Biotechnológiai immunszupresszánsok
Immunszuppresszív terápia Az immunszuppresszív (szó szerint: immunitást elnyomó) terápia az immunrendszer működésének mérséklését, csökkentését szolgáló kezelés Allergia: különböző bőrbetegségek, allergiás aszthma, szénaláz, anafilaxiás sokk, gyógyszer-túlérzékenység, szérumbetegség Autoimmun betegségek: reumatoid arthritis, anaemia perniciosa (vészes vérszegénység), szisztémás lupus erythematosus(SLE), egyes pajzsmirigymegbetegedések, cukorbaj, az agyalapi mirigy csökkent működésének egyes esetei Szervátültetés
Immunszuppresszánsok Készítette: Veszely Réka 2008.12.05.
2
Immunszuppresszív terápia
Történet immunszupresszív szerek iránti kutatás az 1950-es, 1960-as években vált intenzívvé teljes test besugárzást alkalmaztak, betegek nagy részét elvesztették a fertőzések miatt 1962-től vált elérhetővé az azatioprin vagyis Imuran, szteroidokkal éveken át az egyetlen esély 1980-as évek elején került klinikai alkalmazásra a ciklosporin
Transzplantáció esetén az akut és krónikus rejekció megakadályozása más területen (infekció, tumor) ne gátolja az immunrendszer működését, mellékhatásoktól mentes legyen
3
Immunszuppresszív gyógyszerek
Ciklosporin-A
Citosztatikumok Antimetabolitok
4
Norvég Sandoz gyógyszercég találta meg és fejlesztette ki a gyógyszert Tolypocladium inflatum gombát 1970-ben gyűjtötte be talajmintában Ciklopeptid antibiotikum, de immunszuppresszív hatása is van Immunológiai vizsgálatok egerekben, tenyésztés körülményeinek tökéletesítése, szerkezet meghatározása, állat és klinikai tesztek FDA 1983 novemberében engedélyezte a CyA-t, mint Sandimmun-t, fontos mérföldkő a transzplantológiában
purin: azathioprin, mycofenolát-mofetil,mizoribin pirimidin: leflunomid, brequina fólsav-antagonisták: methotrexat Alkilálók: cyclophosphamid Kortikoszteroidok: Prednisolon és Methylprednisolon Lymphocyta antigének elleni antitestek: antithymocyta-globulin (ATG), muromonab-CD3, IL-2R elleni antitestek (basiliximab, daclizumab), CAMPATH-1 ellenanyagok, anti-CD5-T lymphocyta immuntoxin Citokin gének expresszióját gátlók: cyclosporin, tacrolimus Egyéb: sirolimus (rapamycin), gusperimus, glatiramer
5
6
1
Biotechnológiai immunszupresszánsok
Ciklosporin-A
Ciklosporin-A
Cylindrocarpon lucidum és Tolypocladium inflatum (Beauveria nivea), 25 különböző cyclosporint izoláltak, cyclosporin A a legnagyobb mennyiségű 11 aminosavból álló ciklikus peptid, az aminosavak közül 7 metilált, 3 nem esszenciális aminosavat tartalmaz: D-alanin, L-2amino-vajsav és Bmt (4(R)-4-(E-2-butenil)-4-metil –L-treonin)
Tulajdonságai: lipofil, hidrofób, vízben nem oldódik Farmakokinetika: Biohasznosíthatóság: változó, biotranszformációja már a bélnyálkahártyában elkezdődik, Sandimmun Neoral megnövelte a biológiai hozzáférhetőséget Metabolizmus: májban, 99% Felezési idő: változó, kb. 24 óra Kiválasztás: epével, 90%
7
