Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia High Pressure Liquid Chromatography High Precision Liquid Chromatography High Performance Liquid Chromatography
A kromatográfia hasonló kémiai szerkezetű vegyületek térbeli elkülönítésére, mennyiségi és minőségi jellemzésére szolgáló elválasztástechnika. •Réteg kromatográfia -1930-tól 1950 •Gázkromatográfia (Martin és Synge) – 1959 •Gélkromatográfia •Folyadékkromatográfia – 1970 •Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia
Detektálási tartomány
• preparatív ( g kg) • félpreparatív (mg g) • analitikai (mg/ml pg/ml)
A módszer működésének alapja: a mozgófázisba (eluens) kevert mintaelegyet szoros kontaktusba hozzuk egy azzal nem elegyedő állófázissal. A mozgófázis lehet gáz, vagy folyadék, míg az állófázis egy lapra felvitt, vagy cső belsejében rögzített folyadék vagy szilárd halmazállapotú anyag. Az eluenst állandó mozgásban tartva a minta komponensei az állófázissal való kölcsönhatásuk különböző mértéke miatt elkülönülnek egymástól.
Adott komponens meghatározásának alapfeltétele: oldékonyság az eluensben és detektálhatóság Normál fázisú elválasztás az állófázis poláros, a mozgófázis apoláros (a poláros komponens kötődik jobban az állófázishoz). Elválasztás alapja: adszorpció Lipofil anyagok: olajok, zsírok, lipidek Eluens: Alkoholok, Kloroform, n-Hexan, Heptán Fordított (reverz) fázisú elválasztásnál az állófázis apoláros (C-18) és a mozgó fázis poláros (víz-metanol) Elválasztás alapja: adszorpció, deszorpció Legtöbb biológiai anyag: fehérjék, peptidek, amino savak, monoaminok, nuklein savak Eluens: vizes puffer, metanol, acetonitril, adalékanyagok (ionpárképzők)
Tulajdonság Töltés
Az elválasztás alapjai Méret
Ligand specificitás
Molekula szerkezet
Gélfiltráció
Affinitás kromatográfia
Kiralitás
Fehérjék, nukleinsavak, polimerek
Fehérjék, enzimek
Enantiomerek
Vizes puffer, Szerves oldószer
Vizes puffer, adalékok
Vizes puffer, Szerves oldószer
Metodika Ioncserélő kromatográfia
Minta Szervetlen ionok, Savak, bázisok
Eluensek Vizes puffer
Alapfogalmak I. • Kromatogram: a detektorjel idő függvényében való ábrázolásakor a mintakomponenseket reprezentáló csúcssorozat. • Retenciós idő: a mintának a mozgófázisba juttatásától (injektálás) a komponens detektor által mért maximális koncentrációjának (a megfelelő csúcs maximális értékének) a megjelenéséig eltelt idő. A retenció az egyes komponensek anyagi minőségével, szerkezetével függ össze.
Alapfogalmak II. Felbontó képesség (resolution)
V1, V2, = retenciós idők W1, W2 = csúcsszélesség
Alapfogalmak III.
• Kimutathatósági határ 3:1 jel/zaj referencia anyaggal • Mérési alsó/felső határ: validált legkisebb, legnagyobb kalibrációs pont • Lineáris tartomány – egységnyi koncentráció változás állandó jel-változást idéz elő • Dinamikus tartomány – koncentráció változás jel-változást idéz elő
Csúcs kiszélesedés Peak broadening
Tailing
Elválasztási módok Gradiens elúció fajtái Lineáris
Gradiens
Lépcsőzetes
Függvény szerinti
Izokratikus
Állófázis • Mechanikai stabilitás • Kicsi, homogén töltetátmérő (jobb elválasztás) • Energetikai homogenitás (visszatartásért felelős helyek homogén eloszlása) • C-4, C-8, C-18
Szilika-alapú reverz fázisú töltet pH 7.5 alatt
Szintetikus szerves polimer: polisztirén pH 1-12
Oszlop (analitikai, előtét)
• Oszlop hardwer, acél, vagy PEEK • Hossz 5-30 cm • Átmérő Preparatív 40-100 mm Félpreparatív 20 mm Analitikai 3.0, 4.0, 4.6 mm Mikrobore 1.0, 2.0 mm Kapilláris oszlopok 20-800 μm
Elméleti tányérszám • Elméleti tányérmagasság: az az oszlop szakasz, ahol az egyensúlyi koncentráció kialakul a mozgó és az állófázis között • Elméleti tányérszám: N = 16 (tR/W)2 • Minél nagyobb N, annál hatékonyabb az elválasztás
HPLC rendszer Eluens tároló és Degassing rendszer Pumpa/pumpák, pulzálás csillapító Mintaadagoló rendszer (injektor/autosampler) Oszlop (előtét –analitikai) Oszloptermosztáló rendszer Detektor (Frakciókollektor) Jelfeldolgozás
