Excitáció-kontrakció csatolása szívizomsejtekben Dr. Tóth András
2+
i
„Intracelluláris szabad kálcium koncentráció”
Témák Az ECc-ben szerepet játszó sejtstruktúrák Myofilamentumok – az ECc végsı effektorai Az aktivátor Ca kinetikája Akciós potenciálok és ioncsatornák* A Ca beáramlás csatornái A szarkolemma Ca pumpája és az NCX A szarkoplazmás retikulum mőködése Excitációs kontrakciós csatolás SR Ca felszabadulás és Ca fluxusok Inotrópia Ca „mismanagement”
1
! Hasonlóságok a szív- és a vázizom EC csatolásában Mindkét izomtípus harántcsíkolt (fejlett T-tubulus, illetve intracelluláris SR hálózat) Az akciós potenciál biztosítja az excitációs stimulust, mely aktiválja a plazmamembrán Ca csatornáit Az aktivált Ca csatornák triggerelik a szarkoplazmás retikulum Ca release csatornáit Ennek eredményeként megemelkedik az intracelluláris szabad Ca és aktiválja a kontraktilis apparátust
2
! Különbségek a szív- és a vázizom EC csatolásában A szívizomban a T-tubulus, illetve szarkoplazmás retikulum rendszer kevésbé fejlett A szívben specializálódott ingerképzı (SA) szövet és vezetı (Purkinje) rostok találhatók A szívizom sejtek szincitiumot alkotnak – azaz gap junction-ok segítségével elektromosan összekapcsoltak A kamrai szívizomsejtek akciós potenciál kb. 100x hosszabb (250 ms) mint a vázizom akciós potenciálja
3
Az ECc fontosabb lépései szívizomban
Az AP szomszédos myocitákról gap junction csatoláson keresztül átterjed a szívizomsejtre és végigterjed azon A depolarizáció aktiválja a membrán Ca csatornáit, s az elnyújtott AP alatt jelentıs mértékő Ca influx jön létre Az intracelluláris Ca lokális növekedése nagymértékő Ca felszabadulást triggerel az SR-bıl (CICR) Az intracelluláris Ca globális növekedése aktiválja a myofilamentumokat s így kontrakciót hoz létre β1-adrenerg stimuláció a Ca áram, release és reuptake növelésén keresztül növeli a szív kontraktilitását
!
Az EC csatolásban szerepet játszó sejtstuktúrák
4 ~ 100 x 25 µm
Hısünk, a kamrai szívizomsejt
5
Vázizom
Szívizom
Vázizomban az SR sőrő hálózatot alkot, jelentısen kiszélesedik a terminális ciszternáknál, a T-tubulusok átmérıje jóval kisebb, mint szívizomban. Szívizomban az SR hálózat ritkább, junkcionális csatolásokat tartalmaz a külsı szarkolemmával, illetve a T-tubulusokkal, melyek átmérıje sokkal nagyobb, mint vázizomban. A mitochondrium-denzitás is jóval nagyobb.
Vázizomrost és szívizomsejt szerkezete
!
6
!
A junkcionális SR/ER és a szarkolemma közötti „restricted space” külön intracelluláris kompartmentnek tekinthetı és kitüntetett szereppel rendelkezik az EC csatolás és a Ca-homeosztázis vonatkozásában. Ebben a térben jóval nagyobbak a Na+, K+ és Ca2+ koncentrációváltozások, mint a többi citoszol kompartmentben. A teret határoló szarkolemma L-típusú Ca csatorna és NCX fehérje denzitása sokkal nagyobb, mint a sejt más régióiban.
A „restricted space”
7
! Az SR belsejében számos calsequestrin molekula található A nem junkcionális SR felszínen nagyszámú Capumpa egység található A RyR „lábak” két párhuzamos sort alkotnak A DHP receptorok hasonló, de alternáló szimmetriájú struktúrát alkotnak a T-tubulus membránban
A kulcsfehérjék relatív helyzete a vázizom triádban
8
!
Szívizomban a valószínőleg random módon elhelyezkedı DHP receptorok száma sokkal kisebb, mint vázizomban, ahol szabályos struktúrát alkotnak.
T-tubulus junkciók szervezıdése váz-, illetve szívizomban
Myofilamentumok: az E-C csatolás végsı effektorai
9
! Szív Troponin-C 1 db Ca kötı hely (reguláció) Kd = 500 nM) 2 db Ca-Mg kötı hely (stabilitás)
A szívizomsejtek kontraktilis fehérjéi
10
!
A kontrakció mechanizmusa szívizomban
11
Resting muscle
!
