Laboratoře AGEL a.s., klinické laboratoře, tel.: 800 700 701 Laboratoř imunologie a sérologie Revoluční 2214/35, Nový Jičín 741 01, tel.: 556 416 242-244
NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE Autoimunitní choroby jsou onemocnění, při kterém autoprotilátky nebo autoreaktivní T-lymfocyty reagují s endogenními antigeny s následným poškozením vlastních buněk a tkání. Autoimunitní onemocnění se dají zhruba rozdělit na systémová a orgánově specifická, hranice mezi těmito chorobami ale není ostrá. Celková incidence autoimunitních onemocnění v populaci je kolem 5%. Pro diagnostiku autoimunitních chorob se využívá zejména technika nepřímé imunofluorescence, kdy se prokazuje přítomnost autoprotilátek. Zde se na lidské protilátky, které reagovaly s příslušným antigenem, váží zvířecí imunoglobuliny označené fluorochromem. Fluorochrom je nízkomolekulární chemická substance, která absorbuje energii zprostředkovanou buď světlem tvořeným rtuťovou výbojkou nebo laserovým paprskem. Pro každý fluorochrom je stanovena optimální vlnová délka, při které je daný fluorochrom excitován a následně emituje světlo určené vlnové délky ve viditelném spektru. Nejčastěji používaný fluorochrom je FITC (Fluorescein IsoThioCyanát), který má absorpční maximum v oblasti 490 až 495 nm a emituje světlo o vlnové délce zhruba 520 nm v zelené oblasti spektra. Při hodnocení tkáně fluorescenčním mikroskopem pak nalezení typického fluorescenčního zbarvení (zeleného v případě FITC) značí přítomnost autoprotilátek. Jako zdroje antigenů se používá živočišná tkáň, nejčastěji se jedná o řezy z opičí nebo krysí tkáně. Stanovení autoprotilátek metodou nepřímé imunofluorescence představuje významnou, ne však rozhodující součást diagnostiky autoimunitních imunopatologických nemocí. Základem diagnostiky těchto stavů je především podrobné klinické vyšetření, doplněné o další laboratorní postupy. Nález autoprotilátek by však měl být důvodem pro sledování takového pacienta.
ANTINUKLEÁRNÍ PROTILÁTKY (ANA) 1. KLINICKÝ VÝZNAM Identifikace ANA (antinuclear autoantibodies, autoprotilátky proti buněčnému jádru) je důležitou součástí klinické medicíny a klinické imunologie. Využívá se k hodnocení systémových a orgánově specifických autoimunitních onemocnění. Antinukleární a anticytoplazmatické protilátky se objevují u mnoha nemocí viz. tabulka č.1. (dle Bradwell et. al., 1995). Pozitivní výsledky se vyskytují také u starších lidí, těhotných žen, dále u pacientů s nádorovým onemocněním, chronickou infekcí a u mnoha dalších vážnějších onemocnění. Autoprotilátky se objevují měsíce nebo i roky před propuknutím vlastní nemoci. Přes důležitost informace musí být ANA interpretována v kontextu klinických dat.
Nemoci spojené s ANA
Nemoc
% Incidence
Chronický discoidní lupus Chronická infekce Poly-/dermatomyositis SLE indukovaný léky Feltyho syndrom Zdravá populace Zdraví příbuzní SLE pacientů Juvenilní arthritis Lupoidní hepatitis Neonatal lupus syndrom Neoplasma Staří lidé Polyarteritis nodosa Těhotenství Primární biliární cirhóza Revmatická arthritis Revmatická horečka Sjögrenův syndrom Systematický lupus erythematodes Systémová skleróza (sklerodermie)
5-50 10-50 30-40 <50 95-100 <5 25 15-30 95-100 <90 10-30 <30 15-25 5-10 95-100 >95 <5 >95 95-100 >90
Smíšená pojivová nemoc (MCTD) CREST syndrom Chronická aktivní hepatitis Autoimunní trombocytopenická purpura Myasthenia gravis Autoimunní hemolytická anémie Autoimunní onemocnění štítné žlázy Akutní lymfatická leukémie Infekční mononukleóza Uveitis
100 95 75 60 50 50 30 25 50 60
Hodnocení fluorescenčních metod Negativní
N
Hraniční Slabě pozitivní Pozitivní Silně pozitivní
+/+ ++ +++
Není pozorována žádná fluorescence očekávaných struktur v preparátu. Nezřetelná, ale patrná fluorescence očekávaných struktur. Zřetelná, ale slabá fluorescence očekávaných struktur. Zřetelná, jasná, fluorescence očekávaných struktur. Velmi silná fluorescence, která může někdy způsobovat i splývání očekávaných struktur ( např. zrnění ).
