Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin
Mikroflóra masných výrobků Bakalářská práce
Vedoucí práce:
Vypracovala: Eva Burdová
Ing. Libor Kalhotka, Ph.D
Brno 2013
Zadání bakalářské práce
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Mikroflóra masných výrobků vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. Dne ……………………………2013 Podpis ………………………………
PODĚKOVÁNÍ Touto cestou bych ráda poděkovala Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D. za odborné vedení a cenné rady při tvorbě bakalářské práce i při mikrobiologických rozborech. Mé poděkování patří také celému Ústavu agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin. V neposlední řadě bych také ráda poděkovala svým rodičům za podporu během studia.
ABSTRAKT Bakalářská práce pojednává o mikroflóře masných výrobků. Rozděluje skupiny masných výrobků a popisuje jejich sortiment. Definuje maso, vedlejší suroviny a přídatné a pomocné látky používané v masné výrobě. Charakterizuje jednotlivé fáze masné výroby. Zabývá se mikroorganismy a podmínkami pro jejich činnost. Popisuje mikroorganismy používané v masné výrobě, mikroorganismy kontaminující a mikroorganismy způsobující alimentární onemocnění. Navrhuje způsoby boje proti nežádoucím mikroorganismům. Závěrem této práce je experimentální stanovení významných skupin mikroorganismů ve vzorcích fermentovaného salámu bez přídavku jeleního masa a fermentovaného salámu s 5% přídavkem jeleního masa. KLÍČOVÁ SLOVA: mikroorganismy, startovací kultury, fermentované salámy, jelení maso
ABSTRACT This bachelor thesis deals with the microflora of meat products. It distinguishes groups of meat products and describes their assortment. It defines meat, side commodities and additional and auxiliary ingredients used in meat production. It describes phases of meat production. It deals with microorganisms and the conditions for their activity. It describes the microorganisms used in meat production, contaminating microorganisms and microorganisms that cause alimentary diseases. It suggests ways to fight against undesirable microorganisms. The conclusion of this work contains an experimental determination of some important groups of microorganisms in samples of fermented salami and fermented salami with 5% addition of deer meat. KEYWORDS: microorganisms, starter cultures, fermented salami, deer meat
Obsah 1 ÚVOD ............................................................................................................................ 8 2 CÍL PRÁCE.................................................................................................................. 9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED .......................................................................................... 10 3.1 Maso a jeho charakteristika ................................................................................... 10 3.1.1 Postmortální změny masa ............................................................................... 10 3.2 Masné výrobky ...................................................................................................... 12 3.2.1 Sortiment masných výrobků ............................................................................ 12 3.2.2 Rozdělení masných výrobků ........................................................................... 12 3.3 Masná výroba ........................................................................................................ 14 3.3.1 Hlavní suroviny .............................................................................................. 15 3.3.2 Vedlejší jatečné suroviny ................................................................................ 16 3.3.3 Potravinářské přísady a pomocné látky ......................................................... 17 3.3.4 Fáze masné výroby ......................................................................................... 20 3.4 Mikroorganismy .................................................................................................... 21 3.5 Faktory ovlivňující růst mikroorganismů.............................................................. 23 3.5.1 Aktivita vody ................................................................................................... 23 3.5.2 Vliv pH na růst mikroorganismů .................................................................... 24 3.5.3 Vliv oxidoredukčního potenciálu na růst mikroorganismů ............................ 24 3.5.4 Efekt teploty na mikrobiální růst .................................................................... 25 3.6 Mikroorganismy používané ve výrobě.................................................................. 27 3.6.1 Vývoj ............................................................................................................... 27 3.6.2 Vlastnosti startovacích kultur ......................................................................... 28 3.6.3 Bakterie mléčného kvašení ............................................................................. 28 3.6.4 Rod Micrococcus ............................................................................................ 29 3.6.5 Aplikace startovacích kultur ........................................................................... 29 3.7 Mikrobiální kontaminace masa a masných výrobků ............................................. 30 3.7.1 Primární (intravitální) kontaminace .............................................................. 30 3.7.2 Sekundární kontaminace ................................................................................ 30 3.7.3 Mikroorganismy kontaminující maso a masné výrobky ................................. 32 3.8 Mikroorganismy masa a masných výrobků způsobující alimentární onemocnění 33 3.8.1 Stafylokoková gastroenteritida ....................................................................... 33 3.8.2 Alimentární onemocnění způsobené Clostridium perfringens ....................... 34
3.8.3 Botulismus ...................................................................................................... 35 3.8.4 Gastroenteritida způsobená Bacillus cereus .................................................. 36 3.8.5 Alimentární onemocnění způsobené Listeria monocytogenes ........................ 37 3.8.6 Alimentární onemocnění způsobené Salmonella ............................................ 38 3.8.7 Alimentární onemocnění způsobené Shigella ................................................. 40 3.8.8 Alimentární onemocnění způsobené Escherichia coli .................................... 40 3.8.9 Yersinióza ....................................................................................................... 41 3.8.10 Kampylobakterióza ....................................................................................... 41 3.9 Změny masných výrobků vyvolané mikroorganismy ........................................... 42 3.9.1 Změny na povrchu obalu ................................................................................ 42 3.9.2 Změny mezi obalem a dílem ........................................................................... 42 3.9.3 Změny uvnitř výrobků ..................................................................................... 43 3.9.4 Biogenní aminy ............................................................................................... 43 3.10 Boj proti mikroorganismům ................................................................................ 44 3.11 Mikrobiologie zvěřiny......................................................................................... 44 4 MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ ............................................................ 46 4.1 Charakteristika výrobků ........................................................................................ 46 4.2 Příprava laboratorních pomůcek ........................................................................... 46 4.3 Postup mikrobiologické analýzy ........................................................................... 46 4.4 Stanovované skupiny mikroorganismů ................................................................. 47 4.5 Složení a příprava živných půd ............................................................................. 47 4.6 Způsob vyjádření výsledků ................................................................................... 49 5 VÝSLEDKY A DISKUZE ........................................................................................ 50 6 ZÁVĚR ....................................................................................................................... 53 7 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY ................................................................... 54 8 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ...................................................................... 57
1 ÚVOD Při snaze o prodloužení trvanlivosti masa bylo v minulosti vyvinuto značné množství různorodých masných výrobků, které v současnosti představují rozmanitý a bohatý sortiment potravin. Připravují se z rozmělněného masa, vedlejších jatečných surovin, přísad a pomocných látek. Tato směs je následně vytvarována do požadovaného tvaru. Údržnosti se v masné výrobě dosahuje řadou konzervačních zákroků, zejména solením, uzením, sušením a tepelným opracováním (PIPEK, 1998). Maso, jako hlavní surovina pro masnou výrobu, představuje kvůli svým vlastnostem ideální prostředí pro mikroorganismy. Svalovina zdravých jatečných zvířat je obvykle prostá mikroorganismů. Takto tomu ale není u zvířat nemocných, nebo vystresovaných (GÖRNER, VALÍK, 2004). Proto je nutné zabránit primární i sekundární kontaminaci. Mezi hlavní způsoby mikrobiální kontaminace patří: vpich vykrvovacího nože, povrch kůže jatečného zvířete, zažívací trakt jatečného zvířete, nečisté ruce pracovníků a zařízení závodu (JAY et al., 2005). V masných výrobcích se také mohou vyskytnout mikroorganismy patogenní (choroboplodné). Ty mohou vyvolávat onemocnění přímo, jako např. salmonely, nebo produkcí toxinů, jako např. Clostridium botulinum (INGR, 2003). Naproti tomu existují v masných výrobcích i mikroorganismy žádoucí, které jsou nedílnou součástí výroby. Tyto startovací kultury, mezi které patří bakterie mléčného kvašení, produkují kyselinu mléčnou, která působí mikrobicidně na růst patogenních bakterií. Štěpné produkty a metabolity, vzniklé fermentací díla, mají příznivý vliv na typickou chuť a barvu masných výrobků (GÖRNER, VALÍK, 2004).
8
2 CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce je: - zpracovat literární rešerši na téma mikroflóra masných výrobků, - charakterizovat mikroorganismy používané ve výrobě či podílející se na kažení masných výrobků, - charakterizovat mikroorganismy způsobující alimentární onemocnění, - popsat způsoby boje proti nežádoucím mikroorganismům, - experimentálně stanovit významné skupiny mikroorganismů ve vybraných
vzorcích.
9
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Maso a jeho charakteristika Maso je obecně definováno jako veškeré poživatelné části těl jatečně poražených nebo zabitých zvířat, v čerstvém nebo upraveném stavu, způsobilých k výživě lidí. Přesněji se pod tímto termínem rozumí pouze svalovina bez kostí nebo s kostmi, bez tukové a vazivové tkáně (GÖRNER, VALÍK, 2004). Chemické složení masa je významnou charakteristikou jakosti. Odvozují se od něj mnohé vlastnosti masa. Obecnější určení chemického složení masa je obtížné. Je nutno jej vázat na celé jatečně opracované tělo, na jeho jednotlivé části nebo tkáně. Vzhledem k vysoké heterogenitě těchto celků je obsah jednotlivých chemických složek velmi variabilní (INGR, 2003). Libová kosterní svalovina obsahuje 70 až 80 % vody, asi 20 % bílkovin, různý obsah tuku (libové maso asi 5 %), asi 1 % minerálních látek, do 1 % sacharidů, vitamíny a malé množství nízkomolekulárních dusíkatých sloučenin. Tyto hodnoty se liší dle druhu zvířat, plemene, věku a způsobu krmení (GÖRNER, VALÍK, 2004). Bílkoviny masa se dle rozpustnosti ve vodě a solných roztocích dělí na bílkoviny sarkoplasmatické, myofibrilární a stromatické. Rozdílná rozpustnost bílkovin je pro masnou výrobu důležitá, využívá se jí při vytváření struktury masných výrobků (STEINHAUSER, 2000). 3.1.1 Postmortální změny masa
Od okamžiku usmrcení zvířete je zahájen soubor postmortálních biochemických procesů, kterými se svalovina přeměňuje na maso. Získávají se při nich požadované senzorické, technologické a kulinární vlastnosti. Dochází k degradačním změnám základních složek svalových tkání (SIMEONOVA et al., 2003). Tyto rozkladné reakce můžeme rozdělit na autolýzu (samovolný rozklad způsobený nativními enzymy) a proteolýzu, neboli kažení masa (které je způsobeno exogenními mikrobiálními enzymy). Autolýza masa se dále dělí do tří fází: posmrtné ztuhnutí (rigor mortis), zrání masa, hluboká autolýza. Tyto fáze plynule přecházejí jedna v druhou (STEINHAUSER, 1995).
10
Rigor mortis
Posmrtné ztuhnutí zahrnuje především odbourávání glykogenu a adenosintrifosfátu (ATP). Jejich hlavní degradační meziprodukty, kyselina mléčná a kyselina inosinová, postupně okyselí svalovinu. Hlavní myofibrilární bílkoviny, aktin a myosin, přechodně vytváří aktinomyosinový komplex. Svalovina následkem změn v konformaci bílkovin tuhne a zhoršuje se její schopnost vázat vodu (INGR, 2003). Biochemické změny, které vedou k rigor mortis: - Zastaví se respirace, čímž se ukončí syntéza ATP. - Zaniká krevní oběh: nedostatek ATP vyvolá spojení aktinu a myosinu v aktinomyosin, což se projeví ztuhnutím svalů. - Zastavuje se zásobování kyslíkem, což má za následek snížení oxidoredukčního potenciálu ve svalech. - Ustává zásobování vitamíny a antioxidanty. To vede k rozvoji žluknutí. - Přestává fungovat nervová a hormonální regulace. Tím se sníží teplota těla a dojde ke ztuhnutí tuků. - Začne anaerobní glykogenolýza, což vede k přeměně většiny glykogenu na kyselinu mléčnou. Ta snižuje pH ze 7,4 na 5,6. Tento pokles pH spolu s hromaděním metabolitů iniciuje denaturaci bílkovin. - Retikuloendoteliální systém přestane pracovat, což dovoluje nekontrolovatelný růst mikroorganismů. Tyto změny trvají 24 až 36 hodin (JAY et al., 2005). Zrání masa
Při zrání maso získává požadované užitné vlastnosti. Při uvolňování rigor mortis dochází k postupné degradaci kyseliny mléčné a tím k zvyšování pH masa. Aktinomyosinový komplex se disociuje na aktin a myosin. Maso se stává křehčím, zvyšuje se vaznost a zlepšují se jeho senzorické vlastnosti. Hovězí maso ve čtvrtích vyzraje za 10 až 14 dní, vepřové v půlkách za 5 až 7 dní (STEINHAUSER, 1995). Hluboká autolýza
Hluboká autolýza je u běžných druhů mas jev nežádoucí, protože při ní dochází k rozkladu bílkovin a dalších složek masa až na konečné produkty (amoniak, aminy, sulfan, merkaptany, oxid uhličitý, voda) s negativními projevy. Hluboká autolýza se vědomě připouští jen u zvěřiny, je-li zájem o dosažení její typické (ostřejší a mírně přezrálé) chuti a vůně (INGR, 2003). 11
Proteolýza
Rozklad bílkovin způsobený mikroorganismy a jejich enzymy je relativně dlouho brzděn přirozenou kyselostí masa, ale s růstem hodnot pH je intenzivnější. Kažení masa postupuje od povrchového osliznutí, přes povrchovou hnilobu až k hluboké hnilobě (SIMEONOVÁ et al., 2003). Maso je znehodnoceno, dosáhne-li tzv. indexu hniloby. To se nejdřív objeví typický zápach a osliznutí, barva se změní v šedohnědou a počet mikrobů se zvýší až na 108/g (INGR, 2003). Abnormální průběh postmortálních změn masa
PSE (bledá, měkká a vodnatá) a DFD (tmavá, tuhá a suchá) masa jsou jakostní odchylky. U PSE masa dohází po porážce k abnormálně rychlé glykogenolýze, což má za následek pokles pH pod 5,8. To vede k částečné denaturaci bílkovin a ke snížení vaznosti. DFD vada vzniká u zvířat, která jsou před porážkou vyčerpaná. Stresem dojde ke spotřebě glykogenu. Po zabití ve svalovině nemá kyselina mléčná z čeho vzniknout. Maso má poměrně vysoké pH a vyšší vaznost (GÖRNER, VALÍK, 2004).
