NUKLEINSAV-AMPLIFIKÁCIÓS MÓDSZEREK

Nukleinsav-amplifikációs módszerek

Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.5.5. - 1

07/2006:20621

2.6.21. NUKLEINSAV-AMPLIFIKÁCIÓS MÓDSZEREK

1. BEVEZETÉS A nukleinsav-amplifikációs módszerek két különböző elven alapulnak: 1. egy cél-nukleinsavszekvencia amplifikációja, például polimeráz láncreakció (PCR), ligáz láncreakció (LCR) vagy izoterm ribonukleinsav-(RNS)amplifikáció alkalmazásával, 2. egy hibridizációs szignál amplifikációja, például dezoxiribonukleinsav (DNS) esetében az elágazó DNS (bDNS) módszer alkalmazásával. Ebben az esetben a szignál-amplifikációt anélkül érjük el, hogy a nukleinsavat ismétlődő amplifikációs ciklusoknak vetnénk alá. Ez az általános fejezet a PCR-módszert írja elő referenciamódszerként. Egyéb módszerek is alkalmazhatók, amennyiben az alábbiakban előírt minőségi követelményeknek megfelelnek. 2. ALKALMAZÁSI TERÜLET E fejezet rögzíti a minta előkészítésére, a DNS-szekvenciák in vitro amplifikációjára és a specifikus PCR-termék kimutatására vonatkozó követelményeket. A PCR segítségével ki tudunk mutatni meghatározott DNSszekvenciákat. RNS-szekvenciákat is ki tudunk mutatni, ha a ribonukleinsavat fordított átírással (reverz transzkripcióval) átalakítjuk a komplementer DNS-sé (cDNS), és ezt követően vetjük alá amplifikációnak. 3. A MÓDSZER ELVI ALAPJAI A PCR olyan eljárás, amely lehetővé teszi DNS-szakaszok és RNS-szakaszok specifikus in vitro amplifikációját, utóbbiakét cDNS-sé történt fordított átírásuk után.



A kettős szálú DNS szimplaszálúvá denaturálása után két, ellentétes polaritású, szintetikus oligonukleotid primert (indító molekulát) rákapcsolunk az amplifikálandó DNS megfelelő komplementer szekvenciáira. A primerek és a komplementer DNS-szekvencia közti specifikus bázispár-képződés eredményeként kialakult, rövid, kétszálas szakaszok behatárolják az amplifikálandó DNS-szakaszt és kiindulási pontokat kínálnak egy hőre stabil DNS-polimerázzal végzendő in vitro DNS-szintézishez. A DNS-amplifikáció a következő szakaszokban (ciklusokban) zajlik le:

− a nukleinsav (célszekvencia) denaturálása hővel két szimpla szállá, − a primerek specifikus rákapcsolása a célszekvenciára megfelelő körülmények között;

− a két szimpla szálra kapcsolt primer meghosszabbítása DNS-polimeráz közreműködésével, megfelelő hőmérsékleten (DNS-szintézis). A ciklusok – a hővel történő denaturálás, a primerek rákapcsolása és a DNSszintézis – ismétlése a primerek által behatárolt DNS-szakaszok exponenciális amplifikációját eredményezi. A specifikus PCR-termék – az u.n. amplikon – számos, megfelelő specifitású és érzékenységű módszerrel detektálható. A multiplex PCR-meghatározások során több olyan primer-párt használnak, amelyeket a különböző célszekvenciák egyidejű, egyetlen reakcióban lezajló amplifikációjához terveztek. 4. VIZSGÁLATI ANYAG A PCR rendkívüli érzékenysége miatt a mintákat óvni kell attól, hogy idegen célszekvenciákkal szennyeződjenek. A vizsgálandó anyag mintavételéhez, eltartásához és szállításához olyan körülményeket kell biztosítani, hogy a célszekvencia bomlásának lehetőségét minimálisra csökkentsük. RNScélszekvenciák esetében speciális óvitézkedésekre van szükség, mert az RNS rendkívül érzékeny a ribonukleázok lebontó hatásával szemben. Tekintettel arra, hogy a hozzáadott reagensek – pl. antikoagulánsok, tartósítószerek – némelyike szintén zavarhatja a vizsgálat menetét, megfelelő gondossággal kell eljárni. 5. VIZSGÁLATI MÓDSZER



5.1. A szennyeződés megelőzése A szennyeződés kockázata indokolja, hogy a munkaterületeket – az alkalmazott anyagtól és technológiától függően – szigorúan elkülönítsük egymástól. Figyelembe kel venni a személyzet mozgását, a munkaruházatot, az anyagáramlást, a szellőztetési rendszert, valamint a szennyezések eltávolítására alkalmazott eljárásokat. A rendszert munkaterületekre (zónákra) kell osztani, ilyenek pl.

