PENGARUH PEMBERIAN SUSU KAMBING TERHADAP GAMBARAN MIKROSKOPIS TESTIS DAN KADAR TIMBAL (Pb) DALAM DARAH TIKUS WISTAR YANG TERPAPAR ASAP KENDARAAN BERMOTOR
LAPORAN HASIL KARYA TULIS ILMIAH
Diajukan sebagai syarat untuk mengikuti ujian hasil Karya Tulis Ilmiah mahasiswa Program Strata-1 Kedokteran Umum
DINNI LUTFIANI MUZAKKI 22010111120019
PROGRAM PENDIDIKAN SARJANA KEDOKTERAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS DIPONEGORO 2015
i
LEMBAR PENGESAHAN LAPORAN HASIL KTI PENGARUH PEMBERIAN SUSU KAMBING TERHADAP GAMBARAN MIKROSKOPIS TESTIS DAN KADAR TIMBAL (Pb) DALAM DARAH TIKUS WISTAR YANG TERPAPAR ASAP KENDARAAN BERMOTOR
Disusun oleh DINNI LUTFIANI MUZAKKI 22010111120019 Telah disetujui Semarang, 7 Juli 2015 Pembimbing
dr. R.B. Bambang Witjahyo, M.Kes 19540413 198303 1 002 Ketua Penguji
Penguji
Dr.dr.Kusmiyati Tjahjono DK.,M.Kes 19531109 198301 2 001
dr. Fanti Saktini, MSi. Med 19810224 201012 2 001
Mengetahui, a.n. Dekan Ketua Program Studi Pendidikan Dokter
dr. Erie BPS Andar, Sp.BS, PAK (K) 195412111981031014
ii
PERNYATAAN KEASLIAN PENELITIAN
Yang bertanda tangan ini, Nama
: Dinni Lutfiani Muzakki
NIM
: 22010111120019
Program Studi :Program Pendidikan Sarjana Program Studi Pendidikan Dokter Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro Judul KTI
: Pengaruh Pemberian Susu Kambing terhadap Gambaran Mikroskopis Testis dan Kadar Timbal (Pb) dalam Darah Tikus Wistar yang Terpapar Asap Kendaraan Bermotor.
Dengan ini menyatakan bahwa : (a) Karya tulis ilmiah saya ini adalah asli dan belum pernah dipublikasi atau diajukan untuk mendapatkan gelar akademik di Universitas Diponegoro maupun di perguruan tinggi lain. (b) Karya tulis ini adalah murni gagasan, rumusan dan penelitian saya sendiri, tanpa bantuan orang lain, kecuali pembimbing dan pihak lain sepengetahuan pembimbing. (c) Dalam karya tulis ini tidak terdapat karya atau pendapat yang telah ditulis atau dipublikasikan orang lain, kecuali secara tertulis dengan jelas dicantumkan sebagai acuan dalam naskah dengan disebutkan nama pengarang dan judul buku aslinya serta dicantumkan dalam daftar pustaka.
Semarang, 1 juli 2015 Yang membuat pernyataan,
Dinni Lutfiani Muzakki 22010111120019
iii
KATA PENGANTAR
Puji syukur saya panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa, karena atas berkat dan rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan tugas Karya Tulis Ilmiah yang berjudul “Pengaruh Susu Kambing terhadap Gambaran Mikroskopis Testis dan Kadar Timbal (Pb) dalam Darah Tikus Wistar yang Terpapar Asap Kendaraan Bermotor”. Penulisan Karya Tulis Ilmiah ini dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Kedokteran di Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro. Penulis menyadari sangatlah sulit bagi penulis untuk menyelesaikan Karya Tulis Ilmiah ini tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak sejak penyusunan proposal sampai terselsaikannya laporan hasil karya tulis ilmiah ini. Dalam kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada pihak-pihak yang telah memberikan bantuan dan bimbingan dalam menyelesaikan karya tulis ilmiah ini, yaitu: 1.
Rektor Universitas Diponegoro Semarang yang telah memberi kesempatan kepada kami untuk menimba ilmu di Universitas Diponegoro.
2.
