MELANOCYTÁRNÍ NEOPLAZIE DOMÁCÍCH MASOŽRAVCÙ

Melanocytární neoplazie

VETERINÁRNÍ LÉKAØ  ROÈNÍK 6  2008  ÈÍSLO 1

MELANOCYTÁRNÍ NEOPLAZIE DOMÁCÍCH MASOŽRAVCÙ MELANOCYTIC NEOPLASIAS IN DOMESTIC CARNIVORES LEOPOLD ŠARŠON, DARINA ŠARŠONOVÁ Veterinární ordinace, Sadová 2, Blansko SOUHRN Cílem našeho èlánku je podat souhrn informací o souèasném stavu znalostí týkajících se melanocytárních neoplazií u domácích masožravcù, jejich patogeneze, klinických pøíznakù, morfologie, diagnostiky a léèby. Histologicky lze rozlišit sedm typù melanocytárních tumorù. U pigmentovaných melanocytárních neoplazií je v diagnostice zlatým standardem histopatologické vyšetøení, popøípadì v kombinaci s imunohistochemickým prùkazem Melan A, avšak v diagnostice amelanotických melanomù je možno pomocí imunohistochemických metod správnì urèit 61,9 % tìchto neoplazií (lepších výsledkù je možno dosáhnout pomocí in situ hybridizace za cenu zvýšení nákladù na diagnostiku). Melanomy v orální oblasti a v drápovém lùžku se chovají malignìji než v jiných lokalizacích. V souèasné dobì používané metody léèby melanomu jako radikální chirurgická resekce tumoru, radiaèní terapie a chemoterapie jsou málo úèinné. Klíèová slova: psi, koèky, fretky, melanom, mitotický index, imunohistochemie

SUMMARY We would like to provide you with a survey of contemporary knowledge about melanocytic neoplasias in domestic carnivores especially about their pathogenesis, clinical features, morfology, diagnostics and treatment. There are seven types of melanocytic neoplasias in animals currently known. Histopathology is the golden standard in diagnostics of pigmented melanocytic neoplasias, eventually in combination with immunohistochemical reaction with Melan A antibodies. Immunohistochemical methods are able to determine only 61.9 % of amelanotic melanomas cases (better results may be achieved if in situ hybridization is used in diagnostics of amelanotic melanomas, but such examination is of course more expensive). Oral and nail bed melanomas behave more malignantly than melanomas growing in other sites of body. The effect of current methods of melanoma treatment (radical surgical tumor resection with consequent radiation therapy and/or chemotherapy) is insufficient. Key words: dogs, cats, ferrets, melanoma, mitotic index, immunohistochemistry

Úvod Melanocyty jsou dendritické buòky pocházející z neuroektodermálních melanoblastù, které bìhem embryogeneze migrují do rùzných míst v organismu. Nejèastìji se melanocyty nacházejí v bazální vrstvì epidermis rozptýlené mezi bazálními keratinocyty pøipojené pomocí hemidesmozomù k lamina basalis (Jelínek et al.). Normálnì mezi sebou melanocyty nevytváøejí bunìèná spojení (dokonce ani když se dotýkají jeden druhého), spíše tvoøí adherentní a regulatorní spojení s pìti až osmi sousedními keratinocyty pomocí molekul epiteliálního cadherinu (Smith et al., 2002). Melanin (barvivo produkované melanocyty) je vytváøen transformací tyrozinu pomocí tyrozinázy na 3,4 dihydroxyfenylalanin (DOPA = dihydroxyphenylalanin) a potom na DOPAchinon, který je po nìkolika reakcích pøemìnìn na melanin. Tyrozináza se syntetizuje v ribozomech pøiléhajících na membránu endoplazmatického retikula. Sekreèní vakuoly obsahující tyrozinázu jsou následnì zabudovány do Golgiho aparátu melanocytù. Z Golgiho aparátu se potom uvolòují nezralé melanozomy (tzv. premelanozomy), které èasem ztrácejí tyrozinázovou aktivitu a stávají se zralými melanozomy (Jelínek et al.). Vyvíjející se melanozomy putují v aktivních melanocytech

smìrem ke konci dendritických výbìžkù. Každý dendritický výbìžek proniká do epitelií v bazální vrstvì nebo do mladých keratinocytù ve stratum spinosum epidermis. V epitelii nebo keratinocytu dojde k uvolnìní koneèku výbìžku i s obsaženými melanozomy a vznikne fagozom. Melanozomy se potom mohou z fagozomu uvolnit do cytoplazmy tìchto bunìk a zpùsobovat jejich tmavé zabarvení (Samuelson, 2007) Dalšími místy, kde mùžeme melanocyty najít, jsou pigmentované sliznice, duhovka oka a mìkká plena mozku a míchy (Maretta, 1990). Ultrafialové záøení stimuluje tvorbu melaninu, ten následnì chrání stratum germinativum kùže pøed nepøíznivými úèinky sluneèního záøení. Jako albinismus oznaèujeme stav, kdy melanocyty nejsou schopny vytváøet melanin díky chybìjící tyrozinázové aktivitì nebo díky neschopnosti melanocytù vychytávat tyroxin (Jelínek et al.) Patogeneze vzniku metastazujícího melanomu Podle WHO zprávy (Spangler, Kass 2006) se melanocytární neoplazie dìlí na základì morfologických znakù bunìk na nezhoubné melanocytomy a na zhoubné melanomy. Pøi pøemìnì normálního melanocytu v buòku nádorovou byl prokázán pozitivní vliv ultrafialového záøení

11

Melanocytární neoplazie a genetické dispozice organismu k tomuto druhu nádorového bujení. Maligní transformace melanocytomù je u zvíøat málo èastá a vìtšina melanomù vznikne z melanocytù de novo. Bìhem celého složitého procesu pøemìny normálního melanocytu v buòku metastazujícího melanomu musí neoplastické buòky uniknout imunitní kontrole organismu, musí být schopné pøežít a pohybovat se v krevním a/nebo lymfatickém systému a musí být schopny proliferace v prostøedí stromatu odlišném od prostøedí stromatu místa primárního výskytu neoplazie (Smith et al., 2002). Klinické pøíznaky PSI – melanocytární neoplazie tvoøí pøibližnì 3 % ze všech neoplazií u psù a více než 7 % ze všech maligních neoplazií u psù (Smith et al., 2002). – Dutina ústní – melanocytární neoplazie dutiny ústní tvoøí 19 % (Spangler, Kass, 2006) až 56 % (Smith et al., 2002) všech pøípadù tìchto tumorù. Vyrùstají zejména z dásnì, dále ze sliznice jazyka, bukání sliznice, faryngeální sliznice, sliznice mandlí a sliznice patra. Pokud byly jako kritérium malignity použity morfologické znaky neoplastických bunìk, bylo 92 % pøípadù hodnoceno jako maligní tumor. 70 % – 90 % z nich metastazovalo (Smith et al., 2002). Pokud byla za kritérium malignity považována smrt pacienta (úhyn nebo eutanázie) související s neoplazií, chovalo se malignì 68 % pøípadù. Byla-li za kritérium malignity považována rekurence nebo metastazování neoplazie, chovalo se malignì 59 % pøípadù (Spangler, Kass 2006). Støední doba pøežívání èinila 147 dní a støední doba do výskytu rekurence nebo nálezu metastázy èinila 78 dní (Spangler, Kass, 2006). Klinicky se tyto tumory manifestují jako dysfagie, halitóza, ptyalismus, krvácení, jednostranný krvavý nebo hnisavý výtok z nosu, nadmìrná pohyblivost až úplná ztráta zubu(ù), zøídka fraktura mandibuly. Charakteristický je rychlý rùst tumorù, invazivita a èasté rekurence po chirurgickém odstranìní. Nejèastìjšími místy metastazování jsou regionální mízní uzliny, plíce a vnitøní orgány vèetnì srdce (Smith et al., 2002). – Kùže – melanocytární neoplazie tvoøí 4 % – 20 % ze všech neoplazií kùže, ale ménì než 5 % z nich se chová malignì (Smith et al., 2002). Jiná studie (Spangler, Kass, 2006) uvádí, že 59 % ze všech melanocytárních neoplazií se nachází na kùži. 12 % ze všech melanocytárních neoplazií kùže vykazovalo rekurenci nebo metastazovalo a 7 % psù uhynulo nebo bylo utraceno z dùvodù spojovaných s neoplazií. – Prsty – 8 % ze všech melanocytárních tumorù se nachází na prstech. Po skvamocelulárním karcinomu jsou druhou nejèastìjší neoplazií prstù. Rentgenologické známky metastáz jsou pozorovány v 58 % pøípadù digitálních melanomù, a to buï pøed chirurgickým zákrokem, nebo brzy po jeho provedení. Støední doba pøežívání èiní 12 mìsícù (Smith et al., 2002). Studie Spanglera a Kasse (2006) uvádí, že melanocytární tumory na kùži prstù, polštáøcích tlap, kùži metakarpu a metatarzu a drápového lùžka tvoøila 8,3 % ze všech melanocytárních neoplazií. Melanomy kùže prstù tvoøily 50 % a drápového lùžka 44 % pøípadù. Jako kritérium ma-