3.2 Masné výrobky Dle Nařízení EP a Rady ES se masnými výrobky rozumějí zpracované výrobky získané zpracováním masa nebo dalším zpracováním takto zpracovaných výrobků, takže z řezné plochy je zřejmé, že produkt pozbyl znaků charakteristických pro čerstvé maso (NAŘÍZENÍ EP A RADY ES 853/2004). 3.2.1 Sortiment masných výrobků
V jednotlivých oblastech i státech se sortiment masných výrobků vytvářel celá staletí v závislosti na surovinových zdrojích, na zdokonalovaných výrobních postupech a na oblibě u spotřebitelů. Velké množství jednotlivých druhů masných výrobků je při relativně malém počtu výchozích základních surovin dáno mnoha faktory. Masné výrobky se liší především kombinací základních surovin, velkým počtem pomocných látek a přísad, různým stupněm mělnění, volbou rozličných obalů, různými způsoby tepelného opracování a dalšími faktory (INGR, 2011). 3.2.2 Rozdělení masných výrobků
Dle jakostních a technicko-hospodářských norem se v minulosti masné výrobky na základě technologie výroby dělily do následujících skupin: Drobné masné výrobky jsou mělněné, vyráběné s přídavkem soli a dusitanu sod-
ného, naražené do střev, vyuzené a tepelně opracované. Jsou oddělovány v malých 12
dávkách, přičemž jedna nebo více dávek odpovídá množství, které spotřebitel zkonzumuje při jednom jídle. Měkké salámy se vyrábí jako drobné masné výrobky, liší se tvarem a velikostí. Trvanlivé masné výrobky jsou zrněné salámy vyráběné s přídavkem dusitanové
solící směsi, narážené do obalu, a vyuzené. Jejich údržnost je zvýšena sušením. Jsou buď tepelně opracované, nebo fermentované. Speciální masné výrobky jsou velmi různorodou skupinou, jejíž výrobky se znač-
ně liší v technologii výroby, většinou s velkým podílem manuální práce. Vařené masné výrobky se na rozdíl od ostatních vyrábí z tepelně opracovaných
surovin. Až na výjimky se zde nepoužívají dusitany a výrobky se neudí. Pečené masné výrobky jsou zastoupeny několika druhy sekané, které se vyrábí
rozmělněním masa s přísadami, naplní se do forem a pečou se. Uzená masa jsou nasolené a vyuzené části masa. Ostatní masné výrobky jsou výrobky, které se expedují syrové a tepelně se opra-
cují až těsně před konzumací (PIPEK, 1998). Dle současné legislativy (VYHLÁŠKA č. 264/2003 Sb.) se masné výrobky dělí: Tab. 1 Členění masných výrobků Druh
Masný výrobek
Skupina Tepelně opracovaný Tepelně neopracovaný Trvanlivý tepelně opracovaný Trvanlivý fermentovaný Masný polotovar Kuchyňský masný polotovar Konzerva Polokonzerva
Tepelně opracovaným masným výrobkem je výrobek, u kterého bylo ve všech
částech dosaženo minimálně tepelného účinku odpovídajícího působení teploty plus 70 °C po dobu 10 minut. Tepelně neopracovaný masný výrobek je výrobek určený k přímé spotřebě bez
další úpravy, u něhož neproběhlo tepelné opracování surovin ani výrobku. Trvanlivý tepelně opracovaný masný výrobek je výrobek, u kterého bylo ve
všech částech dosaženo minimálně tepelného účinku odpovídajícího působení teploty 13
plus 70 °C po dobu 10 minut a navazujícím technologickým opracováním (zráním, uzením nebo sušením za definovaných podmínek) došlo k poklesu aktivity vody s hodnotou aw
(max.)
= 0,93 a k prodloužení minimální doby trvanlivosti na 21 dní při
teplotě skladování plus 20 °C. Fermentovaným trvanlivým masným výrobkem se rozumí výrobek tepelně neo-
pracovaný, který je určený k přímé spotřebě a u kterého v průběhu fermentace, zrání, sušení, popřípadě uzení za definovaných podmínek došlo ke snížení aktivity vody s hodnotou aw (max.) = 0,93, s minimální dobou trvanlivosti 21 dní při teplotě plus 20 °C. Masný polotovar je maso tepelně neopracované, u kterého zůstala zachována
vnitřní buněčná struktura masa a vlastnosti čerstvého masa, a ke kterému byly přidány potraviny, kořenící přípravky nebo přídatné látky, a které jsou určeny k tepelné kuchyňské úpravě před spotřebou, a splňují požadavky zvláštních právních předpisů; za masný polotovar se považuje i výrobek z mletého masa s přídavkem jedlé soli vyšším než 1 % hmotnostní. Kuchyňským masným polotovarem se rozumí částečně tepelně opracované upra-
vené maso nebo směsi mas, přídatných a pomocných látek, popřípadě dalších surovin a látek určených k aromatizaci, určené k tepelné kuchyňské úpravě. Konzerva je výrobek neprodyšně uzavřený v obalu, sterilovaný za podmínek sta-
novených zvláštním právním předpisem tak, aby byla zaručena obchodní sterilita. Polokonzerva je výrobek neprodyšně uzavřený v obalu, pasterovaný za podmínek
stanovených zvláštním právním předpisem (VYHLÁŠKA MZE č. 264/2003 Sb.).
3.3 Masná výroba Výroba masných výrobků je třetí hlavní fází zpracovatelské vertikály jatečných zvířat a masa. Předchozími fázemi jsou jatečnictví a bourání masa. Masná výroba je nejvíce členěnou výrobní fází, což je zapříčiněno jednak pestrostí sortimentu finálních masných výrobků, jednak složitostí výrobních postupů a jednotlivých technologických operací (INGR, 2011). Hlavními surovinami používanými pro výrobu masných výrobků jsou druhy masa z jatečných zvířat. Mezi vedlejší suroviny patří krev a poživatelné vnitřnosti. Další suroviny jsou početné; zahrnují pitnou vodu, sůl a solící směsi, bílkovinné a sacharidické přísady, koření, ochucující přísady a ostatní přídavné látky důležité pro ovlivnění barvy, výtěžnosti, údržnosti a dalších vlastností masných výrobků (INGR, 2011). 14
3.3.1 Hlavní suroviny
Tradičně se hovězí a vepřové výrobní maso třídí, jak uvádí ČERNÝ (2007), do níže uvedených kategorií. Ostatní druhy masa (telecí, ovčí, kozí a koňské) se pro výrobní účely netřídí (SIMEONOVÁ et al., 2003). Hovězí zadní výrobní HZV
Patří sem části označené jako zadní maso - nízký roštěnec, plec bez kližky a kýta bez kližky. Svíčková se pro výrobu nepoužívá. Hovězí zadní se používá především pro výrobu kvalitních spojek do salámů, má vynikající vaznost. Musí být zbaveno povázek, šlach a loje. Používá se také při výrobě trvanlivých salámů. Hovězí přední výrobní HPV
Mezi HPV se řadí ořezy získané při bourání a méně hodnotná masa - hrudí, bok, žebra, podplečí, krk, a kližka. Musí být zbaveno kostí, chrupavek, šlach a větších částí povrchového loje. Z úsporných důvodů se používá častěji do mělněných výrobků než do výrobků s mozaikou. Hovězí speciálně opracované HSO
Jde o vybrané zadní maso, které bylo zbaveno tukové tkáně, šlach a blan. Používá se zvláště pro výrobu fermentovaných salámů. Vepřové libové VL
Jedná se o vykostěné a upravené vepřové kýty a pečeně, které se používají k výrobě speciálních masných výrobků, jako jsou šunky, debrecínky apod. Také se používá jako vložka do některých mělněných masných výrobků kvůli libovosti. Vepřové speciálně upravené VSO
Jde o maso z kýty zbavené tuků, šlach a blan, které se používá zvláště pro výrobu šunky a podobných výrobků. Vepřové libové II VLII
Jedná se zejména o maso z krkovic a plece. Má podobné využití jako VL, používá se do mělněných masných výrobků, např. do klobás. Vepřové výrobní bez kůže VVbk
Toto označení se používá pro vepřové maso bez kůže, které pochází z boků, ale obsahuje i další ořezy získané při úpravě jiných částí vepřového masa. Používá se společně s hovězím masem mělněné do spojky. U některých výrobků tvoří i vložku. 15
Vepřové výrobní s kůží VVsk
Je podobné VVbk, ale zahrnuje i kůži, která musí být řádně zbavena štětin a dobře rozmělněna (ČERNÝ, 2007). Specifická surovina - mechanicky separované maso
Mechanická separace umožňuje pracovníkům bourárny vykosťovat jednotlivé části těl ,,nahrubo“, přičemž zbytky se dočistí na separátorech. Separát je maso dobře vazné, které se používá zejména do mělněných výrobků. U drůbežích masných výrobků je převažující složkou (PIPEK, 1998). Podle SZKUCIK (1985) je mechanicky separované maso více kontaminováno bakteriemi, než maso, které bylo odděleno od kostí ručně. 3.3.2 Vedlejší jatečné suroviny Droby jsou poživatelné části těl jatečných zvířat, které se nepočítají k masu. Dro-
by následujících druhů jatečných zvířat se dle STEINHAUSER (1995) třídí na: - hovězí: hlava s jazykem a mozkem, hlava s mozkem bez jazyka, hlava bez mozku a bez jazyka, jazyk s podjazyčím, jazyk bez podjazyčí, maso z hlavy, mozek, tlama opařená (mulec), maso z jícnu, játra, srdce, plíce, slezina, ledvinky, brzlík, dršťky opařené, vemeno, býčí žlázy loupané, mícha, šlachy z noh, krvavý ořez, - vepřové: celé osrdí, játra srdce, plíce, jazyk s podjazyčím, slezina, ledvinky, mozek, mícha, krvavý ořez, - telecí: hlava bez kůže s mozkem, hlava bez kůže bez mozku, mozek, tlama opařená, celé osrdí, játra, plíce, srdce, jazyk s podjazyčím, slezina, okruží s drštičkou, nožky opařené, krvavý ořez, brzlík, ledvinky, - skopové a kozí: hlava s jazykem a mozkem, celé osrdí, játra, plíce se srdcem, plíce, srdce, slezina, vemeno, krvavý ořez (STEINHAUSER, 1995). Krev lze použít, pouze pokud byla hygienicky odchycena a uznána za poživatel-
nou. Musí být získána v čerstvém stavu, zpracování musí proběhnout nejpozději do 4 hodin po odchytu. V případě vychlazení krve bezprostředně po odchytu na teplotu pod 5 °C, ji lze takto skladovat do 10 hodin, nejdéle však 36 hodin při teplotě 0 až -15 °C (INGR, 2011).
16
3.3.3 Potravinářské přísady a pomocné látky
Z technologického a zdravotního hlediska se pomocné výrobní suroviny dělí na přísady a pomocné látky základní, a přísady a pomocné látky povolené k použití. Do I. skupiny patří látky, které jsou běžnou složkou masných výrobku a jejich po-
užívání nepodléhá žádnému zvláštnímu povolení, např. pitná voda, solící směsi, koření, mouka, škrob, bílkovinné přísady a další. Do II. skupiny patří látky, které nejsou běžnou složkou potravin, zlepšují techno-
logické a senzorické vlastnosti. Používání je podmíněno zvláštním povolením Ministerstva zdravotnictví. Mezi tyto přísady patří např. kyselina askorbová, polyfosfátové přípravky apod. (STEINHAUSER, 1995). Pitná voda
Pitná voda se uplatňuje jako přímá složka masných výrobků. Umožňuje lepší zpracování díla,
zlepšuje jeho reostatické vlastnosti a šťavnatost
výrobků.
Z technologických důvodů (hlavně pro udržení dobré vaznosti) se používá co nejvíce vychlazená pitná voda, ve formě šupinového ledu. Pitná voda musí splňovat příslušnou hygienickou normu. Spotřeba vody při zpracování jatečných zvířat a masa je velká, počítá se s asi 15 m3 vody na produkci jedné tuny masných výrobků (INGR, 2011). Sůl a solící směsi
Solení masa patří mezi jedny z nejstarších a nejosvědčenějších konzervačních prostředků pro jeho uchování (REŽ et al., 1967). Sůl jedlá je velmi významnou surovinou používanou v masném průmyslu. V mase a masných výrobcích plní tyto funkce: zlepšuje chuť, rozpouští myofibrilární bílkoviny, zlepšuje texturu, snižuje aw a zvyšuje vaznost masa (KAMENÍK, 2010). Sůl však může být mikrobiálně kontaminována, zejména halofilními mikroorganismy, např. Halobacterium salinarum a Staphylococcus aureus. Dále se v soli mohou vyskytovat bakterie z rodů Bacillus, Micrococcus a další (CEMPÍRKOVÁ et al., 1997). Nadměrné používání jedlé soli je zdravotníky posuzováno velmi kriticky, protože sodné ionty zvyšují krevní tlak v lidském organismu. Samotná jedlá sůl se uplatňuje pouze u masných výrobků, u kterých nepožadujeme zachování růžové barvy (např. vařené masné výrobky) (INGR, 2011). Většina soli se v masné výrobě uplatňuje ve formě solících směsí, dusičnanových, nebo převažujících dusitanových. Protože je dusitan značně jedovatý, není u nás 17
dovoleno připravovat tuto směs přímo v závodech masné výroby. Vyrábí se centrálně v solném průmyslu pod chemickou laboratorní kontrolou (STEINHAUSER, 1995). Dusitany a dusičnany jsou tradiční přísada do masných výrobků. Slouží především k udržení červené nebo růžové barvy, ovlivnění chutnosti, údržnosti a mají antioxidační účinek. Vedle pozitivních technologických účinků jsou však dusitany i dusičnany problematické ze zdravotního hlediska svým přímým toxickým působením a možností tvorby karcinogenních nitrosaminů (PIPEK, 1998). U nás, stejně jako v dalších evropských státech, je obsah přidávaného dusitanu sodného nebo dusitanu draselného (E 250, resp. E 249) legislativně limitován dle VYHLÁŠKY MZ č. 4/2008 Sb., a to množstvím 150 mg/kg masného výrobku. Koření a ochucující látky
Koření jsou produkty rostlinného původu, které se vyznačují intenzivní chutí a vůní a slouží k ochucování potravin. V masné výrobě určuje přidávané koření charakteristickou chuť jednotlivých výrobků. Koření se získává usušením a rozemletím různých částí rostlin. Malá část koření je domácího původu, velká většina je původem z tropických a subtropických krajů (STEINHAUSER, 1995).
Obr. 1 Koření (WWW.MISS-PEPPER.CZ) Při profesionální výrobě masných výrobků se dnes obvykle používají hotové kořenící směsi, speciálně určené pro jednotlivé druhy výrobků. Tyto směsi zjednodušují výrobu, na druhé straně může být výsledná chuť univerzální (GAHM, 2012). Zastoupení mikroorganismů v koření je rozdílné nejen podle jeho druhu, ale i podle místa získávání, hygienické úrovně zpracování, skladování apod. Na koření se běžně mohou vyskytovat aerobní i anaerobní sporotvorné mikroby, dále byly izolovány koliformní bakterie, bakterie z rodu Micrococcus, Streptococcus, Pseudomonas a další. Při dodržení správných skladovacích podmínek je počet kvasinek a plísní menší než počet bakterií. Skladba a počet mikroorganismů jsou značně ovlivněny přítomností fytoncidů (CEMPÍRKOVÁ et al., 1997). 18
Ve studii zabývající se možností aplikace různých rostlinných výtažků z koření do masných výrobků za účelem prodloužení jejich mikrobiologické trvanlivosti bylo zjištěno, že nejúčinnější proti mikrobům byl extrakt z rozmarýnu. Nejintenzivnější růst mikrobů byl pozorován u vzorku s libečkem (JALOSINSKA, WILCZAK, 2009). Bílkovinné přísady
Proteiny jsou přidávány do masných výrobků za účelem stabilizace emulze, zvýšení obsahu proteinů a ovlivnění chuti a konzistence. Lze je rozdělit na bílkoviny rostlinné (např. sójové nebo hrachové) a na bílkoviny živočišné (KAMENÍK, 2010). Sacharidické přísady
Cukry se přidávají do masných výrobků pro otupení slané chuti nebo jako substrát pro mikroorganismy ve fermentovaných výrobcích. Kromě sacharózy se jako substrát pro mikroflóru fermentovaných výrobků používají glukóza, laktóza, fruktóza aj., v množství obvykle 0,1 až 0,4 % podle druhu výrobku (PIPEK, 1998). Startovací kultury O startovacích kulturách bude pojednáno v kapitole o mikroorganismech používaných ve výrobě. Další látky používané v masné výrobě
Kyselina askorbová působí redukčně při vybarvovacích reakcích, čímž se dosáhne lepšího vybarvení při stejném přídavku dusitanů. Působí jako antioxidant. Určitou nevýhodou je snížení hodnoty pH s následkem snížení vaznosti díla, čemuž se lze vyhnout použitím askorbanu sodného, který sice dílo neokyseluje, ale musí se aplikovat ve větším množství (PIPEK, 1998). Glukono-δ-lakton (GDL) po přídavku do díla za přítomnosti vody hydrolyzuje na kyselinu glukonovou a malé množství kyseliny octové, čímž dojde ke snížení pH. Nadměrné dávky GDL však způsobují hořkou chuť a podporují růst laktobacilů, které produkují peroxid vodíku (KAMENÍK, 2010). Sorbová kyselina a sorban sodný či draselný se přidávají do výrobků jako konzervační prostředek proti plísním a sporotvorným bakteriím. Do jisté míry nahrazují účinek dusitanů, čímž umožňují snížení jejich přídavku a tím omezení tvorby nitrosaminů (PIPEK, 1998).
