KORELASI ANTARA INFEKSI HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV) 18 DENGAN MUTASI GEN K-RAS KODON 12 PADA PENDERITA KANKER KOLOREKTAL DI MAKASSAR

KORELASI ANTARA INFEKSI HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV) 18 DENGAN MUTASI GEN K-RAS KODON 12 PADA PENDERITA KANKER KOLOREKTAL DI MAKASSAR

THE CORRELATION BETWEEN HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV) 18 INFECTION AND K-ras GENE MUTATIONS OF CODON 12 IN PATIENTS WITH COLORECTAL CANCER

Mujahidah Basarang1 Rizalinda Sjahril2 Nasrum Massi2

1

2

Mahasiswa Mikrobiologi, Biomedik . Pasca sarjana, Unhas Makassar Bagian Mikrobiologi, Fakultas Kedoketran, Unhas Makasar

Alamat Korespondensi : Mujahidah Basarang Villa Taman Madani Blok C 10 Jl. Talasalapang, Kota Makassar Email : [email protected]

Abstrak Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui korelasi infeksi HPV 18 dan mutasi gen K-ras kodon 12 pada penderita kanker kolorektal di Makassar. Infeksi HPV 18 dideteksi dengan amplifikasi PCR menggunakan primer MY9/11 dan primer spesifik untuk HPV tipe 18. Mutasi gen K-ras kodon 12 dideteksi menggunakan amplifikasi PCR menggunakan primer mutan. Analisis statistik menggunakan chi square dan uji korelasi. DNA HPV tidak ditemukan pada 33 jaringan tumor dan 31 jaringan normal dekat tumor. Mutasi gen K-ras kodon 24 pada 33 jaringan tumor (72,7%) dari 33 pasien. Dan pada jaringan normal dekat tumor 18 (58,1%) dari 31 pasien. Data ini menunjukkan bahwa infeksi HPV 18 bukan merupakan karsinogenesis kanker kolon dan rektum dan mutasi gen K-ras kodon 12 sering terjadi sebagai karsinogenesis kanker kolon dan rektum. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada korelasi antara infeksi HPV 18 dan mutasi gen Kras kodon 12 pada pasien kanker kolon dan rektum di Makassar. Kata Kunci : HPV 18, Mutasi gen K-ras kodon 12, kanker kolorektal

Abstract This study aims to investigate the correlation between HPV 18 infection and K-ras mutations of codon 12 in patients with colorectal cancer in Makassar. HPV 18 infection was detected by PCR amplification using MY9/11 primer and specific type primer of HPV 18. K-ras gene mutations were detected by PCR amplification by using mutant primer. The study used the Correlation tests. No DNA of HPV 18 was detected in 33 tumors and 31 normal tissue near the tumors. K-ras gene mtations at codon 24 were found in 33 tumors (72,7%) of 33 patients; and in 18 normal tissue near tumors (58,1%) of 31 patients. The data revealed that HPV 18 infection is not carcinogenesis of colorectal cancer and K-ras gene mutations of codon 12 have significant correlation with colorectal cancer. There is no correlation between HPV 18 infections in patient and K-ras gene mutations of codon 12 with colorectal cancer in Makassar. Key word : HPV 18, K-ras gene mutations of codon 12, colorectal cancer.

