MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE
Odstraňování dusičnanu z vody imobilizovanými denitrifikačními bakteriemi
Diplomová práce
Brno 2010
Bc. Eva Műllerová
Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem předloţenou diplomovou práci vypracovala samostatně pod vedením prof. RNDr. Igora Kučery, DrSc., přičemţ jsem uvedla všechny literární prameny a publikace, ze kterých jsem čerpala. V Brně dne 28. 4. 2010 .............................................. Eva Műllerová
2
Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala panu prof. RNDr. Igoru Kučerovi, DrSc., vedoucímu diplomové práce, za cenné rady a čas, který mi věnoval v průběhu práce. Dále děkuji Mgr. Vojtěchu Sedláčkovi, Ph.D., Mgr. Adéle Illichmanové, laborantce Marcele Hrnčířové a RNDr. Ivu Pluháčkovi za předání zkušeností, cenné rady a pomoc. Poděkování také patří mé rodině za jejich podporu během celého studia. Děkuji také Ing. Čapkové, vedoucí laboratoře Úpravny vody v Brně - Pisárkách za ochotu a poskytnuté informace (tabulka I na straně 19).
3
Obsah Teoretická část ................................................................................................ 7 1.
Denitrifikace .............................................................................................. 7 1.1.
Cyklus dusíku v přírodě .................................................................... 7
1.2.
Denitrifikace ..................................................................................... 8 1.2.1. Denitrifikační enzymy ............................................................. 8
1.3.
Dusík ve vodě ..................................................................................10 1.3.1. Koloběh dusíku ve vodě .........................................................10
2.
Dusičnan ve vodě .....................................................................................12 2.1.
Voda ................................................................................................12 2.1.1. Znečištění vody ......................................................................12 2.1.2. Čištění odpadních vod............................................................13 2.1.3. Pitná voda ..............................................................................16
2.2.
Dusičnan ve vodě ............................................................................17 2.2.1. Norma pro dusičnan v pitné vodě...........................................18 2.2.2. Stanovení dusičnanu ve vodě ................................................20
3.
Imobilizace buněk .....................................................................................22 3.1.
Definice imobilizace buněk ...............................................................22
3.2.
Způsoby imobilizace buněk ..............................................................22 3.2.1. Vhodné nosiče .......................................................................22
3.3.
Imobilizace a denitrifikace ................................................................23
3.4.
Biotechnologie společnosti LentiKat’s..............................................26 3.4.1. Měření s biokatalyzátorem lentikats………………………….. 26
4.
Cíle práce ..................................................................................................29
Experimentální část ........................................................................... 30 5.
Materiál a metody .....................................................................................30 5.1.
Pouţitý materiál................................................................................30 5.1.1. Chemikálie .............................................................................30 5.1.2. Mikroorganismy .....................................................................30
5.2.
Pouţité metody ................................................................................31 5.2.1. Anaerobní kultivace a sklízení bakteriálních buněk ...............31 4
5.2.2. Imobilizace buněk ..................................................................32 5.2.3. Měření
nitrátreduktasové
biokatalyzátoru
aktivity
lentikats
(s
imobilizovaného
bakterií
Paracoccus
denitrificans) vsádkovým způsobem ......................................33 5.2.4. Měření nitrátreduktasové aktivity neimobilizovaných buněk bakterie Paracoccus denitrificans vsádkovým způsobem ......33 5.2.5. Měření oxidasové aktivity imobilizovaného biokatalyzátoru lentikats (s bakterií Paracoccus denitrificans) Clarkovou elektrodou ..............................................................................34 5.2.6. Měření stability imobilizovaného biokatalyzátoru lentikats (s bakterií Paracoccus denitrificans) při uchovávání v 0,1 M fosfátovém pufru při 6°C ........................................................34 5.2.7. Měření závislosti aktivity imobilizovaného biokatalyzátoru lentikats (s bakterií Paracoccus denitrificans) na teplotě .......35 5.2.8. Měření závislosti aktivity neimobilizovaných buněk bakterie Paracoccus denitrificans na teplotě .......................................36 5.2.9. Měření stability imobilizovaného biokatalyzátoru lentikats (s bakterií Paracoccus denitrificans) při teplotě 50°C ............36 5.2.10.Měření
vlivu
kyslíku
na
aktivitu
imobilizovaného
biokatalyzátoru lentikats (s bakterií Paracoccus denitrificans) ..............................................................................................37 5.2.11.Měření vlivu kyslíku na aktivitu neimobilizovaných buněk bakterie Paracoccus denitrificans ..........................................37 5.2.12.Měření výstupní koncentrace dusičnanu v průtočném reaktoru naplněném
imobilizovaným
biokatalyzátorem
lentikats
(s bakterií Paracoccus denitrificans) ......................................38 5.2.13.Zjištění přítomnosti dusitanu ve vzorcích ..............................39 5.2.14. Kjeldahlova metoda stanovení dusíku ..................................39 6.
Výsledky ....................................................................................... 41
7.
Diskuse ......................................................................................... 52
8.
Shrnutí .......................................................................................... 55
9.
Summary....................................................................................... 56
Literatura ............................................................................................. 57 5
Seznam zkratek
ČOV
čistírna odpadních vod
DAM
dusičnanová alimentární methemoglobinaemie
PVA
polyvinylalkohol
6
Teoretická část 1. Denitrifikace 1.1. Cyklus dusíku v přírodě [1,2] Koloběh dusíku v přírodě je biogeochemický cyklus, který zahrnuje přeměnu dusíku a jeho sloučenin v přírodě. Velkou roli v koloběhu dusíku hrají organismy, hlavně různé druhy bakterií. Koloběh dusíku probíhá v několika fázích. Zahrnuje nejméně pět redukčních a tři oxidační reakce.
Obrázek 1: Zjednodušený koloběh dusíku v přírodě. [2] Molekulární dusík tvoří hlavní sloţku zemské atmosféry (78 %). Molekula dusíku je extrémně chemicky inertní, a proto nemůţe být vyuţita jako zdroj dusíku pro většinu ţivých organismů. Skoro všechny rostliny, zvířata a mikroorganismy jsou ve své výţivě závislé na kombinované formě dusíku. Z toho důvodu je v přeměně tohoto prvku v biosféře důleţitá cyklická transformace dusíkatých sloučenin. Biologická fixace dusíku, neboli diazotrofie, zahrnuje reakce, při které jsou některé bakterie, zvané diazotrofní či hlízkovité bakterie, schopny pomocí enzymu nitrogenasa redukovat trojnou vazbu v molekule atmosférického dusíku. Následně se vzniklé amonné ionty začlení do aminokyselin. K rozbití trojné vazby je 7
zapotřebí velkého mnoţství energie ve formě ATP, a to 16 molekul ATP k redukci jedné molekuly dusíku N2. Nitrifikace je běţně definovaná jako aerobní biologická oxidace amonných iontů na dusičnan pomocí nitrifikačních bakterií (Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrospira). Nitrifikace probíhá ve dvou krocích. V prvním kroku jsou pomocí enzymu monooxygenasa převedeny amonné ionty na hydroxylamin NH2OH. I tato reakce vyţaduje dodání energie. Následuje krok oxidace hydroxylaminu na -
-
dusitan NO2 a následně na dusičnan NO3 . Denitrifikace bude detailněji popsána v další kapitole.
1.2. Denitrifikace [3] Denitrifikace je proces, při kterém dochází k postupné přeměně dusičnanu -
NO3 přes různé meziprodukty aţ na elementární dusík N2. Jednotlivé kroky denitrifikace jsou katalyzovány denitrifikačními enzymy v tělech organismů, hlavně bakterií
(Pseudomonas
stutzeri,
Pseudomonas
aeruginosa,
Paracoccus
denitrificans, Ralstonia eutropha, Rhodobacter sphaeroides), ale i některých halofilních a hypertermofilních archeí a také některých hub. Pro denitrifikaci je jako zdroj energie nutný organický substrát. Pro redukci 1 mg dusičnanu je potřeba asi 1,3 mg organického uhlíku, ať uţ z extracelulárních, nebo intracelulárních látek. Denitrifikace probíhá buď za striktně anaerobních podmínek, nebo jen při velmi nízkých koncentracích rozpuštěného kyslíku, asi pod 0,5 mg.l -1. V kyselém prostředí probíhá denitrifikace pomaleji a tvoří se více oxidů dusíku, zatímco při zvýšení pH nad 6 převaţuje produkce elementárního dusíku. 1.2.1. Denitrifikační enzymy [2,4] Denitrifikační enzymy katalyzují jednotlivé kroky denitrifikace. Paracoccus denitrificans syntetizuje čtyři typy oxidoreduktas oxidů dusíku. Bakterie je schopna za anaerobních podmínek vyuţít oxidy dusíku jako terminální akceptory elektronů. Prvním enzymem, který katalyzuje přeměnu dusičnanu na dusitan, je nitrátreduktasa. Existují dva druhy nitrátreduktasy zapojené do cyklu dusíku. Jednou
z nich
je
periplazmatický
enzym
nitrátreduktasa
(periplazmatická
nitrátreduktasa - NAP) a druhou membránově vázaná nitrátreduktasa (NAR). Oba tyto enzymy mají ve svém aktivním místě molybdopterinový kofaktor. NAR se 8
skládá ze tří polypeptidových řetězců. Dva z nich, α a β jsou v podstatě globulární proteiny umístěné na cytoplazmatickém povrchu cytoplazmatické membrány. α podjednotka obsahuje molybdenové centrum, ve kterém dochází k redukci dusičnanu, zatímco β podjednotka obsahuje několik FeS center. FeS centra přijímají elektrony z třetí (γ) podjednotky, která obsahuje dvě hemové skupiny. Přeměna dusitanu na oxid dusnatý je katalyzována dvěma druhy nitritreduktasy (NIR) v závislosti na studované bakterii. Jednou z nich je nitritreduktasa známá jako cytochrom cd1, druhou nitritreduktasa s atomy mědi. Reduktasa oxidu dusnatého (NOR) v bakteriích je membránově vázaný enzym katalyzující redukci oxidu dusnatého na oxid dusný. Posledním krokem denitrifikace je dvouelektronová redukce oxidu dusného na dusík. Tento krok je katalyzován reduktasou oxidu dusného (N2OR), enzymem obsahujícím měď v aktivním místě.
Obrázek 2: Uspořádání denitrifikačních enzymů. Zkratky: NAR - nitrátreduktasa, NIR - nitritreduktasa, NOR - reduktasa oxidu dusnatého, N2OR - reduktasa oxidu dusného, DH - NADH dehydrogenasový komplex. [5]
9
1.3. Dusík ve vodě [3] Dusík se ve vodě vyskytuje v různých oxidačních stupních, v iontové i neiontové formě. Jde hlavně o dusík elementární, anorganicky vázaný +
-
(amoniakální dusík NH4 -N resp. NH3-N, dusitanový dusík NO2 - N, dusičnanový -
dusík NO3 -N, umělého původu jsou kyanidy, kyanatany a thiokyanatany) a dusík organicky vázaný. Splaškové odpadní vody jsou zdrojem organického dusíku, který pochází z fekálií, z odpadů ze zemědělských výrob a také z rozkládající se biomasy odumřelých mikroorganismů. Člověk produkuje denně asi 12 g dusíku. Anorganický dusík ve vodě pochází ze zemědělsky obdělávané půdy hnojené minerálními dusíkatými hnojivy, ale také z některých průmyslových odpadních vod, např. z tepelného zpracování uhlí. Zdrojem dusíku ve vodě můţe být i fixace atmosférického dusíku některými organismy. 1.3.1. Koloběh dusíku ve vodě [3] Organické dusíkaté látky se rozkládají činností mikroorganismů na amoniakální dusík tzv. deaminací. Naopak můţe být i amoniakální dusík vyuţit organismy pro syntézu nové biomasy.
deaminace +
NH4 -N
org. N syntéza biomasy
Probíhá-li rozklad organických dusíkatých látek v anaerobních podmínkách, vzniklý amoniakální dusík se jiţ dále nemění. Za aerobních podmínek ho mohou nitrifikační bakterie oxidovat na dusitan aţ dusičnan. Tento proces se nazývá nitrifikace.