19
Mezi další aditivní látky používané v masné výrobě patří polyfosfáty, citrany, mléčnan sodný a draselný, monoacyl a diacyl glyceroly, karagenany, algináty, potravinářská želatina apod. (STEINHAUSER, 1995). 3.3.4 Fáze masné výroby
Mezi základní technologické operace (fáze) při výrobě patří: solení masa, mělnění masa, míchání díla, narážení díla, tepelné opracování výrobků a chlazení (INGR, 2003). Solení
Způsoby, jak dostat sůl nebo další přísady do masných výrobků, se mohou lišit. U výrobků vyráběných mělněním masa, se solící směs přidává přímo do díla při míchání a to ve formě láku nebo na sucho. Maso určené k mělnění může být předsoleno a to buď na sucho, přídavkem solící směsi a vody, nebo přídavkem láku. Celé kusy masa je možno solit na sucho nebo s přídavkem láku. Do láku se maso nakládá nebo se jím může nastříknout (PIPEK, 1998). Mělnění a míchání
Při těchto procesech se ze surovin tvoří dílo, na jehož kvalitu mají vliv následující faktory: poměr libové a tučné suroviny, kvalita vepřového sádla, teplota suroviny, přísady, konstrukce kutru a kutrových nožů a jejich ostrost (KAMENÍK, 2010). Při mělnění a míchání je třeba dbát na dvě hlavní zásady: mělnit pouze důkladně vychlazené maso a mít ostré nože a řezné desky. V opačném případě dochází k nadměrnému zahřátí masa třením, k částečné denaturaci bílkovin, ke zhoršené vaznosti masa a k tzv. zkrácení masných výrobků (INGR, 2003). Narážení
Dílo se plní narážečkou do obalového střeva a získává tak velikost a tvar. Je nutno respektovat zachování struktury díla a standardnost porcí. Hlavními požadavky na obalová střeva jsou jednoduchá manipulace při plnění a vysoká spolehlivost z hlediska produkce a hygieny (KAMENÍK, 2010). Uzení
Uzení je chemický proces, při kterém během spalování vzniká kouř, což je složitá disperzní soustava. Počet složek kouře je odhadován na 10 000, přičemž asi 500 se jich podílí na typickém aroma. V běžných udících médiích lze nalézt především: alkoholy, karbonylové sloučeniny, karboxylové kyseliny, fenoly, uhlovodíky, estery, ethery aj. (PIPEK, 1998). Chemické složení udícího kouře je závislé na druhu spalovaného dřeva, 20
jeho kvalitě a na teplotě, kterou udíme. Podle teploty kouře rozeznáváme: uzení studeným kouřem (teplota do 20 °C), uzení teplým kouřem (do 60 °C) a uzení horkým kouřem (do 100 °C) (DYK, 2012). Tepelné opracování a chlazení
Tepelné opracování má zajistit údržnost, vytvořit danou strukturu, upravit chuť, vůni, barvu a celkový vzhled výrobku. Pro dosažení údržnosti tepelně opracovaných masných výrobků se požaduje záhřev, při kterém je dosaženo minimálně pasteračního účinku, který je ekvivalentní působení teploty 70 °C ve všech částech výrobku po dobu nejméně 10 minut (KADLEC et al., 2009). Masné výrobky se mohou tepelně opracovávat uzením, ovářením ve vodě nebo v páře či pečením v horkém vzduchu. Výjimečně se využívá odporového ohřevu nebo mikrovlnného ohřevu. Po záhřevu je nezbytné výrobky řádně vychladit (studený vzduch, sprchování vodou). Tím se překoná kritická oblast 20 až 40 °C, ve které může docházet k pomnožení případně přeživších mikroorganismů, nebo k vyklíčení sporulujících bakterií. Vychlazením se také omezí odpar vody u výrobků v propustných obalech, čímž se zabrání zvrásnění povrchu a sníží se hmotnostní ztráty (KOZÁK, 2010).
3.4 Mikroorganismy Bakterie
Bakterie jsou prokaryotické organismy. Tvary buněk mohou být různé, např. tyčinkovitý, kulovitý nebo vláknitý (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Rozměry buněk se pohybují v průměru od 0,5 do 1 µm, tyčinky měří 3 až 50 µm. Buňky mají kvůli svým malým rozměrům velký specifický povrch, který umožňuje intenzivní přeměnu látek podmiňující jejich rychlý růst a rozmnožování (GÖRNER, VALÍK, 2004). Bakterie se rozmnožují nepohlavně buněčným dělením, přičemž generační doba se měří v minutách nebo hodinách. Jejich růst je geometrický. Na základě odlišné stavby buněčné stěny můžeme bakterie podle Gramova barvení rozdělit do dvou skupin: - Grampozitivní bakterie, které mají jednodušší buněčnou stěnu s relativně velkým množstvím peptidoglykanu, který zachycuje krystalovou violeť. - Gramnegativní bakterie, které mají méně peptidoglykanu, který se vyskytuje mezi plazmatickou a vnější membránou. Krystalová violeť se ze stěny těchto bakterií snadno vymývá, ale v buňkách zůstává (CAMPBELL, REECE, 2006).
21
V masných výrobcích se mohou vyskytovat bakterie žádoucí, které jsou nedílnou součástí výroby. Tyto startovací kultury, mezi které patří bakterie mléčného kvašení, produkují kyselinu mléčnou, která působí mikrobicidně na růst patogenních bakterií. Štěpné produkty a metabolity vzniklé fermentací díla mají příznivý vliv na typickou chuť a barvu masných výrobků (GÖRNER, VALÍK, 2004). V masných výrobcích se však také mohou vyskytnout mikroorganismy kontaminující, nebo dokonce mikroorganismy patogenní (choroboplodné), které mohou vyvolat alimentární onemocnění (INGR, 2003). Kvasinky
Kvasinky jsou heterotrofní eukaryotní mikroorganismy, které se řadí mezi houby (Fungi). Nejčastěji mají krátce elipsoidní tvar, případně vejčitý až kulovitý. Šířka buněk většiny kvasinek je 3-6 µm. Rozmnožují se vegetativně pučením nebo dělením. Vedle vegetativního způsobu rozmnožování je u většiny kvasinek znám i pohlavní způsob, jehož výsledkem jsou pohlavní spory (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Kvasinky vyžadují pro svůj růst vzdušný kyslík, ale za anaerobních podmínek mohou změnit svůj metabolismus na fermentační. Rostou v širokém rozmezí hodnot pH (3 až 11) i teplot (0 až 45 °C). Určité druhy rostou i v přítomnosti chemických konzervačních látek nebo v prostředí s vysokým obsahem cukru (GÖRNER, VALÍK, 2004). Kvasinky mají z hlediska technologie potravin poměrně značný význam, jak kladný tak i záporný. Jejich biochemických vlastností se využívá např. v pivovarském a mlékárenském průmyslu, při výrobě vína či preparátů s vysokým obsahem vitamínů skupiny B. Kromě příznivých vlastností však mají kvasinky i vlastnosti nepříznivé. Mohou se podílet na nežádoucích změnách potravin, zapříčiněných jejich enzymatickou činností. V potravinách se také mohou vyskytovat patogenní kvasinky (HRUBÝ, 1984). Plísně
Plísně jsou mikroskopické vláknité eukaryotní mikroorganismy, které patří stejně jako kvasinky mezi houby (Fungi). Plísně se rozmnožují jednak rozrůstáním hyf, jednak sporami, které vznikají buď vegetativním způsobem (vegetativní spory), nebo po spájení dvou buněk (pohlavní spory) (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Plísně jsou aerobní, proto rostou zejména na povrchu potravin. Jejich náročnost na kyslík se ale značně liší podle druhu. Plísně všeobecně jsou na rozdíl od bakterií
22
přizpůsobivější k určitým extrémním podmínkám prostředí. Lépe snáší nižší hodnoty pH, aw a nižší teploty (GÖRNER, VALÍK, 2004). Plísně mohou růst v chladírnách, ale také v mrazírnách do teploty -10 až -12 °C. Na mase jsou častým nálezem. Na skladovaných potravinách mohou způsobit vážné škody nejen změnou senzorických a nutričních vlastností, ale zejména tvorbou fyziologicky aktivních až toxických metabolitů – mykotoxinů. Ty se zpravidla tvoří ve stádiu pozdního exponenciálního pomnožování a jsou rezistentní, často i vůči sterilačním teplotám. Takto mohou v potravině perzistovat i po vegetativním růstu a odstranění plísní (STEINHAUSER, 1995).
3.5 Faktory ovlivňující růst mikroorganismů Faktory, které ovlivňují růst mikroorganismů lze rozdělit dle GÖRNER, VALÍK (2004) na vnější a vnitřní. Mezi vnitřní faktory podmíněné především technologickým procesem patří: aktivita vody, hodnota pH, oxidoredukční potenciál a složení a textura potravin. Mezi vnější faktory podmíněné především podmínkami skladování patří: teplota, relativní vlhkost vzduchu a složení atmosféry v obalu a skladovacím prostoru (GÖRNER, VALÍK, 2004). 3.5.1 Aktivita vody
Voda tvoří nenahraditelnou složku buňky. Všechny chemické reakce v živé buňce mohou probíhat pouze ve vodném prostředí. Mikroorganismy však mohou využít pouze tzv. volnou vodu, jejíž množství v potravině je závislé především na celkovém obsahu vody a na množství a vlastnostech ve vodě rozpuštěných látek (STEINHAUSER, 1995). Sůl, cukr, bílkoviny a některé další složky potravin jsou natolik schopné vázat vodu, že ji následně mikroorganismy nemohou využít pro svůj metabolismus. Míra využitelnosti vody pro mikroorganismy je označována jako aktivita vody a w (GÖRNER, VALÍK, 2004). Tento parametr je definován jako poměr tlaku vodních par nad potravinou k tlaku par destilované vody při stejné teplotě: aw = p / po kde p je tlak páry roztoku a po je tlak par rozpouštědla (JAY et al., 2005). Voda (p = po) má tedy hodnotu 1 a se stoupající koncentrací rozpuštěných látek vodní aktivita klesá. Většina bakterií se dokáže rozmnožovat v prostředí o aw od 0,99 do 0,93. Minimální hodnota aktivity vody u kvasinek je 0,91 až 0,88, je tedy nižší než
23
u bakterií. Plísně se rozmnožují většinou za ještě nižší vodní aktivity v porovnání s bakteriemi a kvasinkami (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 3.5.2 Vliv pH na růst mikroorganismů
Každý mikroorganismus má určité rozmezí pH, při kterém roste. Většině mikroorganismů nejvíce vyhovuje pH od 4 do 9. Pouze několik druhů může růst při pH nižším než 3 nebo vyšším než 9 (MADIGAN et al., 2009). Mezi bakterie tolerující extrémní pH patří například druhy, které tvoří, jako hlavní produkty metabolismu, kyseliny. Při příliš nízkém pH se však přestávají rozmnožovat a produkce kyselin ustává. Střevní bakterie tolerují extrémní pH, neboť musí přežívat nízké pH žaludečních šťáv i alkalické pH žluči (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Většina hnilobných a patogenních mikroorganismů naproti tomu roste v rozmezí pH od 6 do 7,2 (STEINHAUSER, 1995). Kvasinkám na rozdíl od většiny bakterií vyhovuje spíše kyselé prostředí (pH 4,2 až 5,5). Stálé slabě alkalické prostředí zamezuje jejich růst, ale v neústojném prostředí si kvasinky pH upravují směrem k optimální hodnotě. Plísním vyhovuje nejvíce prostředí neutrálního pH, ale jsou schopny se rozmnožovat ve velmi širokém rozmezí od 1,2 do 11. Velmi silně kyselé pH vyhovuje hlavně plísním, které produkují velké množství organických kyselin (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Výchylkou od optimálního pH se u všech mikroorganismů prodlužuje germinační doba. V kyselém prostředí jsou vegetativní buňky i spory mikrobů významně vnímavější na letální účinek teploty. U patogenních mikroorganismů ovlivňuje pH i tvorbu toxinu (STEINHAUSER, 1995). 3.5.3 Vliv oxidoredukčního potenciálu na růst mikroorganismů
Oxidačně redukční potenciál potraviny může být definován obecně jako míra tendence, s jakou substrát odevzdává nebo získává elektrony. Pokud prvek nebo sloučenina odevzdají elektrony, je substrát oxidován, zatímco substrát, který získává elektrony, je redukován (JAY et al., 2005): oxidace
Cu
Cu + e redukce
Oxidoredukční potenciál je tedy mírou stupně oxidace. Měří se v milivoltech a vyjadřuje se jako hodnota Eh (STEINHAUSER, 1995).