Ca2+
ADP+Pi A + M ADP Pi
High actin affinity
* ADP+Pi A-M ADP Pi
* ATP
A-M ATP
Pi
Low actin affinity *
ADP
ATP
A-M
Rigor Complex
A kereszthíd ciklus fontosabb lépései szívizomban
12
! A vázizom kontrakciós erejét meghatározó tényezık A) Kontrakció szummáció (tetanusz) B) További rostok aktiválása (recruitment) C) Szarkomer hossz (myofilamentum „overlap”)
A szívizom kontrakciós erejét meghatározó tényezık A) Intracelluláris Ca koncentráció (analóg) (intrinsic reguláció) B) Szarkomer hossz (myofilamentum „overlap”) (extrinsic reguláció) A kontrakciós erı szabályozása váz- és szívizomban
13
!
A kontrakció hossz-feszülés görbéje váz- és szívizomban
14
Ca szenzitizáló szerek Pozitív inotróp szerek
Hipoxia – iszkémia
A Ca-érzékenységet befolyásoló fontosabb tényezık
15
!
A kontrakciós erı-rövidülési sebesség görbe szívizomban
Az aktivátor kalcium forrásai, eltávolítása és kinetikája
16
!!
(From Bers, 2002)
Ca transzportfolyamatok kamrai myocitákban
17
A) A myofilamentumok Ca érzékenysége (F = Fmax/(1 + (Km/[Ca]i)n) B)
A kontrakció aktiválásához szükséges hozzáadott Ca mennyisége
A görbék a „skinned” szívizomrostokra (Hill koefficiens n = 2), illetve intakt szívizomsejtekre (n = 4) vonatkoznak
A myofilamentumok aktiválásához szükséges („aktivátor”) Ca
18
Nyúl kamrai myocita modell
A [Ca]i ”pontos” értékének kísérletes meghatározása szinte lehetetlen !!!
!!!
A) Változások a szabad és az összes intracelluláris Ca koncentrációkban B) Változások a citoplazmatikus Ca-kötı ligandokhoz kötött Ca mennyiségében C) Ca áram és transzporter fluxusok
Dinamikus Ca változások (Ca tranziens) a kontrakció során
!
Extracelluláris tér (ECS ∼ 30% teljes testtérfogat) [Ca]: 2 mmol/L ECS x 0.55 L ECS/L citoszol = 1000 µmol/L citoszol Influx: VD Ca csatornák, Na/Ca kicserélı, „leakage” csatornák Efflux: Na/Ca kicserélı, szarkolemma Ca-ATPáz
Belsı szarkolemma felszín [Ca]: 60 µmol/L citoszol (nincs szerepe az EC csatolásban!) (ui. gyors extracelluláris Ca eltávolítást követıen a depolarizáció nem hoz létre mérhetı [Ca] növekedést)
Szarkoplazmás retikulum [Ca]: 50-250 µmol/L citoszol Influx: SR Ca-release csatorna (citoszolba!) Efflux: Sr Ca ATP-áz (SERCA2) (SR-be!)
Mitochondriumok [Ca]: 10 000 µmol/L citoszol (in vitro) (PO43- – „matrix loading”) [Ca]: 100 µmol/L citoszol (in vivo) Influx: Na/Ca antiport (citoszolba!) Efflux: Ca uniport (mitochondriumba!)
A citoszol Ca tartalma, Ca influx és efflux mechanizmusok
19
Coffein: felszabadítja az SR Ca tartalmát és gátolja visszavételét 0Na, 0Ca: gátolja az NCX-et FCCP: szétkapcsolja a mitochondriumokat
Az egyes Ca transzporter mechanizmusok szerepe a relaxációban
20
Kritikus [Ca]i ≈ 500 nM
A mitochondriális Ca ciklus – a [Ca2+]m változások tükrözıdnek a dehidrogenázok aktivitásában
A mitochondrium szabad Ca tartalma [Ca]m a citoszol [Ca]i függvényében
A mitochondrium szerepe az intracelluláris Ca regulációban
Akciós potenciálok és ioncsatornák a szívben*
21
!
Ioncsatornák szívizom sejtekben
Ca beáramlás a szarkolemma Ca csatornáin keresztül
22
!
(From Bers, 2002)
Ca transzportfolyamatok kamrai myocitákban
23
!