12

VETERINÁRNÍ LÉKAØ  ROÈNÍK 6  2008  ÈÍSLO 1 lignity byla v této studii použita smrt pacienta související s nádorovým procesem. – Sliznice pyskù – melanocytární neoplazie v této lokalizaci tvoøí 10 % až 23 % všech tumorù této histogeneze (Smith et al., 2002; Spangler, Kass, 2006). – Oko – melanocytární tumory oka a na jiných, výše neuvedených místech tìla tvoøí jen 2 % až 3 % ze všech melanocytárních neoplazií (Smith et al., 2002; Spangler, Kass, 2006) a jsou nejèastìjšími tumory v této lokalizaci. Vìtšinou se jedná o melanocytomy. 83 % intraokulárních melanocytárních neoplazií vyrùstá z anteriorní uvey, 12 % z limbické oblasti (83 % z nich je lokalizováno v dorzálním oblouku od dorzomediálního po ventrolaterální limbus [Donaldson et al., 2006a]), 5 % jich vyrùstá z chorioidey (Smith et al., 2002). Klinicky se tyto tumory manifestují jako ztluštìní iris, nepravidelnosti pupily, slepota, bolestivost oka, sekundárnì se objevuje keratitida, hyphema, edém rohovky, uveitida, unilaterální glaukom, buphthalmos, odchlípení sítnice (Smith et al., 2002). Z 15 % až 29,8 % jde o melanomy, které v pøibližnì 4 % pøípadù metastazují. Pøítomnost melanomù je spojena s kratší dobou pøežívání pacientù (Smith et al., 2002). Pro vznik melanocytárních neoplazií jsou predisponovaná tato plemena psù: * Èau – èau má èastìjší postižení jazyka (Spangler, Kass, 2006) * Psi se silnì pigmentovanou kùží, malí kníraèi, standardní kníraèi a skotští teriéøi mají vyšší výskyt kutánního melanomu (Smith et al., 2002). * Irský setr a zlatý retrívr mají predispozici pro melanom drápového lùžka (Smith et al., 2002). * Irský setr, zlatý retrívr, kokršpanìl a èivava mají predispozici pro melanom pyskù (Smith et al., 2002). * Nìmecký ovèák a boxer mají predispozici pro orální melanom (Smith et al., 2002). * Zlatý retrívr a labradorský retrívr mají predispozici pro oèní melanocytární neoplazie (Donaldson et al., 2006a). Støední vìk psù postižených melanocytárními tumory je v souèasnosti 12 let. Døíve se uvádìla zvýšená frekvence výskytu u samcù, v souèasnosti je frekvence stejná u obou pohlaví (Spangler, Kass, 2006). Støední vìk v dobì diagnostiky limbálního melanomu u psù je 6,2 roku (± 2,75 roku) s rozmezím 1–11 let. Køivka je však dvouvrcholová s prvním píkem mezi 3.–4. rokem a s druhým vrcholem mezi 7.–10. rokem (Donaldson et al., 2006a). KOÈKY – melanocytární neoplazie tvoøí ménì než 1 % tumorù v ústní dutinì a pøibližnì 0,5 % všech neoplazií kùže. V oèní a kožní lokalizaci se vyskytují èastìji než v ústní dutinì (Smith et al., 2002). – Kùže – ve více než 50% dochází k rekurenci tumoru a vývoji metastáz v regionálních mízních uzlinách (Smith et al., 2002). – Oko – pøevážnì se vyskytují v pøedním uveálním traktu (až 60% jich pochází z iris). Zøídka se objevují na limbu, spojivce a mžurce, mohou se vyskytovat i multifokálnì v uveálním traktu a iris. Mohou být lokálnì infiltrativní nebo mohou metastazovat. Metastazující melanomy



Obr. 1: Melanocytom - pes, køíženec, samice kastrát, 17 let

Obr. 2: Melanom drápového lùžka - pes, nìmecká doga, samice kastrát

byly popsány i na oèních víèkách. Bìžným následkem intrabulbárních tumorù je glaukom. Doba pøežívání je kratší u pacientù s invazí neoplazie do øasnatého tìlíska (støednì rozvinuté onemocnìní) v porovnání s pacienty s postižením stromatu iris a trabekulární síśoviny (èasné stadium nemoci) (Smith et al., 2002). Onemocnìní postihuje koèky od 2 let do 18 let vìku s vrcholem výskytu mezi 8.–12. rokem vìku. Nebyla prokázána pohlavní predispozice (Smith et al., 2002).

– IV – melanomy, které metastazují do vzdálených orgánù. Stadia II až IV jsou považována za pokroèilá (Bergman, 2007).

FRETKY – existuje jediná kazuistika málo pigmentovaného kožního melanomu (Smith et al., 2002). Tumor byl S100 protein pozitivní, Melan A negativní a elektronovou mikroskopií byly prokázány melanozomy v rùzné fázi vývoje (Tunev, Wells, 2002). Podle klasifikace WHO (Bergman, 2007) se rozlišují ètyøi stadia rozvoje melanocytárních tumorù: – I – tumory do velikosti 2 cm v prùmìru, které nemetastazují do regionálních mízních uzlin ani do vzdálených orgánù. – II – tumory o velikosti 2–4 cm v prùmìru, které nemetastazují do regionálních mízních uzlin ani do vzdálených orgánù. – III – neoplazie metastazující do regionálních mízních uzlin bez pøítomnosti metastáz ve vzdálených orgánech.

Obr. 3: Melanom sliznice dutiny ústní infiltruje i maxilu, pes, køíženec

Makroskopický patologicko-anatomický nález Melanocytární neoplazie mohou mít rùzný tvar (mohou být vyklenuté s hladkým povrchem, laloènaté, polypoidní nebo plaku podobné), rozdílnou velikost a barvu (šedou, tmavì modrou, èervenou, hnìdou nebo èernou). Vìtší útvary èasto ulcerují. V kožní lokalizaci mohou být alopatické (Smith et al., 2002). Melanomy metastazují krevními a/nebo lymfatickými cévami nejèastìji do regionální mízní uzliny jako prvního cíle. Z vnitøních orgánù bývají metastázami nejèastìji zasaženy plíce, ale melanomy mohou metastazovat do všech viscerálních orgánù (Smith et al., 2002). Melanomy jsou schopné invadovat do kostí a zpùsobit jejich lýzu. To bývá èasté v kostech prstù, maxile, mandibule, obratlích a žebrech (Smith et al., 2002). Obèas bývají melanomem nebo jeho metastázou postiženy i serózní povrchy (perikard, pleura, peritoneum). Efúze s tímto procesem spojená mùže, ale nemusí být èerná (Smith et al., 2002).

Obr. 4: Melanom sliznice dutiny ústní, pes, køíženec, samec

13



Obr. 5: Melanom duhovky oka - pes

Obr. 6: Melanom duhovky oka - pes, bernský salašnický, samec, 6 let

Histopatologie Vìtšina zvíøecích melanomù jsou v dobì odbìru vzorkù pro histopatologické vyšetøení pokroèilé invadující masy odpovídající nodulárnímu melanomu u lidí (Smith et al., 2002). V kùži mohou být lokalizovány v epidermis, v dermis nebo souèasnì postihují epidermis i korium. Podobnì i na sliznicích se nacházejí v epitelu, v subepiteliálním vazivu nebo v obou souèasnì. Termín junkèní melanom oznaèuje pøítomnost nádorových bunìk pøi dermo-epidermální junkci i v povrchovìjších vrstvách epidermis. Je-li intraepidermální komponenta tumoru ve formì individuálních bunìk, nebo drobných bunìèných hnízd, nazývá se takové uspoøádání pagetoidní. U zvíøat však pagetoidní forma melanocytárních tumorù nebyla popsána (Gross et al., 2005; Smith et al., 2002). U domácích zvíøat mají melanocytární tumory dosti variabilní morfologii a stupeò pigmentace. Histologicky se rozlišují: - Epitelioidní melanomy, které jsou tvoøeny buòkami pøipomínajícími epitelie. Mají pomìrnì objemnou cytoplazmu a velká jádra s výraznými jadérky. Èasté jsou jaderné atypie, poèetné mitotické formace, anisokaryóza, anizocytóza, pøípadnì bunìèné monstrozity. Tyto morfologické znaky jsou dobøe patrné pouze v amelanotických

melanomech, nebo po vybìlení melaninu. Amelanotické epitelioidní melanomy mohou být pøi cytologickém vyšetøení zamìnìny za karcinomy (Smith et al., 2002). – Vøetenobunìèné melanomy – jsou tvoøeny více èi ménì vøetenitými buòkami, nìkdy s patrnými dlouhými výbìžky. Buòky jsou seskupeny ve svazcích, èasto vzájemnì propletených. Takovéto melanomy se mohou podobat fibrosarkomu nebo neurofibrosarkomu, ale jádra mívají kulatìjší a nukleoly výraznìjší. Amelanotické vøetenobunìèné melanomy mohou být pøi cytologickém vyšetøení zamìnìny za granulaèní tkáò, hemangiopericytom, histiocytární sarkom nebo jiné nepigmentované mezenchymální neoplazie (Smith et al., 2002). – Smíšené melanomy – jsou tvoøeny buòkami obou výše uvedených typù. Bývají maligní (Smith et al., 2002). – Spirálovitá (prstencovitá nebo dendritická) forma melanomu se vyskytuje jen v kùži. Buòky vøetenovitého vzhledu jsou seskupené do tìsnì sevøených pruhù èasto pøipomínajících otisky prstù. Obvykle bývá benigní (Smith et al., 2002). – Melanom ze svìtlých (balonových) bunìk se vyskytuje u psù v kùži a na sliznici dutiny ústní a u koèek v kùži. Buòky mají jemnì granulovanou, svìtle eozinofilní a slabì hnìdì poprášenou cytoplazmu. Jádra jsou okrouhlá, rozdílné velikosti s chromatinem lokalizovaným na periferii