nitrifikace -
NO3 - N
-
NO2 - N
10
+
NH4 -N
Za anaerobních podmínek můţe být dusitan a dusičnan tzv. denitrifikační dráhou redukován na elementární plynný dusík nebo oxid dusný N 2O i dusnatý NO. Pro denitrifikaci je nutný organický substrát jako zdroj energie. -
-
NO3 - N
NO2 - N
denitrifikace
N2 Vzniklý dusík odchází do atmosféry, ze které můţe být opět fixován některými mikroorganismy, a tím se navrací zpět do vody ve formě organicky vázaného dusíku. fixace N2
org. N
11
2. Dusičnan ve vodě 2.1. Voda [6] Voda pokrývá více neţ 2/3 zemského povrchu a její celkové mnoţství na Zemi ve všech formách se odhaduje na 1,5.1021 litrů. Největší část (cca 97%) představuje slaná voda moří a oceánů. Jen 2,6 % z celkového mnoţství vody je voda sladká [7]. Z toho jde většinou o vodu vázanou v ledovcích. Jen 0,27 % sladké vody je vhodné pro výrobu vody pitné, coţ je méně neţ 0,01 % z celkového mnoţství vody na Zemi [8]. Česká republika má mimořádně nepříznivou situaci v zásobování vodou, neboť je zcela závislá na sráţkách. V průměru připadá u nás na jednoho obyvatele 388 litrů vody na den, tj. nejméně ze všech evropských států. V České republice je ročně vyrobeno 1,1.1012 litrů pitné vody. Město Brno spotřebuje ročně 37,3.10 9 litrů pitné vody, tj. 1,6x celý uţitný objem Brněnské přehrady [7]. 2.1.1. Znečištění vody [6] Rozvinutý průmysl a zemědělství nepříznivě ovlivňují čistotu povrchových vod, coţ se projevuje jak v nedostatku pitné vody, tak i v nedostatku vody pro technické pouţití. Znečištění povrchových vod lze rozdělit na primární a sekundární: 1) Primární znečištění je způsobeno látkami přítomnými v odpadní vodě, popř. změnou některých vlastností. Znečištění je způsobeno inertními materiály (půda, kaolin, apod.), organickými látkami buď přirozeného (huminové látky, splašky), nebo antropogenního původu (ropné produkty, fenoly, pesticidy, detergenty). Ropné produkty zhoršují senzorické vlastnosti vody. Většinou plavou na hladině a zabraňují přestupu kyslíku do vody. Podobné účinky mají detergenty, které vytvářejí pěnu. Fenoly, pesticidy a velká část jejich metabolitů jsou látky toxické pro ryby a mikroorganismy. Dále je znečištění vod způsobováno anorganickými látkami, které mohou mít různé následky, např. se zvyšuje solnost vody a její -
korozivnost (NaCl, CaCl 2), dochází k sekundárnímu znečištění (PO43-, NO3 ), mění se pH vody (NH3, kyseliny), látky mohou být toxické (sloučeniny Hg, Pb, As, Se, Cd, Cu, Cr atd.). Bakteriální znečištění je způsobeno zvýšeným přísunem 12
mikroorganismů, z nichţ některé mohou být patogenní. Vypouštění horké vody způsobuje znečištění tepelné a vede ke sníţení obsahu kyslíku a urychluje rozklad organických látek. Mezi primární znečištění povrchových vod patří ještě radioaktivní znečištění. 2) Sekundární znečištění je nadměrný rozvoj některých organismů vyvolaný přísunem vhodných látek. Mezi typické příklady patří především eutrofizace vodních nádrţí, tj. zarůstání nádrţí řasami, sinicemi a rozsivkami (vodním květem), které je vyvoláno nadměrným přísunem dusičnanu a fosforečnanu. Ve vodách obsahujících cukry se často objevuje vláknitá bakterie Sphaerotilus natans, která vytváří kolonie aţ několik metrů dlouhé. Po odumření dochází k jejich rozkladu a znečištění vody. Velmi nebezpečné je znečišťování podzemních vod, které má velmi dlouhodobé následky. Dochází k němu zejména při přehnojování polí či při ropných haváriích. [8] Ke znečišťování moří a oceánů dochází např. při haváriích ropných tankerů, ale také znečištěnými vodními toky, které se do nich vlévají. V takto znečištěných mořích a oceánech se sniţuje odolnost a zdravotní stav organismů, často je zakázáno koupání, narušena výměna kyslíku a oxidu uhličitého mezi vodou a ovzduším, coţ můţe mít dalekosáhlé důsledky i pro ţivot na souši. [8] Voda, která není znečištěna činností člověka, má v podstatě konstantní zastoupení tří hlavních typů organických látek: 82 % sacharidy (celulosa a jiné cukry), 17 % proteiny a 1 % lipidy. Pokud se ve vodě objeví jiné organické látky nebo se změní zastoupení výše uvedených látek, svědčí to o kontaminaci vody. 2.1.2. Čištění odpadních vod [9] Voda, která odtéká z našeho domova, školy, továrny, obchodů či jiných objektů je odváděna pomocí kanalizace do čistírny odpadních vod. Odpadní voda z města Brna a přilehlých měst a obcí se čistí v čistírně odpadních vod v Brně – Modřicích. [8] Původní čistírna odpadních vod (ČOV) byla do provozu uvedena v roce 1961. S rozvojem města bylo postupně v průběhu 80. let prováděno rozšíření prakticky celé čistírny. Koncem května roku 2001 byla zahájena rekonstrukce a dostavba ČOV a dokončena byla koncem roku 2003. Od 1. ledna 2004 byl 13
zahájen roční zkušební provoz, jehoţ ukončení s vyhovujícími výsledky bylo potvrzeno kolaudačním rozhodnutím, po němţ následovalo převzetí stavby investorem a dnes je jiţ dokončená stavba v trvalém provozu.
Obrázek 3: Celkový pohled na čistírnu odpadních vod v Brně – Modřicích. [9] 2.1.2.1. Popis čištění odpadní vody v ČOV [9] Surová odpadní voda přitéká na čistírnu přes přítokový objekt, který plní funkci rozdělovací komory. Při vyšším přítoku se dešťová voda nejprve kumuluje v dešťové zdrţi s kapacitou 10,5.106 litrů. Voda, akumulovaná v dešťové zdrţi je po skončení dešťové události přečerpávána zpět do ČOV. Voda, přitékající do ČOV je nejprve zbavena největších nečistot v tzv. lapáku štěrku, poté protéká jemnými, strojně stíranými česlemi s šířkou průlin 6 mm. Shrabky z česlí jsou lisovány a poté propírány vodou. Z česlovny voda gravitačně odtéká do provzdušňovaného lapáku písku vybaveného separací tuku. Písek je dále zpracováván v třídičce a pračce písku před jeho uloţením do kontejneru. Voda, přicházející z lapáku písku je kanálem vedena ke šnekové čerpací stanici, ze které je čerpána do rozdělovacího objektu, kde se rozděluje na šest usazovacích nádrţí o průměru 35 metrů. Usazovací nádrţe zajišťují mechanické odstranění usaditelných látek. Jsou vybaveny pojezdy se shrabovacím zařízením kalu a se stíráním plovoucích nečistot. V bezdeštném období jsou do procesu zapojeny maximálně čtyři usazovací nádrţe, zbývající dvě se připojují v případě dešťů.
14
Obrázek 4: Usazovací nádrţ. [9] Po mechanickém vyčištění je odpadní voda vedena potrubím do mezičerpací stanice, odkud je čerpadly přečerpávána do aktivačních nádrţí. Aktivace je rozdělena do dvou linek, kaţdá se dvěma samostatnými drahami, které lze provozovat samostatně nebo společně. Voda je přiváděna nejprve do anaerobní nádrţe s funkcí defosfatace, následně do anoxické nádrţe s funkcí předřazené denitrifikace. Posledním stupněm aktivace je oxická část s jemnobublinou aerací rozdělená na provzdušňovanou a neprovzdušňovanou zónu.
Obrázek 5: Aktivační nádrţ. [9] Z aktivačních nádrţí postupuje aktivační směs do šesti dosazovacích nádrţí, kde dochází k usazení a oddělení aktivovaného kalu. Usazený kal je veden přes čerpací stanici vratného kalu do preanoxické zóny aktivace. Aktivovaný 15
přebytečný kal, odebíraný z aktivace, je zpracováván v kalovém hospodářství. Po vyčištění vody následuje objekt odtoku, který je vybaven měřením mnoţství a kvality vody, odváděné z dosazovacích nádrţí do řeky Svratky. Vedle tohoto objektu je umístěn objekt čerpací stanice pro uţitkovou vodu. Uţitková voda je čerpána do objektu chlorovny a voda je pak dále dodávána do rozvodu uţitkové vody.
Obrázek 6: Blokové schéma čistírny odpadních vod. [9] 2.1.3. Pitná voda [3] Pitná voda musí vyhovovat předepsaným zdravotním a technickým poţadavkům. Nesmí obsahovat organismy nebo látky, které by mohly mít při dlouhodobém poţívání nepříznivý vliv na zdraví člověka. Zdroje pitných vod jsou buď podzemní, nebo povrchové. Nejkvalitnějším zdrojem pitných vod jsou vody podzemní. 16
2.1.3.1. Zdroje pitné vody pro Brno Město Brno je zásobeno ze dvou zdrojů – podzemní vodou z prameniště Březová nad Svitavou a povrchovou vodou z Vírské nádrţe. Voda z této nádrţe se upravuje v úpravně vody ve Švařci a do Brna je přiváděna Vírským oblastním vodovodem. [8] Voda z Březové nad Svitavou je přiváděna tzv. I. a II. březovským vodovodem do vodojemů na Holých horách a na Palackého vrchu. Z těchto vodojemů se čerpá přímo do brněnské vodovodní sítě. Jakost vody z prameniště Březová je velmi vyrovnaná a splňuje průběţné poţadavky normy na pitnou vodu bez úpravy. Avšak pro zvýšený obsah dusičnanu není vhodná pro umělou výţivu kojenců. Má velmi vyváţený obsah minerálů, stálou teplotu 9 - 10°C a patří mezi velmi kvalitní, pro lidskou spotřebu hodnotné a chutné pitné vody. [10]
2.2. Dusičnan ve vodě [6,11] -
Dusičnan se vyskytuje ve vodě v iontové formě NO3 , protoţe všechny dusičnany jsou rozpustné. Jeho zdrojem mohou být atmosférické sráţky (bouřky, provoz motorových vozidel) a nadměrné pouţívání dusíkatých hnojiv, které je hlavní příčinou vysokých koncentrací dusičnanu. Hnojiva se smyvem dostávají do povrchových vod a průsakem do vod podzemních. Ke stejným závěrům docházejí i zahraniční odborníci ze zemí s vysokou intenzitou zemědělské výroby. Pro nesnadnost odstraňování dusičnanu z pitných vod označují někteří z nich dusičnanový problém za největší pohromu ve vodárenství od dob, kdy byl desinfekcí vyřešen problém přenosu infekčních onemocnění vodou. Dusíkatými hnojivy (a dalšími zemědělskými chemickými přípravky) je zasaţena celá zemědělská krajina. Jestliţe
platí,
ţe
dusičnanová
hnojiva jsou
z půdy odčerpávána
zemědělskými plodinami, pak by mělo platit i to, ţe koncentrace dusičnanu v tocích je niţší v době růstu zemědělských plodin a vyšší v době vegetačního klidu, kdy zásoby dusíku v zemědělské půdě nejsou plodinami odčerpávány. Ţe tato závislost skutečně platí, dokládají průměrné měsíční koncentrace dusičnanu v řece Blanici, naměřené laboratoří úpravny vody ve Vlašimi [12]. Dusičnan je sám o sobě pro člověka málo škodlivý, protoţe je z těla poměrně rychle vylučován. Jeho nebezpečí vyplývá z jeho moţné bakteriální 17
redukce v zaţívacím traktu člověka na toxický dusitan. Dusitan se slučuje v ţaludku se sekundárními aminy z potravy na kancerogenní N-nitrosoaminy. Statisticky byla prokázána závislost zvýšeného výskytu rakoviny jater, ţaludku, tlustého střeva a močového měchýře na obsahu dusičnanu ve vodě [13]. Vzniklý
dusitan
můţe
reagovat
s krevním barvivem hemoglobinem
za vzniku methemoglobinu, který není schopen přenášet kyslík. Toto onemocnění se nazývá dusičnanová alimentární methemoglobinaemie (DAM) kojenců. Kojenec je tak vystaven nebezpečí udušení, podobně jako při otravě oxidem uhelnatým. K onemocnění jsou náchylní kojenci do tří měsíců věku. Jejich krev obsahuje tzv. fetální hemoglobin, který snáze reaguje s dusitanem neţ hemoglobin A, obsaţený v krvi starších kojenců, dětí a dospělých. Kromě toho enzymatický systém nejmladších kojenců není dosud dostatečně vyvinut. Za statisticky bezpečnou koncentraci dusičnanu ve vodě se povaţuje 15 mg.l-1 z hlediska prevence DAM. 2.2.1. Norma pro dusičnan v pitné vodě [14] Vyhláška č. 252/2004 Sb. ze dne 22. dubna 2004, kterou se stanoví hygienické poţadavky na pitnou a teplou vodu a četnost a rozsah kontroly pitné vody stanovuje mikrobiologické, biologické, fyzikální, chemické a organoleptické ukazatele pitné vody a jejich hygienické limity. Hygienickým limitem dusičnanu pro pitnou vodu je stanovena nejvyšší mezní hodnota, tedy hodnota zdravotně závaţného ukazatele jakosti pitné vody, v důsledku jejíhoţ překročení je vyloučeno pouţití vody jako pitné, neurčí-li orgán ochrany veřejného zdraví na základě zákona jinak, na hodnotu 50 mg.l -1. Zároveň musí být dodrţena podmínka, aby součet poměrů zjištěného obsahu dusičnanu v mg/l děleného 50 a zjištěného obsahu dusitanu v mg/l děleného 3 byl menší nebo roven 1. Součet poměrů odpovídá svým významem nejvyšší mezní hodnotě. Obsah dusitanu v pitné vodě na výstupu z úpravny musí být niţší neţ 0,1 mg.l -1. Z hlediska lidské výţivy není pitná voda jediným zdrojem dusičnanu. Z důvodů hnojení polí dusíkatými hnojivy se dusičnan vyskytuje i v potravě, hlavně zelenině, ze které bohuţel nelze dusičnan odstraňovat. Ze zeleniny přijímáme zhruba 2/3 dusičnanu, dalších 20% pochází z pitné vody a zbytek z masných výrobků, ryb, ovoce, brambor a obilných produktů. [11]
18
Tabulka I: Průměrná měsíční koncentrace dusičnanu (v mg.l -1) v pitné vodě v Brně. (Informace poskytla Ing. Čapková, vedoucí laboratoře úpravny vody v Pisárkách.)