− a „master-mix” zóna (az a terület, ahol kizárólag templátmentes anyagokkal, pl. primerekkel, tompítóoldatokkal, stb. dolgoznak),

− elő-PCR zóna (az a terület, ahol kémszerekkel, mintákkal és kontrollokkal dolgoznak),

− PCR-amplifikáció zóna (az amplifikált anyagot zárt rendszerben kezelik), − utó-PCR zóna (a detektálás helye; az egyetlen terület, ahol az amplifikált anyagot nyitott rendszerben kezelik). 5.2. A minta előkészítése A minta előkészítése során az amplifikációra szánt célszekvenciát hatékony eljárással, reprodukálható módon kell kivonni, ill. felszabadítani a vizsgálandó anyagból, mégpedig úgy, hogy az amplifikáció a választott reakciókörülmények között kivitelezhető legyen. E célra számos fizikai-kémiai kivonó eljárás és/vagy dúsítási eljárás alkalmazható. A vizsgálandó anyagban jelenlévő adalékanyagok zavarhatják a PCR-t. A vizsgálandó anyagból származó inhibitorok jelenlétének ellenőrzésére a 7.3.2. pontban előírt eljárásokat kell alkalmazni. RNS-templátok esetében ügyelni kell a ribonukleáz-aktivitás kizárására. 5.3. Amplifikáció A célszekvencia PCR-amplifikációjának ciklusait meghatározott körülmények között kell végrehajtani; ilyenek a kettősszálú DNS denaturálásához, a primerek rákapcsolásához és meghosszabbításához alkalmazandó hőmérséklet-profil, a választott hőmérsékleteken végzett inkubációk időtartama, a felfűtés sebessége. Ezek különböző tényezőktől függnek. Ilyenek pl.:

− a primerek és a célszekvenciák hossza, valamint bázis-összetétele;



− a DNS-polimeráz típusa, a tompítóoldat összetétele és a reakcióelegy térfogata az amplifikáció folyamán;

− az alkalmazott termociklizáló készülék típusa, valamint a készülék, a reakcióedény és a reakcióelegy hővezetőképesség-viszonyai. 5.4. Kimutatás A PCR segítségével létrehozott amplikont mérete, szekvenciája, kémiai átalakítása, ill. ezen paraméterek kombinálásával azonosíthatjuk. A méret szerinti kimutatásra és jellemzésre alkalmas a gélelektroforézis (agaróz- vagy poliakrilamid-géllemezek alkalmazása vagy kapillárelektroforézis) vagy az oszlopkromatográfia (pl. folyadékkromatográfia). A szekvencia-összetétel alapján történő azonosításra és jellemzésre alkalmas a célszekvenciához illeszkedő, komplementer szekvenciával rendelkező próbafragmensek specifikus hibridizációja, vagy az amplikon hasítása célspecifikus támadáspontú, restrikciós-enzimmel. Azonosítás és jellemzés kémiai átalakítással is lehetséges, pl. egy fluorofór csoport bevitele után az amplikonok fluoreszcencia-gerjesztéssel detektálhatók. Az amplikonok radioizotóppal jelzett próbafragmensekkel kivitelezett reakció után radioaktivitás-méréssel, vagy enzimmel jelzett próbafragmensekkel végrehajtott reakció után enzimes immunanalitikai módszerekkel is kimutathatók. 6. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE Egy vizsgálaton belül az eredmény csak akkor értékelhető, ha a pozitív kontroll(ok) egyértelműen pozitív(ak) és a negatív kontroll(ok) egyértelműen negatív(ak). Minthogy a PCR módszer rendkívül érzékeny, de éppen emiatt a szennyeződés kockázata is nagy, a pozitív eredményeket meg kell erősíteni: a teljes vizsgálati eljárást – párhuzamosakkal – meg kell ismételni, és az ismételt vizsgálatot – amennyiben megoldható – a minta egy újabb részletével kell lefolytatni. A mintát pozitívnak tekintjük, ha az ismételt vizsgálatok közül legalább egy pozitív eredményt adott. Mérhető célszekvencia-határérték megállapítása után kvantitatív vizsgálati rendszerre van szükség. 7. MINŐSÉGBIZTOSÍTÁS 7.1. A PCR vizsgálati rendszer validálása