Obr. 7: Névus na nose, evropská krátkosrstá koèka, samice kastrát, 2 roky

Obr. 8: Okulární melanom - evropská krátkosrstá koèka, samice kastrát

14



Obr. 9: Melanom podkoží - pes, køíženec, samice kastrát, 15 let

Obr. 10: Névus duhovky oka, pes, maïarský ohaø krátkosrstý, samice, 12 let

a s výraznými jadérky (Smith et al., 2002). – Melanom z bunìk typu peèetního prstene se vyskytuje na sliznici dutiny ústní koèek, je amelanotický a složený z pleiomorfních bunìk s hladkými, excentricky umístìnými jádry, k nimž v nìkterých buòkách pøiléhají velká, svìtlá, intracytoplazmatická inkluzní tìlíska (Smith et al., 2002). – Adenoidní (papilární) forma melanomu se vyskytuje na sliznici dutiny ústní u psù, buòky jsou uspoøádány do struktur podobných acinùm (Smith et al., 2002). – V melanomech vyrùstajících na kterémkoliv místì tìla se mùže vzácnì vyskytovat osteoidní a chondroidní metaplazie (Smith et al., 2002). V orální oblasti se chovají stejnì jako jiné typy melanomù (Sánchez et al., 2007). – Mezi dobou pøežívání a histologickým typem melanocytární neoplazie nebyly zjištìny žádné souvislosti (Smith et al., 2002). Melanocytární neoplazie jsou obvykle doprovázeny pøítomností melanofágù. Jsou to histiocyty, které fagocytují melanin uvolnìný do intercelulárních prostorù. Na rozdíl od melanocytù mají menší jádra a jadérka a melanin se nachází v lyzozomech. Melanofágy mohou být pozorovány i v periferní krvi a v efúzi v pøípadì viscerálních metastáz melanomu (Smith et al., 2002). Vyskytnou-li se buòky melanomu v periferní krvi, mají pigmentová granula velmi jemná, teèkovitá, sférická nebo oválná. Stupeò pigmentace mùže být variabilní dokonce i v jednom nátìru (Smith et al., 2002). Buòky melanomu v místì primárního výskytu a v místech výskytu vzdálených metastáz se nemusí vždy morfologicky shodovat. Vzdálené metastázy bývají èasto ménì pigmentované. Pøi monitoringu metastáz jsou nejèastìji cytologicky vyšetøovány tenkojehlové aspiráty z regionálních mízních uzlin. Nádorové buòky se v roztìrech mohou vyskytovat v rozdílném množství, nìkdy mohou dokonce zakrýt i lymfatickou tkáò. Pro porovnání metastatických bunìk vyskytujících se v nátìru roztroušenì v malém poètu je užiteèné mít po ruce i nátìr z primárního místa výskytu neoplazie (Smith et al., 2002). Vyšetøení mízních uzlin na pøítomnost metastáz mùže být komplikováno pøítomností melanofágù v medulárních sinusech (melanóza mízních uzlin není specifická pro metastázy melanomu, ale mùže se vyskytovat pøi jakékoliv

hyperpigmentaci v regionu drénovaném pøíslušnou mízní uzlinou, napøíklad v mandibulárních mízních uzlinách u psù s orálním melanomem, ale i u psù s pigmentovanou sliznicí dutiny ústní pøi zánìtu sliznice dutiny ústní) (Smith et al., 2002). Pigmentu mùže být v buòkách takové množství, že až zastírá strukturu bunìk. Pro identifikaci bunìèných struktur je nezbytné vybìlení melaninu, pøípadnì použití dalších diagnostických metod (Smith et al., 2002). Pleurální nebo peritoneální efúze zpùsobené melanomem obsahují èasto buòky melanomu i melanofágy. Buòky melanomu bývají obvykle kulaté až epitelioidní, pøípadnì peèetního prstenu nebo balonové. Pokud se vyskytne vøetenobunìèná forma, mívají buòky spíše krátké, tupé cytoplazmatické výbìžky než dlouhé výbìžky typické pro solidní neoplazie. Slabá pigmentace mùže znemožnit definitivní urèení neoplazie jako melanom, ale urèitým vodítkem pro urèení pùvodu neoplastických bunìk mùže být anamnéza. Efúze bývá cytologicky obvykle klasifikována jako modifikovaný transudát nebo exsudát. Uvádí se, že 40 % efúzí zpùsobených melanomem není diagnostických (Smith et al., 2002). Kritéria malignity PSI – v literatuøe obvykle koreluje biologické chování tumorù s morfologií neoplastických bunìk. Ve skuteènosti však tato shoda mezi morfologickými a biologickými vlastnostmi melanocytárních tumorù není zcela spolehlivá (Spangler, Kass, 2006). Melanom je jednou z mála neoplazií u zvíøat, kde je místo výskytu neoplazie dùležitým prognostickým ukazatelem. Melanocytární neoplazie dutiny ústní, subangulární oblasti a mukokutánních spojení jsou obvykle malignìjší než stejné tumory vyskytující se na jiných místech tìla. V pøípadì nízce diferencovaného tumoru jiné histogeneze mùže dojít k zámìnì takového tumoru za melanom, zvláštì v ústní dutinì (Spangler, Kass, 2006). Bylo zjištìno, že bunìèný typ, prùmìr jádra, intraepiteliální proliferace melanocytù, junkèní aktivita a pøítomnost obrovských bunìk nijak neovlivòují mortalitu pacientù s melanocytární neoplazií (Spangler,Kass 2006). – Podle Spanglera a Kasse (2006) byly signifikantnì negativními znaky pro pøežívání psù s melanocytárními

15



Obr. 11: Orální melanom - køíženec, samec, 13 let


tumory pøítomnost metastáz, vyšší mitotický index, vìtší výskyt nukleárních atypií, velikost tumoru, pøítomnost zánìtu v hloubce neoplazie a ložisek nekrózy uvnitø nádorové léze. U tumorù v kùži, na chodidlech a pyscích negativnì ovlivòoval pøežívání také vìk pacienta a u tumorù chodidel a pyskù i junkèní aktivita tumoru. Autoøi se snažili vytvoøit matematické modely pro pøedpovìï chování tumorù po jejich chirurgickém odstranìní a zjistili, že za spolehlivý prognostický znak lze považovat mitotický index a pøítomnost nukleárních atypií. – U intraokulárních melanomù s potvrzenými metastázami byl mitotický index (MI) > = 4. U anteriorního uveálního melanomu byl pozorován vztah mezi malignitou a bunìèným typem neoplazie. Riziko metastazování neoplazie bývá vyšší u smíšeného a epitelioidního bunìèného typu. Naopak u neoplazií tvoøených úzkými vøetenovitými buòkami s malými jádry a žádnými mitózami nebo kulatými buòkami s velkým množstvím melaninu a malými kulatými jádry se velmi pravdìpodobnì jedná o melanocytom (Smith et al., 2002). Mitotický index (MI) je èíselné vyjádøení poètu mitotických figur v 10 po sobì následujících nepøekrývajících se zorných polích pøi velkém zvìtšení (obvykle 40 × 10). Mitotická aktivita kolísá i v rámci jednoho øezu, takže je nutno prohlédnut celý preparát a poèítat mitotické formace v místech jejich nejvìtšího výskytu (Spangler, Kass, 2006).

Pøi MI > 3 je neoplazie považována za melanom, pøi MI < 2 je neoplazie považována za melanocytom (Smith et al., 2002). MI u silnì pigmentovaných neoplazií by mìl být hodnocen z bìlených preparátù, aby se zabránilo zámìnì mitóz za malá hyperchromatická jádra vøetenovitých bunìk podpùrného stromatu nebo za pyknotická jádra (Smith et al., 2002). Pøi cytologickém vyšetøení se používají spíše standardní kritéria malignity (výrazná anizocytóza, anizokaryóza, velká až obrovská jadérka, atypická jadérka a výrazný pleomorfismus). Mitotické figury totiž mohou být díky technice nátìru poškozené a bunìèné artefakty se mohou jevit jako atypie. U preparátù pro cytologické vyšetøení není dále vhodné hodnotit mitotický index kvùli neuniformnímu množství bunìk pøi velkém zvìtšení. Cytologicky benigní neoplazie by mìly být vyšetøeny ještì histologicky (samozøejmì pokud nepocházejí z místa, o nìmž by se dalo uvažovat jako o místu možného výskytu metastázy – napøíklad mízní uzlina) (Smith et al., 2002). U amelanotických nebo u slabì pigmentovaných neoplazií mùže být cytologická diagnostika obtížná díky podobì tìchto bunìk s jinými neoplastickými buòkami. Za urèitý rozlišovací znak lze považovat pøítomnost lymfoglandulárních tìlísek, což jsou globulární, homogenní a bazofilní cytoplazmatické fragmenty pøipomínající trombocyty, které bývají u jiných než lymfoidních neoplazií pozorovány