IMUNOFLUORESCENČNÍ OBRAZY (STRUKTURY) HEp-2 BUNĚK I.
Fluorescenční obrazy autoprotilátek proti jaderným strukturám
1) Homogenní jaderná fluorescence (plazma) Klinika: SLE, SLE indukován léky, revmatická arthritis, juvenilní chronická arthritis, systémová skleróza Antigeny: protilátky proti dsDNA, histonům ([H2A-H2B]-DNA komplex), Ku. Pozn. intenzivní jemně zrnitá fluorescence (př. Scl-70 a PM-Scl) se může jevit jako homogenní. 2) Zrnitá (skvrnitá) fluorescence (někdy nelze rozlišit podtyp) 2a) Nukleární matrix (jaderná fluorescence s velkými skvrnami) Klinika: MCTD, SLE a další chronické revmatické nemoci Antigeny: skupina heterogenních ribonukleárních proteinů hnRNP 26 kDa a 70kDa. 2b) Hrubě zrnitá (skvrnitá) fluorescence Klinika: SLE … Antigeny: U1-snRNP nebo Sm protein 2c) Jemně zrnitá (skvrnitá) fluorescence Klinika: SLE, Sjögrenův syndrom, sklerodermie, subakutní kožní lupus Antigeny: SS-A(Ro), SS-B (La), polymerasa II, III 2d) Různorodá zrnitá fluorescence (anti-PCNA) Klinika: 1-3% SLE pacientů s proliferativní glomerulonefritis a lymfoproliferativní onemocnění. Antigeny: DNA-polymerása delta aux. protein (cyclin) 3) Centromery (centromerová fluorescence) Klinika: CREST syndrom Antigeny: protilátky proti třem proteinům CENT-B, A, C (80, 17, 140 kDa) 4) Jaderné tečky (body) 4a) Ojedinělé jaderné tečky (body) Klinika: autoimunitní a virové jaterní nemoci (PBC, chronická aktivní hepatitis) Antigeny: 80 kDa jaderný protein + p80-coilin obsahující snRNPs 4b) Četné jaderné tečky (body) Klinika: 6% PBC se Sjögren. syndromem, méně často s SLE Antigeny: jaderný protein (100 kDa) 5) Fluorescenční obrazy jadérka (někdy nelze rozlišit podtyp) 5a) Homogenní jadérka Klinika: 50% polymyositis sklerodermie, primární plícní hypertense se sklerodermií Antigeny: PM-Scl, Ku 5b) Chuchvalcovitá jadérka Klinika: systémová skleróza, nemoc příčně pruhovaných svalů, plícní hypertense Antigeny: fibrilarin
5c) Zrnitá (tečkovitá) jadérka Klinika: 30% systémová skleróza Antigeny: RNA polymerasa I 6) Fluorescenční obrazy dělícího aparátu (vzácné struktury) – není ANA 6a) Centrioly Klinika: nejčastěji při nespecifických revmatických nemocích a po virových syndromech Antigeny: autoprotilátky reagují s centriolovým proteinem a heat shock proteinem (48 kDa) 6b) Póly dělicího vřeténka (NuMA) Klinika: nespecificky při SLE, Sjögrenův syndrom, CREST, MCTD … Antigeny: 250 kDa protein 6c) Dělící tělísko (Midbody, MSA-2) Klinika: systémová skleróza, Raynaudův fenomén 6d) CENP-F (Nsp-II, MSA-3) Klinika: tumory plic Antigeny: neznámý 6e) Tubulin Klinika: vzácně při infekční mononukleóze, alkoholová cirhóza … 6f) Vlákna dělícího vřeténka 7) Fluorescenční obrazy na jaderné membráně 7a) Homogenní jaderná membrána Klinika: smíšené chronické autoimunitní nemoci Antigeny: polypeptid lamin A, B, C (74, 68, 60 kDa) 7b) Póry v jaderné membráně Klinika: vzácně při PBC, polymyositis Antigeny: komplex membránových proteinů, hlavní integrální glykoprotein (210 kDa)
II.