A myokardium L - és T-típusú Ca csatornáinak legfontosabb tulajdonságai
24
CaL csatorna:∼ 3-5/µm2 DHP receptor: ∼ 20/µm2
Az L-típusú Ca csatornák tulajdonságai
25
A Ca-dependens ICa-facilitáció (vagy gátlás) – az un. lépcsı (starcase) jelenség – oka a nyugalmi és folyamatos aktivitás alatti Ca szintek közötti eltérés. Egyes speciesekben (pl. kutya, nyúl, humán) az összefüggés pozitív, más speciesekben (pl. patkány, egér) negatív starcase jelenség mutatható ki PR: post rest (a nyugalom utáni elsı pulzus)
SS: steady state pulzus
Ca-dependens – Ca-áram facilitáció – ICa „positive starcase”
26
Az AP alakja (idıtartama – QT) meghatározza a transzportált Ca mennyiségét
Hosszú AP: nagy Ca influx Rövid AP: kevés Ca influx
Az ICa mértéke négyszögimpulzus és AP-clamp alatt
27
! Antagonisták:
Dihidropiridin (DHP)-származékok (nifedipine, nitrendipine, nimodipine, nisoldipine, (+) Bay K 8644, azidopine, iodipine) Fenil-alkilamin (ΦAA)-származékok (Verapamil) Benzothiazepin (BTX)-származékok (Diltiazem)
Agonisták:
(-) Bay K8644 (+) S-202-79, stb.
Agonisták:
mode 2 („tartósan” nyitott állapot) (pl. Bay K 8644 esetén ∼0.6ms → ∼ 20 ms)
Antagonisták:
mode 0 („tartósan” zárt állapot)
A Ca csatorna mőködését moduláló fontosabb ágensek
28
2.
1.
1. 2.
Gs → Adenil-cikláz → cAMP↑ →PKA(REG) Gs → direkt hatás (AKAP: PKA rögzítı protein, PLB: foszfolamban)
Az ICa kétutas β-adrenerg aktivációja szívizomsejtekben
Összefoglalás A) B) C) D) E)
F)
Az L-típusú Ca csatornán bejutó áram (ICa) a Ca influx legfontosabb mechanizmusa. Az ICa centrális szereppel rendelkezik a szív EC-csatolásában, a Ca regulációban és a kontrakcióban. Az ICa AP alatti kinetikája és amplitúdója kritikus faktorok az SRbıl felszabaduló Ca mennyiségének meghatározásában (is). Az ICa-ban belépı Ca közvetlenül hozzájárul a myofilamentumok aktiválásához, az SR Ca-raktárainak feltöltéséhez/fenntartásához. A tartós Ca steady state feltétele, hogy a belépı teljes Ca mennyiség ugyanazon szívciklus alatt (fıleg az NCX mőködése következtében) hagyja el a szívizomsejtet. Ha nem így történik, a sejt fokozatosan telítıdik kalciummal. Az L csatornák nagy Ca konduktanciájának következménye, hogy ha (viszonylag kevés) L-csatorna nem inaktiválódik (vagy reaktiválódik), jelentıs intracelluláris [Ca]-szint emelkedés jön létre, (különösen depolarizált sejtben). Ennek következtében a relaxáció gátlódik, illetve arritmia is kialakulhat
!
A Na/Ca kicserélı és a szarkolemma Ca pumpája
29
!
(From Bers, 2002)
Szarkolemmális Ca-transzport folyamatok kamrai myocitákban
30
A) A PMCA lineáris reprezentációja: B) A PMCA kétdimenziós modellje:
10 TM régió, foszfolipid (PL) szenzitív régió, calmodulin-kötı régió (CaM-BD), stb. autoinhibíciós állapotban (bal), Ca2+-CaM stimulációt követıen (jobb)
A plazmamembrán Ca2+-ATP-áz szerkezeti és mőködési modellje
31
!
A fiziológiás aktivitás alapfeltétele a calmodulin-kötés kialakulása !!!
A plazmamembrán Ca2+-ATP-áz kinetikus tulajdonságai
32
szabályozás
XIP: exchange inhibitory protein
A Na/Ca kicserélı (NCX) szerkezeti modellje
33
A.
2D topológiai modell
B.
TM 2, 3, 7, 8, illetve α-1 és α-2 loop-ok alkotják a transzport centrumot
Az NCX transzport ciklusának lépései szívizomban. A kicserélési aktivitást az intracelluláris Nai & Cai koncentrációk szabályozzák (E1 befelé nyitott, E2 kifelé nyitott)
Az elektrogén Na/Ca kicserélı mőködési modellje
34
!
Spike fázis: (Em > 0) a Ca influx dominál Plato fázis ion-eloszlások függvényében influx, vagy efflux egyaránt lehet Repolarizáció az Ca efflux dominál (különösen magas [Ca2+]i esetén)
A Na/Ca kicserélı áram (INa/Ca) membránpotenciál (Em) függése
35
Az NCX mőködését serkentı és gátló tényezık
36
!