Dekan Fakultas Kedokteran UNDIP yang telah memberikan sarana dan prasarana kepada kami sehingga kami dapat menyelesaikan tugas ini dengan baik dan lancar.
3.
dr. R.B. Bambang Witjahyo, M.Kes selaku dosen pembimbing yang telah menyediakan waktu, tenaga dan pikiran untuk membimbing kami dalam penyusunan karya tulis ilmiah ini.
4.
dr. Fanti Saktini, M.Si. Med selaku dosen penguji yang telah menyediakan waktu, tenaga, dan pikiran untuk mengarahkan penulis.
5.
Dr.dr.Kusmiyati Tjahjono DK.,M.Kes. selaku ketua penguji yang telah memberikan saran dan arahan dalam penyusunan karya tulis ilmiah ini.
6.
Bagian Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro, Semarang.
iv
7.
Bpk. Budi selaku direktur utama SPBU Tugu Suharto Sampangan, yang telah memberikan izin dan memfasilitasi penulis selama melakukan penelitian di SPBU Tugu Suharto Sampangan.
8.
Drs. Lina Herlina, M.Si selaku kepala labolatorium dan analis Laboratorium Biologi FMIPA Universitas Negeri Semarang, yang telah banyak membantu dalam memfasilitasi pelaksanaan penelitian karya tulis ilmiah ini.
9.
dr. MI. Tjahjati DM, Sp.PK dan analis Laboratorium Gangguan Akibat Kekuarangan Iodium (GAKI) Fakutas Kedokteran Universitas Diponegoro Semarang yang telah banyak membantu dalam proses pemeriksaan timbal darah tikus wistar dalam penelitian ini.
10. dr. Meira Dewi Kusuma Astuti, M.Si.Med, Sp.PA selaku konsultan dalam pembuatan preparat hitopatologi testis dan telah mendukung kelancaran dalam penelitian karya tulis ilmiah ini. 11. Laboratorium Patologi Anatomi RSUP. Dr. Kariadi Semarang yang telah memfasilitasi pembuatan preparat histopatologi testis tikus wistar dalam penelitian ini. 12. dr. Siti Amarwati, Sp.PA (K) selaku konsultan yang telah banyak membantu dalam pembacaan preparat histopatologi testis dan telah mendukung kelancaran dalam penulisan karya tulis ilmiah ini. 13. Orang tua, H. Tata Hidayat, B.Sc dan Uus Syayidah S.Ag yang senantiasa memberikan dukungan moral maupun material kepada penulis. 14. Kedua kakak penulis, Rizal Abdul A., M.Pd dan Muhammad Hadi S., S.T yang senantiasa selalu memberikan motivasi kepada penulis. 15. Teman – teman seperjuangan KTI “TIMBING” : Ageng Indah A., Gentaria Rizki S., Eko Djatikanto SN., yang senantiasa telah mendukung dan memberikan sumbangsih pikiran selama proses penelitian hingga penyusunan karya tulis ilmiah ini dapat diselsaikan.
v
16. Para sahabat, Mbak Ade Erma L., Ageng I.A., Gentaria R.S., Pirsa Hatpri N.I. dan Bazilah Dayana yang selalu memberi dukungan dalam menyelesaikan karya tulis ilmiah ini. 17. Teman – teman angkatan 2011 Jurusan S1-Pendidikan Dokter Universitas Diponegoro serta pihak lain yang tidak mungkin penulis sebutkan satu persatu atas bantuannya secara langsung maupun tidak langsung sehingga karya tulis ini dapat terselsaikan dengan baik. Akhir kata, kami berharap Tuhan Yang Maha Esa berkenan membalas segala kebaikan semua pihak yang telah membantu. Semoga karya tulis ilmiah ini dapat bermanfaat bagi pembaca pada umumnya dan almamater pada khususnya. .