A validációs programnak a műszerek validálását és az alkalmazott PCR-módszer validálását egyaránt magában kell foglalnia. Ezzel kapcsolatban az ICHirányelvekre kell utalni (Q2B témakör): Az analitikai módszerek validálása; módszertan 1 . A PCR-vizsgálat validálásához nélkülözhetetlenek a megfelelő hivatalos referenciakészítmények vagy az olyan „házi” referenciakészítmények, amelyeket azoknak a célszekvenciáknak a Nemzetközi Standardjaira állítottak be, amelyekre a vizsgálati rendszer irányul. 7.1.1. A pozitív határérték ( pozitív „cut-off” pont) meghatározása A minőségi vizsgálatok validálása folyamán meg kell határozni a pozitív határértéket, melynek definíciója: a vizsgálati menetek 95 %-ában detektálható célszekvenciák legkisebb száma, a minta térfogategységére vonatkoztatva. Ez a határérték több, egymást kölcsönösen befolyásoló tényezőtől függ; ilyen a mintakivonat térfogata és az extrakciós módszer hatékonysága, a cél-RNS transzkripciója a komplementer DNS-sé, az amplifikációs folyamat és a kimutatási módszer. Amikor a PCR-rendszer kimutatási határát definiáljuk, utalni kell mindegyik célszekvencia „cut-off”-pontjára, valamint a vizsgálatnak e határérték feletti és alatti teljesítőképességére. 7.1.2. A mennyiségi meghatározás módszerei A mennyiségi meghatározások validálása folyamán a következő teljesítményjellemzőket kell megállapítani: torzításmentesség, pontosság, specificitás, a legkisebb meghatározható mennyiség, linearitás, mérési tartomány és robusztusság. 7.2. A reagensek minőségének ellenőrzése Minden olyan reagenst, amely az eljárás szempontjából döntő fontosságú, ellenőrizni kell, mielőtt a rutinszerű alkalmazás során felhasználásra kerülne. Elfogadásukat/visszavonásukat előre megállapított minőségi követelményekre kell alapozni. A primerek döntő fontosságú alkotóelemei a PCR-meghatározásnak, ezért tervezésük, tisztaságuk és felhasználásuk validálása a PCR-meghatározásban 1

Validation of Analytical Method: Methodology.



különös gondosságot igényel. Az amplikon specifikus kimutatása érdekében a primerek átalakíthatók (pl. konjugálás fluorofórral vagy antigénnel), ha az átalakítás nem gátolja a célszekvencia amplifikációjának pontosságát és hatékonyságát. 7.3. Sorozatellenőrzések 7.3.1. Külső kontrollok Annak érdekében, hogy a szennyeződés lehetőségét a legkisebbre csökkentsük, és a megfelelő érzékenységet biztosítsuk, minden PCR-vizsgálathoz szükség van a következő külső kontrollokra:

− pozitív kontroll: a pozitív kontroll meghatározott számú célszekvencia másolatot tartalmaz; ez a szám közel esik a pozitív határértékhez (pozitív cutoff értékhez közeli érték), megállapítása minden PCR-rendszerre egyedileg történik, és a rendszer pozitív cut-off értékének többszöröseként adják meg,

− negatív kontroll: megfelelő – a célszekvenciákat bizonyítottan nem tartalmazó – mátrixból vett minta. 7.3.2. Belső kontrollok A belső kontrollok olyan meghatározott nukleinsav-szekvenciák, amelyek, hacsak nincs más előírás, a primer kötőhelyeket tartalmazzák. A belső kontrollokat meghatározott hatékonysággal kell amplifikálni, és az amplikonoknak egyértelműen felismerhetőknek kell lenniük. A belső kontrolloknak ugyanolyan nukleinsav-típust (DNS-t vagy RNS-t) kell tartalmazniuk, mint a vizsgálandó anyagnak. A belső kontrollt célszerű a nukleinsav izolálása előtt adni a vizsgálandó anyaghoz; ebben az esetben a vizsgálat egészének (kivonás, reverz transzkripció, amplifikáció, kimutatás) kontrolljaként működik. 7.3.3. Határérték-kontroll A mennyiségi meghatározásokra vonatkozó határérték-kontroll olyan vizsgálati minta, amelyben a vizsgálandó alkotórész koncentrációja jelenti azt a határértéket, amelyet nem lehet átlépni. Az ilyen vizsgálati mintát – amelyben a vizsgálandó alkotórész NE-ben kifejezett mennyiségben van jelen – a mennyiségi meghatározások minden egyes menetében párhuzamosan kell vizsgálni a mintával. 7.4. Külső minőségellenőrzés