„Reverse mode”: Ca2+ influx, Na+ efflux – AP kezdeti fázisa „Forward” mode: Ca2+ efflux, Na+ influx – AP késıi fázisai
Az NCX AP alatti „forward”, illetve „reverse” irányú transzportját az ionkoncentrációk mellett a membránpotenciál értéke befolyásolja
37
Ilyen egyszerő az NCX áram közelítı kiszámítása
38
Szívelégtelenség:
INCX ↑↑↑ ISERCA ↓↓↓ Ca transzport-mechanizmusok „versengése” a szívizom relaxációja alatt
39 A nyugalmi csökkenés mértékét elsısorban az SL & SR szivárgási áramainak aránya, illetve a Na/Ca kicserélı aktivitása határozza meg
A „nyugalmi” állapot nem fiziológiás állapota a szívizomsejtnek !!! A csökkenés mértéke erısen species-függı: patkányban igen kicsi, nyúlban viszont jelentıs
Az SR Ca tartalmának nyugalmi csökkenése
Összefoglalás A) B)
C)
D)
E) F)
A Na/Ca kicserélı mechanizmus alapvetı jelentıségő a miokardium intracelluláris Ca-regulációjában Ez az elsıdleges mechanizmus, mellyel az L-típusú Ca-csatornákon keresztül bekerülı Ca a relaxáció/diasztolé során kitranszportálódik a sejtekbıl. A szarkolemma Ca-pumpája (SLCP) szívizomban alárendelt jelentıségő. A Na/Ca kicserélı rendszer teljesítménye igen nagy, összemérhetı az SR Ca-ATPáz (SERCA2) teljesítményével (~ 1 : 2), s ezáltal számottevıen hozzájárul a relaxációhoz Ugyanakkor az NCX elvben képes a kontrakcióhoz szükséges és elégséges Ca-influx létrehozására is. Erre fiziológiás körülmények között nincsen szükség. Az NCX által átlagosan kipumpált Ca mennyisége meg kell, hogy egyezzen az L-típusú Ca-csatornán bejutó Ca mennyiségével. Mivel az NCX a legfontosabb mechanizmus a Ca efflux kialakításában, jelentıs mértékő gátlása esetén várható az intracelluláris Ca szint progresszív emelkedése
!
Szarkoplazmás retikulum Ca felvétel, tárolás és felszabadítás
40
!
(From Bers, 2002)
Az SR Ca-transzport folyamatai kamrai myocitákban
41 Struktúra: 10 transzmembrán hélix. A protein 70%-a a membrán citoszol felıli oldalán van (β-lánc, foszforilációs és nukleotid kötı hely, membránon kívüli domainek, billenı tag) M4-M6 & M6: Ca2+ kötésben és transzportban fontos hélixek. A: Ca2+ felvétel a citoszolból B: Ca2+ leadás az SR lumenbe
A
B A transzport lépései: E1: 2 Ca2+ magas affinitású kötése, ATP kötés, foszforiláció + konf. vált. E2-be E2: 2 Ca2+ release az SR-be, két proton transzportjával, konf. vált. E1-be
Az SR Ca-pumpa (SERCA2) szerkezete és a transzport lépései
42 PLB-SERCA2 interakció: heterodimer PLBSERCA gátolja a Ca transzportot – foszforiláció vagy Ca kötés csökkenti a gátlást Arány: 2(-3) PLB monomer/SERCA2 (nem szaturált)
PLB
A foszfolamban szerkezete és hatása az SR Ca transzportjára
43
A SR Ca-ATPáz (SERCA2) farmakológiai inhibitorai Thapsigargin (TG) (Kd < 2 pM) Ciklopiazonsav (CPA) 2,5-di(tert-butyl)-1,4-benzo-hidrokinon (TBQ)
A SERCA fontosabb (pato)fiziológiás szabályozó faktorai Ca:
az elérhetı Ca mennyisége ([Ca]i) alapvetıen meghatározza a pumpa mindenkori aktivitását
pH:
a pumpa mőködése szempontjából optimális pH ∼ 8, a pH jelentıs csökkenése (különösen pH < 7,4, azaz acidózis) esetén csökken a pumpa aktivitása (is), ezáltal a szívizom relaxációja (is) a pumpa 2 ATP-kötı hellyel rendelkezik (szubsztrát + reguláció) általában az ATP mennyisége nem limitáló tényezı, de súlyosiszkémia alatt, az ATP szintézis lassulása miatt csökkenhet a SERCA aktivitása (is), s ezáltal a szívizom relaxációja (is)
ATP:
Mg:
a SERCA aktuális szubsztrátja valószínőleg Mg-ATP, így a Mg koncentráció jelentıs csökkenése gátolhatja mőködését (is)
A SERCA2 inhibitorai, illetve fontosabb szabályozó faktorai
!