24
Hodnota oxidačně redukčního potenciálu je ovlivněna chemickým složením potraviny, koncentrací vodíkových iontů, parciálním tlakem kyslíku a přístupem vzduchu k potravině. V průběhu technologického zpracování a při skladování se tato hodnota mění za účasti mikroorganismů nacházejících se v potravině (CEMPÍRKOVÁ et al., 1997). Rozmezí hodnot Eh vhodných pro růst mikroorganismů je rozdílné. Některé bakterie vyžadují pro zahájení svého růstu redukční podmínky (Eh asi -200 mV), zatímco jiné vyžadují pozitivní (oxidační) Eh. Do první kategorie patří anaerobní bakterie, například z rodu Clostridium. Do druhé patří aerobní bakterie, například někteří členové rodu Bacillus (JAY et al., 2005). Fakultativně anaerobní bakterie jsou schopny snášet pozitivní i negativní hodnoty oxidačně redukčního potenciálu. Např. Staphylococcus aureus je schopen se množit od -200 mV do +200 mV a více, i když nejvhodnější hodnota pro růst a produkci toxinů je +200 mV (GÖRNER, VALÍK, 2004). Některé aerobní bakterie lépe rostou za nepatrně redukčních podmínek, označují se jako mikroaerofilní. Jejich příkladem jsou laktobacily a kampylobaktery. Většina plísní a kvasinek vyskytujících se v potravinách jsou aerobní (JAY et al., 2005). 3.5.4 Efekt teploty na mikrobiální růst
Život a rychlost rozmnožování mikrobů ovlivňuje teplota vnějšího prostředí. Mikroorganismy mohou být charakterizovány třemi základními teplotními body: minimální teplotou, optimální teplotou, a maximální teplotou. Minimální teplota je nejnižší teplota, při které se daný druh rozmnožuje ještě zjistitelnou rychlostí. Optimální teplota je teplota, při které se daný druh rozmnožuje nejrychleji. Maximální teplota je nejvyšší teplota, při které je daný druh ještě schopen se rozmnožovat (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Minimální teplota je v průměru o 22 °C nižší než optimální teplota, ale průměrná maximální teplota se od optimální liší pouze o 6,5 °C. To znamená, že mikroorganismy lépe snáší nižší teploty, než je optimální teplota, na rozdíl od teplot vyšších, než je optimální teplota (GÖRNER, VALÍK, 2004). Působením nízkých teplot se snižuje, až zastavuje aktivita a rychlost rozmnožování mikroorganismů. Většina jich je však schopna přežít dlouhodobě i teploty nízko pod minimální teplotou. Použitím chladírenských, dokonce ani mrazírenských teplot proto nenastává významná devitalizace mikroflóry (STEINHAUSER, 1995). Naopak při působení teploty vyšší, než je optimální teplota, nastává výrazný pokles rychlosti rozmnožování až následné zastavení. Opětovné zvýšení teploty způsobuje smrt buněk. 25
Pokles růstu je způsoben denaturací enzymů nezbytných pro růst, která je zprvu vratná, ale při působení vyšších teplot se stává nevratnou a nastává smrt buňky. Smrtící účinek vysoké teploty lze vyjádřit letální teplotou, což je nejnižší teplota, při níž je organismus usmrcen během určité doby za definovaných vnějších podmínek (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Smrtící účinek záleží na teplotě; složení prostředí a jeho pH; druhu mikroorganismů, jejich počtu a fyziologickém stavu a době působení teploty. Vegetativní formy mikroorganismů lze usmrtit teplotami od 60 do 65 °C. Spory rodu Bacillus a Clostridium lze naproti tomu spolehlivě zničit až při 120 °C. Spory kvasinek a plísní jsou usmrcovány při 60-70 °C za dobu 10 až 15 minut (STEINHAUSER, 1995). Klasifikace mikroorganismů podle vztahu k teplotě
Různé mikroorganismy mají odlišné nároky na teplotu. Podle optimální teploty růstu můžeme rozlišovat čtyři skupiny mikroorganismů: psychrofilní, psychrotrofní, mezofilní a temofilní (MADIGAN et al., 2009). Tab. 2 Rozdělení bakterií dle teplotních nároků (GÖRNER, VALÍK, 2004) Skupina mikroorganismů
Teplota (°C) Minimální
Optimální
Maximální
Psychrofilní
-5 až +5
12 až 15
15 až 20
Psychrotrofní
-5 až +5
25 až 30
30 až 35
Mezofilní
5 až 15
30 až 40
35 až 47
Termofilní
40 až 45
55 až 75
60 až 90
Psychrofilní mikroorganismy se přizpůsobily nízkým teplotám a vyznačují se optimální teplotou pod 20 °C. Rostou poměrně rychle i při teplotě 0 °C až 5 °C a některé jsou schopny pomalu růst i při -10 °C. Jejich vnitrobuněčná voda je, díky relativně vysokému vnitrobuněčnému osmotickému tlaku, i při takto nízkých teplotách v kapalném stavu, takže se mohou rozmnožovat (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Psychrotrofní mikroorganismy jsou v potravinách více rozšířené než psychrofilní mikroorganismy. Vyskytují se v mase, mléku a dalších živočišných produktech, také v zelenině a ovoci skladovaném při chladničkových teplotách (-4 °C), i když je jejich optimální teplota mezi 20 °C až 40 °C (MADIGAN et al., 2009). Mezofilní mikroorganismy mají optimální teplotu 30 až 40 °C a minimální teplotu vyšší než 5 °C. Do této skupiny patří s určitými výjimkami bakterie z čeledi Enterobacteriaceae, většina grampozitivních bakterií (například rody Bacillus, Clostridium, 26
Micrococcus) a bakterie mléčného kvašení. Také se sem řadí většina bakterií způsobujících alimentární onemocnění (GÖRNER, VALÍK, 2004). Mikroorganismy, které mají optimální teplotu růstu nad 45 °C, patří do skupiny termofilních mikroorganismů. Mezi zástupce termofilních bakterií patří např. Geobacillus stearothermophilus (dříve B. stearothermophilus), dále některé rody Clostridium (C. thermosaccharolyticum), Lactobacillus (L. delbrueckii subsp. delbruecki, L. delbruecki subsp. bulgaricus) a další (ŠILHÁNKOVÁ, 2002).
3.6 Mikroorganismy používané ve výrobě Metabolické činnosti mikroorganismů se využívá např. při výrobě kysaných mléčných výrobků, sýrů, fermentovaných masných výrobků a nakládané zeleniny. Mikroorganismy používané k těmto účelům štěpí cukry na organické kyseliny a produkují nízkomolekulární látky, čímž se podílejí na vůni a chuti těchto výrobků. Jsou označovány jako startovací kultury. Jde o vyšlechtěné kultury mikroorganismů přirozeně se vyskytujících v surovinách a potravinách (LUKÁŠOVÁ, 2004). 3.6.1 Vývoj
Výrazný vývoj startovacích kultur pro masný průmysl nastal při zprůmyslnění výroby masných výrobků, kdy byla snaha o standardizaci hotových produktů. Dále bylo požadováno zkrácení doby zrání. V letech 1919 a 1920 se zkoumala možnost využití monokultur kvasinek. Došlo ke zlepšení aroma a chuti. Poté následovaly nepatogenní nitrátredukující kmeny bakterie z rodu Micrococcus a kmeny rodu Lactobacillus. Tyto kmeny však nesnášely lyofilizaci, hlavní metodu pro uchování mikrobiálních kultur. Proto byla na přelomu 50. a 60. let vyvinuta první startovací kultura vhodná pro komerční účely – kmeny bakterie Pediococcus acidilactici. Jako první startovací kultura v Evropě byl použit kmen Micrococcus M 53, který rychle redukoval dusičnan, potlačoval nežádoucí mikroflóru a zlepšoval chuť, vůni a barvu výrobku. V roce 1966 byl izolován kmen druhu Lactobacillus plantarum, který v kombinaci s kmenem druhu Micrococcus přinesl vynikající výsledky. V roce 1972 byla pod obchodním názvem Lactacel (TM) MC zavedena multikultura z druhů Lactobacillus a Pediococcus, která zkrátila fermentační dobu na 15 hodin. V roce 1977 byla zlepšena barva i aroma výrobků pomocí kombinované kultury stafylokoků, laktobacilů a Streptomyces griseus. V roce 1987 byl zaveden přípravek LACTIL, obsahující kmen Lactobacillus sp. VÚMP 20. V roce 1991 se na Slovensku i v ČR rozšířil přípravek S-lac 1 sestávající z kmene Lactobacillus plantarum CCM 4213. 27
Během uplynulých desetiletí umožnil další výzkum nalézt další kmeny mikroorganismů, vhodných k výrobě jakostních výrobků (KAMENÍK, 1994). V současnosti se nejčastěji používají startovací kultury, které obsahují bakteriální rody Lactobacillus, Pediococcus, Kucuria a Staphylococcus, z kvasinek je to Candida a Debaryomyces (KAMENÍK, 2010). 3.6.2 Vlastnosti startovacích kultur
Startovací kultury musí mít dle GÖRNER, VALÍK (2004) tyto vlastnosti: - musí být halotolerantní a nitritotolerantní (˃ 6 % NaCl, ˃ 100 mg NO2/kg), - musí růst v rozmezí teploty 27 až 43 °C s optimem při 32 °C, ale i při nižších teplotách, - nesmí produkovat štěpné produkty a metabolity bílkovin, které by měly nepříznivý vliv na senzorické vlastnosti výrobků, - nesmí být nebezpečné pro zdraví spotřebitelů (nesmí být patogenní), - nemají být proteolytické ani lipolytické v případech, kdy to není žádoucí. 3.6.3 Bakterie mléčného kvašení
Bakterie mléčného kvašení (BMK) jsou grampozitivní nesporulující mikroaerofilní bakterie fermentující sacharidy za vzniku kyseliny mléčné (KAMENÍK, 2010). Zahrnují 13 rodů grampozitivních bakterií: Carnobacterium, Oenococcus, Enterococcus, Pediococcus, Lactococcus, Paralactobacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Lactosphaera, Tetragenococcus, Leuconostoc, Vagococcus, a Weissella (JAY et al., 2005). BMK jsou schopné růst v uzeninách při takových podmínkách, které potlačují růst nežádoucích gramnegativních aerobních bakterií. BMK jsou fakultativně anaerobní. Jsou odolné vůči dusitanu, udícímu kouři a CO2. Nevadí jim poměrně vysoké koncentrace solí ani nízká aw. Tolerují nižší pH oproti nežádoucím gramnegativním bakteriím vyskytujícím se v mase (GÖRNER, VALÍK, 2004). Bakterie mléčného kvašení lze rozdělit, jak uvádí KAMENÍK (2010), na startovací kultury 1. generace a 2. generace: - Generace I.: tyto kultury byly původně izolovány z rostlinného materiálu. Po aplikaci se rychle pomnoží a pH klesne na hodnotu kolem 5. Poté následuje pokles jejich aktivity a snižování početní převahy. Na jejich místo nastupuje původní
28
laktobacilová mikroflóra přítomná v díle, u které ale nelze vyloučit nárůst laktobacilů s potenciálním negativním vlivem na jakost a údržnost. - Generace II.: tyto kultury byly izolovány z masa. Jejich použití se rozšířilo díky snaze o použití kultur, které jsou adaptované na prostředí díla a mohou se oproti původní mikroflóře prosadit. Skládají se z kmenů Lactobacillus sakei a Lactobacillus curvatus. Význam bakterií mléčného kvašení
BMK produkují kyselinu mléčnou, která působí mikrobicidně na růst patogenních bakterií, zejména na enterotoxinogenní salmonely a na Staphylococcus aureus. Snížení pH na hodnoty blízké izoelektrickému bodu bílkovin způsobuje jejich koagulaci, která přispívá k vzniku požadované textury. Degradační produkty a metabolity, vzniklé při fermentaci, mají příznivý vliv na chuť a barvu výrobků (GÖRNER, VALÍK, 2004). Kromě nespecifických metabolitů (kyselina mléčná, kyselina octová a další organické kyseliny, peroxid vodíku, diacetyl, atd.) produkují některé BMK specifické metabolity – bakteriociny. Bakteriociny jsou extracelulární sloučeniny bílkovinné povahy, které vykazují určité antibakteriální vlastnosti vůči některým mikroorganismům (VESKOVIĆ-MORAČANIN, 2010). Antimikrobiální účinek bakteriocinů je způsoben narušením buněčné stěny nebo buněčné membrány cílových organismů, což má za následek jejich smrt (O'SULLIVAN et al., 2003). Kromě pozitivního účinku však mohou některé BMK způsobit i vady výrobků. Při jejich nepřiměřeném rozmnožení může vzniknout příliš kyselá chuť a vůně. Těmto chybám se lze vyhnout správným použitím vhodných kultur (GÖRNER, VALÍK, 2004). 3.6.4 Rod Micrococcus
Mikrokoky mnohdy bývají součástí multikultur. Mají slabší schopnost fermentovat sacharidy na kyselinu mléčnou, ale produkují enzym kataláza, který štěpí nežádoucí peroxidy. Redukují dusičnan na dusitan (GÖRNER, VALÍK, 2004). 3.6.5 Aplikace startovacích kultur
Startovací kultury se mohou aplikovat v mraženém, lyofilizovaném, nebo tekutém stavu. Do díla se přidávají na začátku míchání v kutru (KAMENÍK, 2010). Kromě mikroorganismů žádoucích, se v mase a masných výrobcích mohou vyskytovat i mikroorganismy kontaminující.
29
3.7 Mikrobiální kontaminace masa a masných výrobků Maso je pro mikroorganismy ideální živnou půdou. Má velice příznivou hodnotu vodní aktivity (asi 0,98 až 0,99) a je bohaté na bílkoviny. Jeho pH se pohybuje kolem hodnoty 7, ale může klesnout až na 5, podle obsahu kyseliny mléčné, která vznikla glykolýzou po porážce. Později pH opět stoupá kvůli vývinu amoniaku při deaminačních procesech. Oxidoredukční potenciál je na povrchu masa oxidační, směrem do hloubky přechází na redukční (HRUBÝ, 1984). Nejvíce mikroorganismů do masa pronikne v průběhu jatečného zpracování. Technologické operace zvyšují počty bakterií, každá asi o jeden logaritmický řád. Proto je nutné co nejefektivněji zabránit primární i sekundární kontaminaci masa (GÖRNER, VALÍK, 2004). 3.7.1 Primární (intravitální) kontaminace
Maso zdravých jatečných zvířat, která byla v dobré tělesné kondici, je ve většině případů prosté mikroorganismů, nebo jich obsahuje pouze malý počet. U nutně poražených zvířat je však mikrobiální obraz změněný. Z masa takovýchto zvířat byly nejčastěji izolované E. coli, Proteus spp., Staphylococcus aureus, hemolytické streptokoky, salmonely a další. Z intravitálních vlivů má na zhoršení mikrobiálního obrazu masa vliv zejména přeprava zvířat na jatka, ustájení na jatkách, zacházení se zvířaty před poražením a povrchová čistota zvířat (CEMPÍRKOVÁ et al., 1997). 3.7.2 Sekundární kontaminace
K postmortální kontaminaci masa může dojít od okamžiku poražení jatečného zvířete ve všech fázích jatečného opracování a v průběhu všech dalších operací až do okamžiku spotřeby (STEINHAUSER, 1995). Po omráčení zvířete následuje vykrvení, při kterém krev rychle proudí z cév. Ze střevního traktu jsou stěnami nasávány mikroby do lymfatických cév i do kapilár vrátnice. Tím dojde k znečištění krevního oběhu (HAMPL, 1968). Počet mikrobů může stoupnout ze 100/ml až 200/ml na 1000/ml během tří minut. Pronikání mikrobů ze střevního traktu se zvyšuje u nedokonale vykrvených a unavených zvířat. Takto může být maso kontaminováno salmonelami, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum aj. (CEMPÍRKOVÁ et al., 1997).