Ciklosporin-A Hatásmechanizmusa: a T-lymphocyták sejten belüli, Ca++ -függő szabályozó rendszerébe beavatkozva gátolja az IL2 gén átíródását, így az IL2 képződést, amely az immunválasz során a T-sejt proliferációhoz szükséges Előnye hogy a macrofag és granulocyta funkciót nem befolyásolja Másodlagosan a gamma interferon keletkezést és a B-sejt aktiváló lymphokinek termelődését is gátolja Használják szervkilökődés, graft-versushoft betegség, psoriasis(pikkelysömör), autoimmun uveitis(szemgyulladás), idiopathic nephrotic syndrome, rheumatoid arthritis ellen Iv. és capsulas kiszerelés
8
Ciklosporin-A Mellékhatásai:
9
Ciklosporin-A Dozírozás: vérszintfüggő, a transzplantációt követő két hét alatt a 250-400 ng/ml (napi dózis: 10-ről 6mg/tskg/napra csökkentve) Folyamatosan csökkenthető az adag Kombinálva alkalmazzák: kortikoszteroid-ciklosporin-A: fél év alatt 150-200 ng/ml-re, ciklosporin-Amycofenolát-mofetil(MMF), vagy ciklosporin-A-Imuranszteroid kombinációban 100-150ng/ml (napi dózis: 2,54mg/tskg/nap) A megfelelő dózis beállítása nagyon fontos, mert az immunszupresszív gyógyszerek túl nagy adagban fokozott fertőzésveszélyt jelentenek, alacsony dózisban viszont nem fejtik ki a szervet védő hatásukat és a szerv elvesztéséhez vezethetnek a kilökődés 11 révén.
vírusfertőzésre hajlamosít malignus daganatok keletkezését elősegíti, elsősorban a bőrtumorokét, és a malignus lymphomákét nephrotoxicus diuretikum nélkül hyperkalaemiára hajlamosít hypertoniát okoz, a már fennállót ronthatja növeli a serum koleszterint és a serum húgysav-szintet elősegíti diabetes kialakulását mérsékelten hepatotoxicus kellemetlen mellékhatása, hogy a szőrnövekedést fokozza, és a fogíny hyperplasiáját okozza mellékhatásai kevésbé zavaróak, mind a szteroidoké
10
Ciklosporin-A Fermentáció: 6 és 33 C° között növekszik, hőmérséklet-optimuma 24 C°, 12-14 napig Tápközegként maláta- és élesztőextraktummal kevert agart alkalmaznak Üzemben: glükóz szénforrás, kazein-pepton nitrogénforrás, nyomelemek (Zn, Mn, MO, Cu, Fe), vitaminok (tiamin, biotin, piridoxin) HPLC-vel követik
Feldolgozás: 25 különböző ciklosporint lehet elválasztani etil-acetáttal extrahálják, több lépésben kromatográfiával tísztítják, pl sephadex gél szűrés, silica géles fordított fázisú, közép és magas nyomású kromatográfia kitermelés növelhető: speciális aminosavak tápközeghez adásával, pl. L-valin hozzáadásával 710 mg/liter (L-valin nélküli 130mg/liter), spórák porózus gyöngyökre való immobilizálással 3xos növekedés 12
2
Biotechnológiai immunszupresszánsok
Ciklosporin-A
Tacrolimus
1990-ben izolálták a cyclosporin–szintetáz enzimet a T. inflatum tenyészetéből. Az enzim cyclosporint szintetizál a prekurzor aminosavakból ATP felhasználásával. cyclosporin-szintetáz gén: izolálták, klónozták és megszekvenálták. 1 open reading frame: 45,8 kb, 15281 aminosavból álló fehérjét kódol CyA bioszintézise: tiotemplát mechanizmust követ, nem riboszómális fehérjeszintézis, egyetlen enzim 40 lépést katalizál tenyészetéből izolált enzimmel lehetséges in vitro szintézise a cyA-nak, két speciális aminosavat előállító enzim is, Bmt-szintáz és alanin-racemáz új ciklosporin analógok előállítása is lehetséges, megnövelhető vagy megváltoztatható a biológiai hatásuk, pl. [MeIle4]CyA HIV-1 virus elleni szer, amit különböző aminosavak hozzáadásával kísérleteztek ki. DNS mediált transzformációval az óriás cya szintetáz génje manipulálható → új ciklosporinok előállítása, kitermelés növelése egyes minor komponensnek a normál bioszintézis során