rok 2007
2008
2009
2010
měsíc květen červen červenec srpen září říjen listopad prosinec leden únor březen duben květen červen červenec srpen září říjen listopad prosinec leden únor březen duben květen červen červenec srpen září říjen listopad prosinec leden únor březen
vodojem průměrná [NO3 ], mg.l-1 Palackého vrch Holé hory 35,0 39,8 34,0 38,6 34,8 38,4 33,6 36,0 32,7 36,5 32,2 36,8 30,9 36,0 32,8 38,0 33,7 40,1 33,9 37,5 32,7 38,7 32,9 38,6 33,6 39,5 36,6 40,2 34,5 39,6 35,1 38,5 33,5 38,2 32,4 38,1 33,6 36,5 33,6 36,1 34,5 34,8 30,2 32,9 34,4 38,8 40,2 41,7 38,7 41,8 39,3 42,0 40,9 41,2 42,6 44,4 39,8 40,8 37,5 39,5 39,4 42,4 41,6 42,9 38,5 39,5 38,7 40,2 40,8 42,8
19
2.2.2. Stanovení dusičnanu ve vodách [6] Ke stanovení dusičnanu ve vodách jsou pouţívány nejrůznější metody. Pokud nejsou koncentrace iontů dusičnanu příliš nízké, jsou větší neţ 1 mg.l -1, a nejsou
přítomny
ţádné
interferující
ionty
(dusitan,
chlorid,
síran
a
hydrogenuhličitan), pak lze pouţít metodu potenciometrie s vyuţitím iontově selektivní elektrody. Dusičnanová elektroda pracuje s kapalnou membránou obsahující roztok krystalové violeti v nitrobenzenu. Tato metoda není vhodná pro neznámé vzorky. Při stanovení dusičnanu v pitné a dešťové vodě lze pouţít iontovou chromatografii. Výhodou této metody je moţnost analyzovat vzorky neznámého sloţení a lze s ní určit větší počet aniontů současně. U vod povrchových a odpadních mohou nastat problémy, např. velká mnoţství kationtů mohou interferovat s píkem fluoridu, uhličitan můţe maskovat pík chloridu. U povrchových vod mohou vadit i iontové tenzidy a organické kyseliny. Další metodou stanovení dusičnanu je fotometrické stanovení dusičnanu v UV oblasti po jeho redukci na dusitan kadmiem v kyselém prostředí nebo hydrazin sulfátem s mědí jako katalyzátorem v prostředí alkalickém, s následnou diazotací a kopulací. Jinou metodou, která je často uţívaná, je reakce se salicylanem sodným. Tato metoda je vedena jako standardizovaná pod označením ČSN ISO 7890-3 Jakost vod. Stanovení dusičnanů. Část 3: Spektrofotometrická metoda s kyselinou sulfosalicylovou. Do odpařovací misky se odměří 10 ml vzorku vody, k ní se přidá 1 ml 0,5% salicylanu sodného. Obsah misky se odpaří do sucha při 100°C. Po vychladnutí se miska ovlhčí 1 ml koncentrované kyseliny sírové a nechá se minimálně 10 minut působit. Po ochlazení se přidají 2-3 ml destilované vody a 10 ml alkalického roztoku (800 ml destilované vody, 200 g NaOH, 50 g Chelatonu III, to vše se rozpustí a po vychlazení doplní vodou na objem 1 litr). Obsah misky se promíchá krouţivým pohybem a přelije do 50 ml odměrné baňky, která se doplní po rysku destilovanou vodou. Vzniklé ţluté zbarvení soli kyseliny nitrosalicylové se měří při 410 nm. Jako slepý vzorek se pouţije místo vzorku vody voda destilovaná. Tuto metodu, jak uvedla Ing. Čapková, pouţívali dříve i v úpravně vody v Brně - Pisárkách, nyní jiţ ale pouţívají iontovou kapalinovou chromatografii s vodivostním detektorem. 20
Novějšími metodami je měření absorpce při několika vlnových délkách v UV oblasti (měří se absorbance vodného roztoku po 1 nm v intervalu 205-250 nm) a kapilární elektroforéza (separace iontů v úzké kapiláře naplněné elektrolytem) a kapilární izotachoforéza.
21
3. Imobilizace buněk 3.1. Definice imobilizace buněk Imobilizace je technika, při které dojde k omezení pohybu buněk, ale nezmění se jejich metabolická aktivita. Imobilizací se vytvoří mikroklima, jehoţ vlastnosti jsou často odlišné od okolního prostředí. [15] Imobilizované buňky mají oproti neimobilizovaným mnoho výhod. Nejen, ţe manipulace s imobilizovanými buňkami je mnohem snazší, lze je opakovaně vyuţívat, lehce oddělit od reakčního média, ale mikroorganismy lze imobilizací prostorově lokalizovat a zvýšit jejich odolnost vůči nepříznivým vnějším podmínkám, např. toxickým látkám.
3.2. Způsoby imobilizace buněk Pro imobilizaci buněk existuje několik metod: adheze na povrch vhodného nosiče, zachycení buněk do nosiče (entrapment) a mikroenkapsulace. Ale také imobilizace bez účasti nosiče, kdy se buňky převedou např. flokulací nebo zesítěním na agregáty s lepšími sedimentačními vlastnostmi [15]. Výběr metody imobilizace silně závisí na zamýšlené aplikaci. Adheze je pouţívána pro stabilní in vitro kultury a je zaloţena na připojení buněk na povrch polymeru. Entrapment stabilizuje kulturu drţením buněk uvnitř nosiče a mikroenkapsulace znamená obklopení jedné nebo několika buněk tenkou, polopropustnou membránou. Tyto tři metody mohou být kombinovány, aby dosáhly komplexních cílů. [16] Pro zamýšlenou aplikaci imobilizovaných buněk je nutno brát v úvahu druh buněk, metodu imobilizace, ale i vhodný nosič. 3.2.1. Vhodné nosiče Volba nosiče závisí na vlastnostech imobilizovaných buněk, charakteru reakce, kterou mají katalyzovat, na konstrukci bioreaktoru a na podmínkách provozu. Nosič nesmí sniţovat ţádnou biokatalytickou aktivitu buněk, nesmí reagovat se substrátem, ţivinami a produktem, musí být dostatečně vysoký specifický povrch, nesmí se rozpouštět, musí mít vysoký difuzní koeficient pro
22
substrát, produkt a ţiviny, musí být rezistentní vůči biodegradaci a musí být nezávadný pro potravinářské a farmaceutické účely. [15] Vhodnými nosiči pro následné pouţití v medicíně a biotechnologiích jsou hydrogely. Hydrogely jsou polymery zesíťované pomocí chemických vazeb, iontových interakcí, vodíkovými můstky, hydrofobními interakcemi či fyzikálními vazbami. Pro imobilizaci různých typů buněk byly zkoušeny jak syntetické, tak přírodní hydrogely. Z velké řady hydrogelů vhodných pro imobilizaci lze jmenovat např. polyvinylalkohol, kolagen, alginát nebo agarosu. Další nosiče mohou vznikat jejich modifikací. [16] Pro úspěšnou imobilizaci je nezbytné, aby hydrogel zabezpečoval buňkám ţivotaschopnost
a
funkčnost.