Külső minőségellenőrzési programokban való részvétel minden laboratórium és minden vizsgáló személy részére fontos PCR-minőségbiztosítási eljárás. A következő rész tájékoztató, útmutató jellegű.

A hepatitisz-C-vírus-ribonukleinsav (HCV-RNS) plazmakeverékekben történő kimutatására szolgáló nukleinsavamplifikációs módszerek (NAT) 2 validálása; útmutató 1. ALKALMAZÁSI TERÜLET A nukleinsav-amplifikációs analitikai eljárások többsége nukleinsav kimutatására alkalmas kvalitatív (kvantális) vizsgálat. Ezeket kiegészítheti néhány, akár „házon belül” kifejlesztett, akár kereskedelemből beszerzett készlettel végzett kvantitatív vizsgálat. A plazmakeverékek HCV-RNS-szennyezésének kimutatására megfelelőek a kvalitatív vizsgálatok. Ezek a Pharmeuropa Szakmai útmutató a cikkelyek kidolgozására c. kiadvány (1999, december, III. fejezet „Analitikai eljárások validálása”) által definiált szennyezés határérték-vizsgálatnak tekinthetők. A plazmakeverékek HCV-RNS-szennyezésének becsléséhez az útmutató csak a kvalitatív nukleinsav-amplifikációs analitikai eljárásokra ír elő validálási módszereket. Az ilyen analitikai eljárások validálásához a specifitás és a kimutatási határ tekinthető a két legfontosabb jellemzőnek. Ezen túlmenően az analitikai eljárás robusztusságát is értékelni kell. Mindamellett, a nukleinsav-amplifikáció validálásához általánosságban jelen útmutató is alapot képezhet. A cél egy komplett analitikai eljárás körvonalazása, kezdve a nukleinsav kivonásától egészen az amplifikált termékek kimutatásáig. Ha az analitikai eljárás egy részéhez vagy egészéhez kereskedelmi forgalomban kapható készletet (kit) használunk, a készlet gyártója által már elvégzett, dokumentált validációs vizsgálatokat már nem kell elvégezni. Mindazonáltal, a készletnek az adott célra vonatkozó teljesítőképességét (pl. kimutatási határ, robusztusság, kereszt-szennyeződés) a felhasználónak bizonyítania kell.

2

Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT).



2. SPECIFITÁS Specifitásnak nevezzük a nukleinsav egyértelmű becslésének lehetőségét a várhatóan jelenlévő, egyéb összetevők jelenlétében. A nukleinsav-amplifikációs analitikai eljárás specifitása függ a primerek és a próbafragmens megválasztásától (a végtermék analízise esetében) és a vizsgálati körülmények szigorúságától (mind az amplifikációs, mind a kimutatási szakaszt illetően). A primerek és a próbafragmensek megtervezésekor a primerek és próbafragmensek kimutatásának specifitását, azaz azt, hogy a vizsgálattal csak a HCV-RNS-t mutatjuk ki, a kiválasztott szekvenciákat adatbankokban publikált szekvenciákkal összehasonlítva kell vizsgálni. A HCV esetében a primereket (és a próbafragmenseket) a HCV-genomnak rendszerint az összes genotípusra nézve rendkívül állandó, 5’ nem-kódoló részének szakaszaiból választjuk. Az amplifikált terméket a számos módszer egyikével – pl. beillesztett primerekkel végzett amplifikációval, restrikciós enzim-analízissel, szekvencia-analízissel vagy adott specifikus próbafragmenssel történő hibridizációval – egyértelműen azonosítani kell. Az analitikai eljárás specifitásának validálása érdekében legalább 100 HCV-RNSnegatív plazmakeveréket kell megvizsgálni és inaktívnak találni. Inaktív plazmakeverékekből származó, megfelelő minták az Európai Gyógyszerminőségi Igazgatóságtól 3 szerezhetők be. Szintén a primerek, a próbafragmensek és a módszer paramétereinek megválasztásától függ, hogy az analitikai eljárás alkalmas-e az összes HCVgenotípus kimutatására. Az alkalmasságot jól jellemzett referenciakészítményekkel kell bizonyítani. Mindazonáltal, néhány genotípus (pl. a 6-os genotípus) mintájának beszerzési nehézségei miatt a leggyakoribb genotípusokat (Európában pl. az 1-es és a 3-as genotípust) kell megfelelő érzékenységgel kimutatni. 3. KIMUTATÁSI HATÁR Adott egyedi analitikai eljárás kimutatási határának nevezzük valamely mintában a nukleinsav azon legkisebb mennyiségét, amely kimutatható, de mennyiségileg nem feltétlenül határozható meg. 3