Pumpa típusok
kiszorításos pumpa: achát dugattyúk, 2 alternáló pumpa
dugattyús fecskendő típusú
Pumpa: mire figyeljünk? • Számítógép vezérlés • Pulzálásmentes áramlás 0.01-10 ml/perc mellett pulzálás csillapítás: hosszú cső membrán acélgolyók
• Magas nyomás:100-200 bar, nano HPLC 500-600 bar tömítés C-porral dúsított teflon titán rugó achát dugattyú
• Korrozíótűrő: titán, rozsdamentes acél • Könnyű légtelenítés visszacsapó szelep: achát gyűrű, rubin golyó
Injektor Manual injektor
Autosampler
Mire kell figyelni? • • • • • •
Számítógép vezérlés Programozható (származékképzés) Mintatálca hűthető legyen Pontosság Fénytől védhető legyen (vagy a vial) Átszennyezés (tű átmosása)
Oszloptermosztálás Hűtés, fűtés Stabilitás
Detektorok Komponensek vagy mozgófázis tulajdonságát észlelik
• • • • • • • •
UV-VIS (ultraibolya-látható) elektrokémiai ECD fluoreszcens FLD tömegszelektív MSD radiokémiai RD törésmutató RID vezetőképességi CD fényszórásos LSD
Jó detektor kritériumai • Széles koncentráció tartományban lineáris • Érzékeny • Szelektív (egymás melletti komponensek elválnak) • Üzemeltetési költsége nem magas (lámpa)
UV-VIS, DAD
• A vegyületek UV energiát nyelnek el. • Hullámhossza a vegyületben lévő konjugációk (Π kötések) mennyiségétől függ • UV aktív csoportok • Konjugált rendszerek, kromofór csoportok • elnyelési maximumok: peptidkötés. 210 nm, aromás vegyületek 254 nm, triptofán 280 nm, kinonok 270 nm • DAD – spektrum 3D
DAD - 3D spektrum
Abundance
Hullámhossz (nm) Idő (perc)
Fluoreszcens detektorok • Érzékenyebb • Szelektívebb • Csak fluoreszcenciával bíró komponensek detektálása • Származékképzés (oszop előtt, oszlop után) • Gerjesztés (excitáció), elnyelés (emisszió)
Elektrokémiai detektorok • Elektroaktív csoportot tartalmazó komponensek Oxidálhatók Redukálhatók
• • • • •
Munka-, segéd-, referencia elektród Aminok, aromás alkoholok, indolok, purinok Belső standard! Előny: nagyon érzékeny Hátrány: lassan áll be, elektródfelszín szennyeződik
Törésmutató detektor
• A komponens törésmutatója különbözik az eluensétől • Csak izokratikus! • Cukrok • Hőmérsékletváltozásra érzékeny!
2D-HPLC
2D-HPLC
SMART készülék
Mikrodialízis mintavevő
Monoamin mérés agyi dializátumból
0,009
0
0,018
5 10 15
retention time (min)
thymidine
guanosine
hypoxanthine
0,036
20
adenosine 2'-deoxyadenosine
cAMP
2'-deoxyinosine 2'-deoxyguanosine
cGMP inosine
2'-deoxyuridine dAMP
xanthine uridine thymine 2'-deoxycytidine
uracil
0,027
uric acid cytidine
cytosine
orotic acid
AU
Nukleozidok elválasztása hűtött C18 Hipersyl oszlopon
0,000 25
deoxyadenosine
adenosine
thymidine
inosine guanosine
uracil
0,12
deoxyuridine
uric acid cytidine hypoxanthine xanthine uridine deoxycytidine
Liquor, szöveti és mikrodialízis mintákból mért nukleozid szintek összehasonlítása
0,09
AU
CSF
0,06
TISSUE
0,03
EXTRACELL
0,00 0
5
10
15
min
20
25
Tripszines emésztés után BSA peptid fragmensek elválasztása Abundance
Idő (perc)
Hol használjuk? • Gyógyszeripar – Hatóanyag-tartalom; – Szennyezők és vagy bomlástermékek vizsgálata; – Metabolizmus vizsgálatban – Farmakokinetika – Kombinatorikus kémia; – stb.
Hol használjuk? • Klinikai vizsgálatok – Metabolikus rendellenességek vizsgálata; – Tumormarkerek azonosítása; – Neurotranszmitterek (acetilkolin, dopamin stb.); • Élelmiszeripar – Élelmiszer adalékok (vitaminok; E vegyületek; tartósítószerek; stb); – Toxinok (aflatoxinok, ochratoxin, stb.) – Aminosavak; – Cukrok (fruktóz; glükóz; szacharóz stb.); – Gyógyszermaradékok (Maximum Residue Level érték);
Hol használjuk? • Környezet analitikában – – – –
Poliaromás szénhidrogének; Peszticidek; Nem-ionos felületaktív anyagok; Stb.
• Bűnügyi vizsgálatok – – – –
Kábítószerek (kokain, amfetaminok stb.); Dopping szerek (szteroidok); Robbanószer maradékok; Stb.