1987-ben fedezte fel egy japán kutatócsoport, vezetői T. Goto, T. Kino and H. Hatanaka Streptomyces tsukubaensis nevű, a talajban élő gomba termeli, makrolid antibiotikum, erősen lipofil név eredete: ‘Tsukuba macrolide immunosuppressant'
13
Tacrolimus
14
Tacrolimus Hatásmechanizmus:
Tulajdonságai: lipofil Farmakokinetika:
az FK506-binding proteinhez kötődve a limfokin-gének expressziójához szükséges defoszforilációs folyamatokat gátolja, CyA-hoz hasonlóan gátolja a T-sejtek IL-2 szintézisét In vitro kísérletekben immunszupresszív hatékonysága kb. 100-szor erősebbnek bizonyult, mint a CyA-é, a mellékhatásai mégis azonosak Előnyös a használata az immunológiai szempontból magas rizikójú betegeknél, valamint CyA mellett kialakult szteroid rezisztens rejekció gyógyulása is szignifikánsan jobb a CyA Tacrolimusra cserélését követően
Biohasznosíthatóság: 20%, étkezés után kevesebb, főleg zsíros ételeknél Metabolizmus: májban Felezési idő:11,3 óra (3,5-40,6 óra között) Kiválasztás: epével Fehérjekötés: 75-99% 15
Tacrolimus A gyógyszert a Prograf, Advagraf és Protopic névek hozzák forgalomba 1994-ben alkalmazták májátültetésnél, később szív, pancreas, tüdő, bőr, csontvelő, vékonybél, légcső, szaruhártya és végtag transzplantációra Helyileg kenőcsben a tacrolimus súlyos atopiás dermatitisben használható, azoknál akik más szerre nem reagálnak, hatása a szteroidokhoz hasonló, de nem alakulnak ki szteriodhoz kapcsolható mellékhatások, pl. athrópia
16
Tacrolimus Mellékhatásai:
gyakori: neurológiai szövődmények, diabetes mellitus nephrotoxicitása a CSA-éval azonos ritkábban hypertonia, hyperlipidaemia, kifejezetten ritka a hirsutizmus (rendellenes szőrnövekedés), a gingiva hyperplasia (fogíny elburjánzása)
Orálisan vagy intravénásan adható Adagolása: szintén vérszintfüggő, első két hétben 10-20ng/ml (0,15-0,2mg/tskg/nap dózis), fenntartó szint 5-10ng/ml (fél év után) és kb. két év után 3-5ng/ml
17
18
3
Biotechnológiai immunszupresszánsok
Tacrolimus
Tacrolimus
Immunszupresszív terápiában alapszer a cyclosporin és a tacrolimus Kombinációkban adva a kívánt hatás erősödik, a mellékhatások csökkenek
Fermentáció:
mycophenolate-mofetillel, vagy azathioprinnel, vagy sirolimussal, vagy kortikoszteroidokkal
Kölcsönhatások más szerekkel: Magas vérszintet eredményez, gátolja a metabolizmust, növelik a vegyület toxicitását : különböző gombaellenes szerek, bromokriptin, lidokain, midazolam, kinidin, grapefruit Ciklosporinnal együtt nem szedhető Csökkenti a tacrolimus koncentrációját: metamizol (algopyrin)
tápközeg: szárított élesztő, vízoldható keményítő, kukoricalé, CaCO3, habzásgátló, (szójaliszt, gyapotmag liszt, glicerin), pH=6,8 4 napig 25-28°C-on, keverés és levegőztetés mellett inkubálják 40 óra után eléri a stacionárius fázist és ezután kezd el tacrolimust termelni, a maximumot 90 óra után éri el, ekkorra a pH=7,3 ra emelkedik