30
Po vykrvení následuje opracování povrchu těla a bourání. Mezi hlavní zdroje a způsoby kontaminace masa při těchto operacích patří: - Povrch kůže: Organismy z kůže mohou do těla vstoupit přes vykrvovací vpich, při odštětinování, nebo přes řeznou ránu. - Zažívací trakt: Mikroorganismy ze střevního obsahu mohou kontaminovat jatečné tělo stažené z kůže. Zejména důležitý je v tomto ohledu bachor u přežvýkavců, který obvykle obsahuje 1010 bakterií na gram. - Nečisté ruce pracovníků: Jatečně upravené tělo může být znečištěno nedodržením principů hygieny pracovníků. Dokonce i při používání rukavic se mohou organismy přenést z jednoho jatečně upraveného těla na další. - Zařízení závodu: Mikroorganismy na nesterilním zařízení mohou kontaminovat kusy masa, které jsou s ním v kontaktu. Do mikroflóry masa se tedy promítá i prostředí, ve kterém byla zvířata porážena a maso zpracováváno (JAY et al., 2005). Tyto uvedené faktory hrají důležitou roli v omezení kontaminace masa. Mezi hlavní opatření, která mohou omezit kontaminaci, patří: stavební řešení porážek a použité materiály, důkladná sanitace, hygiena pracovníků a oddělení čistých a nečistých částí provozu (STAINHAUSER, 2000). Ke kontaminaci dochází i v masné výrobě. Výrobní postupy mají mnoho modifikací, které se liší skladbou surovin, jemností mletí či sekání, tepelným opracováním i balením. Soli a zejména solné roztoky vnášejí řadu mikroorganismů tolerantních vůči nízkému aw (hlavně mikrokoky) a tím negativně ovlivňují trvanlivost výrobků. Značnou kontaminaci vnáší koření, proto je lepší ho sterilovat, nebo aplikovat extrakty. Při mletí a míchání dochází k rozptýlení mikrobů do celého díla, počet mikroorganismů zde dosahuje hodnot 106/g až 107/g. Vyskytují se zde koliformní mikroorganismy, dále Proteus, Citrobacter i salmonely (HRUBÝ, 1994). Významné zvýšení počtu mikroorganismů může nastat při narážení díla do obalů. Z přírodních střev je možno izolovat velmi různorodé spektrum bakterií, např. aerobní sporotvorné bakterie, mikrokoky a koliformní bakterie. I po technologické úpravě je počet mikrobů 109/g a víc. Při několikaměsíčním skladování se počet mikrobů v solených střevech sníží a nejvíce jsou zastoupeny aerobní a anaerobní sporotvorné mikroorganismy. Z mikrobiologického hlediska je proto výhodnější použít střeva umělá (CEMPÍRKOVÁ et al., 1997). 31
Po naplnění do obalů se výrobky udí, pasterují nebo vaří. Tyto pochody se následně odrážejí ve složení i kvantitě mikroflóry. Dodržení teploty a doby, po které teplota působí, je důležitým kritickým bodem, stejně jako čistota provozu a osobní čistota (HRUBÝ, 1984). 3.7.3 Mikroorganismy kontaminující maso a masné výrobky Bakterie
Mezi nejčastěji izolované druhy patří: - z gramnegativních: Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Enterobacter, Citrobacter,
Moraxela,
Pseudomonas,
Citrobacter,
Escherichia,
Serratia,
Psychrobacter, Shewanella a Yersinia, - z grampozitivních: Bacillus, Brochotrix, Carnobacterium, Micrococcus, Microbacterium a Lactobacillus. Většina bakterií vyskytujících se na povrchu masa a orgánů je mezofilních. Při zchlazování dochází ke změně zastoupení mikroorganismů ve prospěch psychrotrofních druhů, např. Pseudomonas, Enterococcus, Alcaligenes, Psychrobacter, Lactobacillus, Micrococcus, Brochotrix a dalších (STEINHAUSER, 2000). Kromě bakterií bývají často na mase a masných výrobcích nacházeny i kvasinky a spory plísní. Kvasinky
Nejčastěji se vyskytují kvasinky rodu Torulopsis, Saccharomyces a Debaryomyces (HRUBÝ, 1984). Plísně
Kromě bakterií a kvasinek se na povrchu masa nacházejí i spory plísní, které jsou schopny růst i při nízkých teplotách. Mezi nejrozšířenější psychrotrofní plísně patří některé druhy z rodů Aspergillus, Cladosporium, Geotrichum, Mucor, Rhizopus a Thamnidium (STEINHAUSER, 2000). Kromě saprofytických druhů mikroorganismů se v mase a masných výrobcích nachází i některé patogeny, které se mohou stát původci alimentárního onemocnění.
32
3.8 Mikroorganismy masa a masných výrobků způsobující alimentární onemocnění Podle charakteru mikroorganismu, který vyvolává onemocnění a podle mechanismu jeho účinku, dělíme alimentární onemocnění na infekce z potravin a otravy (toxoinfekce a intoxikace). -
Infekce jsou vyvolány mikroorganismy, které se potravinou nebo vodou dostávají do trávicího traktu člověka, kde se pomnoží a vyvolají onemocnění.
-
Toxoinfekce jsou onemocnění vyvolaná endotoxiny uvolněnými z bakterií, které působí na střevní sliznici.
-
Intoxikace (enterotoxikózy) jsou onemocnění z potravin, ve kterých se pomnožily bakterie a vlivem jejich metabolické aktivity se nahromadily toxické metabolity (exotoxiny) (VĚDECKÝ VÝBOR PRO POTRAVINY, 2005).
3.8.1 Stafylokoková gastroenteritida
Stafylokoková gastroenteritida je zapříčiněna požitím potraviny, která obsahuje enterotoxin(y), které produkují pouze některé stafylokokové druhy a kmeny. Rod Staphylococcus zahrnuje přes 30 druhů (JAY et al., 2005). Stafylokoky jsou grampozitivní, nepohyblivé, nesporulující, fakultativně anaerobní bakterie. Řadí se mezi všudypřítomné bakterie (SEDLÁČEK, 2007). Stafylokoky způsobující alimentární onemocnění se do potravin dostávají především prostřednictvím zvířat a lidí. U mnoha lidí osídlují nosní průduchy, kde vyvolávají infekce dutin. Dále mohou být zdrojem těchto bakterií vředy a infikované rány. Proto je nutné zabránit manipulaci potravin lidmi se stafylokokovou infekcí v podobě nachlazení, vředů a hnisajících ran (FRAZER, WESTHOFF, 1988). Nejprozkoumanějším druhem je S. aureus. Je to mezofil, který roste v rozmezí od 7 do 47,8 °C, přičemž enterotoxin je produkován od 10 do 46 °C. Optimální teplota je 40 až 45 °C. S. aureus roste při koncentraci NaCl 7 až 10 %, některé kmeny dokonce i při 20% koncentraci. Optimální pH pro růst je 6 až 7, ale roste v rozmezí 4 až 9,8. Stafylokoky jsou oproti jiným nehalofilním bakteriím unikátní v tom, že rostou i při hodnotě 0,83 za jinak optimálních podmínek (JAY et al., 2005). Konkurenční mikroflóra vyskytující se v potravinách může potlačit růst stafylokoků natolik, že zabrání produkci toxinu. Míra potlačení závisí na rodu a počtu konkurenčního
mikroorganismu,
typu
potraviny,
WESTHOFF, 1988). 33
teplotě
a
čase
(FRAZER,
Bylo identifikováno 13 stafylokokových enterotoxinů: A, B, C1, C2, C3, D, E, G, H, I, J, K, a L. Všechny tyto enterotoxiny jsou jednoduché proteiny složené z 18 aminokyselin. Minimální množství enterotoxinu, které je schopno vyvolat onemocnění, je okolo 20 ng. Jejich produkce závisí na podmínkách prostředí (JAY et al., 2005). Stafylokokové enterotoxiny jsou značně termorezistentní, snáší až půlhodinový var a ani při sterilaci nedojde k jejich spolehlivé eliminaci (v závislosti na jejich koncentraci v potravině). Odolávají i působení proteáz a snáší působení krátkovlnného ionizujícího záření (GÖRNER, VALÍK, 2004). Příznaky alimentárního onemocnění způsobeného stafylokoky se obvykle objeví během 4 hodin po požití potravin kontaminovaných enterotoxinem. Jsou to nevolnost, zvracení, silné křeče v břiše, průjem, pocení, bolest hlavy, vyčerpanost, a někdy pokles tělesné teploty. Tyto příznaky trvají 24 až 48 hodin. Úmrtnost je velmi nízká nebo nulová. Obvyklá léčba u jinak zdravých osob se skládá z klidu na lůžku a dodržování rovnováhy tekutin (JAY et al., 2005). 3.8.2 Alimentární onemocnění způsobené Clostridium perfringens
Původcem tohoto onemocnění je grampozitivní, sporulující, anaerobní tyčinka. Podle schopnosti produkovat určité exotoxiny se dělí na 5 typů: typy A, B, C, D a E. Všechny známé případy alimentárního onemocnění způsobeného C. perfringens jsou způsobeny kmeny typu A. Typ C, který produkuje beta toxin, způsobuje nekrotizující enteritidy. I když úmrtnost na tyto nekrotizující enteritidy se pohybuje okolo 35 až 40 %, alimentární onemocnění způsobené typem A jsou smrtelné pouze u starších nebo jinak oslabených osob (JAY et al., 2005). Počátečním článkem přenosu C. perfringens je lidské nebo zvířecí trávicí ústrojí. Tato bakterie se pravidelně nachází ve fekáliích i zdravých lidí (102 až 104 KTJ/g) a zvířat, přičemž ve fekáliích zvířat se kmeny tvořící enterotoxin vyskytují ve velkém, u člověka v nízkém zastoupení. Přímou i nepřímou kontaminací půdy a vody fekáliemi se může tento mikroorganismus dostat i do potravin. Ke kontaminaci masa může dojít při porážce. Uzeniny se mohou znečistit kontaminovanou vodou nebo nedostatečně ošetřenými střevy (GÖRNER, VALÍK, 2004). C. perfringens je mezofil, s optimem mezi 37 a 45 °C. Nejnižší teplota růstu je kolem 20 °C, nejvyšší je asi 50 °C. Většina kmenů roste v rozmezí pH 5,5-8. Nejnižší hodnoty aw pro růst a klíčení spor se pohybují mezi 0,97 a 0,95, ale k tvorbě spor
34
dochází při vyšších hodnotách. Růst je inhibován při 5% koncentraci NaCl. Vzhledem k tomu, že C. perfringens tvoří spory, může odolávat nepříznivým podmínkám prostředí, např. sušení, záhřevu a některým toxickým látkám. Enterotoxin je syntetizován buňkami při sporulaci, přičemž vrchol tvorby je těsně před lyzí buňky, kdy se spolu se sporou uvolní i enterotoxin (JAY et al., 2005). Tento toxin je termolabilní, k inaktivaci dochází při teplotě 60°C, dále působením enzymu pronázy, ale ne trypsinem, chymotrypsinem nebo papainem (STEINHAUSER, 1995). Nejrizikovějšími potravinami jsou masné pokrmy nebo masné výrobky, které byly uvařeny, ale nebyly dostatečnou rychlostí zchlazeny, čímž vzniklo vhodné prostředí pro vyklíčení spor. Před opětovnou konzumací je proto důležité správné tepelné ošetření (FRAZER, WESTHOFF, 1988). Příznaky onemocnění se objevují v rozmezí 6 až 24 hodin, a to zejména mezi 8 až 12 hodinou po požití kontaminované potraviny. Je to především akutní bolest břicha a průjem, ale zvracení a horečka jsou vzácné. S výjimkou starších pacientů a oslabených osob je nemoc krátká, trvá přibližně den nebo i méně (JAY et al., 2005). 3.8.3 Botulismus
Botulismus je onemocnění způsobené požitím vysoce toxického exotoxinu, který je produkován v potravině některými kmeny Clostridium botulinum, což je grampozitivní, anaerobní, sporulující tyčinka. Na základě sérologické specifičnosti jej dělíme na 7 typů: A, B, C, D, E, F, a G. Typy A, B, E, F, G způsobují botulismus u člověka, typ C u drůbeže, skotu, norků, a dalších zvířat. Typ D je spojen otravami skotu z krmiva (JAY et al., 2005). Typy můžeme také rozlišovat na základě jejich proteolytické aktivity. Typ A a většina kmenů typu B mají proteolytické schopnosti, na rozdíl od typu E a zbytku kmenů B, které je nemají (FRAZER, WESTHOFF, 1988). Teplota růstu proteolytických typů je od 12,5 do 48 °C a hodnota aw musí být minimálně 0,93 až 0,95. Proteolytické kmeny mohou růst při vyšších koncentracích soli, než kmeny neproteolytické, jejichž růst je inhibován již při 3 % NaCl. Neproteolytické typy rostou od 3,3 do 48 °C a minimální hodnota aw je 0,97. C. botulinum se množí v rozmezí pH od 4,6 do 9 a je citlivé na přítomnost nitrátů a organických kyselin. U proteolytických kmenů je D121 – hodnota 0,2 minut (STEINHAUSER, 1995).
35
Toxin C. botulinum patří mezi nejtoxičtejší látky známé člověku. LD50 pro člověka je asi 1 ng/kg tělesné hmotnosti. (Toxin C. botulinum typu A je toxičtější než toxiny typu B a E.) Toxin se tvoří uvnitř buněk za normálních podmínek. K uvolnění do prostředí dochází při autolýze. Největší nebezpečí otravy botulotoxinem hrozí z podomácku vyrobených konzerv, které nebyly správně ošetřeny a tepelně opracovány tak, aby došlo ke zničení spor. Tyto potraviny jsou pak často konzumovány bez ohřevu. Nejlepší preventivní opatření je tepelné ošetření podezřelých potravin při teplotě varu na 10 minut, což je dostačující ke zničení neurotoxinu (JAY et al., 2005). Onemocnění se projeví mezi 18 až 36 hodinou po požití potraviny, která obsahuje toxin dvojitým viděním, rozšířením zřítelnic, obtížemi při polykání a mluvení, celkovou ochablostí kosterního svalstva a paralýzou dýchání. Botulismus může vzniknout také jako raná infekce v případě, že se do rány dostanou spory C. botulinum (HORÁČEK, 2000). Doba trvání nemoci je od 1 do 10 i více dní. Úmrtnost se pohybuje mezi 30 a 65 %. Léčba sestává z podání speciálního antiséra, jehož brzké podání zlepšuje prognózu (JAY et al., 2005). 3.8.4 Gastroenteritida způsobená Bacillus cereus
B. cereus je grampozitivní fakultativně anaerobní tyčinka, schopná sporulace. V přírodě je hojně rozšířená, především v půdě, vodě a na rostlinách. Lze ji nalézt v řadě potravin, kam se dostává zejména surovinami (koření, mouka, škrob aj.), ve kterých je přítomna ve formě vysoce termorezistentních spor (STEINHAUSER, 1995). B. cereus má minimální teplotu růstu kolem 4 až 5 °C a maximální kolem 48 až 50 °C. Roste v rozmezí pH od 4,9 do 9,3. Jeho spory jsou stejně jako u jiných mezofilů termorezistentní (JAY et al., 2005). B. cereus je producentem řady toxinů. Enterotoxin zvyšuje permeabilitu cév, má nekrotizující účinky a je letální pro myši. Emetický toxin je termorezistentní, acidorezistentní a odolný proti působení proteáz. Fosfolipáza C štěpí fosfatydilcholin, fosfatidylinositol a sfingomyelin. B. cereus také tvoří 2 typy hemolyzinů (HORÁČEK, 2000). Bacillus cereus může vyvolat 2 formy alimentárního onemocnění: diaroický a emetický syndrom.