16

VETERINÁRNÍ LÉKAØ  ROÈNÍK 6  2008  ÈÍSLO 1 s mnohem menší èetností (Smith et al., 2002). Nukleární atypie ukazuje relativní zralost bunìk. Byla definována jen u melanomù epitelioidního typu (Spangler, Kass, 2006). – Dobøe diferencované melanocyty nebo typické buòky melanocytomu charakterizuje malé jádro a jedno centrálnì uložené jadérko. Chromatin se shlukuje minimálnì, èasto se objevují kondenzovaná vlákna jaderného chromatinu zasahující od jadérka k jaderné membránì a objevuje se kondenzace chromatinu podél vnitøního povrchu jaderné membrány (Spangler, Kass, 2006). – Málo diferencované (atypické) buòky melanomu charakterizují vìtší jadérka ménì pravidelného tvaru, excentricky uložená v jádøe a èasto mnohoèetná (v nìkterých pøípadech neuspoøádanì pøipojená k vnitønímu povrchu jaderné membrány tenkými vlákny chromatinu, takže jádro vypadá jako hrubozrnnì vakuolizované) (Spangler,Kass 2006). Nukleární atypie se hodnotí stupnicí 1 – 10 podle subjektivnì odhadnutého procenta postižených jader (0 = žádná nukleární atypie, 1 = 1 % – 9 % postižených jader, 2 = 10 % – 19 % postižených jader, 3 = 20 % –29 % postižených jader, 4 = 30 % – 39 % postižených jader, 5 = 40 % – 49 % postižených jader, 6 = 50 % – 59 % postižených jader, 7 = 60 % – 69 % postižených jader, 8 = 70 % – 79 % postižených jader, 9 = 80 % – 89 % postižených jader, 10 = 90 % - 99 % postižených jader) (Spangler,Kass 2006). Kritéria nukleární atypie se nehodí pro hodnocení melanocytárních neoplazií pøevážnì složených z vøetenovitých bunìk, dendritických bunìk nebo bunìk typu peèetního prstenu (Spangler, Kass 2006). KOÈKY – kritérii malignity u koèek jsou: * nukleární atypie (neoplazie s výraznìjší atypií jsou s vìtší pravdìpodobností maligní), * mitotický index (èím vìtší je poèet mitóz, tím je neoplazie malignìjší). Histologické urèení malignity nemusí souhlasit s klinickým chováním neoplazie. U uveálních melanocytárních neoplazií koèek bunìèný pleomorfismus, stupeò pigmentace, pomìr jádro/cytoplazma a množství jadérek nijak nesouvisí s metastatickým chováním neoplazie (Smith et al., 2002). Sofistikovanìjší metody jako napøíklad prùtoková cytometrie pro detekci chromozomálních anomálií, použití MIB-1 (= monoklonální protilátka proti Ki – 67, která identifikuje proliferující buòky), stanovení PCNA (= proliferating cell nuclear antigen) a exprese p 53 proteinu nepøinášejí proti výše uvedeným kritériím založeným na morfologických znacích žádnou výraznou výhodu v pøedpovìdi biologického chování neoplazie (Smith et al., 2002). Aèkoliv podle jiné (novìjší) studie (Sánchez et al., 2007) je užiteèným prostøedkem pro pøedpovìï biologického chování melanocytárních neoplazií analýza mitotického indexu a exprese proliferaèního markeru Ki-67. Další diagnostické metody Amelanotické nebo málo diferencované melanomy

Melanocytární neoplazie èasto unikají definitivní diagnóze a (jak už bylo uvedeno výše) mnohé jiné neoplazie mohou morfologicky imitovat melanocytární neoplazie. Proto se pro jejich urèení vyvíjejí další diagnostické postupy jako histochemické metody, elektronová mikroskopie, imunohistochemické metody a novìji in situ hybridizace (Smith et al., 2002). HISTOCHEMIE – je založena na principu barevné chemické reakce – Impregnaèní metoda Mason-Fontanova je založena na redukci amoniakálního roztoku støíbra melaninem a používá se jako jedna z metod diagnostiky amelanotických nebo nízce pigmentovaných melanomù. Smith (2002) uvádí, že tato metoda není zcela spolehlivá, protože redukèní aktivitu mohou mít i jiné endogenní pigmenty, napøíklad lipofuscin. – Specifiètìjší reakcí je prùkaz tyrozinázy (synonymum dihydroxyfenylalanin oxidáza), což je enzym konvertující tyrozin v melanin. V amelanotických melanomech se pozitivní reakce projeví tvorbou hnìdého nebo èerného pigmentu v cytoplazmì bunìk. Pro provedení tohoto testu je však bohužel nutná èerstvá tkáò (Smith et al., 2002). ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE (EM) – pomocí elektronové mikroskopie se pøi diagnostice melanocytárních neoplazií detekují melanozomy. Pøítomnost melanozomù indikuje, že buòka melanozomy obsahující je schopná aktivní produkce melaninu, tedy že je neuroektodermálního pùvodu. Melanozomy je nutné odlišit od sekundárních lyzozomù v keratinocytech a makrofázích obsahujících melanin fagocytovaný tìmito buòkami. Melanocyty a buòky melanomu je možné ultrastrukturálnì rozpoznat podle pøítomnosti nejen normálních, ale i abnormálních nebo nezralých melanozomù (synonymum premelanozomù), které jsou pro tyto buòky typické. Melanozomy a premelanozomy nejsou specifické pro melanocyty, nacházejí se i v jiných buòkách neuroektodermálního pùvodu a také v keratinocytech. Nevýhodou elektronmikroskopického vyšetøení je, že ho nelze realizovat na materiálu fixovaném formalínem a zalitém do parafínu (Smith et al., 2002). IN SITU HYBRIDIZACE (ISH) – spoèívá v použití sondy komplementární DNA pro tyrozináza specifickou mRNA. Je to reakce vysoce specifická a citlivá a je možno ji provádìt i na formalínem fixovaných a v parafínu zalitých tkáních. Protože amelanotické i pigmentované melanomy obsahují podobná množství tyrozináza specifické mRNA, je in situ hybridizace vhodnou metodou pro diagnózu nízce diferencovaných melanomù (Smith et al., 2002). IMUNOHISTOCHEMIE (IHC) – je založena na principu vazby primárních monoklonálních a polyklonálních protilátek na bunìèné antigeny. Tato vazba je detekována sekundární protilátkou konjugovanou s enzymem (nejèastìji peroxidázou nebo alkalickou fosfatázou) a místo reakce se vizualizuje buï diaminobenzidinem, nebo fast red. – V melanomech lze prokázat vimentin, který je však pøítomen i ve všech tkáních mezenchymální histogeneze. Ve vìtšinì melanocytárních tumorù lze prokázat S100 protein, který je ale nacházen i v jiných tkáních neuroektodermální histogeneze (Smith et al., 2002). – Melan-A/MART (= melanoma antigen recognized by T cells) – je protein s neznámou funkcí vyvolávající cytotoxickou odpovìï T – lymfocytù. Vìtšinou je silnì pozitivní v cytoplazmì melanocytù. V ostatních tkáních

17

Melanocytární neoplazie má omezenou distribuci. Melanofágy jsou melan-A negativní (Smith et al., 2002). Rùzné studie uvádìjí rozdílné výsledky (Choi, Kusewitt, 2003), ale shodují se až na 92 % pozitivitì melan-A u pigmentovaných melanomù, zatímco u amelanotických melanomù bylo pozitivních pouze 47,6 %. Navíc, pozitivita v amelanotických melanomech byla slabá (Choi, Kusewitt, 2003). Benigní neoplazie jsou støednì až silnì pozitivní. Metastázy melanomù a nìkteré karcinomy (slinných žláz, pøechodního epitelu) bývají slabì pozitivní (Smith et al., 2002). – Protilátka proti TRP-2. TRP-2 (tyrosinase - related protein – 2) je jedním z diferenciaèních antigenù melanocytù. Jedná se o enzym úèastnící se syntézy eumelaninu. Choi a Kusewitt (2003) zjistili pozitivitu u 61,9 % amelanotických melanomù. Reakce nebyla prokázána u nepigmentovaných schwannomù ani u S-100 pozitivních GISTs (= gastrointestinal stromal tumors). - Melanom – asociované antigeny (obzvláštì melanozomální – HMSA – human melanosomal specific antigens) – anti-HMSA 1 oznaèila 60 %, anti-HMSA 5 oznaèila 69 % testovaných psích melanomù. Pokud byla použita kombinace anti-HMSA 1 a anti-HMSA 5, bylo pozitivnì oznaèeno 83 % psích melanomù (Smith et al., 2002). Diagnostika za pomoci anti-HMB-45 se dle nìkterých autorù u zvíøecích melanomù neosvìdèila, podle jiných je však její užitek možno zvýšit po pøedchozím ošetøení formalínem fixovaných tkání pomocí KMnO4 – šśavelové kyseliny (podle jedné studie bylo dosaženo u psù až 88% pozitivity, zatímco u neoplazií jiné histogeneze byla pozitivita pouze 6%) (Smith et al., 2002). IBF 9 je první myší monoklonální protilátka pro rozpoznávání antigenù psího melanomu, která však není dosud komerènì vyrábìna pro diagnostické úèely. Senzitivita je více než 80 %. Køížovì reaguje i s jinými typy neoplazií (napøíklad bazaliomem a lymfosarkomem), které je však snadné vylouèit na základì použití dalších imunohistochemických testù a na základì morfologie bunìk (Smith et al., 2002). Diferenciální diagnostika Je nutné od sebe odlišit melanocytární neoplazie a pigmentované neoplazie epidermis a adnex (napøíklad bazaliomy a karcinomy, trichoblastomy, trichoepiteliomy, pilomatrixomy, sebaceózní a apokrinní neoplazie, ceruminózní cysty u koèek). Melanocytární hyperplazie (lentigo simplex) na pyscích, oèních víèkách, nose a sliznicích oranžových, krémových a støíbrných koèek vypadají na tìchto místech jako pigmentové makuly. Hyperpigmentované makulární léze klinicky se podobající melanomu se mohou vyskytovat na kùži psù hlavnì na bøiše a bradavkách. Podobnì také epidermální hamartomy (pigmentované epidermální névy, seborrhoická keratóza psù) a dermální hemangiom nebo hemangiosarkom mohou vypadat jako pigmentované kožní neoplazie. Nemelanocytární neoplazie bìžnì vyrùstající v dutinì ústní a oku se málokdy klinicky projevují jako pigmentované neoplazie (Smith et al., 2002). Terapie 1. Chirurgické radikální odstranìní neoplazie vede samotné u psù se stadiem I orálního melanomu ke støední

