Kémiai szenzorok, bioszenzorok Nagy Géza Általános és Fizikai Kémia Tanszék Pécsi Egyetem, TTK
13. MKN’09 Veszprém április21-24
1
Szenzorok Fizikai (gyorsulás, helyzet, mozgás, hőmérséklet stb.) Kémiai
környezetük anyagairól kvalitatív, kvantitatív információt adnak élettartam, raktározási-, szállítási körülmények ellenőrzése
Definíciójuk? Műszer? Reverzibilisek? Visszacsatolt jelképzés?
A szenzorok és a jövő A szenzorok és a profit
A kémiai szenzorok – analizátor rendszerek A szenzorok alkalmazásának előnyei: Egyszerű használat Költséghatékony működés Folyamatos nyomonkövetés lehetősége In situ alkalmazhatóság
Nagyon fontos tulajdonságok: Szelektivitás Stabilitás
A szenzor funkció két lépése Szelektív anyagfelismerés Jelképzés, jel transzdukció
Ion-szelektív elektródok
ISE mikropipetta Pungor Ernő (1923-2007)
Folyadék membrán elektród
Metal oxide field effect tranzisztor(MOSFET), Ion selective FET
Enzyme FET, ENZFET- biosensor
Szilárd kontaktusú ion szelektív elektródok
Termisztorra épülő szenzor
Hővezetésen alapuló szenzor
Optikai szenzorok
ATIR szenzor (száloptikai hullám vezető)
Antibody/Antigen
YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
Cladding + sensing layer Core
Field distribution
Planáris hullámvezető
Cladding
Penetration depth z λ Δ z = of evanescent field is 2 2 2 π N − n defined as
SAW érzékelő Surface Acoustic Wave
Felületi plazmon rezonancia érzékelő
Kvarc-kristály mikromérlegen alapuló érzékelő
Quartz crystal and holder.
Experimental apparatus for a piezoelectric sensor. Piezoelektromos szenzor készülék Antigén - Antitest kötődés
Nanopóruson alapuló szenzor
Nanopóruson alapuló érzékelés
Róbert E. Gyurcsányi Chemically-modified nanopores for sensing Trends in Analytical Chemistry, Vol. 27, No. 7, 2008
Méréstechnikailag fontos érzékelő sajátságok - A detektáció határa, dinamikus méréstartomány
- Szelektívitás Anyagfelismerés Jel transzdukció
Szeparáló réteg Interferencia eliminálás Perm szelektívitás Méret kizárás Mediátor Direkt elektron átlépés
- Érzékenység A kalibrációs görbe meredeksége - Válasz idő - Reverzibilitás - Stabilitás (raktározási, műveleti)
16
Igen sok különböző, más kémiai szenzor van használatban: -szilárd elektrolitos gázszenzorok -kemorezisztorok -mágneses oxigén mérők -kapacitív nedvességmérők A szelektivitás nehezen biztosítható
bioszenzorok
A bioszenzor definíciója Biológiai rendszerekben használható szenzor Páciensben lokális pH mérés Mikroelektród in vivo monitorozásra Vérnyomás mérő klinikai hőmérő
biológiai anyagot tartalmazó szenzorok Biomimetikus szenzorok, (Enzim, nonactin?)
IUPAC: Sensor incorporating biological element ˚ Enzim ˚ ˚ ˚ ˚ ˚
Antitest Nuklein sav Mikroorganizmusok Sejtek, szövetek Teljes biológiai érzékelő “Bug sensor”
18
A bioszenzor kutatás története Inventor Leland C. Clark Jnr. oxigén elektród Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs 2, 41-48 (1956) Ann. NY Acad. Sci. 102, 29-45 (1962).
“making more intelligent electrochemical sensors by adding enzyme transducers” 2005-ben megkapta a Fritz J. és Dolores H. Russ díjat Ez a fénykép az átadás után készült, néhány hónappal Clark halála előtt. 19
Updike és Hicks
Glükóz szenzor oxigén elektródon Updike, S.J. and Hicks, J.P. Nature 214, 986-988 (1967)
Guilbault és Montalvo Karbamid mérő potenciometriás enzimelektród Guilbault, G.G. and Montalvo, J. JACS 91, 2164-2569 (1969).