36
Diaroický syndrom se projevuje poměrně mírně, příznaky se dostaví za 8 až 16 hodin a trvají 6 až 12 hodin. Jsou to nauzea, bolesti břicha, tenesmus a vodnatá stolice. Horečka se obvykle nedostavuje. Je zde podobnost s onemocněním způsobeným C. perfringens. Mezi rizikové potraviny patří pokrmy z obilovin, bramborová kaše, zelenina, mleté maso, játrovka, sekaná, mléko, vařené maso, pudinky, a polévky. Průběh emetického syndromu je vážnější a naléhavější než u diaroického syndromu. Inkubační doba se pohybuje mezi 1 až 6 hodinami. Za rizikové potraviny jsou považovány smažené nebo vařené pokrmy z rýže, pasterovaná smetana, špagety, a šťouchané brambory. Kmeny tvořící emetický toxin rostou v rozmezí od 15 do 50 °C, s optimem mezi 35 a 40 °C. Počet organismů nutný k vyvolání tohoto onemocnění se zdá být vyšší než pro diaroický syndrom, je to asi 2 × 109/g (JAY et al., 2005). 3.8.5 Alimentární onemocnění způsobené Listeria monocytogenes
Listerie jsou grampozitivní, nesporulující, pravidelné tyčinky. Z glukózy a dalších fementovatelných cukrů produkují kyselinu mléčnou, ale bez vývinu plynu. Mají několik peritrichálních bičíků, při kultivaci ve 20 až 25 °C jsou pohyblivé. Jsou široce rozšířené v přírodě (SEDLÁČEK, 2007). Lze je nalézt v rozkládající se vegetaci a v půdě, v živočišných výkalech, odpadních vodách, v silážích a ve vodě. Obecně platí, že je můžeme očekávat tam, kde se nachází i BMK. L. monocytogenes se může vyskytovat v čerstvých potravinách živočišného i rostlinného původu, např. v syrovém mléce, měkkých sýrech, čerstvém a zmrazeném mase, mořských plodech, dále na ovoci a zelenině (JAY et al., 2005). Listerie rostou ve velkém teplotním rozmezí mezi 0 až 45 °C. Jsou odolné vůči vyšším teplotám, ale při teplotách nad 70 °C jsou zničeny za několik minut. Mrazírenské teploty je konzervují. L. monocytogenes roste i v prostředí 10 % NaCl a snáší pH od 5,5 do 9. Pro rozmnožování je nutná hodnota aw nad 0,95. Listerie jsou také do určité míry citlivé na působení organických kyselin a přítomnost mikroflóry produkující kyselinu mléčnou (STEINHAUSER, 1995). Častým zdrojem listerií je syrové, především mleté maso a drůbež, zatímco fermentované masné výrobky jsou jejich méně častými nositely. Listerie jsou vylučovány stolicí. Při porážce může dojít ke kontaktu fekálií s poraženým tělem zvířat i s vlastním masem. Z hlediska konzumentů není toto riziko významné, protože maso se zpravidla konzumuje až po tepelné úpravě. I při zrání masa bývají listerie devitalizovány. Také se
37
udává, že některé enterokoky (E. faeccium) mají svými bakteriociny vysoký antimikrobiální účinek vůči grampozitivním bakteriím, mezi jinými i vůči L. monocytogenes. Přítomnost listerií v tepelně ošetřených masných výrobcích může být způsobena jejich sekundární kontaminací nebo nedostatečným záhřevem. Proto je nutné dodržovat správnou výrobní praxi (GÖRNER, VALÍK, 2004). Listerióza u člověka není charakterizována určitým souborem příznaků, protože průběh nemoci závisí na stavu nemocného. Zdraví jedinci, kteří netrpí poruchou imunity, jsou vysoce odolní proti infekci L. monocytogenes. Náchylnými k infekci jsou naopak jedinci trpící alkoholismem, novotvary, diabetem (zejména I. typu), AIDS, kardiovaskulárním onemocněním, dále pacienti po transplantaci ledvin, nebo jinak oslabení. U takto náchylných lidí jsou nejčastějšími komplikacemi zánět mozkových blan a sepse (JAY et al., 2005). Za období leden až prosinec 2012 bylo hlášeno v České republice 32 případů listeriózy (WWW.SZU.CZ). 3.8.6 Alimentární onemocnění způsobené Salmonella
Mezi mikroorganismy, které mohou vyvolat alimentární onemocnění, patří také salmonely. Salmonely patří do čeledi Enterobacteriaceae. V přírodě se vyskytují v trávicím traktu zvířat i člověka, v půdě a povrchových vodách. Koliformní mikroorganismy neindikují jejich výskyt, jelikož salmonely byly izolovány i z výrobků, ve kterých byl zjištěn nízký počet koliformních mikrobů (HRUBÝ, 1984). Salmonely jsou gramnegativní nesporulující tyčinky. Jsou schopny fermentovat glukózu za produkce plynu, ale obvykle nefermentují laktózu ani sacharózu. Minimální teploty růstu se pohybují kolem 6 až 10 °C, maximální teploty kolem 45,6 °C v závislosti na dalších podmínkách. Optimální teplota je 37 °C. Rostou v rozmezí pH od 4,1 do 9. Minimální hodnota aw vhodná pro růst se liší podle potraviny, ale je od 0,93 do 0,95. Doporučená teplota pro zničení salmonel je záhřev na teplotu 66 °C ve všech částech potraviny po dobu 12 minut (FRAZER, WESTHOFF, 1988). Z epidemiologického hlediska můžeme salmonely rozdělit dle JAY et al. (2005) do tří skupin: - Salmonely primárně patogenní pro člověka: Tato skupina zahrnuje: S. typhi, S. paratyphi a S. paratyphi C, které způsobují nejzávažnější ze všech nemocí zapříčiněných bakteriemi rodu Salmonella, tyfus a paratyfus. Břišní tyfus má nejdelší
38
inkubační dobu, způsobuje vysoké horečky a má nejvyšší úmrtnost (JAY et al., 2005). V roce 2012 byly v ČR hlášeny 2 případy břišního tyfu (WWW.SZU.CZ). Paratyfus může probíhat jako lehký břišní tyfus, ale liší se od něj kratší inkubační dobou (6 až 8 dní), kratším trváním a méně často se vyskytujícími komplikacemi (DIEŠKA, 1985). - Sérovary primárně adaptované na určitý druh zvířete: patří sem S. gallinarum (drůbež), S. dublin (skot), S. abortus (koně a ovce) a S. choleraesuis (prasata). - Sérovary, které nejsou adaptovány na jeden hostitelský druh: jsou patogenní pro zvíře a člověka a zahrnují většinu sérovarů způsobující salmonelózu z potravin (JAY et al., 2005). Potraviny živočišného původu mohou být kontaminovány primárně za života zvířete nebo sekundárně. K sekundární kontaminaci masa a masných výrobků salmonelami může dojít v mikrobiálně silně znečištěném prostředí nebo při nevhodné přípravě, uchovávání a přepravě pokrmů. Nejčastěji k ní dochází při přidávání koření nebo jiných syrových ingrediencí do hotového, dále již tepelně neopracovaného pokrmu (STEINHAUSER, 1995). Problém výskytu salmonel ve vepřovém mase se týká zejména výroby tepelně neopracovaných trvanlivých masných výrobků. Proto je nutné kontrolovat vepřové půlky, určené k tomuto zpracování, na přítomnost salmonel. Tepelně opracované masné výrobky by neměly představovat riziko, protože salmonely jsou citlivé na tepelný zásah již na úrovni pasterace (INGR, 2003). Inkubační doba salmonelové enteritidy se pohybuje okolo 6 až 36 hodin. Onemocnění začíná náhlou nevolností, nucením na zvracení, zimnicí a bolestí hlavy. Následuje zvracení, bolest břicha a průjmy. Onemocnění může trvat u lehčích forem několik dní, u těžších případů několik týdnů i déle (DIEŠKA, 1985). Za rok 2012 bylo v ČR hlášeno 10482 případů. Salmonelóza je tedy po kampylobakterióze druhé nejčastější onemocnění z potravin (WWW.SZU.CZ). Při prevenci salmonelózy se uplatňují tři základní principy: - zabránění kontaminaci potravin salmonelami: např. čistotou prostředí, vyloučením nakažených lidí i asymptomatických nosičů z manipulace s potravinami, ochranou potravin před hmyzem a hlodavci, kontrolou surovin, - zničení salmonel dostatečným tepelným ošetřením,
39
- prevence nárůstu salmonel v potravinách adekvátním zchlazením nebo jinými způsoby (FRAZER, WESTHOFF, 1988). 3.8.7 Alimentární onemocnění způsobené Shigella
Shigella je další rod z čeledi Enterobacteriaceae, který může způsobit alimentární onemocnění. Od salmonel se taxonomicky odlišuje tím, že glukóza je zkvašována za produkce kyselin, ale bez tvorby plynu. Všechny kmeny jsou nepohyblivé. Shigella se v přírodě vyskytuje v trávicím traktu lidí a někdy v odpadních vodách. Do potravin se dostává výhradně sekundární kontaminací. Shigely jsou citlivé na vnější prostředí, proto jsou vektorem zejména ty potraviny, které se tepelně neupravují (HRUBÝ, 1984). 3.8.8 Alimentární onemocnění způsobené Escherichia coli
Bakterie z rodu Escherichia jsou gramnegativní fakultativně anaerobní rovné tyčinky, vyskytující se jednotlivě nebo ve dvojicích. Fermentují glukózu za tvorby plynu (SEDLÁČEK, 2007). E. coli se nalézá ve střevní flóře zvířat a člověka. Většina kmenů je nejen neškodná, ale i prospěšná, protože chrání trávicí trakt svého hostitele před osídlením patogenními bakteriemi a dodává mu vitamín K2 (JULÁK, 2012). Je to nejpočetnější bakterie saprofytické střevní mikroflóry u lidí. Některé kmeny jsou ovšem zodpovědné za gastrointestitální a systémové infekce, jako např. meningitidy, močové infekce a sepse (KOLÁROVÁ et al., 2011). Podle přítomnosti toxinů a dalších faktorů virulence se dělí na: - Enteropatogenní E.coli (sérotypy O 111, O 26, O 55) způsobující průjmová onemocnění u novorozenců a kojenců, -
Enteroinvazivní E.coli (nejobvyklejší typy jsou O 124 a O 128) způsobující dy-
senterický průjem u dospívajících a dospělých, - Enterotoxigenní sérotypy produkující enterotoxiny vyvolávající průjmy u dětí i dospělých (cestovní průjem), - Enterohemorrhagická E. coli produkující toxin vyvolávající hemorrhagickou kolitidu a u některých pacientů, zejména u dětí, se může rozvinout hemolytickouremický syndrom (MAČÁK, 2008). Sérovar O157:H7 je známým původcem závažného hemolytického syndromu. Infekce tímto kmenem byla v minulosti zodpovědná za řadu epidemií. K infekci tímto
40
kmenem zpravidla dochází požitím neomyté zeleniny nebo nedostatečně tepelně zpracovaného masa (JULÁK, 2012). 3.8.9 Yersinióza
Yersinie jsou gramnegativní fakultativně anaerobní tyčinky. Jsou pohyblivé díky peritrichálním bičíkům, pokud rostou při teplotě pod 30 °C. Fermentují glukózu a další sacharidy bez tvorby (nebo pouze malého množství) plynu. Optimální teplota růstu je 27 až 30 °C (SEDLÁČEK, 2007). Z rodu Yersinia jsou pro člověka a zvířata patogenní Y. pestis, Y. pseudotuberculosis a později objevená Y. enterocolitica, která je rozšířena v přírodě jako parazit domácích i divoce žijících zvířat a ptáků. K přenosu na lidi dochází potravou, vodou, ale i mlékem, ve kterém může tento mikroorganismus růst i při chladničkové teplotě. Syrové vepřové maso se považuje za významný zdroj onemocnění v Evropě (HORÁČEK, 2000). Příčinou onemocnění je požití syrového nebo nedostatečně tepelně ošetřeného masa. Častou příčinou onemocnění jsou také tepelně opracované masné výrobky (např. tlačenky, jazyky, masové saláty) uchovávané delší dobu v chladničce. U tohoto případu se však jedná vždy o sekundární kontaminaci, protože správné tepelné opracování yersinie ničí (STEINHAUSER, 1995). 3.8.10 Kampylobakterióza
Kromě C. jejuni je známo několik dalších druhů Campylobacter, které způsobují průjem u lidí, např. C. coli a C. intestinalis, ale C. jejuni je z nich nejvýznamnější. C. jejuni je spirálovitě zakřivená tyčinka, který má bičík na jednom nebo obou koncích buňky. Je oxidázo a katalázo pozitivní. C. jejuni je mikroaerofilní, pro růst vyžaduje pouze malé množství kyslíku (3-6 %) (JAY et al., 2005). Jeho růstová teplota v takovémto (mikroaerofilním) prostředí je od 30 do 40 °C. V chladírenských teplotách je schopen přežít i několik dnů, mrazírenské teploty snáší relativně dobře. Množí se jen v úzkém rozmezí pH od 6 do 9,5 a v přítomnosti NaCl od 2 do 3 %. Při snížení aw pod 0,95 nebo v přítomnosti organických kyselin je devitalizován během několika hodin. Je také značně citlivý k běžně používaným dezinfekčním prostředkům a k UV záření. Campylobacter je součástí střevního traktu některých domácích i divoce žijících zvířat, aniž by u nich způsobil onemocnění. Velmi častým nositelem C. jejuni je 41
především drůbež (výskyt 60 až 80%), ale ani nálezy u prasat a skotu nejsou výjimkou (STEINHAUSER, 1995). Inkubační doba enteritidy je velmi variabilní. Obvykle se pohybuje okolo 48 až 82 hodin, ale může být i 7 dnů a více. Příznaky mohou být následující: bolesti břicha nebo křeče, průjem, nevolnost, bolest hlavy a horečka. Většinou trvají 1 až 4 dny. U těžších případů se může ve stolici objevit krev, průjem může připomínat ulcerózní kolitidu a bolesti břicha se mohou zaměnit s akutním zánětem slepého střeva (JAY et al., 2005). V roce 2012 bylo v ČR hlášeno 18 387 případů kampylobakteriózy. Je to nejrozšířenější alimentární onemocnění (WWW.SZU.CZ).
3.9 Změny masných výrobků vyvolané mikroorganismy Díky různému složení i technologickým postupům výroby existuje široká škála sortimentu masných výrobků. Odlišné výrobky tedy obsahují různé mikroorganismy, které způsobují jejich změny. Tyto změny můžeme rozdělit na změny na povrchu obalu, změny mezi obalem a dílem a změny uvnitř výrobků (CEMPÍRKOVÁ et al., 1997). 3.9.1 Změny na povrchu obalu
Na vlhkém povrchu obalu může dojít k osliznutí. Zpočátku lze pozorovat jednotlivé kolonie, které mohou později splynout v jednotnou vrstvu šedého slizu. Osliznutí způsobují kvasinky a bakterie mléčného kvašení rodů Lactobacillus, Enterococcus, Weissella, a B. thermosphacta. Po odstranění slizu teplou nebo horkou vodou zůstává výrobek v podstatě nezměněn. Kromě osliznutí může dojít také k plesnivění masných výrobků, přestože to není časté. Pokud jsou výrobky vlhké a skladované při vysoké vlhkosti vzduchu, mají tendenci podlehnout bakteriálnímu a kvasinkovému kažení. K plesnivění naopak dochází pouze tehdy, když je povrch suchý nebo když jsou produkty skladovány za podmínek nevyhovujících bakteriím nebo kvasinkám (JAY et al., 2005). 3.9.2 Změny mezi obalem a dílem
Když je obal propustný pro vodu, růst bakterií je umožněn díky akumulaci vlhkosti. Když je při použití dvou obalů vnitřní obal navlhčený, předtím než je dán vnější obal, dojde k uzavření vody mezi oba obaly. Přes vnitřní propustný obal se dostávají rozpustné živiny, které podporují růst bakterií, zejména kyselinotvorných, které tvoří
42
sliz. Pomnoží-li se heterofermentativní BMK, dochází k produkci CO2 a nafukování obalu (je-li vnější obal plynotěsný) (CEMPÍRKOVÁ et al., 1997). 3.9.3 Změny uvnitř výrobků
Mezi nejčastější mikrobiální změny, které se nacházejí uvnitř masných výrobků, patří kvašení, mikrobiální zelenání, dírkovitost a hluboká hniloba. Ke kvašení dochází především u masných výrobků bohatých na sacharidy, zejména u těch s přísadou mouky nebo škrobu. Tyto sacharidy jsou využívány mikroorganismy za vzniku jednoduchých organických kyselin – pH výrobků se sníží na 5,0 i níže. Tyto změny způsobují zejména laktobaclily, enterokoky, leukonostoky a kvasinky. V masných výrobcích se vyskytují dva typy mikrobiálního zelenání, jeden způsobený peroxidem vodíku a druhý způsobený sulfánem. První typ se objevuje, když je anaerobně uchovávaný výrobek vystaven vzduchu. Dojde k vytvoření peroxidu vodíku, který reaguje s nitrosohemochromem za vzniku nazelenalého porfyrinu (JAY et al., 2005). Zelenání mohou způsobit heterofermentativní bakterie z rodu Lactobacillus a Leuconostoc nebo jiné katalázo-negativní bakterie, které produkují peroxid vodíku (CEMPÍRKOVÁ et al., 1997). Navzdory zelenému zabarvení není známo, že by byl výrobek po požití škodlivý. Druhý
typ
zelenání
je
zapříčiněn
působením
sulfánu,
který
reaguje
s myoglobinem za vzniku sulfmyoglobinu. Dochází k tomu při skladování ve vakuovém balení, při teplotě 1 až 5°C, ale tento typ zelenání se neobjevuje, pokud je pH výrobku nižší než 6 (JAY et al., 2005). Dírkovitost vzniká, když se do díla přidá nadměrné množství cukrů a při zrání působí vysoká teplota a silně proudí vzduch. Laktobacily heterofermentativně kvasí cukry, přičemž mimo jiné produkují oxid CO2, který vytváří dírky v díle. Aroma může být po kyselině octové (KAMENÍK, 2010). Hluboká hniloba nastává při výrazném pomnožení fakultativně anaerobních nesporogeních mikroorganismů a obligátně anaerobních sporogeních bakterií. Hluboká hniloba se vyznačuje zejména hnilobným zápachem (CEMPÍRKOVÁ et al., 1997). 3.9.4 Biogenní aminy
Fermentované salámy, spolu s dalšími fermentovanými potravinami nebo nápoji, představují jednu z potravin, ve kterých se může vyskytovat vyšší obsah biologicky 43
aktivních aminů, známých jako biogenní aminy (BA). Jsou to dusíkaté nízkomolekulární látky s biologickými funkcemi. Mezi ně se řadí např. tyramin, histamin, fenyletylamin, tryptamin, putrescin a kadaverin. Vznikají převážně bakteriální dekarboxylací aminokyselin (LATORRE-MORATALLA et al., 2012). I když BA ovlivňují v organismu člověka významné fyziologické funkce (jsou zdrojem dusíku, prekursorem pro syntézu hormonů, alkaloidů, nukleových kyselin a bílkovin), při vyšším množství přijatém v potravinách mohou působit toxicky. Toxický účinek záleží na množství, na přítomnosti jiných BA, na aktivitě aminooxidáz a na individuálním stavu střeva. Histamin vyvolává hypotenzi, zčervenání, bolest hlavy, arytmii, bušení srdce, návaly pocení, kopřivku, křeče v břiše, nevolnost a zvracení. Zvýšený příjem tyraminu může způsobit hypertenzi, bolest hlavy a migrény, krvácení do mozku i selhání srdce. Podle EEROLA et al. (1998) je tyramin obvykle početně nejvýznamnější BA ve fermentovaných masných výrobcích. Dávky BA v potravinách, které působí toxicky, je obtížné určit, neboť významný podíl mají individuální odlišnosti mezi lidmi a přítomnost jiných aminů. Toxická dávka v potravinách je pro tyramin 100-800 mg/kg, pro histamin 100 mg/kg a pro fenylethylamin 30 mg/kg. Pro ostatní BA nebyly limitní hodnoty stanoveny (CWIKOVÁ, 2009). Podle KALHOTKA et al. (2012) bylo v čerstvě vyrobených fermentovaných salámech Poličan množství BA nízké, přičemž spermidin, spermin a tyramin byly kvantitativně nejpočetnější. Během zrání se množství BA zvyšovalo. Významný rozdíl byl zjištěn u tyraminu, jehož obsah na konci zrání přesahoval 100 mg/kg, což může představovat riziko pro citlivé jedince.