18

VETERINÁRNÍ LÉKAØ  ROÈNÍK 6  2008  ÈÍSLO 1 dobì pøežívání 17–18 mìsícù, u psù se stadiem II orálního melanomu ke støední dobì pøežívání 5–6 mìsícù a u psù se stadiem III orálního melanomu ke støední dobì pøežívání 3 mìsíce (Bergman, 2007). Radikální excizí tumoru se rozumí odstranìní tumoru i se 2–3 cm okolní zdravé tkánì (Vlašín, 2004). U orálních melanomù vyrùstajících z dásní v pøípadì, že nejsou potvrzeny metastázy, mùže být kurativní resekce tumoru provedená zároveò s mandibulektomií popøípadì s maxilektomií (podle lokalizace neoplazie). Je-li tumor rozsáhlý nebo hodnì kaudálnì lokalizovaný, bývá obtížné nebo nemožné pøekrýt defekt po chirurgickém zákroku sliznièní klapkou (Hedlund, 1997). Melanomy vyrùstající z kaudálního úseku hltanu nebo invadující svalovinu podjazyèí jsou neresekovatelné (Hedlund, 1997). Melanomy pyskù se ošetøí odstranìním tumoru a okolní tkánì postiženého pysku v celé jeho tloušśce a souèasnì se provede podle lokalizace nádoru buï parciální mandibulektomie, nebo maxilektomie (Hedlund, 1997). Melanomy vyskytující se na povrchu spojivky se excidují, a má-li následný konjunktivální defekt prùmìr vìtší než 7–8 mm, je nutná sutura spojivky (Moore, Constantinescu, 1997). Epibulbární melanomy se resekují a vzniklý defekt je následnì možné rekonstruovat transplantací štìpù z periferie rohovky, limbu nebo skléry. Pro usnadnìní vaskularizace štìpu a minimalizaci možnosti vzniku dehiscence rány, infekce štìpu nebo kolagenolýzy je možné štìp pøekrýt klapkou vytvoøenou z okolní spojivky (Wilkie, Whittaker, 1997). U intraokulárních melanomù se doporuèuje enukleace postiženého oèního bulbu (Beránek et al., 2000). Kožní melanomy se øeší radikální chirurgickou excizí (Rybníèek et al., 2000). 2. Radiaèní terapie po pøedchozí chirurgické resekci neoplazie – v Èeské republice není dostupná, jinak se používá: a) Hypofrakcionovaná radiaèní terapie externími paprsky, kdy je celková dávka záøení rozdìlena na více dávek dílèích aplikovaných v urèitých èasových intervalech (Blackwood, Dobson, 1996; Farrelly et al., 2004; Proulx et al., 2003; Kinzel et al., 2003; Théon et al., 1997), u psù s orálním melanomem, kteøí podstoupili hypofrakcionovanou radiaèní terapii byla støední doba do objevení se rekurence/metastázy 5 mìsícù od zapoèetí radioterapie (rozmezí 4–6 mìsícù) a støední doba pøežívání 7 mìsícù (rozmezí 6–9 mìsícù) (Proulx et al., 2003). U koèek s orálním melanomem byla støední doba pøežívání 146 dní (rozmezí 66–224 dní) od zaèátku radioterapie (Farrelly et al., 2004). b)Plesioterapie (plesios = blízký) – používá se k léèbì povrchových kožních/sliznièních neoplazií pomocí zdroje beta záøení, který je umístìn uvnitø napøíklad silikonového odlitku povrchu postižené oblasti. Odlitek je možno aplikovat delší dobu pøipevnìný nad místem léze. U psù byla tato terapie zkoušena u intraokulárních melanomù (Donaldson et al., 2006b; Karolis et al., 1983). 3. Chemoterapie – standardem systémové chemoterapie u psù je použití karboplatiny. Míra odezvy na chemoterapii u psù s pokroèilým onemocnìním (stadia II–IV)

VETERINÁRNÍ LÉKAØ  ROÈNÍK 6  2008  ÈÍSLO 1 kolísá od 8 % do 28 %, pacienti s melanomem stadia IV mají støední dobu pøežívání po chemoterapii kratší než 10 mìsícù (Bergman et al., 2003). Pacienti se psím orálním melanomem stadia I mají støední dobu pøežívání po chemoterapii 1 rok (Liao et al., 2006). Celková míra odpovìdi pacientù se psím melanomem na chemoterapii je nízká a s málo dùkazy o tom, že tento druh léèby prodlužuje dobu pøežívání (Liao et al., 2006). U lidí se zkoušelo použití látky ADI-PEG20 (= pegylated arginine deiminase, èesky pegylovaná arginin deimináza) – jedná se o bakteriální enzym štìpící aminokyselinu arginin. U lidských melanomù a hepatocelulárních karcinomù, které jsou arginin auxotrofní (= ztratily schopnost syntetizovat arginin tím, že neexprimují enzym argininosukcinát syntetázu podílející se na syntéze argininu z citrulinu), ADI-PEG20 potlaèuje rùst tìchto neoplazií in vitro i in vivo tím, že rozkládá arginin (potøebný pro rychlý rùst neoplazie) pøítomný v kultivaèním mediu nebo v krvi. ADI-PEG20 u lidí má tolerovatelné nežádoucí úèinky (EMEA, 2005; Feun,Savaraj, 2006). Vysoké dávky chemoterapeutik, které jsou obvykle nutné pro efektivní chemoterapii, èasto zpùsobují systémovou toxicitu, proto se vyvíjejí další zpùsoby, jak chemoterapeutikum dopravit do cílových tkání (Serša et al., 2000a). Zvýšení permeability bunìèných membrán neoplastických bunìk (zajištìné tøemi níže uvedenými zpùsoby) zlepšuje pronikání chemoterapeutika intracelulárnì, a tak je zvýšen antitumorózní efekt chemoterapeutik. 4. Termochemoterapie - jako prostøedek pro zvýšení permeability bunìèných membrán se zkoušela lokální hypertermie 42 stupòù Celsia (± 1 stupeò Celsia) po dobu 30 minut v místì neoplazie a bezprostøednì pøed aplikací lokální hypertermie se do neoplazie aplikovala smìs kolagenu a cisplatiny. Provedeny byly celkem 4 kúry v týdenních intervalech (Théon et al., 1991). 5. Chemoradiaèní terapie – jako prostøedek pro zvýšení permeability bunìèných membrán využívá hypofrakcionovanou radiaèní terapii a 60 minut pøed zapoèetím ozaøování byla podána karboplatina v dávce 90 mg/m2 povrchu kùže pacienta i.v.. Vìtšina pacientù byli psi s orálním melanomem ve stadiu I. Støední doba pøežívání èinila 363 dní (Freeman et al., 2003). 6. Elektrochemoterapie – jako prostøedek pro zvýšení permeability bunìèných membrán využívá elektrické pulzy støídavého proudu a buï systémové nebo intratumorální chemoterapie. Byla použita pøi terapii kožních melanocytárních neoplazií, kožních metastáz a metastáz v povrchovì dostupných regionálních mízních uzlinách. Zvýšení permeability bunìèných membrán v elektrickými pulzy ošetøeném místì bylo nazváno elektroporací (Glass et al., 1996; Rols et al., 2000; Serša et al., 2000a; Serša et al., 2000b). 7. Fotokoagulace (laserová terapie) – byla zkoušena v léèbì intraokulárního limbálního melanomu u psù a koèek. Byla zaznamenána rekurence neoplazie u 6,67 % ošetøených pacientù do 3 mìsícù a u 13,33 % ošetøených pacientù do 1 roku od ukonèení ošetøení (Sullivan et al., 1996). 8. Vakcinace – antigeny exprimované buòkami neoplazie jsou vìtšinou totožné s antigeny exprimovanými na normálních buòkách organismu. Imunitní odpovìï na tyto antigeny bylo doposud možno velmi obtížnì vyvolat kvùli toleranci/ignoranci antigenù neoplazie imunitním