PENDAHULUAN Kanker dapat didefenisikan sebagai pembentukan sel-sel abnormal secara cepat yang tumbuh melampaui batas-batas pertumbuhan sel pada umumnya (WHO, 2012). Kanker adalah penyakit pertumbuhan sel yang bersifat ganas. Bisa mengenai organ apa saja di tubuh manusia. Bila menyerang di kolon, maka disebut kanker kolon, terletak pada pada bagian kolon desesnden (kanan), kolon transversum (tengah), kolon asendens (kiri) dan kolon rektosigmoid. Bila menyerang bagian rektum, maka disebut kanker rektum. Kanker usus besar merupakan masalah kesehatan utama dan merupakan penyakit yang sangat umum di negara-negara maju di dunia. Seluruh dunia setiap tahun, lebih dari 900.000 kasus baru didiagnosa, dan hampir 500.000 orang meninggal karena penyakit ini. Sekitar dua pertiga dari kasus insiden terjadi di negara maju, dimana kanker kolorektal adalah kanker paling umum ketiga pada pria dan kedua yang paling umum pada wanita. Di negara berkembang, kanker ini adalah kanker kelima yang paling umum pada kedua jenis kelamin (Casidy, et. al., 2007). Menurut defenisi WHO dalam Casidy, et.al. (2007), kanker kolorektal terdiri dari semua tumor ganas kolon dan rektum, dan secara histologi, hampir semua kanker usus besar adalah adenokarsinoma (terdiri atas epitel kelenjar) dan dapat menyereksi mukus dalam jumlah yang berbeda-beda (Price, Wilson, 2002). Penyebab pasti dari kanker kolorektal belum diketahui secara pasti, namun beberapa mikroorganisme telah diteliti berasosiasi pada jaringan tumor penderita kanker kolorektal, salah satunya adalah virus human papillomavirus (Ou, Yen, 2010). dengan hampir 20% penyebab kanker pada manusia (Ou, Yen, 2010). Human Papillomavirus (HPV) telah lama diketahui sebagai agen penyebab kutil dan kemungkinan juga HPV berasosiasi dengan beberapa kanker. Telah dilaporkan bahwa HPV 18 ditemukan pada papillomas genital dan kanker usus besar (Lee, et al., 2001). HPV ditemukan berasosiasi dengan lesi premalignan dan malignan pada epithelium squamosa traktus genital dan tumor extragenital. Akan tetapi karsinogensis spesifik yang menyebabkan kanker kolorektal pada manusia belum diketahui secara pasti (Cheng, et al., 1993).

Karsinogenesis kolorektal dipengaruhi oleh beberapa faktor yang kompleks, salah satunya adalah perubahan sekuen genetik. Perubahan genetik menginaktif supresor tumor dan pasangan gen yang tidak sesuai atau aktifasi oncogene yang terlibat dalam pertumbuhan sel, ploriferasi atau diferensiasi yang merupakan implikasi dari perkembangan karsinoma kolon. Salah satu gen target yang mengalami perubahan adalah ras family yang menyandi protein kecil 21-kD (p21 ras) yang terlibat dalam transduksi dengan stimulasi eksternal sampai molekul efektor melintasi membran plasma. Protein ini memiliki aktivitas GTPase yang selalu menginaktifasi signal transduksi pada kondisi sel normal. Aktifasi protooncogene K-ras (Kirsten Rat Sarcoma Viral Oncogene) oleh mutasi titik adalah salah satu perubahan genetik yang berasosiasi dengan kanker pada manusia. Mutasi oncogen K-ras 20-50% secara sporadis terlibat dalam karsinoma kolorektal. Berdasarkan penelitian, mutasi gen K-ras menyebabkan 20-50% kanker kolorektal. Mutasi ini biasa terjadi pada kodon 12 dan 13 pada ekson 1, kodon ini diidentifikasi sebagai target (Buyru, et. al., 2006). Dalam penelitian ini, mukosa normal dan jaringan kanker kolorektal dievaluasi untuk menentukan apakah HPV dan mutasi K-Ras terlibat atau tidak terlibat dalam pengembangan neoplasma usus secara PCR (Bodaghi, et. al., 2005). Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi DNA HPV 18 pada kanker kolorektal, mendeteksi adanya E6 yang disandi HPV 18 penyebab karsinogenesis, menyelidiki adanya mutasi K-ras pada kanker kolorektal, dan mengetahui adanya korelasi keberadaan HPV 18 yang dideteksi melalui keberadaan E6 yang disandi dengan mutasi K-Ras pada kolon penderita kanker kolorektal di Makassar.

