vykazují větší množství fosforylovaných bílkovin). Peptidové mapy fosforylované a defosforylované formy bílko-
120
viny se vzájemně liší a mohou být tedy využity k diagnostice některých onemocnění. Další oblastí, kde lze s výhodou použít peptidové mapování je syntéza bílkovin. Peptidové mapy slouží k monitorování kvality a čistoty syntetizovaných bílkovin. Jedná se o velmi citlivý indikátor, neboť i nepatrná změna v aminokyselinovém složení nebo struktuře vede k odlišné peptidové mapě.
je velmi časté, nicméně optimální podmínky štěpení jsou obvykle stanoveny empiricky. Některé bílkoviny jsou rezistentní k proteolýze a je proto velmi obtížné získat dobrou peptidovou mapu. Toto lze většinou odstranit zvýšením poměru proteinasa-substrát. Avšak zvyšující se množství proteinasy vede ke komplikacím (nespecifické štěpení, výměnné interakce mezi disulfidickými můstky, autolýza). Autolýza proteinas je příčinou toho, že výsledná směs obsahuje peptidové fragmenty nejen z analyzované bílkoviny, ale i z použitého enzymu. To vede ke složitějším peptidovým mapám a k jejich zhoršené interpretaci. Tyto problémy lze odstranit nahrazením rozpustných enzymů enzymy imobilizovanýmř . Imobilizované enzymy musí mít dobře přístupné aktivní místo a vykazovat vysokou specifickou aktivitu, neboť je nutné zajistit, aby došlo k úplné hydrolýze analyzované látky.
2. Štěpení bílkovin Prvním krokem při stanovení peptidové mapy určité bílkoviny je její rozštěpení na menší fragmenty. To lze provést buď enzymaticky nebo chemicky2. S rostoucí délkou peptidových fragmentů roste pravděpodobnost jejich překrytí a zvyšuje se obtížnost jejich identifikace. Proto je vhodné štěpit velké molekuly v malém množství bodů, tyto větší fragmenty izolovat a poté provést jejich další štěpení a identifikaci.
Nejčastěji používaným enzymem je trypsin. Jako druhý enzym pro štěpení velkých fragmentů, vzniklých předchozím chemickým či tryptickým štěpením, se nejčastěji používá proteinasa ze Staphylococcus aureus (V8) nebo chymotrypsin.
U bílkovin se známou primární strukturou lze vybrat, na základě četnosti jednotlivých aminokyselin, nejvhodnější metodu štěpení. Například vysoký obsah argininu nebo lysinu je typickým ukazatelem pro použití trypsinu, zatímco nepřítomnost methioninu ukazuje, že použití kyanobromidu je zbytečné. Pro úplné a reprodukovatelné štěpení je nutné, aby analyzovaná bílkovina byla nejprve denaturována (např. je nutné přerušit S-S vazby). Denaturace bývá nejčastěji provedena rozpuštěním bílkoviny v denaturujícím roztoku (např. 6 M-HC1, 8 M močovina), popřípadě jejím zahřátím či precipitací. Některé vysoce stabilní bílkoviny je nutno před denaturací vhodně modifikovat (např. karboxymethylací či redukcí). Je potřeba si však uvědomit, že neúplná modifikace bílkoviny vede naopak k ještě větším problémům a to hlavně s rozpustností, neboť reoxidací mohou vznikat nahodilé disulfidické můstky mezi různými částmi řetězce a vytvoří se polymerní struktura. 2.1. Štěpení
2.1.1. Trypsin (EC 3.4.21.4)3-43 Trypsin katalyzuje hydrolýzu peptidových vazeb za lysinem a argininem. Je-li následující zbytek prolin, štěpení neprobíhá (toto omezení nemá obecnou platnost, někdy lze pozorovat velmi pomalé štěpení této vazby). Obecně platí, že vazba obsahující lysin je štěpena rychleji než vazba obsahující arginin. Následuje-li kyselý aminokyselinový zbytek dochází k výraznému snížení rychlosti hydrolýzy, zatímco v případě bazických aminokyselinových zbytků se rychlost naopak zvyšuje. Štěpení určité bílkoviny trypsinem nejčastěji probíhá při teplotě 37 °C pH 8-8,5 a po dobu několika hodin. Příliš dlouhá doba štěpení určité bílkoviny vede k vysoké autolýze trypsinu, kterou lze zpomalit přidáním milimolární koncentrace Ca . Tento enzym si zachovává aktivitu i v roztoku 2 M močoviny. 2.1.2. Staphylococcal proteinasa — strain V8 (EC 3.4.21.19)31'44-52
pomocí enzymů
Bylo popsáno mnoho metod štěpení bílkovin enzymy. Enzymy štěpí polypeptidy a bílkoviny na specifických místech, což zaručuje reprodukovatelnost, a proto je enzymové štěpení rozšířenější než štěpení chemickými činidly. Velikost fragmentů závisí na četnosti specifické aminokyselinové sekvence. Užití proteolytických enzymů pro peptidové mapování
Extracelulární proteinasa ze Staphylococcus aureus (strain V8) štěpí vysoce specificky glutamylové peptidové vazby a za určitých podmínek též aspartylové peptidové vazby. Jestliže se glutamylový zbytek nachází v N-koncovém nebo C-koncovém tripeptidu, rychlost štěpení je velmi nízká. Vazba mezi kyselinou glutamovou a prolinem není štěpena
121
vůbec. Tento enzym je používán v širokém měřítku, neboť je komplementární k trypsinu.