H2O2 detektáláson alapuló első amperomtriás enzimelektródok G. Rechnitz
inventív, a területen sok eredményt elért kutató
1975.
Az első kereskedelmi “jól működő” glükóz elektród (1973. Először piacra juttatva) Yellow Springs Instrument Company (Ohio, USA) 20
1974. Mosbach K. Danielsson 1975.
Divis
enzim termisztorok mikrobiológiai elektródok
1980. Voelkl, K. P. Opitz, N. Lubbers D. W. Optódra épülő bioszenzor 1982. Shichiri et al. In vivo tűszerű glükóz szenzor (Intenzív kutatás indult a mesterséges pankreáz kifejlesztésére)
immuno bioszenzorok intenzív kutatás Liedberg, B., Nylander, C. and Lundstrm, I. szenzors and Actuators 4, 299-304 (1983)
Folyóiratok
Bioszenzors and Bioelectronics, Sensor (WEB.) Sensors and Actuators
21
A bioszenzorok működése
Jel
Szelektív anyagfelismerés
Jel transzdukció, jelképzés
22
• • • • • • • •
Bioszenzor Szelektív felismerés Biokatalitikus Enzimek Immobilizált formában, Állati szövet Növényi Szövet
• • • • • • • • • •
Baktérium, gomba Immuno reagens Ab, Ag Jelzett, direkt DNA érzékelők Receptor érzékelők Teljes érzékelő szervek
jel Electrokémiai potenciometriás (FET) voltammetriás amperometriás konduktometriás
Optikai érzékelés lumineszcenciai jelképzés Optikai szenzorok hullámvezetők (wave guide) Entalpia válzozás QMB (tömeg változás) SPR (surface plasmon resonance)
23
A szeketív anyagfelismerés biztosítására használt bioágensek
Biokatalizátorok (enzimek) Immunkémiai ágensek DNS, RNS preparátumok Bio receptorok Aptamerek Egyéb anyagok
Mikroorganizmus telep, növényi szövet, állati szövet, állati érzékszerv, bogár szenzor
Igen sokféle biológiai anyag és transducer (jelképző) Flow analyzers FIA Alkalmazások Egészségügy, klinikai analízis Élelmiszer analízis Környezeti analízis Honvédelem, terror elhárítás
FIA analitikai rendszerek alkalmazása
A bioszenzorok alkalmazásától várható előnyök - Szelektívitás - Specificitás - Egyszerű procedúra - Folyamatos monitorálás - Költséghatékonyság - Mérési eredmény rövid idő alatt
25
Entalpia változás detektálásán alapuló bioszenzor Mosbach - Danielsson
Néhány enzim által katalizált reakció moláris entalpia
Kvarc kristály mikromérleg
Az enzimelektród funkció
O2 Diffúziós réteg
S +E’
Ss
DS
ES
I
P
D’P
E+P
Reakció réteg
S
DP
28
A bioszenzorokban az enzimek immobilizált formában vannak
Az immobilizálás hatásai: -Az enzim sajátság megváltozhat -Általános hatás nem állapítható meg Az immobilizálás Megváltoztathatja az orientációt Árnyékolhatja a szubsztrát/termék transzportot Denaturálást idézhet elő Microkörnyezeti hatások Lokalis pH változások Gátolt anyag transzport, (hozzáférés, tortuozitás) Térhálósodás Ionerősség változás
Az enzim szenzorok reakció rétegei
Az enzim immobilizálás egyik úttörője Prof. Mosbach
30
31
Példa a kémiai enzim immobilizálásra
32
Az enzim immobilizálási módszerek összehasonlítása Membránnal
Jellemzők
Adszorpció