44
!
SOC: store operated channels
triadin, junctin: SR struktúrfehérjék
A SR Ca tartalmát befolyásoló tényezık összegzése
45 Egyes feltételezések szerint a Ca csatorna kimenete a molekula oldalán lehet, s ezáltal a Ca ionok az SR-bıl közvetlenül a „restricted space”-be kerülhetnek. MW = 2 260 000 Da
FKBP: PKA kötı hely CaM: calmodulin kötı hely
Az SR Ca release csatornájának (ryanodin receptor, RyR) modellje
46 A) 2 db Ca spark (2D konfokális) fluoreszcencia) B) 1 db Ca spark (1D „line-scan”) C) Elıbbibıl nyert Ca tranziens D) A fenti sparkot 3D-ben mutató felületi Ca plot Számos lokális spark fúziója Ca-tranziens kialakulásához, ezáltal kontrakcióhoz vezet !!! Az SR-bıl történı Ca felszabadulás elemi eseménye a lokális „spark”, mely gyakran spontán, sztohasztikus módon is létrejön. 6-20 RyR vesz benne részt, a T-tubulus közelében indul, ∼ 10 ms alatt 200-300 nmol csúcs [Ca2+]i-t hoz létre. A csökkenés oka Ca diffúzió, illetve Ca reuptake.
Ca sparkok izolált kamrai szívizomsejtben
47 A RyR makromolekuláris „signaling komplex” számos regulációs mechanizmus „végsı integrátora” !!!
As SR-bıl történı Ca felszabadulást serkentı és gátló tényezık
48
Kiriazis 2000
A SR Ca-transzport genetikai modulációinak következményei
! Összefoglalás Az SR képes az szívizom-kontrakció aktiválásához elegendı Ca-t tárolni és megfelelıen gyorsan felszabadítani Néhány jellemzı számérték Tipikus kamrai szívizomsejtben ~ 2.5*105 DHPR, ~ 1.5-2.5*106 RyR, illetve ~ 0.75-1.25*109 SR Ca-ATPáz molekula található Tipikus nyugalmi Ca spark aktivitás: ~ 50/s, ehhez mindössze ~ 1000/s RyR aktivációja szükséges (az összes RyR ~ 0.02%-a) Csúcs SR Ca release-hez (~ 3 mM/s) ~ 40 000/s RyR szükséges (~ 4%) Teljes SR Ca release-hez (~ 50 µmol/L citoszol) ~ 7500 spark szükséges (azaz a RyR-ok ~ 5%-a) Hasonlóan, a mért Ca influx áram (max. 1 nA) kialakulásához az L-típusú Ca csatornák (DHP receptorok) ~ 2-3%-a (~ 5000 db) szükséges
Excitációs-kontrakciós csatolás (ECc)
49
!
A) Izolált patkány kamrai szívizomsejt
B) Béka vázizom rost
A vázizommal ellentétben a szívizomban a kontrakció aktiválásához szükséges a külsı Ca beáramlása
50
Az SR-bıl történı Ca felszabadulás lehetséges aktivátor mechanizmusai
51
A. B.
Aktiválás
Delay idıtartam↑ ↑
Gátlás
Eltérı [Ca]-jú oldatok gyors cseréjét követıen mért tenziók Az SR Ca-release-ét indukáló (trigger) [Ca] az adott [Ca] eléréséhez szükséges (delay) idıtartam és a max. kontrakció kapcsolata (pCa = - log[Ca])
A tenzió (azaz Ca release) függ mind a trigger [Ca]-tól, mind annak változási sebességétıl (rate of change), azaz a mért delay mértékétıl Egy adott Ca-szint alatt pozitív, felette negatív feed-back van, azaz alacsony [Ca]sm aktiválja, magas deaktiválja a CICR mechanizmust. Ezt támasztja alá, hogy a delay idıtartam növekedésével a tenzió csökken
A CICR mechanizmus igazolása, illetve lokális (Ca) kontroll szívizomban (skinned Purkinje rostokon)
!
52
!
A RyR két Ca-kötıhelye eltérı kinetikával köti a Ca iont, ezáltal Ca-dependens aktiváció és inaktiváció is létre tud jönni: (1: gyors, alacsony affinitású kötıhely – gyors aktiváció, 2: lassú, magasabb affinitású kötıhely – lassú inaktiváció)
Az SR-bıl indukált Ca-release (CICR) javasolt lépései szívizomban
53
TT
+
SR
TT
Vm
+ +
Ca2+
Ca2+ Channel Release Channel
Excitációs-kontrakciós csatolás szívizomban (Ca2+-Induced-Ca2+-Release)
SR
54 A szívizom EC-csatolásának „lokális kontrol” elmélete
!!