Semarang, 1 Juli 2015
Penulis
vi
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL……………………………………………………………... i LEMBAR PENGESAHAN………………………………………………………. ii PERNYATAAN KEASLIAN PENELITIAN……………………………………. iii KATA PENGANTAR……………………………………………………………. iv DAFTAR ISI……………………………………………………………………... vii DAFTAR TABEL………………………………………………………………... xi DAFTAR GAMBAR……………………………………………………………... xii DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………………………... xiv DAFTAR SINGKATAN…………………………………………………………. xv ABSTRAK………………………………………………………………………... xvii ABSTRACT……………………………………………………………………… xviii BAB I PENDAHULUAN……………………………………………………….... 1 1.1 Latar belakang……………………………………………………………….. 1 1.2 Rumusan masalah……………………………………………………………. 6 1.3 Tujuan penelitian…………………………………………………………….. 6 1.3.1 Tujuan umum……………………………………………………………..... 6 1.3.2 Tujuan khusus…………………………………………………………….... 7 1.4 Manfaat penelitian……………………………………………………….......
8
1.5 Orsinilitas……………………………………………………………………. 8 BAB II TINJAUAN PUSTAKA…………………………………………………. 10 2.1 Infertilitas……………………………………………………………………. . 10 2.2 Testis…………………………………………………………………………. 14 2.2.1 Anatomi testis………………………………………………………………. 14
vii
2.2.2 Histologi testis……………………………………………………………… 17 2.2.2.1 Tubulus seminiferus testis………………………………………………... 18 2.2.2.2 Spermatogenesis………………………………………………………….. 20 2.2.2.3 Saluran-saluran genital intratestis………………………………………… 23 2.2.3 Fisiologi testis……………………………………………………………….24 2.2.4 Patologi testis………………………………………………………………. 26 2.3 Pencemaran udara……………………………………………………………. 27 2.3.1 Polutan asap kendaraan bermotor………………………………………….. 29 2.3.1.1 Karbon monoksida (CO)………………………………………………... 29 2.3.1.2 Nitrogen oksida (NOx)……………………………………...................... 30 2.3.1.3 Sulfur oksida (SOx)…………………………………………………....... 30 2.3.1.4 Hidrokarbon (HC)………………………………………………………..31 2.3.1.5 Timbal (Pb)…………………………………………………………….... 31 2.4 Kadar Pb darah………………………………………………………………. 38 2.5 Pengaruh Pb terhadap testis………………………………………………….. 39 2.6 Susu kambing……………………………………………………………....... 40 2.6.1 Kandungan susu kambing dan manfaatnya………………………………… 41 2.6.2 Pengaruh susu kambing terhadap testis yang terpapar Pb………………….. 43 BAB III KERANGKA TEORI, KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS…... 46 3.1 Kerangka teori……………………………………………………………….. 46 3.2 Kerangka konsep…………………………………………………………….. 46 3.3 Hipotesis……………………………………………………………………... 47 3.3.1 Hipotesis mayor…………………………………………………………….. 47 3.3.2 Hipotesis minor…………………………………………………………….. 47 BAB IV METODE PENELITIAN……………………………………………….. 48 4.1 Ruang lingkup penelitian…………………………………………………….. 48 4.2 Tempat dan waktu penelitian……………………………………………….... 48
viii
4.3 Jenis dan rancangan penelitian………………………………………………. 48 4.4 Populasi dan sampel…………………………………………………………. 49 4.4.1 Populasi target……………………………………………………………… 49 4.4.2 Populasi terjangkau……………………………………………………….... 49 4.4.3 Sampel penelitian…………………………………………………………... 49 4.4.3.1 Kriteria inklusi……………………………………………......................... 49 4.4.3.2 Kriteria eksklusi…………………………………………………………... 49 4.4.4 Cara sampling………………………………………………………………. 50 4.4.5 Besar sampling……………………………………………………………... 50 4.5 Variabel penelitian…………………………………………………………… 50 4.5.1 Variabel bebas……………………………………………………………… 50 4.5.2 Variabel terikat……………………………………………………………... 50 4.6 Definisi operasional…………………………………………………………. 50 4.7 Cara pengumpulan data………………………………………………………51 4.7.1 Bahan……………………………………………………………………….. 51 4.7.2 Alat………………………………………………………………................. 52 4.7.3 Jenis data…………………………………………………………………… 53 4.7.4 Cara kerja…………………………………………………………………... 53 4.8 Alur penelitian………………………………………………………….......... 56 4.9 Pengolahan data dan analisis data…………………………………………… 57 4.10Etika penelitian………………………………………………………………. 57 4.11Jadwal penelitian……………………………………………………….......... 57 BAB V HASIL PENELITIAN…………………………………………………… 58 5.1 Analisis sampel……………………………………………………………… 58 5.2 Analisis deskriptif…………………………………………………………… 59 5.2.1 Kadar timbal (Pb) darah…………………………………………………… 59 5.2.2 Gambaran mikroskopis testis……………………………………………... .. 59 5.3 Analisis analitik……………………………………………………………... 65 ix