Kovalens kötés
Bezárás (gélbe, polimerbe)
Készítés
Egyszerű
Nehéz
Egyszerű
Egyszerű
Költség
Kicsiny
Nagy
Moderált
Nagy
Változó
Erős
Gyenge
Erős
Enzim kioldódás
Igen
Nem
Igen
Nem
Alkalmazhatóság
Széles
Szelektíve
Széles
Igen széles
Alkalmazás során fellépő Komplikációk száma
Nagy
Kicsi
Nagy
Nagy
Mátrix hatások
Igen
Igen
Igen
Nem
Nagy diffúziós gátlás
Nem
Nem
Igen
Igen
Védelem bakteriális fertőzéssel szemben
Nem
Nem
Igen
Igen
Kötő erő
(NH 2 )2 CO + 2H 2O + H
+
+ 4
− 3
⎯⎯ ⎯→ 2 NH + HCO ureáz
alkohol − oxidáz
alkohol + O2 ⎯⎯ ⎯ ⎯⎯→ H 2O2 + acetaldehid ADH alkohol + NAD + ⎯⎯ ⎯→ aldehid + NADH + H + laktát − oxidáz
L − laktát + O2 ⎯⎯ ⎯ ⎯ ⎯→ piruvát + H 2O2 arg inin − dea min áz
L − arg inin ⎯⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯→ citrullin + NH 3 34
Potenciometriás alapérzékelők: pH érzékeny , NH4+, CN-, CO2, I- ISE FET szenzorok Enzime FET, ENZFET- bioszenzor
Amperometriás alapérzékelők: Pt, Au, GC, CP, Különböző alakúak, méretűek lehetnek
35
Az amperometriás enzimelektródok három generációja
a.,- A reakció terméke reagál az elektródon (I. generáció)
b., – Egy mediátor reagál az elektródon (II. generáció)
c.,- Az enzim redox csoportja vesz részt az elektród folyamatban (III. generáció)
36
Mediált elektronátmenet
Tetracianoquinodimetan
mediátorok
(TCNQ)
37
glükóz elektród válasz a- glükóz nélkül b, c – glükózzal Mediátor jelenlétében
Elektronátvitel oxidoreduktáz enzim és voltammetriás munkaelektród között
Közvetlen átlépés
Átvitel oldott mediátorral
Torma peroxidázzal mediált
Ferrocén származék a mediátor
Molekuláris „huzal” alkalmazása (Adam Heller)
41
Szol-gél típusú reakció réteg elektronátvivő mediátorral
a) sequential invertáz
mutarotáz α-D-glükóz
szukróz
O2
b) competitive
glukonolakton+ H2O2
β-D-glükóz
O2 GOx
ATP hexakináz
β-D-glükóz
glukonolakton + H2O2
GOx
glükóz-6-foszfát + ADP
c) eliminator HO+O 2
H2O2 + gluconolakton
O2
CAT GOx
glükóz + szukróz
2
invertáz szukróz
mutarotáz α-Dglükóz
β-Dglükóz
GOx gluconolakton + H2O2
43
Komplex működésű enzim szenzorok:
-szekvenciális enzim reakciók, -interferencia eliminátor reació,
Erősítés
-dúsításos (erősítő) enzim akció -kompetitív érzékelés
44
Laktát mérő amperometriás enzim szenzor
Saját eredmények -Potenciometriás bioszenzorok I- alapelektródon Glükóz, L-fenilalanin elektródok (az első bienzim ektród, oxidáz- peroxidáz) - NH4+-elektród, karbamid elektród (LPA, nonactin ionofor, elasztikus szilikon membrán - Aszkorbin sav interferencia eliminátor elektród (mikro-elektródos „in vivo” neurotranszmitter mérés) - Amperometriás putreszcin elektród - Mikro-cella enzim aktivitás mérésre - Hullámvezető optód detektor -
(karbamid hullámvezető szenzor FIA mérésére)
-
(koncentráció profilok enzimelektródok reakció rétegében,)
- Scanning electrochemical microscope SECM - Glükóz tolerancia teszt patkányokban