3.10 Boj proti mikroorganismům V boji proti činnosti nežádoucích mikroorganismů se v potravinářském průmyslu používají biologické prostředky, fyzikální prostředky, chemické prostředky a jejich kombinace. Dále je zapotřebí zachovávat přísné hygienické zásady, aby nedošlo ke kontaminaci patogenními ani jinými mikroorganismy, ani k jejich pomnožení v potravinách (ŠILHÁNKOVÁ, 2002).
3.11 Mikrobiologie zvěřiny Protože je součástí této bakalářské práce i stanovení vybraných skupin mikroorganismů ve fermentovaných salámech s 5% přídavkem jeleního masa, je v této kapitole krátce pojednáno o mikrobiologii zvěřiny. 44
Maso zvěře má jemnou vláknitou strukturu s nízkým podílem vazivové tkáně, tuk se vyskytuje pouze v malém množství. Stupeň vykrvení může být nižší, vzhledem k tomu, že se zvěř neporáží, ale loví. Spolu s vyšším obsahem svalových barviv může být maso zvěře zbarveno intenzivněji (WINKELMAYER et al., 2005). Svalovina zdravých zvířat je obvykle prostá mikroorganismů. Aby nedošlo k masivnímu pomnožení mikroorganismů zvěřiny, zvláště při zásahu, kterým se naruší stěna bachoru nebo střevního traktu, je nutné ulovený kus bezodkladně vyvrhnout. Poškozené a silně znečištěné tkáně se odřežou nožem, ostatní znečištění se očistí čistou vodou. Vyvržený kus poté musí být co nejdříve umístěn do chladící místnosti, kde se rychlým zchlazením pod 7°C zpomalí další množení bakterií (VODŇANSKÝ, 2008).
45
4 MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ 4.1 Charakteristika výrobků Předmětem analýzy byly trvanlivé fermentované salámy. Ty nejsou při výrobě ani před spotřebou vystaveny tepelnému ošetření, což jim dává specifické senzorické vlastnosti ceněné spotřebiteli. Na druhé straně to představuje zvýšené nároky při výrobě, především z hlediska hygienického a technologického (STEINHAUSER, 1995). Jelení maso na výrobu fermentovaných masných výrobků pochází ze společnosti Šmidrkal – Lázně Bohdaneč, která se zabývá zpracováním a prodejem zvěřiny. Firma Kmotr – Masna Kroměříž a.s., která produkuje masné výrobky, odebírá jelení maso ve zmraženém stavu a přidává ho do trvanlivých masných výrobků. Vzorky byly odebrány firmou Kmotr – Masna Kroměříž a.s. a poté byly poskytnuty pro naši analýzu. Následně byly rozděleny na dvě skupiny vyrobené podle stejné receptury, u jedné z nichž byl použit 5% přídavek jeleního masa: 1. skupina: 5 vzorků fermentovaného salámu s 5% přídavkem jeleního masa 2. skupina: 5 vzorků fermentovaného salámu bez 5% přídavku jeleního masa Složení: vepřové maso, vepřové sádlo, jelení maso (u první skupiny), jedlá sůl (max. obsah 4,2 %), voda, vepřové kůže, dextróza, směs koření, startovací kultura mikroorganismů, konzervant E250, antioxidant E301. Výrobek je bezlepkový. 100 g výrobku obsahuje průměrně: bílkoviny 27,4 g; sacharidy 0,1 g; tuky 45 g.
4.2 Příprava laboratorních pomůcek Před mikrobiologickým rozborem bylo laboratorní sklo sterilizováno v horkovzdušném sterilizátoru při teplotě 165 °C po dobu 60 minut. Pipety byly před sterilizací zavatovány a zabaleny do hliníkové folie. Erlenmayerovy baňky s živnými půdami a zkumavky s fyziologickým roztokem byly sterilizovány v parním sterilizátoru při teplotě 121 °C po dobu 20 minut. Petriho misky byly použity sterilní jednorázové.
4.3 Postup mikrobiologické analýzy Při analýzách byla využita plotnová metoda se zalitím inokula živnou půdou. Navážka 10 g vzorku salámu byla smíchána s 90 ml sterilního fyziologického roztoku. Následovala homogenizace v homogenizátoru typu STOMACHER po dobu 1 minuty. Z této suspenze byla ve zkumavkách s 9 ml fyzilogického roztoku připravena řada desetinného ředění. Bylo použito ředění od 10-1 do 10-5. Inokulum (1 ml)
46
z příslušného ředění bylo pipetou naočkováno do sterilních Petriho misek a zalito živnou půdou zchlazenou na teplotu přibližně 45 °C. Inonkulum bylo v Petriho misce s půdou řádně promícháno krouživým pohybem po desce stolu. Směs se nechala zatuhnout. Poté se misky obrátily dnem vzhůru a následovala inkubace v termostatu. Po uplynutí inkubační doby se spočítaly jednotlivé kolonie, které na miskách narostly. U stanovení termorezistentních mikroorganismů bylo nutno před inokulací zničit vegetativní formy mikroorganismů záhřevem na teplotu 85 °C po dobu 15 minut ve zkumavce s inokulem. Následně bylo inokulum ochlazeno a naočkováno na Petriho misky. Další postup byl shodný s předchozím odstavcem.
4.4 Stanovované skupiny mikroorganismů Stanovovány byly tyto skupiny mikroorganismů: CELKOVÝ POČET MIKROORGANISMŮ (CMP): inokulum se naočkovalo na živnou půdu PCA (Plate Count Agar). Misky byly inkubovány v termostatu při teplotě 30 °C po dobu 72 hodin. KOLIFORMNÍ BAKTERIE: inokulum se naočkovalo na agar s krystalovou violetí, neutrální červení, žlučí a laktózou (VRBL). Misky byly inkubovány v termostatu při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin. PSYCHROTROFNÍ BAKTERIE: stanovily se na živné půdě PCA (Plate Count Agar). Misky byly inkubovány v termostatu při teplotě 6 °C po dobu 10 dnů. KVASINKY A PLÍSNĚ: byly stanoveny na živné půdě s chloramfenikolem, kvasničným extraktem a glukózou (Chloramfenicol Glucose Yeast Agar) při teplotě 25 °C po dobu 120 hodin. TERMOREZISTENTNÍ BAKTERIE: inokulum se naočkovalo po předchozím záhřevu na 85 °C po dobu 10 minut na živnou půdu PCA. Misky byly inkubovány v termostatu při teplotě 30 °C po dobu 72 hodin. BAKTERIE MLÉČNÉHO KVAŠENÍ: stanovily se kultivací na MRS půdě (Deman Rogosa Sharpe Agar) při 37 °C po dobu 72 hodin. ENTEROKOKY: inokulum bylo naočkováno na živnou půdu Compass Enterococcus Agar. Inkubace probíhala 24 hod při teplotě 45 °C.
4.5 Složení a příprava živných půd K mikrobiologické analýze byla použita tato živná media:
47
AGAR S TRYPTONEM, KVASNIČNÝM EXTRAKTEM A GLUKÓZOU (PCA) o složení: trypton 5,0 g; kvasničný extrakt 2,5 g; glukóza 1,0 g; agar 12,0 g. Navážka 20,5 g půdy se rozpustí v 1 000 ml destilované vody, pH půdy se upraví na 7 ± 0,2 při 25 °C a sterilizuje se v autoklávu při 121 °C po dobu 15 minut. (Složení půdy dle ČSN ISO 4833) Výrobce: Biokar Diagnostics, Francie AGAR S KRYSTALOVOU VIOLETÍ, NEUTRÁLNÍ ČERVENÍ, ŽLUČÍ A LAKTÓZOU (VRBL) o složení: pepton 7 g; kvasničný extrakt 3 g; laktóza 10 g; chlorid sodný 5 g; žlučové soli 1,5 g; neutrální červeň 0,03 g; krystalová violeť 0,002 g; agar 12 g; destilovaná voda 1000 ml. Dehydratovaná půda se smísí s předepsaným objemem destilované vody, provede se úprava pH na 7,4 ± 0,2 při 25 °C. Půda se nesterilizuje v autoklávu, pouze se vaří po dobu 2 minut. (Složení půdy dle ČSN ISO 4832) Výrobce: Biokar Diagnostics, Francie AGAROVÁ
PŮDA
S KVASNIČNÝM
EXTRAKTEM,
GLUKÓZOU
A
CHLORAMFENIKOLEM o složení: kvasničný extrakt 5 g; glukóza 20 g; chloramfenikol 0,1 g; agar 15 g. Navážka 40,1g se rozpustí v 1 000 ml destilované vody, pH půdy se upraví na 6,6 ± 0,2 při 25 °C a sterilizuje se v autoklávu při 121 °C (±1°C) po dobu 15 minut. (Složení půdy dle ČSN ISO 7954). Výrobce: Biokar Diagnostics, Francie MRS AGAR (DEMAN, ROGOSA, SHARPE AGAR) o složení: pepton 10 g; masový extrakt 10 g; kvasničný extrakt 5 g; glukóza 20 g; tween 80 1 g hydrogenfosforečnan draselný 2 g; octan sodný 5 g; citran amonný 2 g; síran hořečnatý 0,2 g; síran manganatý 0,05 g; agar 15 g; destilovaná voda 1000 ml. Navážka 70,3 g živného média se smíchá s destilovanou vodou a nechá se několik minut stát. Poté se zahřívá do rozpuštění. Následně se upraví pH na hodnotu 5,7 ± 0,1. Steriluje se při 121°C po dobu 15 minut. Výrobce: Biokar Diagnostics, Francie COMPASS ENTEROCOCCUS AGAR o složení: pepton 27,5 g; kvasničný extrakt 5 g; chlorid sodný 5 g; tween 80 1 g; selektivní agenc 0,3 g, X-glucoside 0,1 g; agar 14,0 g. Navážka 59,2 g se rozpustí v 1l destilované vody. Poté se zahřívá do rozpuštění. Steriluje se při 121°C po dobu 15 minut. Výrobce: Biokar Diagnostics, Francie
48
4.6 Způsob vyjádření výsledků Po ukončení kultivace byly spočítány na jednotlivých Petriho miskách kolonie mikroorganismů. Výsledky byly poté vyjádřeny jako KTJ na gram, dle rovnice:
Kde: Σa+b+c+d je součet kolonií napočítaných na Petriho miskách, n1 je počet Petriho misek použitých pro výpočet z prvního ředění, n2 je počet Petriho misek použitých pro výpočet z druhého ředění, d je faktor prvního ředění použitého pro výpočet, V je objem napipetovaného inokula.
49
5 VÝSLEDKY A DISKUZE Vzorky fermentovaného salámu byly rozděleny na dvě skupiny. I. skupina obsahovala 5% přídavek jeleního masa, II. skupina byla bez přídavku jeleního masa. Stanovovány byly tyto skupiny mikroorganismů: celkový počet mikroorganismů (CPM), koliformní bakterie, psychrotrofní mikroorganismy, kvasinky a plísně (mikromycety), termorezistentní mikroorganismy, bakterie rodu Enterococcus a bakterie mléčného kvašení (BMK). Výsledky analýzy jsou uvedeny v následující tabulce. Pro lepší přehlednost byly KTJ/g převedeny na log KTJ/g a znázorněny graficky. Tab. 3 Počty mikroorganismů ve vzorcích fermentovaného salámu v KTJ/g vzorek
CPM
Psychrotrofní
Termorezistentní
BMK
Enterokoky
1
2,3 × 105
3,6 × 103
2,3 × 101
1,6 × 107
6,8 × 101
2
1,5 × 105
2,7 × 103
7,7 × 101
1,4 × 107
1,7 × 102
3
2,8 × 105
3,2 × 103
2,7 × 101
2,3 × 107
6,8 × 101
4
3,0 × 105
4,5 × 102
2,3 × 101
2,8 × 107
7,7 × 101
5
1,7 × 105
4,5 × 102
3,7 × 103
1,9 × 107
1,9 × 102
2,3 × 105
2,1 × 103
7,7 × 102
2,0 × 107
1,2 × 102
6
2,3 × 105
6,3 × 104
5,0 × 101
2,0 × 107
4,4 × 102
7
1,8 × 105
6,4 × 103
9,8 × 102
2,0 × 107
3,5 × 104
8
3,3 × 105
4,5 × 103
2,1 × 102
2,2 × 107
2,8 × 102
9
3,2 × 105
0
6,4 × 101
2,5 × 107
1,4 × 102
10
2,5 × 105
1,8 × 103
1,4 × 101
2,2 × 107
2,5 × 102
2,6 × 105
1,5 × 104
2,6 × 102
2,2 × 107
7,3 × 103
průměr I. skupina
průměr II. skupina
Vzorky 1 až 5 (I. skupina) obsahovaly 5% přídavek jeleního masa, vzorky 6 až 10 (II. skupina) byly bez přídavku jeleního masa.