5.3.1 Kadar timbal (Pb) darah…………………………………………………. . 65 5.3.2 Gambaran mikroskopis testis……………………………………………. . 66 BAB VI PEMBAHASAN………………………………………………………... 67 BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN……………………………………….... 73 7.1 Simpulan……………………………………………………………………... 73 7.2 Saran…………………………………………………………………………. 73 DAFTAR PUSTAKA…………………………………………………………….. 74 LAMPIRAN……………………………………………………………………….84
x
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Orsinilitas penelitian…………………………………………………….. 8 Tabel 2. Baku mutu udara ambien nasional………………………………………. 28 Tabel 3. Klasifikasi kadar timbal darah pada anak berdasarkan ATDSR………... 39 Tabel 4. Fungsi biologis protein yang ditemukan pada susu kambing…………... 41 Tabel 5. Kandungan mineral dan vitamin per 100 gram susu kambing, domba, sapi dan manusia………………………………………………………... 42 Tabel 6. Definisi operasional……………………………………………………... 50 Tabel 7. Skoring kerusakan tubulus seminiferus berdasarkan modifikasi Skor Johnsen dengan perhitungan kuantitas………………………………… . 55 Tabel 8. Jadwal penelitian………………………………………………………... 57 Tabel 9. Data deskriptif pengamatan kadar timbal darah post test……………
. 59
Tabel10.Data deskriptif kategorikal histopatologi testis tiap kelompok yang dinyatakan dalam jumlah tikus………………………………………… . 60
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Anatomi testis………………………………………………………… 17 Gambar 2. Mikroskopis testis manusia dengan pengecatan hematoksilin dan eosin, pembesaran lemah……………………………………………. 18 Gambar 3. Irisan testis bagian perifer dengan pengecatan hematoksilin dan eosin, pembesaran lemah…………………………………………….. 20 Gambar 4. Sebagian dinding tubulus seminiferus. Mengamati flagella spermatid yang berhubungan dengan sel-sel sertoli. Pengecatan hemotoksilin dan eosin. Pembesaran kuat………………………………………….. 22 Gambar 5. Spermatosit dan spermatid salam epitel dari tubulus seminiferus. Tubulus dilingkupi oleh sel myoid. Pengecatan dengan Picrosirinushematoxylin (PSH). Pembesaran menengah……………………....... 23 Gambar 6. Tubulus seminiferus, tubuli rekti, rete testis dan duktus deferentes. Pengecatan: hematoksilin dan eosin. Pembesaran lemah (sisipam : pembesaran kuat)…………………………………………………….. 24 Gambar 7.Pengaturan umpan balik aksis hypothalamus – hipofisis anterior (pituitary anterior) – testis pada system reproduksi pria…………….. 26 Gambar 8. Skema pengaruh susu kambing terhadap testis yang terpapar Pb….. .. 45 Gambar 9. Kerangka teori………………………………………………………… 46 Gambar 10.Kerangka konsep……………………………………………………. 46 Gambar 11. Alur penelitian………………………………………………………. 56
xii
Gambar 12.Gambar mikroskopis tubulus seminiferus testis kelompok K pembesaran 100x…………………………………………………….. 62 Gambar 13. Gambar mikroskopis tubulus seminiferus testis kelompok K pembesaran 400x…………………………………………………….. 63 Gambar 14. Gambar mikroskopis tubulus seminiferus testis kelompok P1 pembesaran 100x…………………………………………………….. 63 Gambar 15. Gambar mikroskopis tubulus seminiferus testis kelompok P1 pembesaran 400x…………………………………………………….. 64 Gambar 16. Gambar mikroskopis tubulus seminiferus testis kelompok P2 pembesaran 100x…………………………………………………….. 64 Gambar 17. Gambar mikroskopis tubulus seminiferus testis kelompok P2 pembesaran 400x…………………………………………………….. 65
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Prosedur sampling darah vena retroorbital……………………….