Musí
mít
také
řádnou
propustnost
pro
nepostradatelné ţiviny a kyslík a zároveň odvádět produkty metabolismu [17]. Hydrogel musí být netoxický a nezasahovat do fungování buněk. [16] Efektivní variantou pro pokročilé čištění odpadních vod je imobilizace biomasy pomocí enkapsulace do polyvinylalkoholu. Výhody by spočívaly ve snadné separaci pevné a kapalné sloţky v usazovacích nádrţích a menší citlivosti na nízké teploty v zimním období. Nevýhodou polyvinylalkoholu je jeho snadná rozpustnost ve vodě. Tato nevýhoda lze odstranit přidáním práškového aktivního uhlí nebo zmýdelněním polyvinylalkoholu. [17]
3.3. Imobilizace a denitrifikace Byla vyvinuta nová metoda, tzv. hybridní imobilizace mikroorganismů. Je zaloţena na hybridní entrapment-enkapsulaci. Entrapment dovoluje vysokou mechanickou sílu, ale má i nějaké nevýhody, např. unikání buněk. U enkapsulace jsou kapsle velmi slabé. Proto k překonání problémů samotných metod byla vyvinuta hybridní metoda entrapment-enkapsulace. K imobilizaci byl vyuţit polyvinylalkohol pro entrapment a xantanová guma (pro zlepšení povrchových vlastností a pro tvorbu kulovitého tvaru) a Tween 20 (netoxické a neiontové činidlo pro zlepšení propustnosti membrány) pro enkapsulaci. Tyto sloţky byly smíchány ve vhodném poměru a byly z nich vytvořeny kuličky. Jako mikroorganismus byla pouţita bakterie Ochrobactrum anthropi SY509. Byla imobilizována hybridní metodou a byla zkoumána její denitrifikační aktivita v reaktoru. Tato hybridní
23
metoda sníţila unikání buněk z kuliček a hlavně zvýšila aktivitu imobilizovaných buněk ve srovnání s imobilizovanými jednou metodou. [18]
Obrázek 7: Schéma metody hybridní imobilizace: technika enkapsulace byla aplikována na metodu entrapment. [18] V Číně byl proveden výzkum na moţnou imobilizaci nitrifikačních a denitrifikačních bakterií společně do jednoho nosiče, tzv. koimobilizací. Byly zkoumány faktory nutné pro správné fungování jednostupňového biologického odstranění dusíku (biodenitrifikace) u syntetické odpadní vody v reaktoru, a to poměr nitrifikačních a denitrifikačních bakterií, zdroj organického uhlíku, pH, alkalita, teplota, rozpuštěný kyslík a operační stabilita koimobilizovaných buněk. Jako nosič pouţili polyvinylalkohol (PVA) s přídavkem alginátu sodného. [19] Jednotlivá měření vedla k zjištění, ţe hodnota pH je důleţitým faktorem ovlivňující pochody bakterií. Optimální hodnota pro samotnou nitrifikaci je mezi 8,0 a 8,4, zatímco pro denitrifikaci to je 7,0 aţ 7,5 [20]. Takţe po zkoumání různých hodnot došli k závěru, ţe nejvhodnější hodnotou pH pro jednostupňové odstranění dusíku je hodnota okolo 8,2, coţ vyjadřuje hodnotu vhodnou pro nitrifikaci, ale ne pro denitrifikaci. Poměr odstranění dusíku byl limitován nitrifikací, proto optimální hodnota pH pro jednostupňové odstranění dusíku odpovídá hodnotě pH pro nitrifikaci. Také teplota významně ovlivňuje biodenitrifikaci. Jako optimální teplota 24
se ukázala teplota 30°C. Pokud byla teplota jiná, poměr odstranění dusíku se sníţil. [19]
Obrázek 8: Poměr odstranění dusíku koimobilizovanými buňkami jako funkce pH (25°C), (vlevo) a jako funkce teploty (vpravo). [19] Vliv kyslíku na jednostupňový biodenitrifikační proces se zdál jako problém. Z pohledu mikroorganismů jsou nitrifikace a denitrifikace protichůdné děje. Zatímco při nitrifikaci je amoniak oxidován na dusitan nebo dusičnan jen v přítomnosti kyslíku, denitrifikační buňky redukují dusitan nebo dusičnan na plynný dusík jen za anoxických a anaerobních podmínek. Klíčem úspěchu tedy bylo utvoření aerobních a anoxických zón uvnitř gelových částic. Rozpuštěný kyslík byl kontrolován v reaktoru změnou aerace. Nakonec se ukázalo, ţe pokud bylo rozpuštěného kyslíku 1-2 mg.l-1, poměr odstraněného dusíku byl nízký. Při zvyšování kyslíku rostl i poměr odstraněného dusíku, při překročení hranice 6 mg.l-1 se začal sniţovat. Důvodem bylo, ţe pokud bylo málo kyslíku, oxidace amoniaku byla limitována, a pokud bylo kyslíku moc, byla sníţena denitrifikace. [19] Denitrifikační bakterie potřebují pro svůj růst a respiraci organický zdroj uhlíku. Přítomnost organického uhlíku navíc ovlivňuje i nitrifikaci. Studie vybrala čtyři běţné zdroje uhlíku, kterými byly methanol, ethanol, kyselina octová a glukosa. Jako nejlepší zdroj se ukázal ethanol, za ním následoval methanol, kyselina octová a jako poslední glukosa. [19] Jelikoţ nitrifikace dominuje během biodenitrifikace celému procesu, je nutné, aby byl větší podíl nitrifikačních bakterií. Nejvyšší poměr odstranění dusíku 25
byl, kdyţ se poměr nitrifikačních a denitrifikačních bakterií v PVA pohyboval mezi 1,5:1 a 3,6:1. Stabilita během dlouhodobého pouţívání zůstala zachována po více neţ 60 dnů. [19]
3.4. Biotechnologie společnosti LentiKat’s [21] V roce 2006 byla zaloţena společnost LentiKat’s a.s. Cílem této společnosti je prosadit biotechnologii lentikats v celosvětovém měřítku. Hlavně jde o vývoj, výrobu a aplikaci biokatalyzátorů pro průmyslové vyuţití v čištění odpadních vod, v lihovarnictví pro výrobu biolihu, ve farmacii pro výrobu robustních biokatalyzátorů a také v potravinářství. Lentikats umoţňuje imobilizovat volné enzymy nebo buňky do pevného nosiče z PVA, který má vynikající fyzikálně-mechanické vlastnosti, které poskytují dlouhodobou mechanickou stabilitu a navíc je biologicky obtíţně odbouratelný a netoxický. Mezi hlavní oblasti vyuţití biotechnologie lentikats patří zejména imobilizace (enkapsulace) nitrifikačních a denitrifikačních bakterií, enkapsulace ostatních mikroorganismů na selektivní biodegradace, imobilizace nativních mikrobiálních buněk, dezintegrovaných nebo částečně dezintegrovaných buněk, nevegetativních forem mikroorganismů (spór), rostlinných buněk, volných enzymů pouţívaných v potravinářství a farmacii a náhrada cross-linkovaných enzymů a na pevný nosič imobilizovaných enzymů pouţívaných v potravinářství a farmacii. 3.4.1. Měření s biokatalyzátorem lentikats 3.4.1.1. Denitrifikace zasolených vod [22] Na Univerzitě Jana Evangelisty Purkyně v Ústí nad Labem zkoumali denitrifikaci zasolených vod po regeneraci iontoměničových kolon pomocí biotechnologie lentikats. Iontoměničové kolony se pouţívají k odstraňování dusičnanu z pitných a bazénových vod. Je nutné je pravidelně regenerovat vodnými roztoky s vysokým obsahem solí, hlavně NaCl. Vznikající odpadní kapaliny je potřeba zbavit dusičnanu, aby se daly znovu pouţít pro regeneraci iontoměničových kolon, a tím se sníţily provozní náklady. Pro odstranění dusičnanu pouţili imobilizované denitrifikační organismy, konkrétně bakterii Paracoccus denitrificans a jako matrici biokatalyzátor lentikats (polyvinylalkohol). Výroba biokatalyzátoru byla provedena v průmyslovém měřítku, čímţ získali velké 26
mnoţství
homogenního
biokatalyzátoru.
Cílem
práce
bylo
posoudit
vliv
anorganických solí na biokatalyzátor lentikats. Bylo zjištěno, ţe dlouhodobý vliv vysoké koncentrace anorganických solí (osmotického tlaku) sniţuje schopnost regenerace a reprodukce imobilizovaných buněk a dochází tak k vyčerpání denitrifikační kapacity biokatalyzátoru. Byly také provedeny vsádkové experimenty. Ukázalo se, ţe odbourávání dusičnanu probíhá ze začátku přibliţně lineárně a současně je kumulován dusitan jako meziprodukt odbourávání. Při konstantní počáteční koncentraci dusičnanu je maximální koncentrace dusitanu úměrná rychlosti odbourávání dusičnanu. Redukce dusitanů tedy představuje kineticky limitní krok. Také zjistili, ţe aktivita biokatalyzátoru nezávisí ani tak na aktuální koncentraci anorganických solí, jako na době od poslední regenerace a na stupni regenerace biokatalyzátoru. V průběhu měření aktivita biokatalyzátoru postupně klesala, ale po regeneraci se aktivita trojnásobně zvětšila oproti počáteční aktivitě. 3.4.1.2. Čištění odpadních vod a biokatalyzátor lentikats [23] Univerzita J. E. Purkyně ve spolupráci s firmou Lentikat‘s a. s. optimalizovala technologii dvoukrokového odstraňování dusíkatého znečištění a mnoţství organického substrátu s omezenou mezitvorbou. Proces nitrifikace a denitrifikace byl testován na modelových a reálných odpadních vodách. K testování byl vyuţit biokatalyzátor lentikats. Byla sledována kinetika
odbourávání
dusíkatého
znečištění
(odbourávání
amoniakálního,
dusitanového a dusičnanového dusíku) z modelových vod ve vsádkovém uspořádání. Získaná data byla pouţita pro optimalizaci kontinuálního odstraňování dusíku z odpadních vod. Z výsledků měření bylo patrné, ţe při dvoukrokové nitrifikaci dochází nejprve k oxidaci amoniakálního dusíku na dusitan a následně na dusičnan. Konec nitrifikace je také moţné určit z koncentrace rozpuštěného kyslíku, která po konečné oxidaci amoniakálního a dusitanového dusíku skokově vzrůstá. Dále bylo pozorováno, ţe denitrifikace probíhá taktéţ dvoustupňově, tedy nejprve redukce dusičnanu na dusitan a následně dusitan na plynný dusík. Z
provedených
testů
vyplynulo,
ţe
biokatalyzátor
lentikats
pro
dvoukrokovou nitrifikaci je vhodný k odstraňování amoniakálního znečištění. Dále
27
bylo
ověřeno,
ţe
testovaný
biokatalyzátor
lze
pouţít
při
odstraňování
dusičnanového a dusitanového znečištění pro koncentrace niţší neţ 800 mg.l -1. Na základě výsledků modelových testů a optimalizovaného kontinuálního procesu probíhajícího na reálných odpadních vodách lze říci, ţe biokatalyzátory firmy Lentikat‘s a. s. je moţné vyuţít na odbourávání různých forem dusíkatého znečištění. Nutná je pouze úprava pH pro nitrifikaci a pouţití vhodného poměru organického substrátu k celkovému dusíku pro denitrifikaci.
28
4. Cíle práce Cílem diplomové práce je najít vhodný nosič pro imobilizaci buněk, optimalizovat imobilizační postup a zjistit základní charakteristiky připraveného biokatalyzátoru (reakční kapacita kolony, závislost stupně konverze na rychlosti průtoku, teplotě a stupni aerace).
29
Experimentální část 5. Materiál a metody 5.1. Použitý materiál 5.1.1. Chemikálie sada na výrobu biokatalyzátoru LentiKats® (LentiKat®Liquid, LentiKat®Stabilizer) Byly pouţívány běţné chemikálie v čistotě p.a..
5.1.2. Mikroorganismy Paracoccus denitrificans wild
30
(geniaLab®, Německo)
5.2. Použité metody 5.2.1. Anaerobní kultivace a sklízení bakteriálních buněk 5.2.1.1. Příprava média pro anaerobní kultivaci Nejprve se připravilo médium pro anaerobní kultivaci o sloţení: redestilivaná voda
2,8 l
NaH2PO4 . 2 H2 0
7,8 g
KH2PO4
13,6 g
NH4Cl
5,3 g
KNO3
3,4 g
MgSO4 . 7 H2O
0,8 g
Na2MoO4 . 2 H20
0,4 g
Připravený roztok se rozmíchal na magnetické míchačce. Roztok byl přídavkem koncentrovaného NaOH upraven na pH = 7,3. Objem byl poté doplněn na 3 litry destilovanou vodou. Médium bylo rozlito do tří Erlenmeyerových baněk po 900 ml média. Ze zbylého média byla připravena inokula po 27 ml média v kaţdé baňce. Bylo připraveno 500 ml roztoku 0,5 M kyseliny jantarové (m = 29,5 g). Přídavkem koncentrovaného NaOH bylo upraveno pH na hodnotu 7,3. Bylo připraveno 500 ml roztoku citronanu ţelezitého (m = 1,7 g).
5.2.1.2. Sterilizace Všechny připravené roztoky byly zazátkovány a následně sterilizovány 35 minut při 121°C v autoklávu. 5.2.1.3. Anaerobní kultivace První inokulum: Do baňky s 27 ml sterilního anaerobního růstového média byly pipetovány 3 ml sterilního roztoku 0,5 M kyseliny jantarové a 0,1 ml sterilního roztoku citronanu. Očkovací kličkou bylo do média vneseno očko zásobní kultury z agaru. Obsah baňky byl rozmíchán a bakterie byly staticky pěstovány při 30°C po dobu 24 hodin.