European Directorate for Quality of Medicines.



A nukleinsav-amplifikációs analitikai eljárással, amelyet plazmakeverékekben HCV-RNS kimutatására alkalmazunk, általában kvalitatív eredményeket kapunk. Csak kétféle eredmény lehetséges: pozitív vagy negatív. Noha ajánlott a kimutatási határ megállapítása, a nukleinsav-amplifikációs analitikai eljárás gyakorlati céljaira inkább a cut-off pontnak nevezett határértéket kell meghatározni. Ez a határérték, mint azt a 2.6.21. általános fejezetben definiáltuk, a vizsgálati menetek 95 %-ában detektálható célszekvenciák legkisebb száma, a minta térfogategységére vonatkoztatva. Ezt a határértéket befolyásolja a vizsgált egyedi mintákban lévő vírus-genomok megoszlása és az olyan tényezők, mint pl. az enzim-hatékonyság. Így az egyedi analitikai vizsgálati menetekre különböző 95 %-os cut-off értékek adódhatnak. A pozitív cut-off pont meghatározása céljából munkastandardból vagy WHO HCV 96/790 Nemzetközi Standardra beállított BRP hepatitis-C vírusból készült hígítási sorozatokat vizsgálunk különböző napokon, hogy megállapíthassuk az egyes vizsgálati menetek közti ingadozásokat. Legalább három, egymástól független hígítási sorozatot kell vizsgálni, elegendő számú párhuzamossal, úgy, hogy minden hígításra összesen 24 vizsgálati eredményt kapjunk, amelyeket azután statisztikai módszerrel értékelhetünk. Például, egy laboratóriumban vagy 3 hígítási sorozatot vizsgálhatnak különböző napokon, hígításonként 8 párhuzamossal, vagy 4 hígítási sorozatot különböző napokon, hígításonként 6 párhuzamossal, vagy 6 hígítási sorozatot különböző napokon, hígításonként 4 párhuzamossal. Annak érdekében, hogy a hígítások számát észszerű értéken tartsuk, egy előzetes vizsgálattal (pl. a plazmakeverékminta logaritmikus hígításaival) meg kell határozni a közelítő pozitív cut-off értéket (vagyis azt a legnagyobb hígítást, amely még pozitív jelet ad). Ezek után a hígítási tartományt az elővizsgálattal meghatározott cut-off pont köré választhatjuk (pl. a logaritmikus skálán 0,5 vagy ennél kisebb hígítási faktort és mátrixként egy negatív plazmakeveréket választva). Ezután megfelelő statisztikai módszerrel kiszámíthatjuk azt a HCV-RNS-koncentrációt, amelyet a vizsgálati menetek 95 %ban ki tudunk mutatni. Ezek az eredmények alátámaszthatják az analitikai eljárás meghatározáson belüli és napok közötti ingadozását is. 4. ROBUSZTUSSÁG Valamely analitikai eljárás robusztussága annak a mértéke, hogy a módszer paramétereinek kicsi, de szándékos változtatásai mennyire hatástalanok az