BAHAN DAN METODE Lokasi Penelitian Pengambilan sampel penelitian ini direncanakan akan dilakukan di bagian Bedah digestif Instalasi Bedah Sentral Rumah Sakit Umum Dr. Wahidin Sudirohusodo Makassar, Rumah Sakit Hikmah Makassar, dan Rumah Sakit Umum Haji Makassar untuk selanjutnya akan dilakukan penelitian di

Laboratorium Unit Penelitian Rumah Sakit Pendidikan Universitas Hasanuddin Makassar Desain Penelitian Rancangan penelitian yang digunakan adalah metode explorative , yaitu rancangan penelitian yang digunakan untuk menelusuri kemungkinan adanya hubungan sebab akibat antara dua variabel yang belum pernah diketahui. Sedangkan desain penelitian menggunakan desain cross sectional yaitu pengambilan data variabel bebas dan variabel terikat dilakukan pada satu waktu/bersamaan waktunya. Populasi dan Sampel Populasi penelitian adalah pasien penderita yang diduga kanker kolorektal pada Rumah Sakit Umum Dr. Wahidin Sudirohusodo Makassar, Rumah Sakit Hikmah Makassar, Rumah Sakit Umum Labuang Baji Makassar, dan Rumah Sakit Umum Haji Makassar. Sampel penelitian ini adalah jaringan normal dekat tumor dan jaringan tumor penderita kanker kolorektal yang telah diangkat pada tindakan operasi sebanyak 30 sampel. Jaringan tumor penderita kanker kolorektal yang telah telah direseksi dipotong sebesar 3 x 2 x 0,5 cm dan dimasukkan ke dalam tabung yang berisi formalin. Sampel ini akan dikirim ke bagian patologi anatomi untuk ditentukan stadium tumornya (TNM staging) secara histopatologi. Pada bagian tumor yang sama, jaringan dipotong lagi untuk selanjutnya dimasukkan ke botol yang berisi NaCl dan akan dideteksi HPV18 dan mutasi K-Ras secara molekuler dengan PCR. Sementara pada kolon atau rektum pasien yang telah direseksi, jaringan normal yang tidak memiliki tumor dipotong untuk selanjutnya dimasukkan ke botol yang berisi NaCl dan akan dideteksi HPV18 dan mutasi K-Ras secara molekuler dengan PCR untuk dibandingkan dengan jaringan tumor. Jaringan kemudian diekstraksi dengan menggunakan mini kit Qiagen. DNA hasil ekstraksi disimpan pada suhu -200 C. Untuk mendeteksi HPV, DNA hasil ekstraksi diamplifikasi menggunakan Genral Primer MY(9/11). MY9 CGTCCMARRGGAWACTGATC dan MY11

GCMCAGGGWCTATAAYAATGG. Produk PCR 450 bp. Sebagai kontrol kualitas isolasi DNA digunakan primer gen Beta globine GH2O GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC, PCO4 CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC (Damin dkk, 2007). DNA HPV yang positif pada amplifikasi menggunakan primer MY9/11 selanjutnya diamplifikasi dengan spesifik primer yang mengamplifikasi region E6 dari genome HPV 18. Primer HPV 18 E6 forward dan reverse masing-masing 5'CAC TTC ACT GCA AGA CAT AGA -3' dan 5'- GTT GTG AAA TCG TCG TTT TTC A -3'. Produk akhir dari PCR dihasilkan 322 bp. Untuk mendeteksi mutasi gen K-Ras digunakan primer forward K12&13F ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGCCCT,

primer

reverse

12mt-R

AACAAGATTTACCTCTATTCCTGGATCA untuk kodon 12 (Nagasaka et. al., 2004). Deteksi mutasi gen K-Ras yang dilakukan sesuai dengan metode yang dijelaskan oleh Buyru et. al., (2006). Produk PCR dihasilkan 120 bp.