užitečné v případě, že jiné proteinasy neposkytují vhodné fragmenty pro doplnění aminokyselinové sekvence. Podmínky štěpení jsou podobné jako u trypsinu.
2.1.3. a-Chymotrypsin (EC 3 4 21 if'10-12,14'18'36-44-46-53-56
2.1.7. Papain (EC 3A.22.2)34-44
a-Chymotrypsin štěpí peptidy a bílkoviny nakarboxylové straně tryptofanu, tyrosinu, fenylalaninu, leucinu a methioninu. Jestliže je následující zbytek prolin, štěpení nenastává. Je-li v blízkosti přítomen kyselý zbytek, rychlost štěpení významně klesá, zatímco v případě bazických aminokyselinových zbytků je hydrolýza rychlejší. Účinek chymotrypsinu lze jen těžko předpovědět, neboť štěpení je závislé na okolí štěpené vazby. Podmínky štěpení jsou obdobné jako u trypsinu. V případě krátkého štěpení dochází k hydrolýze pouze několika určitých vazeb a tím vznikne směs poměrně dlouhých fragmentů, zatímco štěpení delší než 24 hodin vede ke směsi dostatečně malých peptidů. 2.1.4.
Thermolysin
Papain je také nespecifická proteinasa, ale sekvence v místě štěpení má značně velký vliv na rychlost hydrolýzy. Papain je sulfohydrylová proteinasa, která pro svou aktivitu vyžaduje přítomnost redukujících činidel. Papain je někdy používán k získání vhodných peptidů společně s některou další proteinasou, avšak je nutné použít krátkou dobu štěpení a velmi nízkou koncentraci papainu. 2.1.8. Pepsin(EC 3.4.23.1) Pepsin nejlépe štěpí malé substráty obsahující sekvenci hydrofobních zbytků (nejlépe fenylalaninu). Tento enzym ovšem též hydrolyzuje peptidové vazby za aromatickými aminokyselinovými zbytky a leucinem. Následuje-li prolin není vazba štěpena. Použití pepsinu má dvě zřejmé výhody: enzym je aktivní při nízkém pH. Štěpená bílkovina je zároveň denaturována a výměnné interakce mezi disulfidickými můstky jsou ojedinělé. Jako u chymotrypsinu rychlost a pravděpodobnost hydrolýzy závisí na okolí štěpené vazby.
(EC 3.4.23.4)14-26'40'45
Termostabilní endopeptidasa z Bacillus themoproteolyticus (thermolysin) štěpí na N-konci hydrofobních aminokyselin (leucinu, isoleucinu, methioninu, fenylalaninu, tryptofanu a valinu). O mnoho pomaleji hydrolyzuje alanin, tryptofan a threonin. Je-li následující zbytek prolin, štěpení neprobíhá. Thermolysin nelze doporučit pro počáteční štěpení bílkovin, neboť typická bílkovina obsahuje příliš potencionálních míst štěpení a vznikla by příliš složitá směs velmi malých fragmentů. Thermolysin si zachovává aktivitu i při vyšších teplotách (okolo 60 °C), což je velmi výhodné, neboť při této teplotě dochází současně k denaturaci substrátu. Tento enzym vyžaduje pro svou aktivitu přítomnost Zn 2 + a pro svou termostabilitu přítomnost Ca .
2.2. Štěpení specifickými chemickými metodami36'45'60 Pro některé účely je vhodné, aby byla štěpena pouze jedna nebo dvě peptidové vazby. Této podmínky lze dosáhnout použijeme-li ke štěpení specifických chemických činidel. Nejčastěji používaným chemickým činidlem pro tyto účely je kyanobromid. Ten štěpí v kyselém prostředí methionylové vazby na povrchu molekuly. Methionylové zbytky jsou přeměny na směs C-koncových homoserinů a homoserinových laktonů, přičemž jedna forma může přecházet ve druhou.