Melanocytární neoplazie systémem pacienta. Stále se nenašel vhodný zpùsob, jak vyvolat optimální imunitní odpovìï, která by vedla k rejekci neoplazie, ochranì pøed neoplazií nebo k výraznému prodloužení doby pøežívání pacientù s melanocytárními neoplaziemi.(Bergman et al., 2003; Bergman et al., 2006; Rodriguez – Lecompte et al.,2004). Klinické výsledky nìkterých zpùsobù, jak imunotoleranci antigenù melanocytárních neoplazií obejít, se jeví velmi povzbudivì (napøíklad použití xenogenních (= od jiných živoèišných druhù pocházející) DNA vakcín kódujících èleny tyrozinázové rodiny), obzvláštì v kombinaci s chirurgickou resekcí neoplazie a následnou hypofrakcionovanou radiaèní terapií (Bergman et al., 2003; Bergman et al., 2006). Uvádíme zpùsoby, které byly v imunizaci proti melanocytárním neoplaziím použity, a jejich klinické výsledky: a) Použití xenogenních antigenù tyrozinázové rodiny, kterou tvoøí 4 proteiny (enzymy) úèastnící se v melanocytech syntézy melaninu: tyrozináza (kódovaná albino lokusem), TRP-1/gp 75 (kódovaný hnìdým lokusem), TRP-2/DCT (DOPA chrom tautomeráza) (kódovaný bøidlièným lokusem) a P mell 17/Silver/gp 100 (kódovaný støíbrným lokusem) (Alexander et al., 2006; Bergman et al.,2003; Bergman et al., 2006; Choi, Kusewitt, 2003; Di Pucchio et al., 2006; Goldberg et al., 2005; Gyorffy et al., 2005; Lindsey et al., 2006). Èleny tyrozinázové rodiny xenogenního pùvodu je možno k vakcinaci použít buï ve formì proteinù (samotné však nevyvolaly T lymfocytární odpovìï – té bylo dosaženo u lidí podáním IFN (= interferon) alfa do organismu pacienta) (Di Pucchio et al., 2006), nebo jako cDNA (= DNA získaná reverzní transkripcí z mRNA) tyto proteiny kódující zabudovaná do bakteriální plazmidové DNA schopné exprese pøíslušných antigenù, jejíž souèástí je i promotér – tento genový konstrukt se nazývá pING plazmidový vektor (Bergman et al., 2003; Bergman et al., 2006) (POZOR !!! plazmidová DNA vakcinace u lidí a ostatních primátù nevyvolává kompletní a trvalou imunitu proti melanomu a má suboptimální úèinnost (Goldberg et al., 2005)), nebo zabudováním cDNA kódující xenogenní proteiny tyrozinázové rodiny do alfavirových VRP (virus – like replicon particles) – opakované vakcinace tímto genovým konstruktem byly možné bez rizika vzniku antivektorových protilátek s následným rozvojem antivektorové imunity u myší (Goldberg et al., 2005)). POZOR!!! U myší bylo také zjištìno, že dostateènì imunogenní byly i VRP obsahující alogenní (= od jiného jedince téhož druhu pocházející) tyrozinázovou DNA. DNA vakcíny mohou vyvolat bunìènou i protilátkovou imunitu a tato kombinovaná imunita mùže být efektivnìjší než samotná protilátková nebo samotná bunìèná imunita (Bergman et al., 2003). Jako nejefektivnìjší se v imunoterapii psího melanomu jevila vakcinace pomocí humání DNA kódující tyrozinázu (støední doba pøežívání u pacientù tímto zpùsobem ošetøených s melanomem stadia II–IV èinila 389 dní) nebo pomocí myší DNA kódující tyrozinázu (støední doba pøežívání u pacientù s melanomem stadia II–IV èinila 224–242 dní). V pøípadì, že bylo ve vakcínì s myší DNA kódující tyrozinázu použito jako imunologické adjuvans lidského rekombinantního GM – CSF (= granulocyte-macrophage colony stimulating factor), došlo k prodloužení støední doby pøežívání u pacientù s melanomem stadia II–IV na více

19

Melanocytární neoplazie než 402 dní, pøièemž nebylo dosaženo mediánu (Bergman et al., 2006). Chemokiny totiž hrají dùležitou roli v regulaci imunitní reaktivity organismu vùèi patogenùm nebo vùèi nádorovým buòkám a rovnováha jejich produkce mùže mít za následek Th1 nebo Th2 typ imunitní odpovìdi. Lze je tedy s výhodou využít jako imunologická adjuvans. Jedná se zejména o chemokiny GM – CSF, IL (= interleukin) – 2, IFN alfa (Di Pucchio et al., 2006). Další studie uvádí u 3 pacientù se psím melanomem stadia IV s lokálnì- regionálnì kontrolovaným onemocnìním (pøed vakcinací ošetøeni radikální chirurgickou resekcí a hypofrakcionovanou radiaèní terapií) vakcinovaných lidskou DNA kódující tyrozinázu støední dobu pøežívání 329, 421, respektive více než 588 dní. U 2 pacientù se psím melanomem stadia II–III s lokálnì-regionálnì kontrolovaným onemocnìním vakcinovaných lidskou DNA kódující tyrozinázu støední dobu pøežívání 501 respektive 496 dní. U 4 pacientù se psím melanomem bez lokálnìregionální kontroly onemocnìní vakcinovaných lidskou DNA kódující tyrozinázu byla støední doba pøežívání 54–126 dní. Celkem bylo do této studie zahrnuto 9 psù s melanomem (Bergman et al., 2003). Zdá se tedy, že vakcinace xenogenní DNA kódující tyrozinázu (popøípadì s použitím výše uvedených chemokinù jako imunologického adjuvans) je vhodným doplòkem léèby psù s melanomem, kteøí pøedtím podstoupili radikální chirurgickou resekci neoplazie a hypofrakcionovanou radiaèní terapii. Nicménì výzvou zùstává výzkum proteinù dùležitých pro udržení maligních vlastností bunìk melanomu, které by mohly sloužit jako lepší terapeutický cíl než tyrozináza (Lindsey et al., 2006). b) Použití disialogangliosidu GD3 – disialogangliosid GD3 je povrchový antigen melanocytù exprimovaný v 94,2 % pøípadù u šesti ze sedmi bunìèných linií psího melanomu a u normálních bunìk má jen omezenou expresi, což z nìj èiní velmi dobrý cíl pro vakcinaci proti psímu melanomu. Jedná se o velmi slabì imunogenní self – antigen, pokud však byl použit u zdravých psù s CpG – ODN (= CpG - oligodeoxynukleotidové sekvece) a RIBI adjuvans (ví se o nìm, že je zacíleno na TLR (= toll – like receptors) pøirozeného imunitního systému), bylo dosaženo tvorby IgG a IgM protilátek, buòkami ovlivnìná cytotoxicita byla detekována jen v mononukleárních buòkách z periferní krve vakcinovaných psù (Milner et al., 2006). U lidí se provádìla studie vakcinace pomocí „opracovaného“ GD3 (konjugací GD3 - laktonu s KLH (= keyhole limpet haemocyanin) a smísením s QS – 21 adjuvans) u pacientù s melanomem stadia III – IV a u 42% vakcinovaných pacientù došlo k tvorbì IgM a IgG protilátek. Nebyla zjištìna pøítomnost bunìèné imunity, neexistoval žádný významný statistický rozdíl v dobì pøežívání mezi skupinou pacientù, kteøí tvorbou protilátek odpovìdìli a mezi skupinou pacientù, kteøí nevykazovali tvorbu protilátek (Chapman et al., 2004). c) Použití dendritických bunìk – dendritické buòky (= dendritic cells = DC) jsou profesionální antigen prezentující buòky vznikající z monocytù. Diferenciace je podporována in vitro chemokiny (napøíklad IFN alfa, GM – CSF), dendritické buòky mají schopnost migrovat a stimulovat CD4+ T lymfocyty (Th lymfocyty) (Di