Mikrochip szenzor cella putreszcin biológiai mintákban való mérésre klinikai BV detektálás NH2-(CH2)n-NH2+O2+H2O Putreszcin n=5
NH3 detekálás - ISE,
enzim
NH2-(CH2)n-1-CHO+NH3+H2O2
Putreszcin oxidáz Bakteriális fertőzés
Amperometriás oxigén vagy hidrogén peroxid detektálás – Pt elektródon pH változás is detektálható - Sb elektróddal
diamin (putreszcin) pH
külső réteg (PU) Enzim réteg (PO) Belső réteg (p-mPDA Pt Au Cr Capton membrán
47
A méretkizárásos réteg működésének ellenőrzése
1000
Áram [nA]
H2O2
H2O2
• • • •
500 H2O2 AA
AA
• •
50μl 5mM aszkorbin sav és 20 μl 10mM H2O2 hozzáadása 30 ml pH=7.2 foszfát pufferhez Paracetamol (2mM) Húgy sav epinefrin dopamin
AA
0
0
200
400
600
idő (s)
Lívia Nagy, Géza Nagy
48
49
Szubsztrát és enzim aktivitás mérő cella Szubsztrát Enzim réteg Az enzimreakció elektroaktív terméke
Enzim Szubsztrát réteg elektród
52
Alkalikus foszfatáz aktivitás mérés p-HEMA hydrogel poly(2-hydroxymethyl methacrylate) 200
0.25 U/ml 0.5 U/ml 0.75 U/ml 150
Absorbent layer Hydrogel
1 U/ml 1.75 U/ml
Electrode material
I (nA)
2.5 U/ml 3.75 U/ml
100
50
0 0
25
50
75
100 Time (s)
125
150
175
Glükózmérő bioszenzor állatkísérletek céljaira Glükóz − oxidáz (EC 1.1.3.4)
β − D − Glükóz + O2 + H 2 O ⎯⎯ ⎯ ⎯⎯→ D − glükono − 1,5 − lakton + H 2 O2 Elektródtest és csatlakozója
Glükóz bioszenzor kalibrációs görbéje pH = 7.4 izotóniás foszfát pufferben, 0.65 V elektródpotenciál mellett.
0.0450
iv. inzulin beadás 0.0400
1 Iw (µA)
0.0300
0.8
i/μA
Áram [μ A]
40% glükóz 40 %oldat glükóz oldat
0.0350
0.0250
0.0200
0.6
0.0150
0.4
0.0100
y = 0.0579x + 0.0512
0.2
2
R = 0.9835
8000
5
10
-3 mol dm -3 C / 10koncentráció Glükóz [mM]
9000
9500
10000
10500
11000
11500
12000
12500
13000
13500
14000
14500
15000
time (s)
0 0
8500
15
glükózmérő cella áram - idő regisztrátuma
Beszúrható (in vivo) glükóz érzékelő
Ag katód 100 μm
In vitro glükóz mérés 3,75-37,5 mM Az elektród felépítése
Geometriai felülete Munka elektród: 3,8mm x 0,2 mm A= 0,76 mm2 Referencia:
1,5mm x 0,2 mm A= 0,3 mm2
Ellenelektród:
1mm x 0,3 A=0,33 mm2
Elektrokémiai felülete A=0,08 mm2
0,11 mM L-aszkorbinsav 0,48mM húgysav
Implantálható tűszerű mikroelektród Elektroenzimatikus glükóz szenzor
Bioszenzorok reakció rétegének vizsgálata Pésztázó Electrokémiai Mikroszkóppal
Balázs Csóka, Barna Kovács, G Nagy
61
SECM kép acetil-kolinészteráz ezim folt katalitikus aktivitásáról
Természetes biokomponens alkalmazásával készített bioszenzorok Bio componens élő microorganizmus Alga, baktérium, élesztő, gomba • Egyszerű • költség hatékony preparátum “poliszelektív” • Életben kell tartani a kulturát •
Immobilizálás dializis réteg szűrő Gelbe zárás (PVA, collagen, agar, gelatin)
Transducerek O2 felhasználás CO2 termelés H2S, H2O2, NH3 Acetobacter xylinum → etanol mérés (1975) első alkalmazás
Rechnitz (1981) Yellow squash szelet glutamát decarboxiláz (GLD) glutamin sav
CO2 GLD
CO2 gáz szenzor Severinghaus típusú
65
Bore et al.