Fluorescenční obrazy v cytoplazmě (není pozitivita ANA!)
A. Organely 1) Jemně zrnitý cytoplazmatický obraz (Jo-1) Klinika: 20-40% agresivní polymyositis ve spojitosti s intersticialním plícním onemocněním a arthralgiemi, protilátky jsou velmi specifické (>95%) a koncentrace koreluje s aktivitou nemoci Antigeny: histidyl-tRNA syntasa, … 2) Difúzní cytoplazmatický obraz (ribozomy) Klinika: 10-15% SLE, neuropsychiatrické symptomy, ledvinové nemoci Antigeny: ribosomální P fosfoprotein
3) Mitochondriální obraz Klinika: PBC, sklerodermie Antigeny: mnoho mitochondriálních antigenů, nejčastěji M2 (pyruvát dehydrogenásový komplex) 4) Endoplazmatické retikulum Klinika: léky indukována hepatitis Antigeny: cílový antigen zahrnuje CYP-450 5) Golgiho aparát Klinika: SLE, Sjögrenův syndrom a další systémové chronické revmatické nemoci Antigeny: např. periferní membránový protein (230 kDa) 6) Lysozomální a/nebo peroxizomální obraz Klinika: Bez známých nebo jasných klinických asociací B. Cytoskelet (slabá fluorescence cytoskeletu - při nejasné a slabé fluorescenci) 7) Aktin Klinika: důležitá protilátka při chronické aktivní hepatitis Antigeny: aktin (34 kDa)
8) Vimentin Klinika: chronické revmatické a jaterní nemoci (>90%), SLE, rakovina, hematologické poruchy Antigeny: vimentin 9) Cytokeratin Klinika: revmatická arthritis, chronická aktivní hepatitis, … Antigeny: cytokeratiny (8, 18, 19) 10) Tropomyosin Klinika: revmatická arthritis, chronická aktivní hepatitis, … Antigeny: Tropomyosin 11) Vinkulin Klinika: nespecifický při mnoha autoimunitních a chronických nemocích Antigeny: vinkulin (117 kDa) 12) Desmin Klinika: bez známých nebo jasných klinických asociací
ASOCIACE NEMOCÍ A VÝSKYTU AUTOPROTILÁTEK Protilátky při SLE Antigen - prevalence dsDNA – 60-90% ssDNA – 70-95% Histony – 95% Sm – 20-40% U1-snRNP – 30-40% SS-A – 20-60% SS-B – 10-20% Ribosomal RNP – 10% PCNA (cyklin) – 3% Ku – 10% HnRNP protein A1
HEp-2 struktura Homogenní jaderná plazma (fluorescence) Negativní Homogenní jaderná plazma (fluorescence) Hrubě zrnitá (skvrnitá) fluorescence Hrubě zrnitá (skvrnitá) fluorescence Jemně zrnitá (skvrnitá) fluorescence Jemně zrnitá (skvrnitá) fluorescence Difúzní (ribozomální) cytoplazmatický obraz s homogenní fluorescencí jadérek Různorodá zrnitá fluorescence Homogenní jaderná plazma (fluorescence) s homogenní fluorescencí jadérek Nukleární matrix (jaderná fluorescence s velkými skvrnami)
Protilátky při systémové skleróze Antigen HEp-2 struktura DNA topoizomerasa 1 (Scl-70) Homogenní jaderná plazma (fluorescence) Centromery Centromery (Centromerová fluorescence) PM-Scl Homogenní jaderná plazma (fluorescence) s homogenní fluorescencí jadérek RNA-polymerasa 1 Zrnitá (skvrnitá) fluorescence jadérek RNA-polymerasa 11 Zrnitá (skvrnitá) fluorescence U1-snRNP Hrubě zrnitá (skvrnitá) fluorescence Fibrilarin Chuchvalcovitá fluorescence jadérek Ku Homogenní jaderná plazma (fluorescence) s homogenní fluorescencí jadérek NOR Zrnitá (skvrnitá) fluorescence Mitochondrie Mitochondriální obraz (slabá cytoplazmatická fluorescence) Midbody Dělící tělísko (MSA-2) Protilátky při Sjögrensově syndromu Antigen - prevalence SS-A – 40-95% SS-B – 40-95% Ku NOR p80-colin NuMA Ki/SL