31
Druhé inokulum: Do baňky s 27 ml sterilního anaerobního růstového média byly opět pipetovány 3 ml sterilního roztoku kyseliny jantarové a 0,1 ml sterilního roztoku citronanu. Médium však bylo zaočkováno 1 ml rozmíchané suspenze prvního inokula. Doba pěstování byla opět 24 hodin při 30°C. Vlastní kultivace: Do Erlenmeyerovy baňky s 900 ml sterilního anaerobního růstového média bylo přidáno 100 ml kyseliny jantarové, 3 ml citronanu a celé druhé inokulum. Pěstovalo se opět po dobu 24 hodin při teplotě 30°C. 5.2.1.4. Sklízení buněk Buňky byly centrifugací odděleny od kultivačního média (4620 g, 30 min, 4°C), sediment byl rozsuspendován v 0,1 M fosfátovém pufru (pH=7,3) a znovu zcentrifugován za stejných podmínek. Centrifugace buněk rozsuspendovaných v 0,1 M fosfátovém pufru proběhla celkem 2x. Nakonec byly buňky zředěny malým mnoţstvím 0,1 M fosfátového pufru a zhomogenizovány. 5.2.1.5. Stanovení sušiny buněk Do jedné, předem zváţené váţenky se napipetoval 1 ml suspenze buněk, do druhé váţenky 1 ml 0,1 M fosfátového pufru. Obě váţenky se umístily na tři hodiny do sušárny s teplotou 110°C. Po vychladnutí se váţenky zváţily a byla stanovena sušina po korekci na hmotnost přítomného pufru. 5.2.2. Imobilizace buněk Buňky byly imobilizovány podle návodu firmy LentiKat’s a.s. [24] Nejprve se připravil stabilizátor rozpuštěním prášku v destilované vodě podle poměru uvedeného na obalu, následně se vysterilizoval 20 minut při 121°C. Samotný gel (speciálně upravený PVA roztok, sterilně uzavřený v lahvičce) se rozpustil v mikrovlnné troubě na homogenní roztok během pár minut. Následně se nechal zchladit na teplotu vhodnou pro buňky, ale zároveň se muselo vzít v úvahu, aby roztok moc nezgelovatěl. V plastové uzavíratelné nádobce se smíchal gel se suspenzí buněk v poměru 20:5 ml. Po řádném promíchání otáčením nádobky se gel s buňkami 32
přelil do injekční stříkačky s jehlou (krátkou a širokou) a kapaly se kapky na předem zváţené plastové Petriho misky. Po nakapání kaţdé misky bylo potřeba ji zváţit, čímţ se zjistila (po odečtení váhy prázdné misky) váha mokrých kapek. Misky s nakapaným biokatalyzátorem se nechaly na vzduchu zgelovatět na 28% vlhkost. Po zgelovatění se biokatalyzátor na miskách přelil připraveným stabilizátorem, který po 3 minutách usnadnil odstranění biokatalyzátoru z misek. Následně se biokatalyzátor nechal do druhého dne v kádince se stabilizátorem, aby biokatalyzátor nabobtnal do původní velikosti a měl maximální mechanickou stabilitu. Poté se biokatalyzátor uchovával při 6°C v kádince s 0,1 M fosfátovým pufrem (pH = 7,3). 5.2.3. Měření nitrátreduktasové aktivity imobilizovaného biokatalyzátoru lentikats (s bakterií Paracoccus denitrificans) vsádkovým způsobem Do 5 eppendorfových zkumavek (2 ml) se naváţily různé naváţky biokatalyzátoru a napipetovaly 2 ml připraveného média (1 mM KNO3, 50 mM kyselina jantarová, 0,1 M fosfátový pufr), (pH = 7,3), které se před tím probublávalo 20 minut argonem, do šesté zkumavky se napipetovalo médium bez biokatalyzátoru. Naplněné zkumavky se inkubovaly 10 minut při teplotě 30°C. Během inkubace se několikrát promíchaly převrácením dnem vzhůru. Poté byly odebrány vzorky, které se 10 krát naředily destilovanou vodou a změřila se absorbance na spektrofotometru (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech) při 215 nm. Jako slepý vzorek byla pouţita destilovaná voda. Aktivita byla vypočítána ze směrnice přímky závislosti látkového mnoţství dusičnanu na naváţce buněk. 5.2.4. Měření nitrátreduktasové aktivity neimobilizovaných buněk bakterie Paracoccus denitrificans vsádkovým způsobem Do 5 eppendorfových zkumavek (2 ml) se napipetovaly různé objemy buněk a 2 ml připraveného média (1 mM KNO 3, 50 mM kyselina jantarová, 0,1 M fosfátový pufr), (pH = 7,3), které se před tím probublávalo 20 minut argonem, do šesté zkumavky se napipetovalo médium bez buněk. Naplněné zkumavky se inkubovaly 10 minut při teplotě 30°C. Během inkubace se několikrát promíchaly převrácením dnem vzhůru. Poté se zkumavky stočily na centrifuze (Mini Spin plus, 33
Eppendorf) 5 minut při 14000 g. Ze supernatantů byly odebrány vzorky, které se 10 krát naředily destilovanou vodou a změřila se absorbance na spektrofotometru (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech) při 215 nm. Jako slepý vzorek byla pouţita destilovaná voda. Aktivita byla vypočítána ze směrnice přímky závislosti látkového mnoţství dusičnanu na naváţce buněk. 5.2.5. Měření oxidasové aktivity imobilizovaného biokatalyzátoru lentikats (s bakterií Paracoccus denitrificans) Clarkovou elektrodou Do horní nádobky aparatury se nalilo médium obsahující 0,1 M fosfátový pufr a 20 mM kyselinu jantarovou a probublávalo se vzduchem. Na počítači v programu PSLite se nastavily poţadované parametry metody. Do spodní nádobky s magnetickým míchadlem se napipetovaly 3,4 ml probublaného média, vloţila elektroda a spustilo se měření. Po ustálení signálu se po zvednutí elektrody přidala zvolená naváţka biokatalyzátoru a elektroda se opět vloţila zpět. Počkalo se nějakou dobu na odezvu a pak se přidalo malé mnoţství bezvodého dithioničitanu sodného. Opět se počkalo na ustálení křivky. Následně se měření ukončilo a naměřené hodnoty uloţily. Spodní nádobka se důkladně vypláchla a měřilo se další měření s jinou naváţkou biokatalyzátoru. Aktivita byla vypočítána z rovnice přímky, a to z části křivky naměřené po přidání biokatalyzátoru a rozdílu nejvyšší a nejniţší ustálené hodnoty celé křivky. 5.2.6. Měření stability imobilizovaného biokatalyzátoru lentikats (s bakterií Paracoccus denitrificans) při uchovávání v 0,1 M fosfátovém pufru při 6°C Do eppendorfovy zkumavky (2 ml) se naváţilo 0,25 g biokatalyzátoru a napipetovaly 2 ml připraveného média (1 mM KNO 3, 50 mM kyselina jantarová, 0,1 M fosfátový pufr), (pH = 7,3), které se před tím probublávalo 20 minut argonem, do druhé zkumavky se napipetovalo médium bez biokatalyzátoru. Naplněné zkumavky se inkubovaly 60 minut při teplotě 30°C. Během inkubace se několikrát promíchaly převrácením dnem vzhůru. Poté byly odebrány vzorky, které se
10
krát
naředily
destilovanou
vodou
a
změřila
se
absorbance
na spektrofotometru (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech) při 215 nm. Jako slepý vzorek byla pouţita destilovaná voda. 34
Za 3 týdny byla stejným způsobem změřena aktivita stejné naváţky biokatalyzátoru. Aktivita byla vypočítána podle vzorce: aktivita = (((Amédium-Avzorek,průměr)/Amédium)*n)/m/t = nmol . min-1 . g-1 A - absorbance média nebo vzorku -
n - látkové mnoţství NO3 v médiu, [n] = nmol m - naváţka biokatalyzátoru, [m] = g t - čas, [t] = s 5.2.7. Měření závislosti aktivity imobilizovaného biokatalyzátoru lentikats (s bakterií Paracoccus denitrificans) na teplotě Do 18 eppendorfových zkumavek (2 ml) se naváţily stejné naváţky biokatalyzátoru (0,25 g) a napipetovaly 2 ml připraveného média (1 mM KNO 3, 50 mM kyselina jantarová, 0,1 M fosfátový pufr), (pH = 7,3), které se před tím probublávalo 20 minut argonem, do 6 zkumavek se napipetovalo médium bez biokatalyzátoru. Naplněné zkumavky se inkubovaly 60 minut při šesti různých teplotách (50, 40, 30, 20, 10 a 6°C), vţdy 3 zkumavky s biokatalyzátorem a médiem a 1 pouze s médiem při jedné teplotě. Během inkubace se několikrát promíchaly převrácením dnem vzhůru. Poté byly odebrány vzorky, které se 10 krát naředily destilovanou vodou a změřila se absorbance na spektrofotometru (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech) při 215 nm. Jako slepý vzorek byla pouţita destilovaná voda. Aktivita byla vypočítána podle vzorce: aktivita = (((Amédium-Avzorek,průměr)/Amédium)*n)/m/t = μmol . min-1 . g-1 A - absorbance média nebo vzorku -
n - látkové mnoţství NO3 v médiu, [n] = μmol m - naváţka buněk, [m] = mg t - čas, [t] = s Ze získaných hodnot se určila aktivační energie Ea, a to podle vzorce: v = k . e-(Ea/RT) ln v = ln k - (Ea/R) . (1/T) směrnice přímky = - (Ea/R) 35
5.2.8.
Měření
závislosti
aktivity
neimobilizovaných
buněk
bakterie
Paracoccus denitrificans na teplotě Do 18 eppendorfových zkumavek (2 ml) se napipetovaly stejné objemy buněk (30 μl) a 2 ml připraveného média (1 mM KNO 3, 50 mM kyselina jantarová, 0,1 M fosfátový pufr), (pH = 7,3), které se před tím probublávalo 20 minut argonem, do 6 zkumavek se napipetovalo médium bez biokatalyzátoru. Naplněné zkumavky se inkubovaly 60 minut při šesti různých teplotách (50, 40, 30, 20, 10 a 6°C), vţdy 3 zkumavky s biokatalyzátorem a médiem a 1 pouze s médiem při jedné teplotě. Během inkubace se několikrát promíchaly převrácením dnem vzhůru. Poté se zkumavky stočily na centrifuze (Mini Spin plus, Eppendorf) 5 minut při 14000 g. Ze supernatantů byly odebrány vzorky, které se 10 krát naředily destilovanou vodou a změřila se absorbance na spektrofotometru (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech) při 215 nm. Jako slepý vzorek byla pouţita destilovaná voda. Aktivita byla vypočítána podle vzorce: aktivita = (((Amédium-Avzorek,průměr)/Amédium)*n)/m/t = μmol . min-1 . g-1 A - absorbance média nebo vzorku -
n - látkové mnoţství NO3 v médiu, [n] = μmol m - naváţka buněk, [m] = mg t - čas, [t] = s Ze získaných hodnot se určila aktivační energie Ea, a to podle vzorce: v = k . e-(Ea/RT) ln v = ln k - (Ea/R) . (1/T) směrnice přímky = - (Ea/R) 5.2.9. Měření stability imobilizovaného biokatalyzátoru lentikats (s bakterií Paracoccus denitrificans) při teplotě 50°C Do 3 eppendorfových zkumavek (2 ml) se naváţily stejné naváţky biokatalyzátoru (0,25 g) a napipetovaly 2 ml 0,1 M fosfátového pufru. Zkumavky se temperovaly 60 minut při teplotě 50°C. Poté byl fosfátový pufr vyměněn za médium (1 mM KNO3, 50 mM kyselina jantarová, 0,1 M fosfátový pufr), (pH = 7,3), které se před tím probublávalo 20 minut argonem. Do 1 zkumavky se napipetovalo médium bez biokatalyzátoru. Naplněné zkumavky se inkubovaly 60 minut při 30°C. Během kaţdé inkubace se několikrát promíchaly převrácením dnem vzhůru. 36
Poté byly odebrány vzorky, které se 10 krát naředily destilovanou vodou a změřila se absorbance na spektrofotometru (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech) při 215 nm. Jako slepý vzorek byla pouţita destilovaná voda. Aktivita byla vypočítána podle vzorce: aktivita = (((Amédium-Avzorek,průměr)/Amédium)*n)/m/t = nmol . min-1 . g-1 A - absorbance média nebo vzorku -
n - látkové mnoţství NO3 v médiu, [n] = nmol m - naváţka biokatalyzátoru, [m] = mg t - čas, [t] = s 5.2.10. Měření vlivu kyslíku na aktivitu imobilizovaného biokatalyzátoru lentikats (s bakterií Paracoccus denitrificans) Do dvou 100 ml Erlenmeyerových baněk temperovaných na 30°C bylo nalito 25 ml média (1 mM KNO 3, 50 mM kyselina jantarová, 0,1 M fosfátový pufr), (pH = 7,3). Do jedné baňky byl vháněn vzduch (kyslík), do druhé baňky byl vháněn dusík. Do kaţdé baňky bylo přidáno 3,05 g biokatalyzátoru. Po 1, 2 a 3 hodinách byly odebrány vzorky, které se 10 krát naředily, také čisté médium a změřila se absorbance na spektrofotometru (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech) při 215 nm. Jako slepý vzorek byla pouţita destilovaná voda. Z poklesu absorbance vzorku oproti absorbanci média byla vypočítána koncentrace dusičnanu. 5.2.11. Měření vlivu kyslíku na aktivitu neimobilizovaných buněk bakterie Paracoccus denitrificans Do dvou 100 ml Erlenmeyerových baněk temperovaných na 30°C bylo nalito 25 ml média (1 mM KNO3, 50 mM kyselina jantarová, 0,1 M fosfátový pufr), (pH = 7,3). Do jedné baňky byl vháněn vzduch (kyslík), do druhé baňky byl vháněn dusík. Do kaţdé baňky bylo napipetováno 214 μl buněk. Po 1 a 2 hodinách byly odebrány vzorky, které se stočily na centrifuze (Mini Spin plus, Eppendorf) 5 minut při 14000 g. Ze supernatantů byly odebrány vzorky, které se 10 krát naředily destilovanou vodou a změřila se absorbance na spektrofotometru (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech) při 215 nm. Jako slepý vzorek byla pouţita destilovaná voda.