A fermentlé feldolgozása: szűrés és több extrakciós és kromatográfiás lépés után kapott fehér port kristályosítják és így színtelen kristályt kapnak
19
Rapamycin
20
Rapamycin
1975-ben izolálták a Streptomyces hygroscopicus gombatörzsből egy Rapa Nui (Húsvét szigetek) szigetéről származó talajmintából, a neve is innen származik, makrolid antibiotikum, szerkezete hasonlít a tacrolimushoz
Fizikai tulajdonságok: fehér kristályos anyag, 183185°C az olvadáspontja, metanolban, etanolban oldható, vízben nem
Farmakokinetika: Biohasznosíthatóság: 20%, étkezés után kevesebb, főleg zsíros ételeknél Metabolizmus: májban Felezési idő: 57-63 óra Kiválasztás: epével Fehérjekötés: 92%
21
Rapamycin
22
Rapamycin
Hatásmechanizmus: sejtbe jutva köt az FKBP-hez, rapamycin-FKBP komplex gátolja a T- és B- sejtek citokinek hatására meginduló proliferációját és a Bsejtek ellenanyag-termelő sejtekké való differenciálódását. Tumorellenes és immunszuppresszív hatása van, más aktivitása van és remélhetőleg kisebb a toxicitása, mint a cyA-nak és Tacrolimusnak. Hatásmechanizmusában és támadáspontjában eltér a korábban alkalmazott szerektől csökkenti az akut rejekciók arányát vese-, máj-, tüdő-, hasnyálmirigy-, szív- és vékonybélátültetések esetén
Alkalmazásával lehetővé válik a szteroidok elhagyása bizonyos helyzetekben, ami előbbiek hosszútávú mellékhatásainak kiküszöbölését jelentheti. Hosszútávon kedvező a vesefunkció, vesetranszplantációt illetően kombinációban alkalmazzák mikofenolát-mofetillel (Cellcept) vagy ciklosporinnal (Neoral) vagy tacrolimusszal (Prograf) Felezési ideje 62,5 óra, így naponta egyszer kell alkalmazni Rapamune néven kerül piacra
23
24
4
Biotechnológiai immunszupresszánsok
Rapamycin
Rapamycin
Mellékhatások:
Fermentáció:
csontvelő vérképzését befolyásolhatja nyálkahártyafekélyek (ún. afták) alakulhatnak ki a szájüregben, bakteriális és vírusfertőzések kerülendők oppurtinista fertőzések gyakorisága nem nőtt hypertrigliceridaemia trombocytopaenia
Adagolás: Kezdő dózisa: napi egyszer 16-24 mg/m2 7-10. naptól 8-12mg/m2 dózisra csökkentve, amellyel kívánatos vérszint az első két hónapban 30ng/ml, ezután 15ng/ml.
Optimális szilárd tápközeg: paradicsomsűrítmény és zabliszt tartalmú agar Optimális pH-tartománya: 6-8 Optimális növekedési hőmérséklet: 25-27 C° Üzemi léptékű fermentációhoz tápközeg: glükóz, szójababliszt, (NH4)2SO4-tal és KH2PO4-tal, valamint habzásgátlóval Fermentáció 25°C és 6,1 körüli pH-n folyik, keverést és levegőztetést igényel
Feldolgozás: a rapamycin a micéliumokban található, ezért a feldolgozáshoz szűrés után extrahálják több lépésben, majd kristályosítják
25
Rapamycin
26
Köszönöm a figyelmet!
Azonosították a rapamicint szintetizáló enzim génjét. A makrolid gyűrű létrehozását három nagy multienzim-komplex katalizálja, a három fehérje összesen 70 reakciót katalizál. Az enzimkomplex egyes részei hasonlítanak a tacrolimust szintetizáló enzimekre, pl. a poliketid szintáz enzimek, amely részt vesz a tacrolimus makrolakton gyűrűjének kialakításában, de vizsgálatok szerint nem cserélhetők fel 27
5