HEp-2 struktura Jemně zrnitá (skvrnitá) fluorescence Jemně zrnitá (skvrnitá) fluorescence Homogenní jaderná plazma (fluorescence) s homogenní fluorescencí jadérek Zrnitá (skvrnitá) fluorescence jadérek Jaderné tečky (body) Póly dělícího vřeténka Zrnitá (skvrnitá) fluorescence
Protilátky při poly-/dermatomyositis Antigen - prevalence tRNA-synthasa (Jo-1, PL-7, PL-12, EJ, KJ) –25-35% PM-Scl – 50-70% Ku – 50% Mi-2 – 5% SRP SS-A SS-B
HEp-2 struktura Jemně zrnitý cytoplazmatický obraz (fluorescence) Jo-1 Homogenní jaderná plazma (fluorescence) s homogenní fluorescencí jadérek Homogenní jaderná plazma (fluorescence) s homogenní fluorescencí jadérek Zrnitá (skvrnitá) fluorescence Difúzní cytoplazmatický obraz Jemně zrnitá (skvrnitá) fluorescence Jemně zrnitá (skvrnitá) fluorescence
Protilátky při revmatické arthritis Antigen - prevalence Histony – 15-50% dsDNA RNP SSA/SS-B Cytokeratin Tropomyosin
HEp-2 struktura Homogenní jaderná plazma (fluorescence) Homogenní jaderná plazma (fluorescence) Hrubě zrnitá (skvrnitá) fluorescence Jemně zrnitá (skvrnitá) fluorescence Cytokeratin (slabá fluorescence cytoskeletu) Tropomyosin (slabá fluorescence cytoskeletu)
Protilátky při jaterních nemocích Antigen - prevalence Mitochondrie Aktin (hladká svalovina) „Laminy“ „Nuclear pore complex“ Coilin p80 sp-100 Tropomyosin Vimentin
HEp-2 struktura Mitochondriální obraz (slabá cytoplazmatická fluorescence) Aktin (slabá fluorescence cytoskeletu) Jaderná membrána Póry v jaderné membráně Jaderné tečky (body) Četné jaderné tečky (body) Tropomyosin (slabá fluorescence cytoskeletu) Vimentin (slabá fluorescence cytoskeletu)
VÝSKYT AUTOPROTILÁTEK PROTI BUNĚČNÉMU JÁDRU U JEDNOTLIVÝCH NEMOCÍ Antigen ds DNA ss DNA
Nemoc
SLE SLE SLE indukovaný léky MCTD Poly-/dermatomyositis Sklerodermie, Sjögrenův syndrom, revmatická arthritis RNA SLE 4-6-S-RNA, skleroderma, Sjögrenův syndrom Histony SLE indukovaný léky SLE Revmatická arthritis U1-nRNP MCTD SLE Revmatická arthritis Sm SLE SS-A (Ro) Sjögrenův syndrom SLE Neonatal lupus syndrom SS-B (La) Sjögrenův syndrom SLE Fibrilarin Progresivní systémová skleróza, difúzní forma RNA-Polymerasa I Progresivní systémová skleróza, difúzní forma PM-Scl (PM1) Poly-/dermatomyositis Progresivní systémová skleróza, difúzní forma Centromery Progresivní systémová skleróza, difúzní forma Scl-70 Progresivní systémová skleróza, difúzní forma Cyklin (PCNA) SLE RANA Revmatická arthritis Ku SLE Poly-/dermatomyositis, progr. systémová skleróza Mi-1, Mi-2 Dermatomyositis
Prevalence (%) 60-90 70-95 60 20-50 40-50 8-14 50 65 95 30-70 15-50 95-100 30-40 3 20-40 40-95 20-60 100 40-95 10-20 5-10 4 50-70 5-10 80-95 25-75 3 90-95 10 >50 5-10