Megfigyelések:
A [Ca] változás mértéke (sebessége) a RyR környezetében aktiválni, illetve inaktiválni tudja a RyR-t A DHPR és a RyR junkcionális kolokalizációja INa → ([Na]sm↑ → [Ca]sm↑) → SR Ca/release Lokalizált SR Ca-release események (Ca sparkok) kimutatása „Közös Ca-pool” modellek nem magyarázzák a „graded” CICR-t
Hipotézis:
A RyR-t a „fuzzy space” azaz a [Ca]sm változásai modulálják „Ca-szinapszis” hipotézis: 1 DHPR → 1 RyR-t triggerel „Cluster bomb” hipotézis: 1 DHPR → „cluster” RyR-t aktivál
Tulajdonságok:
Mindkét modell magyarázza a CICR analóg jellegét és nagy erısítését, de utóbbi valószerőbb, mivel nem igényel extra nagy „single RyR” Ca-fluxust A RyR-ok egy clusterjében (un. couplon) a Ca felszabadulás gyakorlatilag „all or none” jellegő és regeneratív. Aktív „cluster” nem képes a többit aktiválni (Ca-spark csak igen ritkán hoz létre újabbat) a “graded” jelleg az aktív clusterek számának változásából ered.
Érvényesség:
A lokális kontrol elmélet az ICa indukált SR Ca-release-re vonatkozik. Érvényessége nem igazolt más módokon (NCX, „caged”Ca) létrehozott SR Carelease vonatkozásában, melyek térbeli eloszlása kevésbé lokalizált a junkcionális régióhoz.
55
!
Vázizomban A DHPR és RyR közötti fizikai kapcsolat alapvetı jelentıségő Nincsen szükség külsı Ca beáramlásra
Szívizomban A DHPR és RyR közötti fizikai kapcsolat nem közvetíti a VDCR-t A külsı Ca beáramlása (ICa) alapvetı jelentıségő
EC-csatolás vázizomban (VDCR), illetve szívizomban (CICR)
Összefoglalás A)
B)
Ca C)
D)
Lényegét tekintve a 3-féle alapvetı izomtípus modellként szolgálhat az SR-bıl történı Ca-release 3-féle alapvetı mechanizmusára. (VDCR: vázizom; CICR: szívizom; IP3ICR: simaizom). Ez szubsztanciális egyszerősítés. Mindhárom izomtípusban mindhárom mechanizmus jelenléte, és mőködése igazolható Vázizomban a release indítása szempontjából a VDCR alapvetı, de a CICR szerepe is vélhetıen nagyon fontos a DHPR-ekkel fizikailag nem kapcsolódó (kb. 50%), VDCR-rel nem aktivált RyR-ok aktiválásában (recruitment), illetve IP3 is létre tud hozni (perinukleáris) felszabadulást (IP3ICR). Szívizomban a CICR az alapvetı jelentıségő EC-csatolási mechanizmus. Ugyanakkor az IP3ICR release-moduláló szereppel rendelkezhet. Néhány megfigyelés felveti a szarkolemma és az SR közötti funkcionális direkt kapcsolat (így a VDCR) létét. E kapcsolat tényleges súlya nem ismert. Simaizomban mind az IP3ICR, mind a CICR szerepe bizonyított, sıt az is bizonyított, hogy az IP3ICR kölcsönhat egy más típusú, a csatolásban is résztvevı plazmamembrán Ca csatornával (TRP).
!
Az SR és SL Ca fluxusok szerepe a szív kontrakció szabályozásában
56 Koffein, illetve ryanodin elıkezelés hatása a kontrakciós erı nagyságára különbözı szívizom preparátumokban.
A kontrakciós erı helyreállása szívizom preparátumokban 30 s nyugalmi fázis után, ryanodin kezelést követıen (alsó vonal), illetve kontroll-ban (felsı vonal).