2.1.5. Lysin specifická proteinasa z Lysobacter enzymogenes (EC 3.4. ?. ?.)36-57-59 Lysin specifická proteinasa z Lysobacter enzymogenes je endoproteinasa štěpící specificky vazbu na karboxylové straně lysinu. Hydrolýza probíhá za alkalických podmínek. Enzym je aktivní v 5 M močovině a 1 % SDS. Podmínky štěpení jsou obdobné jako u trypsinu.
3. Separace peptidů po hydrolýze Druhým krokem při stanovení peptidové mapy je separace fragmentů, enzymaticky nebo chemicky naštěpené bílkoviny. Mají-li být od sebe jednotlivé peptidy odděleny, musí se lišit alespoň v jedné fyzikální či chemické vlastnosti. Metody používané pro stanovení peptidových map
2.7.6. Subtilisin (EC3.4.21.14)53 Subtilisin je nespecifická proteinasa katalyzující hydrolýzu celé řady peptidových vazeb. Její použití může být
122
lze rozdělit do dvou skupin. První tvoří elektromigrační metody, druhou pak metody chromatografické. 3.1. E l e k t r o m i g r a č n í
SDS polyakrylamidovou elektroforézou a detegovány specifickým barvením. Vyříznuté plátky gelu, obsahující bílkoviny, jsou umístěny do drážek druhého diskontinuálního polyakrylamidového gelu. Studované bílkoviny jsou elektroeluovány z plátků do zaostřujícího gelu, jenž obsahuje proteinasy s vysokou specifickou aktivitou. Zde probíhá štěpení. Peptidové fragmenty jsou pak elektroforeticky separovány v polyakrylovém gelu v přítomnosti SDS. Naštěpené a separované produkty jsou detegovány jako v případě klasické SDS-PAGE. Tato metoda může sloužit jako citlivý indikátor stupně homologie bílkovin 1 8 ' 3 1 ' 4 7 .
metody
Elektromigrační metody jsou založeny na elektroforetickém pohybu ionizovaných částic ve stejnosměrném elektrickém poli. Pohyblivost iontů závisí na velikosti náboje, velikosti a tvaru molekuly, na povaze nosiče, elektrolytu aj. U amfoterních iontů jako jsou bílkoviny a peptidy velikost náboje závisí na pH, vzhledem k tomu, že bílkoviny a peptidy mohou existovat minimálně ve třech nábojových formách.
3.1.3. Kapilární zónová elektroforéza (CZE)
3.1.1. Zónová elektroforéza
Třebaže jsou různé formy elektroforézy v gelech snadné a lehce dostupné, obvykle probíhají několik hodin a je nesnadné je automatizovat a také kvantitativně vyhodnocovat výsledky. Z těchto důvodů je vhodné použít pro separaci kapilární elektroforézu, při které dělení probíhá ve velmi tenkých (průměr 1 až 10 um) kapilárách, které rychle odvádějí teplo, takže mohou být použita elektrická pole s vysokým napětím (100-300 V.cm ). Tím se sníží čas potřebný pro rozdělení vzorku na několik minut. Objem vzorku potřebného pro jeho analýzu se pohybuje maximálně v desítkách nanolitrů. Tato metoda má nejen vysoký stupeň rozlišení, ale může být snadno automatizována. Peptidy jsou zpravidla detegovány UV absorbčním detektorem.
Termín zónová elektroforéza označuje všechny elektromigrační metody, kde se zóny pohybují v nosném elektrolytu různou rychlostí a v závěrečné fázi jsou nosným elektrolytem vzájemně zcela odděleny. Pro účely peptidového mapování se používá zónová elektroforéza na nosičích, nejčastěji na tenké vrstvě silikagelu nebo celulosy . Hlavní nevýhodou všech těchto metod je vysoká pravděpodobnost překrytí zón jednotlivých peptidových fragmentů, proto je v současnosti tato metoda stále častěji nahrazována dvojrozměrnými technikami. Separované peptidy jsou nejčastěji detegovány specifickým barvením (např. ninhydrinem, Commassie Blue). Pro zvýšení citlivosti lze použít fluorescenční či radioaktivní značení.
Příkladem úspěšného použití CZE pro peptidové mapování je separace peptidových fragmentů vzniklých po štěpení lidského růstového hormonu trypsinem . Velmi vhodná je tato metoda i pro rozlišení fosforylované a defosforylované formy určité bílkoviny. Například Cobb a Novotný takto analyzovali tryptické peptidové fragmenty (3-kaseinu . Hynek a spol. pak různé formy pepsinogenů, 55 56 které byly štěpeny a-chymotrypsinem ' . Pro speciální aplikace peptidového mapování se používá vysoce účinná afinitní kapilární elektroforéza. Rush a spol. charakterizo35 vali touto metodou rekombinantní lidský erytropoetin .