Burgonya szelet
polifenol oxidáz
Clarke O2 elektród katekol, dopamine, L-dopa, etc. detektálás uborka juice (aszkorbát oxidáz) AO L − ascorbinsa v + 1 / 2O2 ⎯⎯→ dehidroasz korbinsav + H 2O
Clarke O2 elektród Malochan (1991) banán szövet “bananatrode” → dopamin mérés
66
Mikroorganizmusok metabolitikus aktivitásának nyomonkövetése Élesztő-alapú bioszenzorok Módosított szénpaszta elektród NAD+ + K3[Fe(CN)6] → alkohol mérés Egész szövet alapú bioszenzorok Disznó vese szövet → szenzor → glutamin mérés Rechnitz Patkány máj szelet
monoamin oxidáz (MAO)
R − CH 2 − NH 2 ⎯⎯ ⎯→ R − CHO + NH 3 MAO
67
Cianid mérő bioszenzor Intact animal sensor blue crab antennae → removed → sensory nerve exposed activity spikes followed with microelektróds Bug senzor Potato bug reports insect activity in field Receptor element based bioszenzorok ion channel based sensing LB technique, patch-clamp
68
A krumpli föld fertőzöttségét detektáló bioszenzor (BIOFET) cis-3-hexén-1-ol detektálás
71
Antitestek, Fehérjék immunoglobulinok antigének hatására keletkeznek Mw ≈150 kDa Kb.110 aminosav
}
73
Immunosensing Recognizing bio-component Signal transduction
→
→
antibody antigen
optical electrochemical mass QCMB temperature SPR, SAW. Refr. Index
reversible ? not strictly (high affinity) quasi reversible - direct immunoszenzorok problem nonspecific binding (NSB, NSA) -labeling, RIA, Enzyme label, Fluorescence label -liposoma lysis 74
Policlonal antiszérum many different antibody specifecities recognizing various epitopes on the antigen concerned production
↓ immunisation of animal (rabbit, sheep, goat, mouse, rat, horse) ↓ several injection of antigen (hapten) many different B-lymphocyte cells (multiply) ↓ antiserum → heterogeneus reagent - binding to different epitopes of the Ag - different affinities (competition) - different specifity - different titre Affinity purification with immobilised antigen on solid-phases. Antigen eg. polypeptides immunogenic
Mw > 100000 Da
smaller molecules antigenic but not immunogenic → haptens steroids, vitamins, drugs → haptens hapten-carrier protein injection → immunization variety of Ab-s (h-c, c, h) just “h” is needed Injection: subcutaneous or intramuscular (rabbit: 100 μg) (boosting after 4 weeks) 3-6 months production time
75
Preparation of Monoclonal Antibodies specific, homogeneous reagent 1975. Kohler Milstein
single antibody-producing B-lymphocytes are immortalized single clone → “monoclonal” - monospecific continuous production by fusion with a B-.cell tumor line → hybridoma cell line
76
Production 1. immunization, booster injection 2. blood sampling, antibody testing 3. selected animal sacrificed its spleen removed (aseptic condition) 4. spleen cells separated by sieving, washing 5. mixed with compatible strain of myeloma cells 6. fusing agent (polyethylene glycol) used to help fusing → 1 from 10000 spleen cells fuses (rare event) only a few of the fused ones secret good antibodies 7. media is applied in which the unfused spleen cells die – only the hybridomas survive 8. the antibody production of hybridoma cells are tested (microtiter plates used) diluted → one cell in one plate cells grown → tested → diluted → monoclonal 9. in vivo or in vitro production ↓ ↓ solid tumor hollow fiber culture systems (g ⁄ month) roller bottles → mg ⁄ month
77
Antibody fragments Fc portion removed F(ab)2 Fab fragments used production by cloning the gene E. coli sFv single chain antibody fragment
separation use
Antibody mimics, artificial antibody molecular imprinting monomer + analyte
polymer with analyte
Lecitins
wash out
reagent
Carbohydrate-binding proteins (non immune origin) Concanavalin A (ConA) glükóz-mannose binding
Receptors 100 kDa proteins; unavaible in pure form in intact cells, membranes receptor binding by antibody to sensing surfaces
78
Binding proteins Protein A and G Bacterial Proteins