Species különbségek a steady state kontrakcióban, illetve a kontrakciós erı post-rest recovery-jében
57
A) A Ca transzport [Ca]i-függése szívsejtekben B) Relatív Ca-fluxusok kamrai preparátumokban C) Integrált Ca-fluxusok relaxáció alatt D) ICa & SR eredető aktivátor Ca frakciók
A Ca fluxusok analízise különbözı species-ekben
58
Frekvencia-függı változások a kontrakciós erıben nyúl kamrai szívizomban
Erı-frekvencia összefüggés patkány, nyúl, tengeri malac és humán kamrai izomban
Erı-frekvencia kapcsolat szívizomban
Összefoglalás A)
B)
C)
D)
E)
A [Ca]i szabályozás részleteiben, különbözı preparátumokban és kísérleti feltételek között jelentıs variabilitás áll fenn. E komplexitás lényegében érthetıvé válik kis számú közös kölcsönható rendszer, és néhány, a különbözı szívpreparátumokban eltérı lényeges funkcionális tulajdonság figyelembevételével. A Ca-influx speciális körülmények között képes kontrakció kiváltására, de normális esetben felnıtt emlıs szívizomban az aktivátor Ca legfıbb forrása az SR. Az SR-bıl felszabaduló Ca egyrészt újra az SR-ben akkumulálódhat, másrészt az NCX eltávolíthatja a sejtbıl. Steady state-ben a szívciklus során létrejövı Ca-influx és Ca-efflux meg kell, hogy egyezzen. Az SR Ca tartalma során fokozatosan kiürülhet (NCX), de az ICa segítségével post-rest aktivitás során gyorsan helyreállhat (5-10 kontrakció alatt). A transz-szarkolemmális Na-gradiens értékétıl függıen nyugalomban az SR kiürülhet, de fel is töltıdhet. A szív [Ca]i szabályozására dinamikus, de érzékeny egyensúly jellemzı, és ennek megváltozása inotróp, illetve luzitróp hatással jár.
!
Pozitív inotrópia
59
!
1. 3. 5.
A myokardium kontraktilis állapotát szabályozó mechanizmusok: Szimpatikus idegrendszer, 2. Frank-Starling mechanizmus Erı-frekvencia összefüggés 4. Adrenerg reguláció Vaszkuláris funkció
A szív inotróp állapotának fiziológiás szabályozása
Hormonreceptorok & ion transzporterek szívizomsejtekben 1.
Hormonreceptorok & ion transzporterek szívizomsejtekben 2.
60
Fenn: β1-receptor aktiválása, deszenzitizációja és down-regulációja molekuláris szinten Lenn: Különbségek a háromféle β-receptor G-protein csatolásában
β-adrenerg mechanizmusok (pl. β2,3-receptorokon keresztül) gátló (kardioprotektív) hatást is közvetíthetnek (pl. NO-szintézisen keresztül kontraktilitás csökkentés) !!!
β-adrenerg receptor szignál-mechanizmusok szívizomban
61
!
Az α-adrenerg reguláció → G-protein → PLC (& PLD) → IP3+DAG → lépéseken keresztül pozitív inotróp hatású, továbbá hipertrófia kialakulását is serkenti
α-adrenerg traszdukciós mechanizmusok kamrai sejtekben
62 α-adrenerg aktiváció hatására a Ca-tranziens sokkal kevésbé nı mint az erı, β-adrenerg hatás jelentısen növeli a tranzienst β-adrenerg hatás csökkenti, αadrenerg hatás viszont növeli a myofilamentumok Caérzékenységét
α- és β-adrenerg inotrópia összehasonlítása
!
63
!
Emelkedett diasztolés [Ca]i pozitív inotróp hatású
64 A Na-pumpa gátlása szívglikoziddal (strofantin) növeli a nyugalmi Nai szintet (A), ezáltal emeli az IC Ca szintjét és az SR Ca szintjét (B).
Szívglikozid (acetilstrofantin) koffein vagy ryanodin jelenlétében is növeli a kontrakció erejét
Acetil-strofantidin hatásai a Ca-homeosztázisra
65
Ca-blokkoló (Nifedipine) hatására szinte teljesen megszőnik a kontrakció, még koffein jelenlétében is (fenn), továbbá az APD is számottevıen rövidül. A Na-pumpa gátlását követıen (acetil-strofantin) a Nifedipine már nem képes az elızı mértékben csökkenteni a kontrakciós erıt, bár az APD csökken (lenn).
Ca csatorna gátlás következményei
Összefoglalás A)
A szív inotrópiájának növelése több mechanizmussal is lehetséges - hypotermia (kísérleti célok) - β-adrenerg aktiváció (fiziológiás) - α-adrenerg aktiváció (fiziológiás) - CaMKII (Ca-CaM-függı protein kináz) aktiváció (fiziológiás) - kardioaktív szteroidok (szív glikozidok) (terápiás)
B)
Fiziológiás körülmények között a β1-adrenerg aktiváció (ANS) szerepe különlegesen jelentıs (inotróp, chronotróp, luzitróp, stb. hatások), de a β2,3-receptorok gátló, kardioprotektív hatásokat is közvetíthetnek (NO). Az α-adrenerg aktiváció szerepe az inotrópia növelésében humán szívben kevésbé jelentıs, ugyanakkor fontos szerepe van a szív hipertrófiájának indukciójában (PKC). α-adrenerg aktiváció növeli a myofilamentumok Ca érzékenységét, de nem fokozza a relaxáció sebességét. Az APD-t növeli. A CaMKII szerepe viszonylag kevésbé ismert. Mivel autofoszforilációra képes, szerepe lehet [Ca]i szignálok integrációjában. A digitalis a szív patológiás körülmények között csökkent inotrópiájának terápiás növelésére legrégebben (1785) használt anyag. A Na-K pumpa gátlásán keresztül növeli a Ca influxot és csökkenti az effluxot, ezáltal az [Ca]i is emelkedik, ami intrinsic módon inotrópia növelı hatású. Túlzott használata azonban negatív inotrópiához és arritmogenezishez vezet.