3.1.2. Zónová elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomností dodecylsulfátu (SDS-PAGE) Velmi jednoduchá a široce užívaná metoda pro sta7 33 34 36 45 50 52 59 novení peptidových map bílkovin ' ' ' ' ' ' ' . Základem je elektroforéza komplexů denaturovaných peptidů s anionickým detergentem dodecyl sulfátem sodným (SDS). Nábojové rozdíly mezi různými peptidy se navázáním SDS téměř úplně potlačí, komplexy protein-SDS jsou v neutrálním a alkalickém prostředí silně negativně nabité a putují k anodě. Procházejí-li polyakryamidovým gelem o vhodné porozitě, je jejich pohyblivost dána velikostí molekuly. Separované fragmenty jsou nejčastěji detegovány specifickým barvením, fluorescenčním nebo radioaktivním značením. Cleveland popsal modifikovanou verzi této metody . Bílkoviny jsou nejprve odděleny od kontaminujících látek
3 . 2 . Chro mat ograf i cké m e t o d y Základním principem všech chromatografických metod je opakované ustalování rovnováhy rozpuštěné látky mezi dvěma fázemi, z nichž jedna je pohyblivá (mobilní) a druhá zakotvená (stacionární). Pro peptidové mapování se používá kapalinová chromatografie. Tato metoda zahrnuje všechny druhy, kde mobilní fáze je kapalná a stacionární fáze tuhá látka.
123
3.2.1. Chromatografie na měničích iontů
separací. Jako počáteční krok může být použita permeační gelová chromatografie či chromatografie na měničích iontů. V druhém případě je vhodné použít tandemového uspořádání HPLC, kdy peptidy jsou postupně eluovány z měniče iontů přímo na reverzní fázi 1 9 ' 2 0 . Takto uspořádaným experimentem lze dosáhnout velmi vysoké citlivosti.
Chromatografii na měničích iontů můžeme definovat jako vratnou výměnu iontů mezi mobilní a stacionární fází. Ionty, které jsou elektrostaticky vázané ke stacionární fázi se reverzibilně vyměňují s ionty v roztoku. Dělení látek je způsobeno rozdílem ve velikosti náboje. Ionty se stejným nábojem se hromadí na stejném místě a jsou eluovány současně. Peptidové fragmenty jsou detegovány UV detektorem či fluorescenčním detektorem. Dnes je tato metoda stále více nahrazována vysoce účinnou kapalinovou chromatografii na reverzní fázi. Peptidové mapy stanovil touto metodou prvně Benson . Jednalo se o peptidové mapy tryptických štěpů ribonukleasy, lysozymu a hemoglobinu. Později byly takto studovány i další bílkoviny, např. hovězí albumin , a-interferon a bílkoviny obsahující cukerné složky .
3 . 3 . D v o j r o z m ěr n é m e t o d y Dvojrozměrné peptidové mapování je velmi účinná a citlivá metoda, jenž je vhodná i pro složité směsi peptidů (okolo 50). Principem je kombinace dvou na sobě nezávislých metod separace (jak elektromigračních tak chromatografických). Ačkoli lze navrhnout celou řadu experimentálního uspořádání nejznámější je kombinace elektroforézy na tenké vrstvě následované chromatografii v kolmém směm7,8,i0,4l,45,61 T a k t Q b y l y n a p ř í k l a d stanoveny peptidové mapy aktinů z různých tkání 14 . Další často používanou aplikací je dvojrozměrná elektroforéza v experimentálním uspořádání zahrnujícím izoelektrickou fokusaci (IEF) za denaturujících podmínek (močovina, redukující činidla) a následnou polyakrylamidovou elektroforézu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS) 62 . Výsledkem rozdělení peptidů je rovina o souřadnicích pI-Mr (izoelektrický bod-relativní molekulová hmotnost). Lze samozřejmě použít i dvojrozměrnou chromatografii, například na tenké vrstvě polyamidů1'.
3.2.2. Vysoce účinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi (RP-HPLC) Vysoce účinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi (RP-HPLC) se stává v současné době nejrozšířenější metodou používanou k peptidovému mapování. Dělí látky na základě různě silných hydrofobních interakcí s chromatografickým nosičem obsahujícím hydrofobní skupiny. Chromatografie na reverzní fázi používá jako stacionární fázi nepolární kolonu plněnou mikročásticemi modifikovaného silikagelu, ke kterému je vázán alkyl o 8 či 18 uhlících. Jako mobilní fáze se pak používá polární kapalina. Nejčastěji to bývá voda s přídavkem kyseliny triflourooctové. Eluce je pak prováděna například gradientem acetonitrilu. Existuje celá řada faktorů ovlivňujících citlivost a účinnost. Citlivost metody je nejvíce ovlivněna čistotou použité mobilní fáze, nečistoty mohou způsobovat vysoké pozadí absorbance. V porovnání s běžnými chromatografickými metodami je účinnost mnohem vyšší díky použití kolon s vysokými rozlišovacími vlastnostmi (nmol množství analyzované látky) a díky zkrácení času potřebného pro rozdělení (použití vysokého tlaku). Touto metodou lze dosáhnout velmi dobré reprodukovatelnosti ' . Separované peptidy jsou detegovány UV absorbancí, indexem lomu či fluorescencí. Někdy je nutné pro zlepšení detekce provést derivatizaci separovaných peptidů ' 2 4 . V poslední době se stále častěji používá spojení RP-HPLC s hmotnostní spektrometrií.