20

VETERINÁRNÍ LÉKAØ  ROÈNÍK 6  2008  ÈÍSLO 1 Pucchio et al., 2006). Vlastní dendritické buòky naplnìné xenogenním antigenem (lidským P mell 17/Silver/gp 100) a vpravené do organismu psù s melanomem byly schopny vyvolat v periferní krvi psù s melanomem T lymfocytární odpovìï s variabilní klinickou odezvou (Gyorffy et al., 2005). V jiné studii byly u psù použity vlastní dendritické buòky naplnìné lyzátem bunìk psího melanomu CMM2 v pøítomnosti KLH a tyto CMM2 – KLH – DC byly schopny vyvolat bunìènou imunitní odpovìï (hodnoceno kožním testem pro pozdní typ pøecitlivìlosti). V místì pozitivních reakcí byla detekována mobilizace CD8+ a CD4+ T lymfocytù (Tamura et al., 2007). U lidí byla vakcína z dendritických bunìk naplnìných kompletní mRNA kódující proteiny vlastního melanomu (mRNA byla do dendritických bunìk pøenesena elektroporací) schopna vyvolat T lymfocytární odpovìï proti antigenùm kódovaným mRNA melanomu u 70 % pacientù vakcinovaných intradermálnì a u 25 % pacientù vakcinovaných intratumorálnì (Kyte et al., 2006). Dále se u lidí zkoušela vakcinace pacientù s melanomem stadia IV vlastními z monocytù pocházejícími dendritickými buòkami naplnìnými mrtvými buòkami humánního melanomu bunìèné linie Colo 829. U 23% takto ošetøených pacientù byla pozorována T lymfocytární imunita a vyskytla se i CD8+ T lymfocytární imunita specifická pro nový peptid odvozený od MART – 1 (= cross – priming) (Palucka et al., 2006). d) Použití vakcín z alogenních bunìk psího melanomu (ATCV = allogenic tumor cell vaccine) – u psù se zkoušelo použití vakcíny z alogenních bunìk psího melanomu vylepšených pøidáním lidského P mell 17/Silver/gp 100. In vitro byla prokázána cytotoxicita vyvolaná ACTV, avšak ta nekorelovala s klinickou odpovìdí. U vìtšiny testovaných pacientù byly vytvoøeny protilátky proti lidskému P mell 17/Silver/gp 100, to však také nekorelovalo s klinickou odpovìdí vakcinovaných psù. Psi s prokázanou kontrolou onemocnìní žili výraznì déle než psi, kteøí kontrolu onemocnìní nevykazovali (Alexander et al., 2006). 9. U psù se k chirurgické resekci neoplazie zkoušela jako adjuvantní metoda léèby kombinace sebevražedné (suicide) genové terapie (= pomocí adenovirového vektoru je dopraven gen thymidin-kinázy z Herpes simplex do cílové buòky (infiltrací okraje kavity po chirurgickém odstranìní neoplazie), exprimovaná thymidin-kináza potom fosforyluje souèasnì podané antivirové léèivo gancyklovir na gancyklovir-fosfát (této biochemické reakce nejsou savèí kinázy schopné), ten mùže být transportován dovnitø okolních bunìk, kde savèí kinázy mohou ke gancyklovir-fosfátu pøidat ještì další dva fosfáty, èímž vznikne gancyklovir-trifosfát, který mùže být zabudován do DNA. DNA-polymerázy však nemohou replikovat DNA obsahující gancyklovir-trifosfát, mitóza je pøerušena a buòka hyne (Cambridge University Press 2003) a podkožní aplikace vakcíny vytvoøené z formaldehydem ošetøených bunìk melanomu (ATCV) a z ozáøených xenogenních bunìk produkujících lidský IL-2 a GM-CSF. U takto ošetøených pacientù se signifikantnì zvýšil podíl pacientù bez výskytu lokálního onemocnìní na 58 % proti 6 % u pacientù pouze po chirurgickém ošetøení a podíl pacientù bez výskytu vzdálených metastáz na 78 % proti 43 % u pacientù pouze po chirurgickém ošetøení, dále

VETERINÁRNÍ LÉKAØ  ROÈNÍK 6  2008  ÈÍSLO 1 se výraznì prodloužila celková doba pøežívání u takto ošetøených pacientù na více než 1312 dní proti 112 dnùm u pacientù pouze po chirurgickém ošetøení a také doba bez výskytu metastáz na více než 1312 dní proti 78 dnùm u pacientù pouze po chirurgickém ošetøení. U pacientù, u nichž pøi chirurgickém ošetøení nedošlo ke kompletnímu odstranìní neoplazie a kterým byla podávána výše uvedená adjuvantní terapie, bylo 49 % objektivních odpovìdí (tedy k v prùmìru 85% zmenšení objemu ne-

Melanocytární neoplazie oplastické masy) a k progresi onemocnìní došlo u 22 % takto ošetøených pacientù proti 94 % pacientù ošetøených pouze chirurgicky neúplnou resekcí neoplazie (Finocchiaro, Glikin 2007). MVDr. Leopold Šaršon, MVDr. Darina Šaršonová Veterinární ordinace Sadová 2 Blansko, PSÈ 678 01

LITERATURA:

Alexander AN, Huelsmeyer MK, Mitzey A, Dubielzig RR, Kurzman ID, Macewen EG, Vail DM. Development of an allergenic whole – cell tumor vaccine expressing xenogeneic gp 100 and its implementation in a phase II clinical trial in canine patients with malignant melanoma. Cancer Immunol Immunother. 2006 Apr; 55(4): 433–42. Beránek J , Spiess BM , Vít PJ. Neoplazma – 2.4.8.2 Získané zmìny – 2.4.8 Nemoci uveálního traktu – 2.4 Nemoci oèí a víèek. In : Svoboda Miroslav, Senior David F, Doubek Jaroslav, Klimeš Jiøí a kolektiv (eds). Nemoci psa a koèky 1.díl, Brno, Noviko a.s. 2000: 580 – 1 Bergman Philip J, McKnight Joanne, Novosad Andrew, Charney Sarah, Farrelly John, Craft Diane, Wulderk Michelle, Jeffers Yusuf, Sadelain Michel, Hohenhaus Ann E, Segal Neil, Gregor Polly, Engelhorn Manuel, Riviere Isabelle, Houghton Alan N, Wolchok Jedd D. Long – Term Survival of Dogs with Advanced Malignant Melanoma after DNA Vaccination with Xenogeneic Human Tyrosinase. Clinical Cancer Research. 2003 April, Vol. 9, 1284–90. Bergman Philip J, Camps–Palau MA, McKnight JA, Leibman NF, Craft DM, Leung C, Liao J, Riviere I, Sadelain M, Hohenhaus AE, Gregor P, Houghton AN, Perales MA, Wolchok JD. Development of xenogeneic DNA vaccine program for canine malignant melanoma at the Animal Medical Center. Vaccine. 2006 May 22; 24(21): 4582–5. Bergman Philip J. Canine oral melanoma. Clin Tech Small Anim Pract. 2007 May; 22(2): 55–60. Blackwood L, Dobson JM. Radiotherapy of oral malignant melanomas in dogs. J Am Vet Med Assoc. 1996 Jul 1; 209(1): 98–102. Donaldson D, Sansom J, Scase T, Adams V, Mellersh C. Canine limbal melanoma: 30 cases (1992 – 2004).Part 1.Signalment, clinical and histological features and pedigree analysis. Vet Ophthalmol. 2006 Mar – Apr; 9(2): 115–9. Donaldson D, Sansom J, Adams V. Canine limbal melanoma: 30 cases (1992 – 2004). Part 2.Treatment with lamellar resection and adjunctive stroncium – 90 beta plesiotherapy – efficacy and morbidity. Vet Ophthalmol. 2006 May – Jun; 9(3): 179–85.

melanoma. Gene Ther. 2007 Nov 22 [Gene Therapy advance online publication, 22 November 2007; doi:10.1038/sj.gt.3303072]. Freeman KP, Hahn KA, Harris FD, King GK. Treatment of dogs with oral melanoma by hypofractionated radiation therapy and platinum – based chemotherapy (1987–1997). J Vet intern Med. 2003 Jan – Feb; 17(1): 96–101. Glass LF, Pepine ML, Fenske NA, Jaroszeski M, Reintgen DS, Heller R. Bleomycin – mediated electrochemotherapy of metastatic melanoma. Arch Dermatos. 1996 Nov; 132(11): 1353–7. Goldberg Stacie M, Bartido Shirley M, Gardner Jason P, Guevara – Patiòo José A, Montgomery Stephanie C, Perales Miguel – Angel, Maughan Maureen F, Dempsey Jo Ann, Donovan Gerald P, Olson William C, Houghton Alan N, Wolchok Jedd D. Comparison of Two Cancer Vaccines Targeting Tyrosinase: Plasmid DNA and Recombinant Alphavirus Replicon Particles. Clinical Cancer Research Vol.11, 2005 November 15, 8114–21. Gyorffy S, Rodriguez – Lecompte JC, Woods JP, Foley R, Kruth S, Liaw PC, Gauldie J. Bone – marrow derived dendritic cell vaccination of dogs with naturally occuring melanoma by using human gp 100 antigen. J Vet Intern Med. 2005 Jan – Feb; 19(1): 56–63. Hedlund Cheryl S. Surgical Treatment - Oral Tumors – Chapter 16 (Surgery of the Digestive System) – Part II (Soft Tissue Surgery). In: Fossum Theresa Welch, Hedlund Cheryl S, Hulse Donald A , Johnson Ann L, Seim Howard B, Willard Michael D, Carrol Gwendolyn L (eds). Small Animal Surgery 1-st Edition , Mosby Publishing 1997: 225 Chapman Paul B, Wu Dianna, Ragupathi Govind, Lu Sharon, Williams Linda, Hwu Wen – Jen, Johnson Diantha, Livingston Philip O. Sequential Immunization of Melanoma Patients with GD3 Ganglioside Vaccine and Anti-Idiotypic Monoclonal Antibody That Mimics GD3 Ganglioside. Clinical Cancer Research Vol.10, 2004 July 15, 4717–23. Choi C, Kusewitt DF. Comparison of Tyrosinase–related Protein–2, S–100 and Melan A Immunoreactivity in Canine Amelanotic Melanomas. Veterinary Patology 40; 2003: 713–8.

European Medicines Agency, Comittee for orphan medicinal products. Public summary of positive opinion for orphan designation of pegylated arginine deiminase for the treatment of hepatocellular carcinoma. London, 26 July 2005.

Karolis C, Reay–Young PS, Walsh W, Velautham G. Silicone plesiotherapy molds. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 1983 Apr; 9(4): 569–73.

Farrelly J, Denman DL, Hohenhaus AE, Patnaik AK, Bergman PJ. Hypofractionated radiation therapy of oral melanoma in five cats. Vet Radiol Ultrasound. 2004 Jan – Feb; 45(1): 91–3.

Kinzel S, Hein S, Stopinski T, Koch J, Buecker A, Treusacher HP, Schmachtenberg A, Jansen T, Eble M, Kupper W. Hypofractionated radiation therapy for the treatment of malignant melanoma and squamous cell carcinoma in dogs and cats. Berl Munch Tierarztl Wochenschr. 2003 Mar – Apr; 116 (3–4): 134–8.