37
Z poklesu absorbance vzorku oproti absorbanci média byla vypočítána koncentrace dusičnanu. 5.2.12. Měření výstupní koncentrace dusičnanu v průtočném reaktoru naplněném
imobilizovaným
biokatalyzátorem
lentikats
(s
bakterií
Paracoccus denitrificans) Kolona (kolona XK 16, GE Healthcare) byla naplněna 30 g biokatalyzátoru lentikats (s bakterií Paracoccus denitrificans) a temperována pomocí kryostatu (kryostat 9106, PolyScience) na 30°C. Kolonou protékal přes peristaltickou pumpu (LKB Pump P-1, Pharmacia) na promytí 0,1 M fosfátový pufr (pH = 7,3).
Obrázek 9: Aparatura pro měření výstupní koncentrace dusičnanu v průtočném reaktoru naplněném imobilizovaným biokatalyzátorem lentikats.
38
Bylo připraveno médium (pH = 7,3) o sloţení 0,1 M fosfát sodný, 10 mM sukcinát sodný a 1 mM NaNO3 a probublané 20 minut argonem. Médium bylo umístěno do kryostatu, utěsněno a temperováno na 30°C. Z média byl odebrán vzorek, který se 10 krát naředil destilovanou vodou. Následně bylo kolonou proháněno médium při různých průtokových rychlostech, vţdy od nejvyšší po nejniţší. Průtokové rychlosti se měnily aţ po ustálení koncentrace dusičnanu na výstupu. Frakce byly odebírány do zkumavek pomocí jímače frakcí (LKB FRAC200, Pharmacia). Z jednotlivých frakcí byly odebírány vzorky, které se 10 krát naředily destilovanou vodou a změřila se absorbance (i naředěného média) na spektrofotometru (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech) při 215 nm. Jako slepý vzorek byla pouţita destilovaná voda. Totéţ bylo změřeno i při temperování média a kolony při 20°C. Z poklesu absorbance vzorku oproti absorbanci média byla vypočítána koncentrace dusičnanu. 5.2.13. Zjištění přítomnosti dusitanu ve vzorcích (Griessova reakce) Nejprve byla naměřena kalibrace dusitanu. Z připraveného roztoku 1 mM NaNO2 byly ve zkumavkách namíchány různé koncentrace o objemu 1 ml (NaNO2 doplněn destilovanou vodou), následně bylo do kaţdé zkumavky přidáno 0,5 ml kyseliny sulfanilové (1% v 0,1 M HCl) a 0,5 ml α-naftylaminu (0,02% v 0,1 M HCl). Do jedné zkumavky NaNO2 přidán nebyl - poslouţil jako slepý vzorek. Všechny zkumavky se promíchaly na vortexu (TK3S, TecnoKartell) a nechaly se 30 minut stát. Pak se změřila absorbance při 524 nm. Při měření látkového mnoţství dusitanu ve vzorcích získaných při jednotlivých měřeních se postupovalo stejným postupem, jen místo NaNO 2 se do zkumavky napipetovalo 10 μl vzorku, který se doplnil na objem 1 ml destilovanou vodou. 5.2.14. Kjeldahlova metoda stanovení dusíku Do šesti mineralizačních tub se pipetovalo podle schématu: tuba č. 1 a 2
1 ml standardního 40 mM roztoku (NH4)2SO4 + 9 ml H20
tuba č. 3 a 4
1 g biokatalyzátoru + 10 ml H20
tuba č. 5 a 6
1 g polymeru + 10 ml H20 39
Do kaţdé tuby se přidalo ještě 5 ml koncentrované kyseliny sírové a 0,5 g mineralizačního katalyzátoru (směs CuSO4, MgSO4 a selenu). Tuby se umístily na mineralizační stojan, připojily na odtahový systém a zahřívaly na teplotu 420°C. Během prvních asi 5 minut odsávání par bylo potřeba nechat běţet vodní vývěvu na plný výkon, později se intenzita odsávání sníţila tak, aby se kyselé páry udrţovaly v horní části nástavce odtahu. Po úplném vyjasnění roztoku (čirý modrozelený roztok) se tuby zahřívaly ještě 1 hodinu. Pak se tuby nechaly při zapojeném odtahu 20 minut zchladnout ve stojanu a po zchladnutí se do kaţdé tuby přidalo po stěně 10 ml vody. Následovalo vydestilování amoniaku. Postupně byla kaţdá tuba nasazena na destilační přístroj (předem propařený proháněním vodní parou, asi 10 minut). Do tuby bylo vţdy přidáno 20 ml 40% NaOH pomocí pumpy, byl otevřen parní ventil a amoniak byl vydestilován do předlohy v titrační baňce obsahující 20 ml 2% kyseliny borité s přídavkem Tashiro indikátoru (směs bromkresolové zeleně a methylčerveně). Aţ se barva roztoku v předloze změnila z růţové na zelenou, odpočítával se čas destilace na 5 minut. Po 5 minutách destilace byl uzavřen parní ventil a destilace ukončena. +
Následovalo titrační stanovení koncentrace NH4 chlorovodíkovou.
Bod
ekvivalence
byl
indikován
0,01 M kyselinou
barevným
přechodem
acidobazického Tashiro indikátoru ze slabě zeleného do slabě růţového zbarvení.
40
6. Výsledky 6.1. Stanovení sušiny buněk Při první kultivaci činila sušina 36,3 mg buněk na 1 ml homogenizovaných buněk. Při druhé kultivaci byla sušina 99,7 mg. ml-1 a při třetí kultivaci činila sušina 71,2 mg buněk na 1ml homogenizovaných buněk.
6.2. Imobilizace buněk Postupem popsaným v kapitole materiál a metody byl produkován biokatalyzátor lentikats. Po imobilizaci buněk z první kultivace napěstovaných ve 3 litrech anaerobního růstového média bylo vytvořeno 51 g biokatalyzátoru se sušinou 7 mg buněk v 1 g biokatalyzátoru. Sušina v biokatalyzátoru byla určena z pouţitého mnoţství buněk. Biokatalyzátor lentikats s buňkami Paracoccus denitrificans vypadal, jak ukazuje obrázek 10, jako světle hnědé tuhé čočky s jednou rovnou stranou o průměru 5 mm a výšce 1 aţ 2 mm. Jeho tvar byl stálý.
Obrázek 10: Biokatalyzátor lentikats s buňkami Paracoccus denitrificans.
41
6.3.
Charakterizace
biokatalyzátoru
lentikats
s
bakterií
Paracoccus denitrificans Byla měřena nitrátreduktasová aktivita imobilizovaného biokatalyzátoru lentikats (s bakterií Paracoccus denitrificans) a neimobilizovaných buněk bakterie Paracoccus denitrificans vsádkovým způsobem. Vše bylo inkubováno 10 minut při 30°C. Během inkubace se obsah eppendorfových zkumavek (2 ml) několikrát promíchal převrácením dnem vzhůru. Pro imobilizované i neimobilizované buňky bylo vzato 5 různých naváţek. Hmotnost imobilizovaných buněk byla vypočítána z naváţky biokatalyzátoru (7 mg buněk v 1 g biokatalyzátoru). Médium obsahovalo 0,1 M fosfátový pufr, 50 mM kyselinu jantarovou a 1 mM KNO 3. Zkumavky s neimobilizovanými buňkami se před odebráním vzorku zcentrifugovaly (5 minut, 14000 g). Vzorky byly po naředění změřeny na spektrofotometru při 215 nm.
Obrázek
11:
Srovnání
nitrátreduktasové
aktivity
imobilizovaných
(ο)
a
neimobilizovaných (Δ) buněk bakterie Paracoccus denitrificans v závislosti na hmotnosti buněk. Inkubace 10 minut při 30°C. Médium (pH = 7,3) o sloţení 0,1 M fosfátový pufr, 50 mM kyselina jantarová, 1 mM KNO3. Hmotnost imobilizovaných buněk
byla
vypočítána
z naváţky biokatalyzátoru
biokatalyzátoru). 42
(7
mg
buněk
v1
g
Aktivita byla určena ze směrnice přímek. Pro imobilizované buňky činila 27,6 nmol.min-1.mg-1 a pro neimobilizované (volné) buňky 53,3 nmol.min-1.mg-1 (aktivity vztaţeny na mg buněk), tzn. imobilizací poklesla aktivita o 48 %. Taktéţ byla změřena oxidasová aktivita imobilizovaného biokatalyzátoru lentikats (s bakterií Paracoccus denitrificans) Clarkovou elektrodou. Byly pouţity dvě různé naváţky biokatalyzátoru a médium o sloţení 0,1 M fosfátový pufr a 20 mM kyselina jantarová. Ze směrnice přímky byla určena aktivita pro naváţku 0,06 g biokatalyzátoru 18,5 μmol.min-1.g-1 a pro naváţku 0,19 g biokatalyzátoru 5,7 μmol.min-1.g-1 (aktivity vztaţeny na g biokatalyzátoru). Bylo také zjištěno, ţe při uchovávání imobilizovaného biokatalyzátoru lentikats (s bakterií Paracoccus denitrificans) v 0,1 M fosfátovém pufru při 6°C nedocházelo k výraznému poklesu aktivity ani po třech týdnech. Aktivita byla měřena vsádkovým způsobem. Během měření byl vzorek biokatalyzátoru inkubován 60 minut při 30°C. Médium (pH = 7,3) obsahovalo 0,1 M fosfátový pufr, 50 mM kyselinu jantarovou a 1 mM KNO 3. Vzorky byly po naředění změřeny na spektrofotometru při 215 nm. Pomocí Kjeldahlovy metody pro stanovení dusíku se zjistilo, ţe v gelu pouţitém pro imobilizaci buněk nebyl přítomen dusík. Kjeldahlovou metodou je moţno v principu kvantifikovat obsah buněk. U všech měření byla zjišťována ve vzorcích přítomnost dusitanu Griessovou reakcí s kyselinou sulfanilovou (1% v 0,1 M HCl) a α-naftylaminem (0,02% v 0,1 M HCl). Akumulace dusitanu se nepozorovala, takţe denitrifikace probíhala správně.