HASIL PENELITIAN Penelitian ini merupakan penelitian eksploratif. Subjek penelitian yang memenuhi kriteria inklusi dan kriteria eksklusi, didapatkan 33 orang pasien bedah digestif yang secara histopatologi adalah kanker usus dan rektum. Setiap orang diambil sampel jaringan hasil reseksi pada dua tempat, yaitu jaringan kanker pada bagian usus dan rektum yang terdapat massa tumor dan jaringan normal pada bagian normal usus dekat massa tumor. Sehingga diperoleh 2 kelompok penelitian, yaitu kelompok jaringan kolon normal dekat tumor (KN) sebanyak 31 sampel dan kelompok jaringan tumor (KT) sebanyak 33 sampel. Sebagai kontrol digunakan jaringan usus yang secara kolonoskopi tidak menunjukkan kanker usus. Sampel jaringan pasien kemudian dibawa ke RS UH untuk diekstraksi dan di amplifikasi dengan mesin PCR menggunakan primer MY 9/11 untuk mendeteksi HPV dan primer K-ras untuk mendeteksi mutasi gen K-ras. Pada penelitian ini, usia subjek berkisar 26 -75 tahun dan terdapat 18 laki-laki (58,1%) dan 31 perempuan (41,9%) pada kelompok KN dan 19 laki-laki (57,6%)

dan 14 perempuan (42,4%) pada kelompok KT yang memenuhi kriteria inklusi secara histopatologi dan bersedia mengikuti penelitian. Sampel yang diamplifikasi untuk pemerikasaan DNA virus HPV menggunakan primer MY9/11 menunjukkan hasil negatif pada smpel kolon normal dekat tumor dan kolon tumor. Hasil PCR mutasi gen K-ras kodon 12 menunjukkan mutasi sebanyak 18 (58,1%) dari 31 sampel kolon normal dekat tumor dan 24 (72,7%) dari 33 kolon tumor. Penelitian ini dilakukan deteksi Human Papilloma Virus (HPV) 18 dan mutasi gen K-ras kodon 12 pada penderita kanker kolorektal di Makssar. Sampel jaringan diperoleh dari jaringan kolon hasil reseksi pasien dengan riwayat kanker kolorektal. Sampel yang diperoleh terlebih dahulu dikonfirmasi dengan pemeriksaan histopatologi untuk memastikan tipe sel jaringan sampel adalah karsinoma atau kanker. Jumlah sampel yang terkumpul sebanyak 38 pasien dan yang termasuk kriteria inklusi adalah 63 yang dikategorikan kedalam 2 kelompok, yaitu sampel jaringan tumor atau kanker (KT) sebanyak 33, dan sampel jaringan normal dekat tumor (KN) sebanyak 31. Semua sampel kemudian diperiksa secara molekuler untuk mencari HPV tipe 18 dan mutasi gen K-ras kodon 12. Berdasarkan pemeriksaan histopatologi 33 jaringan tumor menunjukkan keganasan (adenokarsinoma, adenokarsinoma + polip dan adenokarsinoma yang bermetastasis ke kelenjar getah bening), perkembangan ke arah keganasan (displasia dan anaplastik), dan polip. Adenokarsinoma diferensiasi baik 1 (3.0%), adenokarsinoma diferensiasi sedang 23 (70.0%), adenokarsinoma diferensiasi buruk 2 (6.0%), adenokarsinoma diferensiasi sedang dan polip 2 (6.0%), Adenokarsinoma metastasis ke getah bening 1 (3.0%), polip 1 (3.0%), displasi 2 (6.0%), dan anaplastik 1 (3.0%). Sedangkan sampel KN menunjukkan sel normal. Berdasarkan

Price

dan

Wilson

(2002),

KKR

didominasi

oleh

tipe

adenokarsinoma, yang penyebabnya belum diketahui secara pasti. Korelasi antara adenokarsinoma yang disebabkan oleh virus belum diketahui jelas, akan tetapi berdasarkan Lopez (1997) dan Fox (2000). HPV-18 berhubungan dengan adenocarcinoma serviks, tetapi hubungan HPV 18 dengan karsinoma kolorektal belum diketahui.