50
Graf 1 Srovnání počtu mikroorganismů ve vzorcích 8 7
log KTJ/g
6 5 4 3
s přídavkem jeleního masa
2
bez jeleního masa
1 0
U salámu s přídavkem jeleního masa bylo zjištěno 2,3 × 105 KTJ/g CPM, u salámu bez přídavku jeleního masa bylo zjištěno 2,6 × 105 KTJ/g CPM. U obou salámů tedy bylo přibližně stejně CPM. CPM poskytuje základní informace o stupni mikrobiální kontaminace a rekontaminace. Z jeho hodnot lze usuzovat na dodržování hygienických směrnic při výrobě, přepravě a skladování (BURDYCHOVÁ, SLÁDKOVÁ, 2007). V tomto případě to ale zcela neplatí, neboť se jednalo o výrobek fermentovaný tepelně neopracovaný, kde se do CPM výrazně promítají počty bakterií použitých jako kulturní mikroorganismy pro výrobu salámu. Psychrotrofní bakterie byly zjištěny ve vyšším počtu u skupiny bez jeleního masa, bylo nalezeno 1,5 × 104 KTJ/g. U skupiny s jelením masem to bylo pouze 2,1 × 103 KTJ/g. Nepřiměřený počet těchto bakterií by indikoval primární nebo sekundární kontaminaci při chladírenském skladování, kdy je růst většiny mezofilních bakterií omezen (GÖRNER, VALÍK, 2004). U termorezistentních a sporulujících bakterií byla naměřena vyšší hodnota u salámů s přídavkem jeleního masa v počtu 7,7 × 102 KTJ/g oproti salámům bez přídavku jeleního masa, kde byla naměřena hodnota 2,6 × 102 KTJ/g. Hodnoty BMK jsou u obou skupin salámů velmi podobné vzhledem ke stejné použité startovací kultuře a technologii výroby. U skupiny s přídavkem jeleního masa bylo naměřeno 2 × 107 KTJ/g, u skupiny bez jeleního masa bylo 2,2 × 107 KTJ/g. Enterokoků bylo naměřeno více u skupiny bez jeleního masa, kde bylo 7,3 × 103 KTJ/g, oproti skupině s přídavkem jeleního masa, kde bylo pouze 1,2 × 102 KTJ/g. 51
Koliformní bakterie nebyly u žádného výrobku zjištěny. Jsou to gramnegativní nesporulující tyčinky, které zkvašují laktózu a další sacharidy. Řadí se mezi ně tyto rody: Citrobacter, Enterobacter,Escherichia, a Klebsiella. Dobře rostou v mnoha potravinách, při velkém rozmezí teplot a pH (JAY et al., 2005). Obsah koliformních bakterií indikuje správnost technologických postupů a správnost sanitace nářadí i zařízení (GÖRNER, VALÍK, 2004). Z naměřených negativních hodnot lze usuzovat na správné postupy i správnou sanitaci technologického zařízení a nářadí. V žádném ze vzorků se nevyskytovaly kvasinky ani plísně. Limitní hodnoty mikroorganismů, jejichž hodnoty byly v této práci zjišťovány, nejsou současnou legislativou uvedeny. Trvanlivé fermentované salámy, jsou-li vyrobeny dle zásad správné výrobní praxe, patří mezi stabilní produkty. Tato stabilita je dána sledem faktorů, které na sebe navazují. Jejich souhrn a vzájemné působení se označuje pojmem „překážkový efekt“ (STEINHAUSER, 1995). Jako první překážka se v díle objevuje dusitanová solicí směs. NaCl snižuje počáteční vodní aktivitu masa na hodnotu 0,96-0,97. Dusitan inhibuje růst salmonel a Clostridium botulinum. Jako další překážka se uplatňuje redoxní potenciál. Při mělnění a míchání se do díla dostává vzdušný kyslík, který zvyšuje hodnotu Eh. Naopak přídavek sacharidů redoxní potenciál snižuje. K poklesu hodnoty Eh dochází při fermentaci, kde dochází k inhibici především gramnegativních aerobních a fakultativně anaerobních tyčinek. Další překážku představuje rozmnožení BMK. Jde o kompetitivní působení konkurenční mikroflóry a spolu s tím i produkce antimikrobiálních látek. Kyselina mléčná snižuje hodnotu pH díla, což je další, velmi důležitá bariéra. Pokračujícím procesem zrání nastupuje jedna z nejvýznamnějších překážek, pro trvanlivost salámů vůbec rozhodující, a to pokles hodnot vodní aktivity z původní hodnoty 0,96 v díle na 0,9 až 0,8 i méně. Trvanlivé fermentované salámy jsou tedy mikrobiálně stabilní, avšak je-li použita kontaminovaná surovina nebo dojde-li k chybě v technologickém procesu, nemusí být vznikající překážky dostatečně účinné a může být ohrožena zdravotní nezávadnost (KAMENÍK, 2010).
52
6 ZÁVĚR Masné výrobky jsou již od nepaměti značně oblíbenou součástí stravy. Jejich sortiment je široký zejména kvůli velkému množství surovin a odlišným technologiím výroby. Maso jako hlavní surovina je vhodným prostředím pro mikroorganismy. Svalovina jatečných zvířat před porážkou je obvykle bez mikrobů, je však třeba zabránit její kontaminaci. Pro výrobu masných výrobků se používají startovací kultury, což jsou vybrané a prověřené kmeny mikroorganismů v čisté kultuře nebo ve směsích s jinými kmeny. Do masných výrobků se přidávají za účelem dosažení požadovaných žádoucích změn, zejména v chuti a barvě. Naproti tomu je nutné zamezit výskytu bakterií, které vyvolávají změny nežádoucí, nebo dokonce způsobují alimentární onemocnění. Toho se u masných výrobků dosahuje řadou konzervačních zákroků, zejména solením, uzením, sušením a tepelným opracováním. V praktické části bakalářské práce byla mikrobiologická analýza vzorků fermentovaného salámu s 5% přídavkem jeleního masa a bez 5% přídavku jeleního masa. Byly zjišťovány následující skupiny mikroorganismů: celkový počet mikroorganismů (CPM), koliformní bakterie, psychrotrofní mikroorganismy, kvasinky a plísně (mikromycety), termorezistentní mikroorganismy, bakterie rodu Enterococcus a bakterie mléčného kvašení (BMK). Z výsledků vyplývá, že přídavek jeleního masa CPM ani počet BMK nijak významně neovlivnil. Psychrotrofních bakterií a enterokoků bylo zjištěno méně u vzorků s přídavkem jeleního masa. Termorezistentní bakterie se naopak u skupiny s přídavkem jeleního masa vyskytovaly ve větší míře.
53
7 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY BURDYCHOVÁ R., SLÁDKOVÁ P. Mikrobiologická analýza potravin. 1. vyd. Brno: MZLU v Brně, 2007, 208 s. ISBN 978-80-7375-116-6. CAMPBELL N. A., REECE J. B. Biologie. Brno: Computer Press, a.s., 2006, 1332 s. ISBN 80-251-1178-4. CEMPÍRKOVÁ R., LUKÁŠOVÁ J. a HEJLOVÁ Š. Mikrobiologie potravin. 1. vyd. České Budějovice: Jihočeská univerzita, 1997, 165 s. ISBN 80-7040-254-7. CWIKOVÁ O. Bakterie podílející se na produkci biogenních aminů ve vybraných fermentovaných potravinách. Disertační práce, MZLU v Brně, 2009, 114 s. ČERNÝ L. Co a jak s masem. 1. vyd. Velké Bílovice: TeMi CZ, 2007, 103 s., [16] s. barev. obr. příl. ISBN 978-80-903873-6-2. ČSN ISO 4832 Mikrobiologie. Všeobecné pokyny pro stanovení počtu koliformních bakterií. ČSN ISO 4833 Mikrobiologie. Všeobecné pokyny pro stanovení celkového počtu mikroorganismů. ČSN ISO 7954 Mikrobiologie. Všeobecné pokyny pro stanovení počtu kvasinek a plísní. DIEŠKA D. a kolektiv. Vademecum medici. 3. vid. Martin: Vydavatel´stvo Osveta, 1985, 1632 s. DYK V. Vše o uzení: rady, tipy, recepty. 1. vyd. Praha: Grada, 2012, 120 s., [12] s. barev. obr. příl. ISBN 978-80-247-4068-3. EEROLA H. S. Biogenic amines in Finnish dry sausages [online]. Journal of food safety, 1998 [cit. 2013-03-07]. Dostupné na: http://agris.fao.org FRAZIER W. C., WESTHOFF D. C. Food microbiology: William Carroll Frazier, Dennis C. Westhoff. 4. ed. New York: McGraw-Hill Book, 1988, 16, 539 s. GAHM B. Uzení, nakládání a konzervování masa: od šunky po žebírka. 1. vyd. Praha: Grada, 2012, 125 s. ISBN 978-80-247-4266-3. GÖRNER F., VALÍK L. Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1. vyd. Bratislava: Malé Centrum, 2004, 528 s. ISBN 80-967064-9-7. HAMPL B. Potravinářská mikrobiologie. Praha: SNTL/ALFA, 1968, 205 s. HORÁČEK J. a kolektiv. Základy lékařské mikrobiologie. 1. vyd. Praha: Karolinum, 2000, 309 s. ISBN 80-246-0006-4. HRUBÝ S. a spolupracovníci. Mikrobiologie v hygieně výživy. 1. vyd. Praha: Avicenum, 1984, 206 s.
54
INGR I. a kolektiv. Zpracování zemědělských produktů. 2. vyd. Brno: MZLU, 2003, 249 s. ISBN 80-7157-520-8. INGR I. Produkce a zpracování masa. 2. vyd. Brno: Mendelova univerzita, 2011, 202 s. ISBN 978-80-7375-510-2. INGR I. Zrání masa a jeho praktický význam [online]. Český svaz zpracovatelů masa, 2003 [cit. 2013-03-07]. Dostupné na http://www.cszm.cz JALOSINSKA M., WILCZAK J. Influence of plant extracts on the microbiological shelf life of meat products[online]. Polish Journal of Food and Nutrition Sciences, 2009 [cit. 2013-03-07]. Dostupné na: http://agris.fao.org JAY J. M., LOESSNER M. J. a GOLDEN D. A. Modern Food Microbiology. New York: Springer, 2005, 790 s. JULÁK J. Klinicky významné bakterie. 1. vyd. Praha: Triton, 2012, 123 s. ISBN 97880-7387-588-6. KADLEC P., MELZOCH K. a VOLDŘICH M. Co byste měli vědět o výrobě potravin? 1. vyd. Ostrava: Key Publishing, 2009, 536 s. ISBN 978-80-7418-051-4. KALHOTKA et al. Changes in counts of microorganisms and biogenic amines production during the manufacture of fermented sausages Poličan [online]. The Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences, 2012 [cit. 2013-03-07]. Dostupné na: http://www.jmbfs.org KAMENÍK J. Startovací kultury v masném průmyslu. 1.vyd. Praha: Ústav zemědělských a potravinářských informací, 1994, 51 s. ISBN 80-85120-46-1. KAMENÍK J. Trvanlivé masné výrobky. 1. vyd. Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita, 2010, 262 s. ISBN 978-80-7305-106-8. KOLLÁROVÁ H. Vybrané kapitoly z epidemiologie. 1. vyd. Olomouc: Univerzita Palackého v Olomouci, 2011, 206 s., [5] s. barev. obr. příl. ISBN 978-80-244-2715-7. KOZÁK A. Chladicí řetězec pro maso a masné výrobky. Maso: odborný časopis pro výrobce, zpracovatele a prodejce masa a masných výrobků. 2010, č. 5, s. 6. LATORRE-MORATALLA M. L. a kolektiv. Control of Biogenic Amines in Fermented Sausages: Role of Starter Cultures[online]. Frontiers in Microbiology, ročník 2012, číslo 3, 169 s. [cit. 2013-03-07]. Dostupné na: http://www.ncbi.nlm.nih.gov LUKÁŠOVÁ J. Význam mikrobiologie pro zajištění zdravotní nezávadnosti a jakosti potravin [online]. Časopis Veterinářství, ročník 54, 2004 [cit. 2013-03-07]. Dostupné na: http://www.vetweb.cz MAČÁK J. General pathology. 1st ed. Brno: Masaryk University, 2008, 190 s., [14] s. barev. obr. příl. ISBN 978-80-210-4549-1. MADIGAN M. T. a kolektiv. Biology of microorganisms. 12. ed., San Francisco: Benjamin Cummings, 2009. ISBN 0-321-53615-0. 55
NAŘÍZENÍ EVROPSKÉHO PARLAMENTU A RADY (ES) č. 853/2004, stanovující zvláštní hygienické předpisy pro potraviny živočišného původu. O'SULLIVAN L, ROSS R.P a HILL C. Potential of bacteriocin-producing lactic acid bacteria for improvement in food safety and quality[online]. Biochimie, 2003 [cit. 201303-07]. Dostupné na: http://agris.fao.org PIPEK P. Technologie masa II. 1.vyd. Kostelní Vydří: Karmelitánské nakl., 1998, 348 s. ISBN 80-7192-283-8. REŽ J., KALAŠ J. a ŠOCH J. Maso a masné výrobky. Praha: Merkur, 1967, 148 s. SEDLÁČEK I. Taxonomie prokaryot. 1. vyd. Brno: Masarykova univerzita, 2007, 270 s. ISBN 978-80-210-4207-0. SIMEONOVOVÁ J., INGR I. a GAJDŮŠEK S. Zpracování a zbožíznalství živočišných produktů.. Vyd. 1. V Brně: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2003, 122 s. ISBN 80-7157-708-1. STEINHAUSER L. a kolektiv. Hygiena a technologie masa. 1. vyd. Brno: LAST, 1995, 643 s. ISBN 80-900260-4-4. STEINHAUSER L. a kolektiv. Produkce masa. Tišnov: Last, 2000, 464 s. ISBN 80900260-7-9. SZKUCIK K. Bacterial contamination of mechanically deboned beef and pork [online]. Medycyna Weterynaryjna, 1985 [cit. 2013-03-07]. Dostupné na: http://agris.fao.org ŠILHÁNKOVÁ L. Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. 3. vyd. Praha: Academia, 2002, 363 s. ISBN 80-200-1024-6. VĚDECKÝ VÝBOR PRO POTRAVINY. Alimentární onemocnění (infekce a otravy z potravin) [online]. 2005 [cit. 2013-03-07]. Dostupné na: czvp.szu.cz VESKOVIĆ-MORAČANIN S. Lactic acid bacteria bacteriocins as natural food protectors – possibilities of application in meat industry [online]. Technologija mesa, 2010 [cit. 2013-03-07]. Dostupné na: http://agris.fao.org VODŇANSKÝ M. Základní faktory ovlivňující kvalitu zvěřiny. Časopis Myslivost, 2008, číslo 6, 18 s. VYHLÁŠKA č. 264/2003 Sb. o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů, ve znění pozdějších předpisů, pro maso, masné výrobky, ryby, ostatní vodní živočichy a výrobky z nich, vejce a výrobky z nich VYHLÁŠKA č. 4/2008 Sb., kterou se stanoví druhy a podmínky použití přídatných látek a extrakčních rozpouštědel při výrobě potravin WINKELMAYER R. Hygiena zvěřiny: příručka pro mysliveckou praxi. Brno: Institut ekologie zvěře VFU, c2005, 168 s. ISBN 80-7305-523-6. WWW.SZU.CZ/publikace/data/infekce-v-cr-2007-kumulativne 56
8 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK BMK – bakterie mléčného kvašení BA – biogenní amin aw – vodní aktivita KTJ – kolonie tvořící jednotku Eh – oxidoredukční potenciál CPM – celkový počet mikroorganismů HPV – hovězí přední výrobní VL – vepřové libové VVbk – vepřové výrobní bez kůže
57