C)
D) E)
!
Ca “mismanagement” és negatív inotrópia
66
!
Az EAD-ok az ICa újraaktiválódása következtében alakulnak ki, különösen az APD jelentıs megnyúlása esetén (pl. LQT szindróma) A DAD-ok oka vélhetıen az SR túltöltıdése következtében spontán kialakuló sparkok aktiváló hatása a Ca-függı csatornákra (INA/Ca, ICl(Ca), INS(Ca))
Spontán Ca felszabadulás és utópotenciálok szívizomsejtekben
67
C
D
Papilláris izom preparátum-ban pHo 7.4 →6.2 változtatása után az erı csökkent, a Ca-tranziens nıtt (A+B). A pH-csökkenés hatására lényegesen csökken a maximális kontrakciós erı (C). Az intracelluláris pHi szabályozásának legfontosabb transzport mechanizmusai (D).
Acidózis hatása a szív EC-csatolására
68
Akut iszkémia-reperfúzió alatt kialakuló fontosabb változások
69
Hipertrófiához vezetı szignál kaszkádok
70
! Szívelégtelenségben módosult funkcióval rendelkezı struktúrák : NCX
(reverz és forward módban is) Feszültség szenzor Foszfolamban SR-Ca-ATPáz (SERCA2a) A szarkolemma Ca-transzportjának (NCX) relatív súlya nı A szarkoplazmás retikulum Ca-transzportjának (SERCA) relatív jelentısége csökken.
Szívelégtelenségben az EC-csatolásban kialakuló fontosabb elváltozások
70
! A csökkent pumpa funkciót (fiziológiás) negatív feedback folyamatok próbálják kompenzálni.
!!!
Ezek következtében az intracelluláris Ca-szint és a Ca tranziens emelkedik.
+ feedback - feedback
!!!
Az intracelluláris Ca-szint emelkedése „maladaptív” gén-expressziót indukál, mely tovább rontja a pumpa funkciót, és kóros pozitív feed-back kör, „circulus viciosus” jön létre.
A genetikai változások pozitív feed-back-je
72
A Ca-homeosztázisban szívelégtelenségben kialakuló változások
73
Kontraktilis diszfunkció és arritmogenezis szívelégtelenségben
74
Változások a Ca homeosztázissal kapcsolatos gének expressziójában súlyos fokú szívelégtelenségben
Összefoglalás A)
A szív (kamrai szívizomsejt) nagyon finoman hangolt rendszer, amely képes a kontrakció paramétereit rövid idı alatt a fiziológiás igények rendkívül széles tartományban történı változásaihoz igazítani az ion-áramok, Ca-homeosztázis és a myofilamentumok paramétereinek megváltoztatásával. Ez a rendszer sok ponton redundáns, de amennyiben a normális [Ca]-regulációs mechanizmusok jelentısen sérülnek, súlyos negatív inotrópia jöhet létre.
B)
Ca túlterhelés gyakran spontán SR Ca-release-hez, és Ca-hullámok kialakulásához vezet, melyek, ha nagyszámú sejtben, random módon generálódnak, a kontrakciós erı jelentıs csökkenéséhez vezetnek. A késıi utópotenciálok és utókontrakciók kialakulásában az SR Ca-release által indukált Iti (tranziens inward áram: INa/Ca+ ICl(Ca) + INS(Ca)) vesz részt. Az acidózis, mely gyakran myokardiális iszkémia következménye, a Catranszport több komponensének (NCX, SERCA, stb.) gátlása révén jelentıs kardiodepresszív hatással rendelkezik (kontrakciós erı & Ca-érzékenység). A hipoxia, iszkémia/reperfúzió és szívelégtelenség rendkívül komplex, multifaktoriális patomechanizmusainak progressziójában mindig jelentıs szerepet játszanak az intracelluláris Ca-homeosztázis folyamatosan súlyosbodó zavarai, melyek egyik legfontosabb következménye a szív kontrakciós erejének sokszor a keringés összeomlásához vezetı mértékő csökkenése.
C) D)
E)
!