6.4. Vliv teploty na aktivitu biokatalyzátoru lentikats s bakterií Paracoccus denitrificans Byla měřena aktivita buněk v biokatalyzátoru při šesti různých teplotách (stejná naváţka pro všechny teploty), (aktivity vztaţeny na mg buněk). Hmotnost 43
imobilizovaných buněk byla vypočítána z naváţky biokatalyzátoru (7 mg buněk v 1 g biokatalyzátoru).
Obrázek 12: Závislost aktivity buněk v biokatalyzátoru na teplotě. Naváţka biokatalyzátoru 0,25 g (z toho buněk 1,75 mg). Médium (pH = 7,3) o sloţení 0,1 M fosfátový pufr, 50 mM kyselina jantarová, 1 mM KNO 3. Hmotnost imobilizovaných buněk
byla
vypočítána
z naváţky biokatalyzátoru
(7
mg
buněk
v1
g
biokatalyzátoru). Doba inkubace byla pro kaţdou teplotu 60 minut. Během inkubace se obsah zkumavek několikrát promíchal převrácením dnem vzhůru. Médium (pH = 7,3) o sloţení 0,1 M fosfátový pufr, 50 mM kyselina jantarová, 1 mM KNO3. Vzorky byly po naředění změřeny na spektrofotometru při 215 nm. Ze získaných hodnot se určila aktivační energie Ea. Hodnota naměřená při 50°C nebyla pouţita pro výpočet aktivační energie, protoţe přirozený logaritmus nuly není definován a hodnota naměřená při 40°C, protoţe byl vidět vliv denaturace. Aktivační energie pro imobilizované buňky tedy činila 34,6 kJ/mol.
44
Obrázek 13: Výpočet aktivační energie ze závislosti přirozeného logaritmu aktivity buněk na teplotě. Naváţka biokatalyzátoru 0,25 g (z toho buněk 1,75 mg). Hmotnost imobilizovaných buněk byla vypočítána z naváţky biokatalyzátoru (7 mg buněk v 1 g biokatalyzátoru). Stejné měření bylo provedeno i s neimobilizovanými buňkami. Jen před odebráním vzorku se zkumavky s neimobilizovanými buňkami zcentrifugovaly (5 minut, 14000 g), (aktivity vztaţeny na mg buněk). Ze získaných hodnot se taktéţ určila aktivační energie E a. Hodnota naměřená při 50°C a při 40°C nebyla pro vliv denaturace vzata do výpočtu. Aktivační energie pro volné buňky tedy činila 24,4 kJ/mol.
45
Obrázek 14: Závislost aktivity volných buněk na teplotě. 3 mg buněk (30µl) (sušina 99,7 mg.ml-1). Médium (pH = 7,3) o sloţení 0,1 M fosfátový pufr, 50 mM kyselina jantarová, 1 mM KNO3.
Obrázek 15: Výpočet aktivační energie ze závislosti přirozeného logaritmu aktivity buněk (bez gelu) na teplotě. 3 mg buněk (30µl) (sušina 99,7 mg.ml-1). 46
Byla zjištěna stabilita imobilizovaného biokatalyzátoru lentikats (s bakterií Paracoccus denitrificans) při teplotě 50°C. Nejprve byla změřena aktivita biokatalyzátoru na počátku měření (vsádkově, inkubace při 30°C po dobu 60 minut, během inkubace se obsah zkumavek několikrát promíchal převrácením dnem vzhůru), pak byl biokatalyzátor 60 minut inkubován při 50°C v 0,1 M fosfátovém pufru, následně byla změřena aktivita po 60 minutové inkubaci při 30°C (vsádkově, během inkubace se obsah zkumavek několikrát promíchal převrácením dnem vzhůru). Aktivita byla měřena v médiu (pH = 7,3) o sloţení 0,1 M fosfátový pufr, 50 mM kyselina jantarová a 1 mM KNO3. Vzorky byly po naředění změřeny na spektrofotometru při 215 nm. Aktivita na počátku měření měla hodnotu 75 nmol.min-1.g-1, po 120 minutách (60 minut při 50°C a 60 minut při 30°C) klesla na hodnotu 30 nmol.min-1.g-1 (aktivity vztaţeny na g biokatalyzátoru).
6.5. Vliv kyslíku na aktivitu biokatalyzátoru lentikats s bakterií Paracoccus denitrificans Byl zjišťován vliv kyslíku na aktivitu biokatalyzátoru lentikats (s bakterií Paracoccus denitrificans). Bylo pouţito 3,05 g biokatalyzátoru (21,35 mg buněk) a 25 ml média.
Hmotnost
imobilizovaných
buněk
byla
vypočítána
z naváţky
biokatalyzátoru (7 mg buněk v 1 g biokatalyzátoru). Médium (pH = 7,3) obsahovalo 0,1 M fosfátový pufr, 50 mM kyselinu jantarovou, 1 mM KNO3. Do jedné baňky byl zaváděn vzduch (kyslík), do druhé baňky dusík. Baňky byly temperovány na 30°C. Vzorky byly po naředění změřeny na spektrofotometru při 215 nm. Stejné měření bylo provedeno s neimobilizovanými buňkami. Do baněk bylo napipetováno 214 μl buněk (21,34 mg), (sušina 99,7 mg.ml-1). Pro získání vzorku po měření bylo třeba odebrat z baněk vzorky, které se zcentrifugovaly (5 minut, 14000 g). Z takto zcentrifugovaných vzorků se odebraly vzorky na změření absorbance při 215 nm.
47
Obrázek 16: Vliv kyslíku na aktivitu biokatalyzátoru. 3,05 g biokatalyzátoru (21,35 mg buněk), 25 ml média. Médium (pH = 7,3) o sloţení 0,1 M fosfátový pufr, 50 mM kyselina jantarová, 1 mM KNO3. Do jedné baňky zaváděn vzduch (kyslík), do druhé baňky dusík. Hmotnost imobilizovaných buněk byla vypočítána z naváţky biokatalyzátoru (7 mg buněk v 1 g biokatalyzátoru).
Obrázek 17: Vliv kyslíku na aktivitu buněk. 21,34 mg buněk (214 μl, sušina 99,7 mg.ml-1), 25 ml média. Médium (pH = 7,3) o sloţení 0,1 M fosfátový pufr, 50 mM kyselina jantarová, 1 mM KNO3. Do jedné baňky zaváděn vzduch (kyslík), do druhé baňky dusík. 48
6.6.
Měření
výstupní
koncentrace
dusičnanu
v průtočném
reaktoru naplněném imobilizovaným biokatalyzátorem lentikats (s bakterií Paracoccus denitrificans) Kolona byla naplněna 30 g biokatalyzátoru (s buňkami Paracoccus denitrificans) a protékalo jí médium (pH = 7,3) o sloţení 0,1 M fosfát sodný, 10 mM sukcinát sodný a 1 mM NaNO3. Průtok média se sníţil vţdy aţ po ustálení koncentrace dusičnanu. Frakce byly odebírány jímačem frakcí, vţdy jedna frakce po dobu 2 minut. Frakce byly 10 krát naředěny a byla změřena absorbance při 215 nm. Nejprve byla kolona i médium temperována na 30°C. Při dalším měření byla temperována na 20°C.
Obrázek 18: Závislost výstupní koncentrace dusičnanu na průtokové rychlosti média (uvedena číslem v ml.min-1 u křivky). Kolona obsahovala 30 g biokatalyzátoru (s buňkami Paracoccus denitrificans) a protékalo jí médium (pH = 7,3) o sloţení 0,1 M fosfát sodný, 10 mM sukcinát sodný a 1 mM NaNO3. Kolona i médium temperovány na 30°C. 49
bubliny N2
Obrázek 19: Detail kolony naplněné biokatalyzátorem lentikats (s buňkami Paracoccus denitrificans).
Vznikající
bubliny dusíku
denitrifikace probíhala správně.
50
N2 naznačovaly,
ţe
Obrázek 20: Závislost procentuální konverze dusičnanu na průtokové rychlosti (u, ml.min-1) média v koloně při teplotě 30°C (ο) a 20°C (X). Kolona obsahovala 30 g biokatalyzátoru (s buňkami Paracoccus denitrificans) a protékalo jí médium (pH=7,3) o sloţení 0,1 M fosfát sodný, 10 mM sukcinát sodný, 1 mM NaNO 3.
51
7. Diskuze 7.1.
Charakterizace
biokatalyzátoru
lentikats
s
bakterií
Paracoccus denitrificans Podařilo se zavést techniku imobilizace buněk firmy LentiKat‘s, která poskytuje stabilní gel. Mechanické vlastnosti gelu zůstaly zachovány po dlouhou dobu pouţívání i uchovávání. Také aktivita buněk zůstala po 3 týdny zachována při uchovávání v 0,1 M fosfátovém pufru při 6°C. Imobilizací klesla aktivita buněk oproti neimobilizovaným buňkám o 48 %. Výtěţek biokatalyzátoru byl 7 mg buněk na 1 gram biokatalyzátoru. V naší laboratoři bylo zjištěno, ţe pokud byl k imobilizaci bakterie Paracoccus denitrificans pouţit alginát sodný, který vykazoval nízkou pevnost a elasticitu, docházelo po vloţení biokatalyzátoru do růstového média k rozkladu gelu a uvolňování buněk do okolí. Následně byl k imobilizaci pouţit gel ve sloţení 5 g polyvinylalkoholu, 4 g alginátu sodného, to vše rozpuštěné ve 43 ml Tris pufru (25mM) a s přídavkem 0,9 g NaCl. Po přídavku suspenze buněk byly kapány kuličky do 4% roztoku CaCl 2. Následně byl biokatalyzátor několikrát zmraţen a rozmraţen za tvorby tzv. kryogelu. Výtěţek biokatalyzátoru byl 4,9 mg.g-1. Po vloţení biokatalyzátoru do růstového média byl biokatalyzátor zvětšený a vykazoval menší pevnost neţ biokatalyzátor, který v růstovém médiu nebyl. Po vyschnutí při laboratorní teplotě se velikost biokatalyzátoru vrátila do původní velikosti. Zatímco aktivita buněk imobilizovaných pomocí biotechnologie lentikats činila 27,6 nmol.min-1.mg-1, aktivita buněk imobilizovaných v alginátu ve směsi s polyvinylalkoholem byla 2,63 nmol.min-1.mg-1. [25] Rosenberg a kol. pouţili k imobilizaci β-galaktosidasy izolované z Aspergillus oryzae taktéţ biotechnologii lentikats, tedy jako nosič polyvinylalkohol. Po imobilizaci se aktivita enzymu sníţila na 32 % jeho původní aktivity (aktivita neimobilizovaného enzymu byla 25 μmol.min-1 na 1 g enzymu). Během měření a dlouhodobého pouţívání se aktivita enzymu nesníţila. Ke sníţení aktivity nedošlo ani po 14 měsících uchovávání biokatalyzátoru při 4°C a pH 4,5. [26]
52
7.2. Vliv teploty na aktivitu biokatalyzátoru lentikats s bakterií Paracoccus denitrificans Teplota výrazně ovlivňuje aktivitu buněk, ať uţ imobilizovaných, tak neimobilizovaných (volných). Jako optimální teplota vychází z těchto měření teplota 30°C. Při vyšších teplotách dochází k denaturaci buněk a zároveň dochází ke změně struktury gelu. Navíc se uplatňuje limitující difúze. Rosenberg a kol., kteří imobilizovali β-galaktosidasu z Aspergillus oryzae také pomocí biotechnologie lentikats, zjistili, ţe optimální teplotou pro volný enzym je 55°C. Tato teplota však není vhodná pro enzym imobilizovaný biotechnologií lentikats, protoţe při této teplotě docházelo k rozpouštění gelu. Navíc uţ při 50°C enzym unikal z gelu. [26] Při měření vzorků tekoucí vody z Shingobee River v Minnesotě (USA) byla zjištěna aktivační energie pro denitrifikaci 97,3 kJ.mol-1 a při jiném měření 81,5 kJ.mol-1. Měření bylo prováděno v rozsahu teplot 7,5 - 22°C. Výsledky byly srovnány s denitrifikací v usazeninách jezera (77 kJ.mol-1) zjištěných Messerem a Brezonikem [27] a v půdách břehů (47–89 kJ.mol-1) od Maaga a kol. [28]. [29] Při biologické denitrifikaci vody s ethanolem v membránovém reaktoru byla určena aktivační energie v teplotním rozmezí 10 - 40°C. Aktivační energie denitrifikace byla 38,3 kJ.mol-1. [30]
7.3. Vliv kyslíku na aktivitu biokatalyzátoru lentikats s bakterií Paracoccus denitrificans Široká škála bakterií můţe uţívat buď kyslík, nebo dusičnan jako alternativní terminální akceptory elektronů během respirace. Některé bakterie, jako Escherichia coli, redukují dusičnan jen na dusitan, zatímco jiné, jako Paracoccus denitrificans, redukují dusičnan přes dusitan na plynný dusík (N2). U obou druhů bakterií je nitrátreduktasa umístěna v plazmatické membráně. [31] Při zjišťování vlivu kyslíku na aktivitu imobilizovaných a neimobilizovaných buněk bylo zjištěno, ţe imobilizované buňky jsou méně citlivé k vlivu kyslíku. U neimobilizovaných
buněk
vlivem
kyslíku
denitrifikace
neprobíhala,
ale
u imobilizovaných buněk ano, ale ne tak jako u buněk, kterým byl zaváděn dusík.