bind to Fc portion of antibodies
(Staphylococcus aureus) Protein A 42 kDa six independent binding sites for Fc coupling to bioaffinity reagent good orientation
Avidin: Biotin Tetramer protein Avidin (four identical 15 kDa subunits); Basic (pI=10,5) High affinity (1015M-1) B6 vitamin, biotin Biotin-Ab coupling is easy Streptavidin (from streptomyces) less basic
Nucleic Acids DNA: DNA, DNA: RNA, DNA:protein interaction Hybridization with complementary strands
79
Immunkémiai szenzor működése
Ab + Ag ↔ Ab − Ag
[ Ab − Ag ] K= [Ab][Ag ]
K → 105 − 1012
virtually irreversible pH change, ionic strength adjustment can change K→ regeneration monospecific ? group specific Ab Immunoassays → heterogeneous - Direct (non labeled) – capacity change, mass change, Ri change etc. - Sandwich
81
- Kompetitív
82
83
FIIA → like affinity chromatography Liposome amplification Locasio-Brown-Durst-Horvath Anti teophyilline antibodies → immobilized ↓ in column derivatized liposomes filled with marker ↓ competitive binding ↓ liposomes disrupted ↓ detection
84
85
86
Electrochemical immunoszenzorok Direct potentiometric signal Covalent binding immunoreagent onto elektród surface binding signal (change of double layer) Transmembrane potential change (membrane applied) FET sensor
Catalytic antibodies PH elektród coated with membrane containing catalytic antibody. analyte phenyl acetate PH change 13-22mV/decade slope - Amperometric immunoszenzorok
- capacitance measurement based immunosensor Enzyme linked immunoassays Ab-anti-α-fetoprotein (AFP) bound onto Clark-type O2 elektród catalase labeled AFP→ reaction; H2O2 addition local O2 concentration increase
87
Felületi plazmon rezonancia detektációt (SPR) alkalmazó bioszenzor
D- diódasoros detektor, P- prizma, L- fényforrás (lézer), S-érzékelő réteg (arany film, immoblilizált antitest), F- átfolyó cella
Nuklein sav alapú szenzorok
• • • • •
-Hybridisation of complement segments -Specific binding of different molecules -preconcentration of different analyte CME -Gene probes (labeled, direct )
•
-use of aptamers (artificial oligonucleotid segments)
89
The nucleotid bases responsible for binding Section of double strained DNA
(In RNA)
G/C three hydrogen bonds- stronger interaction A/T two hydrogen bonds
90
Stage of art in nucleic acid szenzorok • The nucleic acid szenzorok are in erly experimental stage • High number of working principles have been proved • It is expected that in the future they will be very capable • Analytical tools, sensors • It is hoped, that one system will be able: » recognising, » extracting, ampifying analyte and » giving selective signal
•
Good equipments are ready for the synthesis of oligonucleotides, aptamers
91
Nuklein sav szenzorok működésének fajtái
Szilárd hordozóval Jelző nélkül a, b,
Kapcsolódás olatokban
Mágneses jelzés e Szűréssel c
92
93
Aptamers the active part of future szenzorok •
• •
Aptamers are relatively short single stranded DNA or RNA sequences that are selected in vitro based on affinity for a target molecule. They are synthesised in vitro. Aptamers offer advantages over traditional antibody-based affinity molecules in their ease of production, regeneration, and stability, largely due to the chemical properties of nucleic acids versus amino acids. Mostly optical detection used in experiments with aptamer sensing. A broad library of sequences are used to select the reagent. After separation, labelling can they be used
94
Aptamer szenzor kiválasztása, készítése SELEX process (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) (Ellington and Szostak, 1990);
Arany nanorészecskéhez kötött aptamer reagens és SPR detektálás használata
J. Wang et al. / Talanta 79 (2009) 72–76
1 és 2 nanorészecskék össze vannak kötve, adenozin jelenlétében szétválnak és szinváltozás következik be
Receptoron alapuló bioszenzor
αHL –Hemolizin receptor