Dvojrozměrné techniky mají přiměřeně vysokou citlivost. Množství potřebného vzorku je okolo 5 nmol od každého peptidů. Separované peptidy jsou nejčastěji detegovány specifickým barvením (např. ninhydrinem, Commassie Blue). Pro zvýšení citlivosti lze použít fluorescenční či radioaktivní značení.
4. Detekce peptidů Posledním krokem při stanovení peptidových map je detekce separovaných peptidů. Detekce může být provedena pomocí přímého či nepřímého stanovení peptidů. Přímá stanovení jsou založena na měření určité fyzikální vlastnosti analyzovaného peptidů - např. absorbční spektrometrie, hmotnostní spektrometrie, emisní fluorescenční spektroskopie. Při nepřímých metodách jsou měřeny komplexy peptidů s činidly, která jsou přidávána k analyzovanému peptidů pro zvýšení citlivosti. Výběr vhodné detekční metody závisí na použité separační metodě. Pro kapalinovou chromatografii či kapilární elektro-
Pro bílkoviny o molekulové váze vyšší než 30 000 je velmi obtížné získat jednoznačně interpretovatelné peptidové mapy. Tento problém je často řešen dvoustupňovou
124
tomnost fluorescenčního chromoforu - fluoroforu. Peptidy obsahují přirozené vnitřní fluorofory - aromatické zbytky aminokyselin tryptofanu, tyrosinu a fenylalaninu, které obsahují systém delokalizovaných elektronů n. Absorpční pás těchto aminokyselin leží v rozmezí 240-300 nm. Budí-Ii se tyto aminokyseliny světlem v této spektrální oblasti můžeme pozorovat fluorescenci. Ta je dána u tryptofanu indolovým kruhem (maximum při 350 nm), u tyrosinu fenolovým kruhem (maximum při 303 nm) a u fenylalaninu benzenovým kruhem (maximum při 282 nm). Tuto přímou detekční techniku lze použít i pro peptidové mapování .
forézu se nejčastěji používá přímé měření absorpce v ultrafialové oblasti. Separační metody v plošném uspořádání (zónová elektroforéza, dvojrozměrné metody) častěji využívají k detekci reakcí s chemickými detekčními činidly, fluorescenční nebo radioaktivní značení. 4.1.Absorbční spektrometrie v ultrafialové oblasti Rychlou a poměrně citlivou metodu představuje přímé spektrofotometrické stanovení peptidů v oblasti absorpce peptidových vazeb (210-220 nm) nebo aromatických kyselin (280 nm). Velkou výhodou této metody je, že je nedestruktivní. Hlavním omezením této detekční metody je vysoká ultrafialová absorbance většiny roztoků používaných pro separaci peptidů, jenž ruší stanovení zejména v oblasti 210-220 nm. Absorbance při 280 nm závisí výrazně na složení proteinu. 4.2. Hmotnostní
Daleko hojněji se však používá vnějších fluoroforu s dobře definovanými chemickými a fluorescenčními vlastnostmi, které se přidávají k analyzovanému peptidů. Nejběžněji používaným fluorescenčním činidlem pro stanovení peptidových map je fluoreskamin ' . Fluoreskamin (4-fenylspiro-[furan-2(3//)]-l'-ftalan-3,3'-dion) velmi rychle reaguje s primární aminoskupinou peptidů či bílkovin a vzniká fluorescenční produkt '. Modifikovaný vzorek je nejprve excitován zářením o vlnové délce 390 nm a poté je měřena fluorescence při 475 nm. Fluorescenční vlastnosti jsou stabilní v rozmezí pH 4—10. Tato metoda deteguje ng množství aminokyselin. Dalším fluorescenčním činidlem je o-ftalaldehyd, který reaguje s primární aminoskupinou. Vzniklý komplex je excitován zářením o vlnové délce 340 nm a fluorescence je měřena 66 při 455 nm. Benson použil toto fluorescenční činidlo pro stanovení tryptických štěpů hovězího albuminu13.
spektrometrie
Hmotností spektrometrie se ukazuje být praktickou technikou pro stanovení peptidových fragmentů, separovaných pomocí RP-HPLC, obsahujících méně než 25 aminokyselinových zbytků. Touto metodou můžeme zjistit nejen molekulovou hmotnost ale i totožnost odpovídajících aminokyselinových zbytků. Hmotnostní spektrometrie je založena na interakci iontů molekul s magnetickým polem. Molekuly separované látky jsou nejprve ionizovány a poté se nabité částice rozdělí podle své hybnosti a energie. Tato metoda detekce dosahuje citlivosti v oblasti pikomolů. Použití metody v analýze vysokomolekulárních biomolekul je omezeno průtokovou rychlostí typické analytické HPLC.