53
Imobilizované buňky si vytvoří kolem sebe v gelu mikrookolí se sníţenou koncentrací kyslíku. Ţe nedochází k denitrifikaci u neimobilizovaných buněk, zjistil jiţ John P., kdyţ měřil pomocí elektrod (Clarkova kyslíková elektroda a nitrátová elektroda s kapalnou membránou) aerobní a anaerobní respiraci u bakterií Paracoccus denitrificans a Escherichia coli. Pokud byl v médiu přítomen kyslík, denitrifikace neprobíhala, pokud byl kyslík spotřebován, denitrifikace se rozběhla. [31]
7.4.
Měření
výstupní
koncentrace
dusičnanu
v průtočném
reaktoru naplněném imobilizovaným biokatalyzátorem lentikats (s bakterií Paracoccus denitrificans) Ze získaných hodnot výstupní koncentrace dusičnanu bylo patrné, ţe čím vyšší průtokovou rychlostí médium protékalo, tím byla aktivita imobilizovaných buněk niţší, byla niţší konverze dusičnanu na dusík. Také záleţelo na teplotě, na kterou byla temperována kolona a protékající médium s dusičnanem. Opět se jako vhodnější jevila teplota 30°C. Praktická pouţitelnost imobilizovaných buněk pro čištění odpadních vod by byla moţná, bylo by ale nutné upravit aktivitu buněk pro vyšší průtokové rychlosti, tzn. zvýšit mnoţství imobilizovaných bakterií. Příliš nízká průtoková rychlost by byla nevhodná. Při imobilizaci bylo postupováno podle návodu firmy LentiKat‘s, tedy poměr gel ku suspenze bakterií byl 20 ku 5 ml [24]. Při zachování poměru by bylo vhodné zvýšit sušinu bakteriální suspenze, čímţ by se zvýšila i sušina biokatalyzátoru. Denitrifikační bakterie potřebují pro svůj růst a respiraci organický zdroj uhlíku. [19] Mikroorganismy vyuţívají uhlíkových sloučenin pro stavbu buněčných struktur a při tvorbě energie. Zdrojem uhlíků pro procesy denitrifikace můţe být samotné organické znečištění odpadní vody, hydrolyzovaný nebo okyselený primární kal nebo častěji externí zdroj uhlíku, tzn. průmyslové zbytky (z pivovarů, mléčného průmyslu, cukrovarnického průmyslu) a průmyslové produkty (methanol, ethanol, kyselina octová). [32]
54
8. Shrnutí Denitrifikace je jednou z fází koloběhu dusíku v přírodě. Při denitrifikaci -
dochází k postupné přeměně dusičnanu NO3 přes různé meziprodukty aţ na elementární
dusík
N2.
Jednotlivé
kroky
denitrifikace
jsou
katalyzovány
denitrifikačními enzymy. Denitrifikace vyţaduje anaerobní podmínky. Denitrifikace se vyuţívá např. při čištění odpadní vody. Imobilizace je technika, při které dojde k omezení pohybu buněk, ale nezmění se jejich metabolická aktivita. V diplomové práci byly buňky bakterie Paracoccus denitrificans imobilizovány biotechnologií firmy LentiKat’s do gelu z polyvinylalkoholu. V diplomové práci byl studován připravený biokatalyzátor, jeho stabilita, aktivita imobilizovaných buněk, vliv teploty a kyslíku na aktivitu imobilizovaných buněk. Vliv teploty a kyslíku byl srovnán s volnými neimobilizovanými buňkami. Bylo zjištěno, ţe imobilizace sniţuje aktivitu buněk. Kyslík méně ovlivňuje imobilizované buňky a stabilita při uchovávání imobilizovaných buněk v chladnu neklesá. Optimální teplotou pro denitrifikaci je 30°C. Byla naplněna kolona biokatalyzátorem a byl sledován vliv průtokové rychlosti a teploty na denitrifikaci. Při vysokých rychlostech byla konverze dusičnanu niţší neţ při niţších rychlostech.
55
9. Summary Denitrification is one of the phases of the nitrogen cycle in nature. When -
denitrification occurs a gradual conversion of nitrate NO 3 through the various intermediate products to elementar nitrogen N 2. The individual steps are catalyzed denitrification
enzymes.
Denitrification
requires
anaerobic
conditions.
Denitrification is used for example in the purification of waste water. Immobilization is a technique that leads to restrictions on the movement of cells, but not change their metabolic activity. In this thesis, the cells of bacteria Paracoccus denitrificans were immobilized by biotechnology company LentiKat's in the gel polyvinylalcohol. In the thesis was studied stability of prepared biocatalyst, activity of immobilized cells, the effect of temperature and oxygen on the activity of immobilized cells. Effect of temperature and oxygen was compared with free cells. It was found that immobilization reduces the activity of cells. Oxygen affects the the immobilized cells less than free cells and stability of immobilized cells when they were kept in a cool didn´t decline. The optimum temperature for denitrification is 30°C. Column was filled with biocatalysts and examined the effect of flow rate and temperature on denitrification. At high speeds the conversion of nitrate is lower than at lower speeds.
56
Literatura
1
F. C. Boogerd (1984). Energetic aspects of denitrification in Paracoccus denitrificans.
2
S. J. Ferguson (1998). Nitrogen cycle enzymology. Current Opinion in Chemical Biology. Vol. 2, 182-193.
3
P. Pitter (1981). Hydrochemie. Praha: SNTL – Nakladatelství technické literatury.
4
I. Moura, J. J. Moura (2001). Structural aspects of denitrifying enzymes. Current Opinion in Chemical Biology. Vol. 5, 168-175.
5
webové stránky Biology Resources (2009). Anaerobic Respiration. bimantary27.blogspot.com.
6
M. Popl, J. Fähnrich (1999). Analytická chemie ţivotního prostředí. Praha: Vydavatelství VŠCHT.
7
Brněnské vodárny a kanalizace, a.s. Naše voda. Propagační materiál.
8
Brněnské vodárny a kanalizace, a.s. Bez vody by nebylo ţivota na Zemi. Propagační materiál.
9
webové stránky společnosti Brněnské vodárny a kanalizace, a.s. (2010). www.bvk.cz.
10
Brněnské vodárny a kanalizace, a.s. Březovské vodovody. Propagační materiál.
57
11
webové stránky společnosti Fontanus vyrábějící filtry pro konečnou úpravu pitné vody, V. Michek (2000). www.fontanus.cz.
12
V. Michek (1992). Vlašim - zásobení města pitnou vodou. Návrh technologických opatření. Studie, Hydroprojekt Praha.
13
H. Koubíková (1980). Úprava vody s obsahem sloučenin fosforu a dusíku. Závěrečná zpráva úkolu C 16-331-030-03, VÚV Praha.
14
Sbírka zákonů č. 252/2004 (2004). Vyhláška ze dne 22. dubna 2004, kterou se stanoví hygienické poţadavky na pitnou a teplou vodu a četnost a rozsah kontroly pitné vody. Ministerstvo zdravotnictví České republiky.
15
Ekosystem spol. s.r.o. (2004). Sanace lokalit kontaminovaných PAU a PCB. VaV - zpráva za III. kvartál 2004. www.ekosystem.cz.
16
A. C. Jen, M. C. Wake, A. G. Mikos (1996). Rewiew: Hydrogels for cell immobilization. Biotechnology and Bioengineering. Vol. 50, 357-364.
17
I. S. Chang, Ch. I. Kim, B. U. Nam (2005). The influence of poly-vinylalcohol (PVA) characteristics on the physical stability of encapsulated immobilization media for advanced wastewater treatment. Process Biochemistry. Vol. 40, 3050-3054.
18
S. H. Song, S. S. Choi, K. Park, Y. J. Yoo (2005). Novel hybrid immobilization of microorganisms and its applications to biological denitrification. Enzyme and Microbial Technology. Vol. 37, 567–573.
19
G.-m. Cao, Q.-x. Zhao, X.-b. Sun, T. Zhang (2002). Characterization of nitrifying and denitrifying bacteria coimmobilized in PVA and kinetics model of biological nitrogen removal by coimmobilized cells. Enzyme and Microbial Technology. Vol. 30, 49-55.
58
20
F. J. Zhang (1992). Biodenitrification Technology. China Environmental Science Press. 17–30.
21
webové
stránky
společnosti
LentiKat’s,
a.s.
vyrábějící
biokatalyzátory pro průmyslové využití (2006). www.lentikats.eu.
22
J. Trögl, V. Pilařová, J. Měchurová, J. Krudencová, P. Janoš, A. Boušková, J. Mrákota, R. Stloukal, L. Čechovská (2009). Denitrifikace zasolených
vod
po
regeneraci
iontoměničových
kolon
pomocí
biotechnologie lentikats. centrum-sanace.cs.cas.cz.
23
S. Kříženecká, J. Trögl, V. Pilařová, H. Buchtová, L. Čechovská (2009). Čištení specifických odpadních vod pomocí imobilizovaných mikroorganismů. Studia Oecologica. Vol. 1, 95-103.
24
GeniaLab® BioTechnologie (2004). LentiKats® Tips&Tricks. www.geniaLab.de/download/tt-english.pdf
25
P. Mikulicová (2009). Imobilizované mikroorganismy-příprava a pouţití. Bakalářská práce.
26
M. Rosenberg, Z. Grosová, M. Rebroš, M. Šipocz, B. Sedláčková (2008). Entrapment of β-galactosidase in polyvinylalcohol hydrogel. Biotechnology letters. Vol. 30, 763-767.
27
J. J. Messer and P. L. Brezonik (1983). Laboratory evaluation of kinetic parameters for lake sediment denitrification models. Ecological Modelling. Vol. 21, 277–286.
28
M. Maag, M. Malinovsky, S. M. Nielsen (1997). Kinetics and temperature dependence of potential denitrification in riparian soils. Journal of Environmental Quality. Vol. 26, 215–223.
59
29
R. W. Sheibley, A. P. Jackman, J. H. Duff, F. J. Triska (2003). Numerical modeling of coupled nitrification-denitrification in sediment perfusion cores from the hyporheic zone of the Shingobee River, MN. Advances in Water Resources. Vol. 26, 977-987.
30
B. Delanghe, F. Nakamura, H. Myoga, Y. Magara (1994). Biological denitrification with ethanol in a membrane bioreactor. Environmental Technology. Vol. 15, 61 - 70.
31
P. John (1977). Aerobic and anaerobic bacterial respiration monitored by electrodes. Journal of General Microbiology. Vol. 98, 231 -238.
32
M. Winkler (2008). Optimální poměry nutrientů pro čištění odpadních vod. Aplikační zpráva. www.hach-lange.cz.
60