84
Lampiran 2. Prosedur pembuatan preparat histologi……………………………. 85 Lampiran3.Pengukuran kadar timbal darah dengan
Atomic Absorption
Spectrometry (AAS)………………………………………………. . 89 Lampiran 4. Etical Clearance…………………………………………………… 92 Lampiran 5. Surat izin penelitian di Lab. Fisiologi Hewan FMIPA UNNES…… 93 Lampiran 6. Surat keterangan penelitian di SPBU Tugu Suharto……………… . 94 Lampiran 7. Surat keterangan penelitian di Lab. GAKI FK UNDIP…………… . 95 Lampiran 8. Surat izin penelitian dan pembuatan preparat di Lab. PA RSUP Dr. Kariadi………………………………………………………….. 96 Lampiran 9. Surat keterangan pengiriman hewan coba………………………… . 97 Lapiran 10. Surat keterangan sehat hewan coba…………………………………. 98 Lampiran 11. Hasil pembacaan kadar timbal darah dan mikroskopis testis……... 99 Lampiran 12. Hasil pengolahan data dengan SPSS………………………………. 101 Lampiran 13. Dokumentasi penelitian……………………………………………. 105 Lampiran 14. Biodata penulis……………………………………………………. 108
xiv
DAFTAR SINGKATAN
CO
: karbon monoksida
NOx
: oksida – oksida nitrogen
SOx
: oksida – oksida sulfur
HC
: hidrokarbon
Pb
: plumbum / timbal
TEL
: tetra ethyl lead
TML
: tetra methyl lead
ROS
: reactive oxygen species
HOMC
: high octane mogas component
Ca
: kalisum
Fe
: ferrous
Mg
: magnesium
K
: kalium
Na
: natrium
Cl
: chloride
S
: sulfur
Mn
: mangan
Zn
: zink
I
: yodium
Se
: selenium
P
: fospor
SPBU
: stasiun pengisian bahan bakar umum
xv
Hb
: hemoglobin
HbCO
: karboksihemoglobin
PbS
: timah sulfide
CYP
: cytochrome P450
GSH
: glutation
GST
: glutation-S-transferase
NADPH
: nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
TOL
: tax on location
WHO
: world healt organization
CDC
: disease control and prevention
APA
: american pediatric association
ATDSR
: agency for toxic substances and disease registry
PSH
: picrosirinus-hematoxylin
GnRH
: gonadotropin realizing hormone
LH
: leutinizing hormone
ICSH
: intersitial cell stimulating hormone
FSH
: folicel stimulating hormone
DHT
: dihidrotestosterone
DNA
: deoxyribonucleic acid
HPT
: hipothalamus-pituitari-testicular
ASI
: air susu ibu
CLA
: conjugated linoleic acid
MCTs
: medium chain triglyceride
SCFA
: short chain fatty acids
xvi
PENGARUH PEMBERIAN SUSU KAMBING TERHADAP GAMBARAN MIKROSKOPIS TESTIS DAN KADAR TIMBAL (Pb) DALAM DARAH TIKUS WISTAR YANG TERPAPAR ASAP KENDARAAN BERMOTOR Dinni Lutfiani Muzakki1, R.B. Bambang Witjahyo2 ABSTRAK Latar belakang: Testis merupakan organ reproduksi terpenting pada pria. Timbal (Pb) yang dihasilkan oleh proses pembakaran bahan bakar minyak yang tidak sempurna pada kendaraan bermotor dapat menghambat proses spermatogenesis dan meningkatkan risiko infertilitas. Susu kambing merupakan bahan alami yang mengandung flavonoid,vitamin C, E, B1, B6, B9, Ca, Zn, Mg, Fe dan bermanfaat sebagai antiosidan, chelating agent Pb dan penghambat absorbsi Pb ke dalam darah. Menurunnya kadar Pb darah dapat mempengaruhi gambaran mikroskopis tubulus seminiferus testis yang berkaitan dengan proses spermatogenesis. Tujuan: Membuktikan pengaruh pemberian susu kambing terhadap gambaran mikroskopis testis dan kadar Pb dalam darah tikus wistar yang terpapar asap kendaraan bermotor. Metode: Penelitian ini berjenis true experimental dengan rancangan post-test only controlled group design. Sampel sebanyak 15 tikus wistar usia 2-3 bulan dengan berat badan 100–200 