4 . 4 . A u t o r a d i o g r af i e a k a p a l i n o v á scintilační spektrometrie Obě tyto metody vyžadují peptidy značené radioaktivními izotopy a vedou k výraznému zvýšení citlivosti. Nejčastěji se používají izotopy [ 14 C] [ 1 2 5 I] [3H] [ 32 P] [ 35 S]. Značení bílkoviny dvěmi různými radioaktivními izotopy vede k jednoznačnější interpretaci stanovených peptidových map. Bílkovinu lze radioaktivně označit dvěma způsoby biosyntézou s radioaktivně značenými aminokyselinami nebo modifikací radioaktivním činidlem. V biosyntetickém radioaktivním značení bílkovin se často používá izotop [3H]. Biosyntéza v přítomnosti [3H]lysinu a [3H]argininu je zvláště vhodná pro detekci peptidových map tryptických peptidových štěpů. Všechny polypeptidové fragmenty (kromě C-koncových peptidů) jsou pak detegovány se stejnou citlivostí. Takto byly studovány různé druhy aktinů67
Pro peptidové mapování jsou vhodné tyto ionizační techniky - termosprej 3 ' 49 (zahřátím solventu se vytvoří velmi jemný sprej jehož chemická ionizace vede ke vzniku iontů), elektrosprej 38 ' 57 ' 63 (aplikací vysokého napětí je ze vzorku oddělena kapka, která se po odpaření mobilní fáze rozpadá na menší nabité kapénky) a bombardování rychlými atomy 53 (peptid je rozpuštěn v málo těkavém rozpouštědle a ozářen v ionizační komůrce svazkem atomů argonu nebo xenonu). Je možno použít i ionizační techniku MALDI (peptid je zabudován do matrice, při odpaření matrice dochází k desorpci a ionizaci studované látky). 4.3. Fluorescenční emisní spektrometrie Nezbytnou podmínkou pro měření fluorescence je pří-
125
a myších antigenů9. Dalšími izotopy používanými pro biosyntetické značení je [ 32 P] (cit. 7 * 3 6 ' 4 1 ' 4 5 ). K modifikaci peptidů se používají nejčastěji reakce s methyl[14C]acetimidem10 a reduktivní metylace [ C]formaldehydem . Obě modifikační činidla interagují s primární aminoskupinou. Některé zbytky lze modifikovat selektivně, například lysin [14C]sukcinyl anhydridem8, methionin jodo[14C]acetátem8, tyrosin a histidin jodací [ 1 2 5 I] ( c i t . 7 ' 1 2 ' 3 1 - 4 5 - 5 2 ' 5 9 ). Radioaktivní jodace sice podstatně zvyšuje citlivost, avšak tato metoda má řadu nevýhod, např. vznik dvou derivátů tyrosinu a nerozpustnost některých peptidů obsahujících jodované tyrosinové zbytky. Autoradiografii
využívají plošné
7,8,10,12,15,3U6,41,45,52,59,62
dy
peptidy
aldolasy10. V současnosti není tato metoda příliš používána vzhledem k vysoké toxicitě kadmia. Zvýšení citlivosti chromatografických metod lze dosáhnout reakcí peptidů s detekčním chemickým činidlem ještě před jejich separací. Chang použil takto detekční činidlo (4,4-dimetylaminoazobenzen-4-izothiokyanát), které reaguje s aminoskupinou peptidů. Modifikované peptidy pak separoval RF-HPLC a detegoval při 436 nm (cit. 1 7 ' 6 9 ). LITERATURA 1. 2.