HPV merupakan virus yang secara etiologi telah diketahui sebagai penyebab kanker serviks. Sedangkan pada KKR belum diketahui bagaimana HPV menyebabkan kanker kolorektal. Beberapa penelitian telah membuktikan bahwa pada jaringan kanker kolorektal terdapat HPV. Akan tetapi penelitian lain pun menunjukkan bukti berbeda bahwa pada kolon dan rektum yang mengalami kanker, tidak ditemukan HPV dengan metode diagnosis yang sama. Pada penelitian ini pun tidak dideteksi HPV dengan menggunakan prosedur kerja yang dijelaskan pada beberapa jurnal (Bodaghi, 2005; Buyru, 2006; Deschoolmeester V, 2010; Yavuzer, 2010; Damin, 2007). DNA hasil ekstraksi diamplifikasi menggunakan primer berspektrum luas MY9/11 untuk mendeteksi gen L1 HPV. Semua sampel jaringan tumor, jaringan normal dekat tumor dan jaringan bukan tumor menunjukkan hasil negatif. Hal ini menunjukkan bahwa pada sampel kanker kolorektal tidak ditemukan HPV. Hal ini mungkin disebabkan oleh tipe sel kolon dan serviks berbeda. Berdasarkan penelitian, mutasi gen K-ras menyebabkan 20-50% kanker kolorektal. Mutasi ini biasa terjadi pada kodon 12 yang diidentifikasi sebagai target (Buyru, et. al., 2006). Untuk deteksi mutasi gen K-ras kodon 12 pada penderita KKR di Makassar dilakukan sesuai prosedur yang dijelaskan Nagasaka (2004). DNA hasil ektraksi diamplifikasi dengan menggunakan primer forward dan reverse yang didesain untuk mengamplifikasi K-ras mutan. Berdasarkan histopatologi jaringan, terdapat 23 (70.0%) sampel dengan adenocarsinoma diferensiasi sedang, yang terdiri atas 18 (78.3%) sampel yang mengalami mutasi gen K-ras kodon 12. Pada tingkatan umur, 9 (27.3%) pasien terbanyak mengalami kanker pada rentang umur 41 – 50 tahun dan 9 pasien mengalami mutasi pada gen K-ras. Pada kriteria jenis kelamin, laki-laki lebih banyak mengalami kanker (19 (57.6%)) dibanding perempuan (14 (42.4%)). 12 (63.3%) dari penderita laki-laki mengalami mutasi pada gen K-ras kodon 12. Sedangkan pada jaringan normal kolon dekat tumor ditemukan mutasi 18 (58.1%) dari 31 pasien mengalami mutasi. Pada tingkatan umur, mutasi paling banyak pada rentang 41 – 50 tahun, yaitu 8 (88,9%) dari 9 pasien. Dan pada tingkat jenis kelamin, mutasi lebih banyak pada pasien laki-laki, yaitu 12 (66.7%)

dari 18 pasien. Sehingga dapat dikatakan bahwa mutasi K-ras pada jaringan yang secara histopatologi terlihat normal dan pada jaringan kanker pada pasien yang sama pada bagian kolon atau rektum yang sama tidak memiliki perbedaan signifikan. Pada kedua jaringan itu ditemukan mutasi dengan tingkat persentasi yang hampir sama.

KESIMPULAN DAN SARAN HPV 18 tidak ditemukan pada penderita kanker kolorektal di Makassar. Mutasi gen K-ras berperan dalam meningkatkan angka kejadian kanker kolorektal di Makassar. Tidak ada korelasi antara infeksi HPV 18 dengan mutasi gen K-ras pada penderita kanker kolorektal di Makassar. Untuk peneliti selanjutnya perlu dilakukan penelitian terhadap agen mikroba yang lain yang mungkin mempengaruhi mutasi gen K-ras dan gen-gen lainnya yang mungkin mempengaruhi atau memperparah terjadinya kanker kolorektal