gram dibagi menjadi 3 kelompok, yaitu kelompok kontrol (K) yang hanya diberi makanan dan minuman standar, dan kelompok perlakuan (P1,P2) diberi paparan asap kendaraan bermotor 8 jam/hari selama 30 hari dan susu kambing sebanyak 473,2mg/kgBB pada P2. Pada hari ke-31, tikus diambil darah dan testisnya, kemudian diterminasi dan diamati kadar Pb darah dan gambaran mikroskopis tubulus seminiferus testis. Hasil: Pemberian susu kambing sebelum pemaparan asap kendaraan bermotor pada kelompok P2 mengakibatkan rerata kadar Pb darah pada kelompok P2 (7,80µg/dl± 4,18265) < kelompok P1 (11,24µg/dl± 6,27229) (p>0.05) dengan kerusakan tubulus seminiferus testis P2
0.05) dilihat secara mikroskopis. Simpulan: Susu kambing dengan dosis 473,2 mg/kgBB tidak berpengaruh secara bermakna terhadap kadar Pb darah dan pencegahan kerusakan tubulus seminiferus testis akibat paparan asap kendaraan bermotor. Kata kunci : susu kambing, timbal, mikroskopik, testis, tubulus seminiferus, asap kendaraan 1) Mahasiswa Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro, Semarang 2) Staff Pengajar Bagian Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro, Semarang
xvii
THE EFFECT OF GOAT MILK ON MICROSCOPIC TESTIS APPEARANCE AND LEAD (Pb) BLOOD LEVEL OF WISTAR RATS WHICH MOTORIZED VEHICLE EMISSION EXPOSURED Dinni Lutfiani Muzakki1, R.B. Bambang Witjahyo2 ABSTRACT Background: Testis is the most important male reproductive organ. Lead (Pb) which is produced by incomplete fuel combustion on motorized vehicle can inhibit spermatogenesis process and increase infertility risk factor. Goat milk is a natural substance which contains of flavonoid, vitamin C, E, B1, B6, B9, Ca, Zn, Mg, Fe and useful as an antioxidant, Pb chelating agent and Pb absorption inhibitor into bloodstream. A decrease of Pb blood level influence microscopic appearance of testicle seminiferous tubules which related with spermatogenesis process. Aim: To verify the effect of goat milk on microscopic testes appearance and Pb blood level of wistar rats with motorized vehicle emission exposure. Method: This was a true experimental research study with post-test only controlled group design. The sample were 15 wistar rats, 2-3 month old, 100 –200 gram. The sample were divided into 3 groups randomly, namely control group (K) which was given standard food and beverage only, treated group (P1,P2) which was given motorized vehicle emission exposure 8 hour/day for 30 days and 473.2mg/kgBW goat milk for P2.On day 31, blood and testes were taken and the rats were terminated, then examined Pb blood level and microscopic seminiferous tubule testes appearance of wistar rats each groups. Result: The administration of goat milk before motorized vehicle emission exposure on P2 group had less the mean of Pb blood level P2(7,80µg/dl± 4,18265)0.05) while the seminiferous tubule microscopic damage P20.05). Conclusion: Goat milk 473,2mg/kgBB does not effect on Pb blood level and seminiferous tubules testis damage prevention caused by motorized vehicle emission exposure significantly Keyword : goat milk, lead, Pb, microscopic, testis, seminiferous tubules, vehicle emission exposure
1) Student of Faculty of Medicine Diponegoro University, Semarang 2) Staff of Histology Departement Faculty of Medicine Diponegoro University, Semarang
xviii