Ingram V. M.: Nature 778, 792 (1956). Allen G.: Laboratory techniques: Sequencing ofProteins andPeptides, str. 73. Elsevier, Amsterdam 1989. 3. Kim H. Y., Pilosof D., Dyckes D. F., Vestal M. L.: J. Am. Chem. Soc. 106, 7304 (1984), 4. Cobb K. A., Novotný M.: Anal. Chem. 61,2226 (1989). 5. Shirota O., Rice D., Novotný M: Anal. Biochem. 205, 189 (1992). 6. Benson J. V. Jones R. T., Cormick J., Paterson J. A.: Anal. Biochem. 16, 91 (1966). 7. Bray D„ Brownlee S. M.: Anal. Biochem. 55,213 (1973). 8. Waterson R. M. Konigsberg W. H.: Proč. Nat. Acad. Sci USA 71, 376 (1973). 9. Brown J. L., Kato K., Silver J., Natheson S. G.: Biochemistry 75,3174(1974). 10. Bates D. L., Perham R. N. Coggins J. R.: Anal. Biochem. 68, 175(1975). 11. Tichy H.: Anal. Biochem. 69, 552 (1975). 12. Davison P. F.: Anal. Biochem. 75, 129 (1976). 13. Benson J. R.: Anal. Biochem. 71, 459 (1976). 14. Vandekerckhove J., Weber K.: Eur. J. Biochem. 90, 451 (1978). 15. NellesL.P.,BambergJ.R.:Anal.Biochem.94,150(1979). 16. Rubinstein M., Levý W. P., Moschera J. A., Lai C. Y. Herschberg R. D., Bartlett R. T., Pestka S.: Arch. Biochem. Biophys. 270, 307 (1981). 17. Chang J. Y., Knecht R., Balí R., Alkan S. S., Braun D. G.: Eu. J. Biochem. 727, 625 (1982). 18. Walker A. I., Anderson C. W.: Anal. Biochem. 146, 108(1985). 19. Takahashi N., Ishioka N., Takahashi Y., Putman F. W.: J. Chromatogr. 326, 407 (1985). 20. Takahashi N., Takahashi Y., Ishioka N., Blumberg B. S., Putman F. W.: J. Chromatogr. 359, 181 (1986). 21. StoneK.L.,WiliemsK.R.:J.Chromatogr.359,203(1986). 22. Hartman P. A., Stodola J. D., Harbour G. C, Hoogerheide J. G.: J. Chromatogr. 360, 385 (1986).
separační metoJSQU
n e j p r y e
c h e
.
micky modifikovány radioaktivním činidlem a po té je elektroforéza (či chromatogram) separovaných radioaktivně značených peptidových fragmentů umístěna do kazety, kde probíhá ozáření filmu. Autoradiografii nelze použít pro peptidy značené izotopem ["H], ten lze však detegovat kapalinovou scintilační spektrometrií9'60. Scintilátor absorbuje energii radioaktivního záření a vyzáří ji ve formě záblesku viditelného nebo ultrafialového světla. 4.5. Detekční
chemická
činidla
Specifická detekční chemická činidla reagují s peptidovými fragmenty a vznikají barevné komplexy, které jsou detegovány spektrofotometricky. Tyto detekční metody jsou používány hlavně pro separační metody v plošném experimentálním uspořádání. Pro účely peptidového mapování se dříve často používaná reakce polypeptidů s ninhydrinem '. Toto činidlo reaguje s primární aminoskupinou a vede ke vzniku modrých produktů (absorpce při 570 nm). Ninhydrinové barvení nelze použít pro detekci peptidů v roztocích obsahujících močovinu (neboť je hydrolyzována na čpavek během reakce) nebo primární či sekundární aminy. Popsaná metoda deteguje |0.g množství aminokyselin. Někdy je vhodné použít pro usnadnění detekce separovaných peptidů činidlo, které reaguje specificky pouze s určitým aminokyselinovým zbytkem. Činidlo ninhydrinkadmium reaguje s volnou koncovou aminoskupinou a různé aminokyselinové zbytky dávají rozdílně zbarvené pro68 dukty . Většina aminokyselinových zbytků dává růžové komplexy, glycin, threonin a prolin žluté a serin oranžové. Touto metodou byly detegovány tryptické štěpy ribozomálních proteinů61 a chymotryptické štěpy králičí svalové
126