DAFTAR PUSTAKA

Bodaghi S, Yamanegi K, Xiao SY, Costa MD, Palefsky JM, Zheng ZM. Colorectal papillomavirus infection in colorectal cancer patients. Clin cancer Res. 2005 April 15; 11 (8): 2862-2867. Buyru N, Tezol A, Dalay N. Coexistence of K-ras mutations and HPV infection in colon cancer. BMC cancer 2006, 6:115. Casidy J, Johnston P, Cutsem. 2007. Colorectal Cancer. Informa Healthcare USA, Inc. Cheng JY, Meng CL, Chao CF, Gau SD, Lin JC. Human papillomavirus 16 DNA in NIH3T3 cells transformed by colonic cancer celluler DNA. Gut 1993; 34: 1710-1713. Damin et al. Evidence for an association of human papillomavirusinfection and colorectal cancer EJSO 33 (2007) 569e574 Deschoolmeester V, Marck VV, Baay M, Weyn C, Vermeulen P, Marck

EV, Lardon F, Fontaine V, Vermorken JB. Detection of HPV and the role of p16INK4a overexpression as a surrogate marker for the presence of functional HPV oncoprotein E7 in Colorectal cancer. BMC cancer 2010, 10:117. Lee YM, Leu SY, Chiang H, Fung CP, Liu WT. Human Papillomavirus type 18 in Colorectal Cancer. J Microbial Immunol Infect. 2001 Jun; 34(2):n87-91. Nagasaka, T., et., al. 2004. Colorectal Cancer With Mutation in BRAF, KRAS and Wild-type with respect to Both Oncogenes Showing Different Patterns of DNA Methylation. Jc0 volume 22. Number 22. November 15 2004. Doi: 10.1200/JCO.2004.02.154. Ou, J. J., Yen, T. S. B. 2010. Human Onkogenic Viruses. World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. Price SA. Dan Wilson LM. 2002. Patofisiologi. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta. WHO. 2012. Cancer. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/. Yavuzer, D. et. al. Investigation of human papillomavirus DNA in colorectal carcinomas and adenomas. Med Oncol (2011) 28:127–132

LAMPIRAN Gambar 1. Hasil amplifikasi gen L1 HPV 18 (1-17 adalah sampel jaringan kolon normal dekat tumor)

Gambar 2. Hasil amplifikasi gen L1 HPV 18 (1-13 adalah sampel jaringan kolon tumor)

Gambar 3. Hasil PCR gen K-ras sampel jaringan normal dekat tumor (KN14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 23, 24, 27, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37)

Gambar 4. Hasil PCR gen K-ras sampel jaringan tumor (KT17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 34, 35, 37)

Tabel 1. Hubungan antara histopatologi jaringan, umur, jenis kelamin dengan HPV 18 dan mutasi gen K-ras pada sampel jaringan normal dekat tumor (KN)

Kriteria

N

HPV 18

Mutasi K-ras

31 (100%)

0

18 (58,1%)

20 – 30

0

0

0

31 – 40

4 (12,9%)

0

3 (75%)

41 – 50

9 (29,0%)

0

4(44,5%)

51 – 60

7 (22,6%)

0

3(42,9%)

61 – 70

6 (19,4%)

0

4 (42,9%)

71 – 80

5 (16,1%)

0

4 (80%)

Laki-laki

18 (58,1%)

0

12 (66,7%)

Perempuan

13 (41,9%)

0

6 (46,2%)

Histopatologi jaringan Normal Umur

Jenis Kelamin

Tabel 1. Hubungan antara histopatologi jaringan, umur, jenis kelamin dengan HPV 18 dan mutasi gen K-ras pada sampel jaringan tumor (KT) Kriteria

N

HPV 18

Mutasi K-ras

31 (100%)

0

18 (58,1%)

20 – 30

1 (3,0%)

0

1 (100%)

31 – 40

4 (12,1%)

0

2 (50%)

41 – 50

9 (27,3%)

0

9(100%)

51 – 60

7 (21,2%)

0

6(85,7%)

61 – 70

7 (21,2%)

0

5 (71,4%)

71 – 80

5 (16,1%)

0

1 (20%)

Laki-laki

19 (57,6%)

0

12 (63,3%)

Perempuan

14 (42,4%)

0

12(85,7%)

Histopatologi jaringan Normal Umur

Jenis Kelamin