Feun L, Savaraj N. Pegylated arginine deiminase: a novel anticancer enzyme agent. Expert Opin Investig Drugs. 2006 Jul; 15(7): 815–22. Finocchiaro LM, Glikin GC. Cytokine – enhanced vaccine and suicide gene therapy as surgery adjuvant treatments for spontaneous canine

Kožní systém – Stavba kùže a jejích derivátù – Stratum spinosum. In: Jelínek R, Dostál M, Likovský Z, Halašková M, Maòáková E, Peterka M, Peterková R, Titlbach M, Velický J, Zemanová Z (eds). Histologie a Embryologie, http://old.lf3.cuni.cz/histologie/materiály/doc/skripta.pdf: 188.

21



Kyte JA, Mu L, Aamdal S, Kvalheim G, Dueland S, Hauser M, Gullestad HP, Ryder T, Lislerud K, Hammerstad H, Gaudernack G. Phase I/II trial of melanoma therapy with dendritic cells transfected with autologous tumor - mRNA. Cancer Gene Ther. 2006 Oct; 13(10): 905–18.

Miroslav , Senior David F , Doubek Jaroslav , Klimeš Jiøí a kolektiv (eds). Nemoci psa a koèky 1.díl , Brno , Noviko a.s. 2000 : 534 – 5

Liao Jack CF, Gregor Polly, Wolchok Jedd D, Orlandi Francesca, Craft Diane, Leung Carrie, Houghton Alan N, Bergman Philip J. Vaccination with human tyrosinase DNA induces antibody responses in dogs with advanced melanoma. Cancer Immunity, Vol. 6, p. 8 (21 April 2006).

Sánchez J, Ramirez GA, Buendia AJ, Vilafranca M, Martinez CM, Altimira J, Navarro JA. Immunohistochemical Characterization and Evaluation of Prognostic Factors in Canine Oral Melanomas with Osteocartilaginous Differentiation. Veterinary Pathology 44; 2007: 676–82.

Lindsey Kimberly R, Gritz Linda, Sherry Richard, Abati Andrea, Fetsch Patricia A, Goldfeder Lisa C, Gonzales Monica I, Zinnack Kimberly A, Rogers – Freezer Linda, Haworth Leah, Mavroukakis Sharon A, White Donald E, Steinberg Seth M, Restifo Nicholas P, Panicali Dennis L, Rosenberg Steven A, Topalian Suzanne L. Evaluation of Prime/Boost Regiment Using Recombinant Poxvirus/Tyrosinase Vaccines for the Treatment of Patients with Metastatic Melanoma. Clinical Cancer Research Vol. 12, 2006 April 15, 2526–37.

Serša Gregor, Štabuc Borut, Èemažar Maja, Miklavèiè Damijan, Rudolf Zvonimir. Electrochemotherapy with cisplatin: clinical experience in malignant melanoma patients. Clinical Cancer Research. 2000 March, Vol.6, 863–7.

Maretta Milan. Spojivové tkanivá – bunky vaziva. In: Belák M, Maretta M, Zibrín M, Cigánková V, Horáková A (eds). Veterinárna histológia, Príroda Bratislava 1990: 81. Melanocytic tumors – Mesenchymal Neoplazma and Other Tumors. In: Gross Thelma Lee, Ihrke Peter J, Walder Emily J, Affolter Verena K (eds). Skin diseases of the Dog and Cat: Clinical and Histopathologic Diagnosis, Blackwell Publishing 2005, 932. Milner RJ, Salute M, Crawford C, Abbot JR, Farese J. The immune response to disialoganglioside GD3 vaccination in normal dogs: a melanoma surface antigen vaccine. Vet Immunol/Immunopathol. 2006 Dec 15; 114 (3–4): 273–84. Moore Cecil P, Constantinescu Gheorghe M. Surgery of the Adnexa. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice, Volume 27, Number 5, September 1997: 1048 – 9 Palucka AK, Ueno H, Connolly J, Kerneis – Norvell F, Blanck JP, Johnston DA, Fay J, Banchereau J. Dendritic cells loaded with killed allogeneic melanoma cells can induce objective clinical responses and MART-1 specific CD8+ T-cell immunity. J Immunother. 2006 Sep – Oct; 29(5): 545–57. Proulx DR, Ruslander DM, Dodge RK, Hauck ML, Williams LE, Horn B, Price GS, Thrall DE. A retrospective analysis of 140 dogs with oral melanoma treated with external beam radiation. Vet Radiol Ultrasound. 2003 May – Jun; 44 (3): 352–9. Di Pucchio Tiziana, Pilla Lorenzo, Capone Imerio, Ferrantini Maria, Montefiore Enrica, Urbani Francesca, Patuzzo Roberto, Pennacchioli Elisabetta, Santinami Mario, Cova Agata, Sovena Gloria, Arienti Flavio, Lombardo Claudia, Lombardi Arianna, Caporaso Patrizia, D´Atri Stefania, Marchetti Paolo, Bonmassar Enzo, Parmiani Giorgio, Belardelli Filippo, Rivoltini Licia. Immunization of Stage IV Melanoma Patients with Melan-A/MART-1 and gp 100 Peptides plus IFN-alpha Results in the Activation of Specific CD8+ T Cells and Monocyte/Dendritic Cell Precursors. Cancer Research 66, 2006 May 1, 4943–51.

Samuelson DA. Textbook of Veterinary Histology, Saunders Elsevier St.Louis 2007.

Serša Gregor, Štabuc Borut, Èemažar Maja, Miklavèiè Damijan, Rudolf Zvonimir. Electrochemotherapy with cisplatin: the systemic antitumour effectiveness of cisplatin can be potentiated locally by the application of electric pulses in the treatment of malignant melanoma skin metastases. Melanoma Res. 2000 Aug; 10(4): 381–5. Shimoyama Y, Akihara Y, Kirat D, Iwano H, Hirayama K, Kagawa Y, Ohmachi T, Matsuda K, Okamoto M, Kadosawa T, Yokota H, Taniyama H. Expression of Monocarboxylate Transporter 1 in Oral and Ocular Canine Melanocytic Tumors. Veterinary Pathology 44; 2007: 449–57. Smith SH, Goldschmidt MH, McManus PM. A Comparative Review of Melanocytic Neoplasms. Veterinary Pathology 39; 2002: 651–78. Spangler WL, Kass PH. The Histologic and Epidemiologic Bases for Prognostic Considerations in Canine Melanocytic Neoplasia. Veterinary Pathology 43; 2006: 136–49. Suicide gene therapy. Expert Reviews in Molecular Medicine. Cambridge University Press, 2003 January 7. Sullivan TC, Nasisse MP, Davidson MG, Glover TL. Photocoagulation of limbal melanoma in dogs and cats: 15 cases (1989–1993). J Am Vet Med Assoc. 1996 Mar 15; 208(6): 891–4. Tamura K, Yamada M, Isotani M, Arai H, Yagihara H, Ono K, Washizu T, Bonkobara M. Induction of dendritic cell – mediated immune responses against canine malignant melanoma cells. Vet J. 2007 Jan 5. Théon AP, Madewell BR, Moore AS, Stephens C, Krag DN. Localized thermo – cisplatin therapy: a pilot study in spontaneous canine and feline tumours. Int J Hyperthermia, 1991 Nov – Dec; 7(6): 881–92. Théon AP, Rodriguez C, Madewell BR. Analysis of prognostic factors and patterns of failure in dogs with malignant oral tumors treated with megavoltage irradiation. J Am Vet Med Assoc. 1997 Mar 15; 210(6): 778–84. Tunev SS, Wells MG . Cutaneous melanoma in a ferret (Mustela putorius furo). Vet Pathol. 2002 Jan; 39(1): 141–3.

Rodriguez – Lecompte JC, Kruth S, Gyorffy S, Wan YH, Gauldie J. Cell – based cancer gene therapy: breaking tolerance or inducing autoimmunity ?. Anim Health Res Rev. 2004 Dec; 5(2): 227–34.

Vlašín Michal. Volba radikality excize – Základní principy onkologické chirurgie. In : Sborník k semináøi I.ONKOLOGICKÝ SEMINÁØ – ONKOLOGIE V PRAXI MALÝCH ZVÍØAT , Brno 14.3.2004

Rols MP, Bachaud JM, Giraud P, Chevreau C, Roché H, Teissié J. Electrochemotherapy of cutaneous metastases in malignant melanoma. Melanoma Res. 2000 Oct; 10(5): 468–74.

Wilkie David A, Whittaker Cameron. Surgery of the Cornea. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice , Volume 27, Number 5, September 1997: 1098 – 1100

Rybníèek J , Svoboda M , Svobodová V , Rybnikáø A , Benák J , Konvalinová J. 2.2.17.1.3 Melanocytární nádory – 2.2.17.1 Primární kožní novotvary – 2.2.17 Kožní novotvary – 2.2 Nemoci kùže. In : Svoboda

Zibrín Martin. Cytológia – Bunkové inklúzie – paraplazma. In: Belák M, Maretta M, Zibrín M, Cigánková V, Horáková A (eds). Veterinárna histológia, Príroda Bratislava 1990: 53–4.

22

MELANOCYTÁRNÍ NEOPLAZIE DOMÁCÍCH MASOŽRAVCÙ

Recommend Documents