23. L'Italien J. I: J. Chromatogr. 359, 213 (1986). 24. Lu H. S., Lai P. H.: J. Chromatogr. 368, 215 (1986). 25. Huberman A., AguilarM. B.: J. Chromatogr. 443,337 (1988). 26. Krishna K., Horvath C: J. Chromatogr. 443, 343 (1988). 27. Garnik R., Solli N. J., Papá P. A.: Anal. Chem. 60, 2546(1988). 28. NielsenR. G.,RickardE.C:J.Chromatogr.516,99(1990). 29. Gollinelli-Pimpaneau B., Badet B.: Eur. J. Biochem. 201, 175(1991). 30. Yamaguchi H.: J. Biochem. 110, 785 (1991). 31. Caldwell K. K., Lips D. L„ Bansal V. S., Majerus P. W.: J. Biol. Chem. 266, 18378 (1991). 32. Bloom J. W.: J. Chromatogr. 574, 219 (1992). 33. Airey J. A., Grinsell M. M., Jones L. R., Sutko J. L., Witcher D.: Biochemistry 32, 5739 (1993). 34. Maruta S., Ikebe M.: Biochem. J. 292, 439 (1993). 35. Rush R. S., Derby P. L., Strickland T. W, Rohde M. F.: Anal. Chem. 65, 1834 (1993). 36. el Benna J., Faust L. P„ Babior B. M.: J. Biol. Chem. 269,23431 (1994). 37. VossT., FalknerE., Ahorn H„ KrystekE., Maurer-Fogy I., Bodo G., Hautmann R.: Biochem. J. 298,719 (1994). 38. Klarskov K., Roecklin D., Bouchon B., Sabatie J., van Dorsselear A., Bischoff R.: Anal. Biochem. 216, 127 (1994). 39. Wang Y., Mackay E. A., Kurasaki M., Kagi J. H.: Eur. J. Biochem. 225, 449(1994). 40. Haniu M., Horan T„ Arakawa T., Katta V., Le J., Rohde M. F.: Arch. Biochem. Bioph. 324, 344 (1995). 41. Yakel J. L. Vissavajjhala P., Derckach V. A., Brickey D. A., Soderling T. R.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 1376(1995). 42. Lipari F., Hercovics A.: J. Biol. Chem. 271,27615 (1996). 43. Ono S. Yamakita Y., Yamashiro S., Matsudaira P. T., GnarraJ. R., ObinataT., MatsumuraF.: J. Biol. Chem. 272,2527(1997). 44. Cleveland D. W., Fisher S. G., Kirschner M. W., Laemmli U. K.: J. Biol. Chem. 252, 1102 (1977). 45. Judd R. C: Anal. Biochem. 160, 306 (1987). 46. Jones A. T., Roberte N.B..-J. Chromatogr. 599,179(1992). 47. Boivin D., Gingras D., Beliveau R.: J. Biol. Chem. 268,2610(1993). 48. Jones A. T., Keen J. N., Roberts N. B.: J. Chromatogr. 646,207(1993). 49. Legrand R., Falconnet J. B., Prevost D. P. Schoot B., Devaux P.: J. Chromatogr. 647, 3 (1993).
127
50. SavageT. J„ Hatch M. W., CroteeauR.: J. Biol. Chem. 269,4012(1994). 51. Jones M. D. Mereweter L. A., Clogston C. L. Lu H. S.: Anal. Biochem. 276, 135 (1994). 52. Čepek K. L., Rimm D. L., Brenner M. B.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93, 6567 (1996). 53. Caprioli R. M., Wiliam T. M., Da GlueB., Martin M: J. Chromatogr. 443, 355 (1982). 54. Kanaya S., UchidaT.: Biochem. J. 240, 163 (1986). 55. Hynek R., Kačička V., Kučerová Z., Káš J.: J. Chromatogr. B 681, 37 (1996). 56. Hynek R., Kasička V., Kučerová Z., Káš J.: J. Chromatogr. B 688, 213 (1997). 57. Drummond J. T., Loo R. R. Matthews R. G.: Biochemistry 32, 9282 (1993). 58. Katoh T., Tanahashi K., Hasegawa Y., MoritaF.: Eur. J. Biochem. 227, 459(1995). 59. Corsi D., Galluzzi L., Lecomte M. C, Magnani M.: J. Biol. Chem. 272,2977(1997). 60. Pohl G., Kallstrom M., Bergsdorff N., Wallen P., Jornvall H.: Biochemistry 23, 3701 (1984). 61. Heiland I., Brauer D., Wittann-Liebold B.: Hoppe-Seyler's Z. Physiol. 357, 1751 (1976). 62. 0'Farrel P. H.: J. Biolog. Chem. 250, 4007 (1974). 63. Hara S. Rosenfeld R., Lu H. S.: Anal. Biochem. 243, 74(1996). 64. Udenfriend S., Stein S.,BohlenP., Dairman W., Leimgruber W., Weigele M.: Science 178, 871 (1972). 65. FelixA.M.,JimenezM.H.:J. Chromatogr. S9,361 (1974). 66. Roth M : Anal. Chem. 43, 880 (1971). 67. Gruenstein E., Rich A.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 64, 472 (1975). 68. Heilmann J., Barollier J., Wetzke E.: Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 309, 219 (1957). 69. Chang J. Y.: Biochem. J. 799, 537 (1981). H. Vaňková (Institute ofPathofysiology, lst Faculty of Medicíně, Charles University, Prague): Peptide Maps Peptide mapping is common techique ušed for studying proteins. Such methods can explain small changes in the structure of the protein molecule. The article deals with various types of methods which are ušed for this purpose. The article describes first hydrolysis of different enzymes or degradation with cyanogen bromide, then separation of peptide fragments (by chromatography and electrophoresis). Finally, the separated peptides are detected. The individual steps of the technique are reviewed.