eljárásra; a robusztusság egyben jelzi a módszer megbízhatóságát is a normális alkalmazás során. A robusztusságot a kifejlesztés szakaszában kell megállapítani. Igazolni kell az analitikai eljárás megbízhatóságát a módszer paramétereinek szándékos változtatásaival szemben. Az NAT-ra nézve a módszer paramétereinek kis változtatásai is döntőek lehetnek. Mindazonáltal, a módszer robusztussága igazolható a kifejlesztés folyamán, ha a kémszerek (pl. MgCl2, primerek vagy dNTP) koncentrációinak kis változtatásainak hatását vizsgáljuk. A robusztusság bizonyítására legalább 20, véletlenszerűen választott HCV-RNS-negatív plazmakeveréket, melyeket az előzetesen meghatározott 95%-os cut-off érték háromszorosáig terjedő koncentrációban HCV-RNS-sel szennyeztünk, meg kell vizsgálni és pozitívnak kell találni. A robusztussággal olyankor is gondok keletkezhetnek, amikor a módszer alkalmazásakor egy kezdeti centrifugálásra van szükség, még a vírus-RNS kivonása előtt. Az ilyen módszerek robusztusságának vizsgálatára legalább 20 olyan plazmakeveréket kell megvizsgálni és pozitívnak találni, amelyek különböző mennyiségű HCV-RNS-t tartalmaznak, de a HCV-specifikus antitestek hiányoznak belőlük. A „kereszt-szennyeződések” megelőzését olyan, 20 mintából álló sorozat gondos detektálásával kell igazolni, amely váltakozva tartalmaz negatív plazmakeverékmintákat és olyan mintákat, amelyek HCV-vel erősen szennyezett (a 95 %-os cutoff értéknek legalább százszorosát vagy legalább 104 NE/ml-t tartalmazó) negatív plazmakeverékekből állnak. 5. MINŐSÉGBIZTOSÍTÁS Az olyan biológiai vizsgálatok esetében, mint pl. a NAT, speciális problémák merülhetnek fel, amelyek mind a validálást, mind az eredmények értelmezését befolyásolhatják. A vizsgálati eljárásokat részletesen le kell írni „Szabványos műveleti eljárások” (SOPs) 4 formájában. Ezeknek tartalmazniuk kell a következőket:

− a mintavétel módja (a tartály típusa, stb.), − a mini-plazmakeverékek készítése (adott esetben), − az eltartás körülményei az analízis előtt, 4

standard operating procedures



− a vizsgálati körülmények, beleértve a vírus-RNS kereszt-szennyeződésének vagy lebomlásának megakadályozására tett elővigyázatossági intézkedések, a reagensek és az alkalmazott referenciakészítmények pontos leírása,

− az alkalmazott készülék pontos leírása, − az eredmények kiszámítására alkalmazott összefüggések részletezése, beleértve a statisztikai értékelést is. A megfelelő sorozatellenőrzés (pl. megfelelő hígítású BRP hepatitis-C vírus vagy WHO HCV 96/790 Nemzetközi Standardra beállított HCV-mintával „szennyezett” plazma alkalmazásával) kielégítő rendszeralkalmassági ellenőrzésnek tekinthető és minden körülmények között biztosítja az analitikai eljárás megbízhatóságát. A technikai felszerelés minősítése: a felhasznált berendezés minden lényeges részét megfelelő beüzemelési és működési minősítési program szerint kell ellenőrizni. Lényeges eszköz (pl. termociklizáló) cseréje után ismét dokumentálni kell az analitikai eljárás teljesítőképességét, mégpedig egy, az előzetesen meghatározott 95%-os cut-off érték háromszorosáig terjedő koncentrációban HCV-RNS-sel szennyezett plazmakeverékből vett, 8 párhuzamos minta vizsgálatával. Valamennyi eredménynek pozitívnak kell lennie. A vizsgáló személy minősítése: A vizsgálat munkálataiba bevont valamennyi személynek megfelelő minősítő programot kell teljesítenie. A sikeres képzés igazolására az előzetesen meghatározott 95%-os cut-off érték háromszorosáig terjedő koncentrációban HCV-RNS-sel szennyezett plazmakeverékből vett, legalább 8 párhuzamos minta vizsgálatát kell végrehajtani. Ezt a vizsgálatot (a 8 párhuzamos mintáét) kétszer meg kell ismételni, két különböző napon, vagyis összesen 24 vizsgálatot kell végezni három különböző napon. Valamennyi eredménynek pozitívnak kell lennie.

NUKLEINSAV-AMPLIFIKÁCIÓS MÓDSZEREK

Recommend Documents