EVALUASI TIGA METODE PREPARASI RNA TOTAL UNTUK DETEKSI Turnip mosaic virus PADA BENIH Brassica sp. DENGAN REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION
JATI ADIPUTRA
SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
2
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Evaluasi Tiga Metode Preparasi RNA Total untuk Deteksi TuMV pada Benih Brassica sp. dengan Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Februari 2009
Jati Adiputra NIM A451064084
3
ABSTRACT
JATI ADIPUTRA. Evaluation of Three Total RNA Preparation Methods for Detection of Turnip mosaic virus from Brassica Seeds using Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Supervised by SRI HENDRASTUTI HIDAYAT and TRI ASMIRA DAMAYANTI. Turnip mosaic virus (TuMV) is an important seedborne virus that infects vegetable crops, especially brassica group. Plant Quarantine agency of Indonesia considers TuMV as an A1 Quarantine regulated pest, because its occurrence was not reported until 2006. Due to increasing number of brassica seeds imported to Indonesia, it is important for Plant Quarantine Agency to have an accurate and reliable detection method to prevent the virus entering the country. The objective of the study is to evaluate three total RNA extraction methods from Brassica seeds for TuMV detection using RT-PCR. The sample used are caisin (Brassica rappa L cv. group caisin) seeds and seeds germinated for 3, 5 and 7 days. Total RNA extraction methods evaluated in this study were: Willey, Randles, and RNeasy plant mini kit for comparation. Analysis on total RNA produced by the three methods showed that Randles method resulted in high RNA concentration, but the RNA purity was low. On the other hand, RNeasy method resulted in high RNA purity but the concentration of RNA was low. Specific TuMV fragment of 800 bp was succesfully amplified from seeds without germination using Willey and Randles methods. All three methods were able to detect TuMV seeds germinated for 3 days. Randles method was the only method which able to detect TuMV from seeds germinated for 5 days; whereas none of the methods were able to detect TuMV from seeds germinated for 7 days. Duplex RT-PCR with primer nad5F and nad5R used as an internal control was able to amplify both TuMV and internal control DNA. It was concluded that Willey methods have the best succes rate compare to the other two methods for detecting TuMV from Brassica seeds. Keywords: TuMV, caisin, seeds, RNA, detection, RT-PCR
4
RINGKASAN JATI ADIPUTRA. Evaluasi Tiga Metode Preparasi RNA Total untuk Deteksi TuMV pada Benih Brassica sp. dengan Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Dibimbing oleh SRI HENDRASTUTI HIDAYAT dan TRI ASMIRA DAMAYANTI. Turnip mosaic virus (TuMV; Potyvirus) merupakan jenis virus terpenting kedua yang menyerang pertanaman sayur-sayuran, terutama dari marga Brassica. Virus ini terbawa benih, sehingga berpotensi untuk masuk ke wilayah Indonesia melalui benih impor. Berdasarkan Kepmentan no.38 tahun 2006 TuMV masih tergolong OPTK A1 dan harus dicegah pemasukkannya ke dalam wilayah Indonesia. Oleh karena itu perlu dilakukan upaya deteksi TuMV pada benih menggunakan metode dengan tingkat keberhasilan yang baik. RT-PCR telah dikenal memiliki sensitivitas yang lebih baik dibanding ELISA, namun keberhasilan RT-PCR untuk mendeteksi virus tanaman ditentukan oleh metode ekstraksi RNA yang tepat. Oleh karena itu perlu dilakukan evaluasi untuk menentukan metode ekstraksi yang tepat untuk mendeteksi TuMV pada benih Brassica sp. Sampel yang digunakan adalah benih caisin (Brassica rappa L cv. group caisin) yang terinfeksi TuMV di lapang. Ekstraksi RNA dilakukan pada benih, serta kecambah umur 3, 5 dan 7 hari dengan tiga metode ekstraksi RNA yang berbeda, yaitu: Willey, Randles, dan RNeasy plant mini kit. RNA hasil ekstraksi diukur konsentrasi dan kemurniannya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelimbang 260 dan 280 nm. RNA kemudian diubah menjadi cDNA menggunakan enzim M-MuLV reverse transcriptase, lalu cDNA yang dihasilkan diamplifikasi menggunakan duplex PCR dengan primer spesifik TuMV, yaitu TuMV8573F dan TuMV 9385R dengan produk berukuran 800 bp dan primer nad5F dan nad5R sebagai kontol internal. Hasil amplifikasi divisualisasi menggunakan gel agarosa konsentrasi 1,5%. Hasil kuantifikasi RNA menunjukkan bahwa metode Randles memiliki nilai konsentrasi RNA total tertinggi, namun dengan kemurnian terendah. Sebaliknya metode RNeasy memiliki konsentrasi terendah namun dengan kemurnian yang cukup baik. Deteksi TuMV pada benih menunjukkan hasil positif untuk RNA total yang dideteksi menggunakan metode Willey dengan tingkat keberhasilan yang lebih baik dari Randles, sedangkan metode RNeasy tidak dapat mendeteksi TuMV pada benih. Pada kecambah 3 hari TuMV berhasil terdeteksi menggunakan ketiga metode ekstraksi. Pada kecambah 5 hari hanya RNA yang diekstrak menggunakan metode Randles yang mampu mendeteksi TuMV. Sedangkan pada kecambah berumur 7 hari TuMV tidak berhasil terdeteksi dengan tiga metode ekstraksi RNA tersebut. Kesimpulan dari penelitian ini adalah metode ekstraksi RNA total yang dikembangkan oleh Willey merupakan metode dengan tingkat keberhasilan terbaik untuk mendeteksi TuMV dari benih dan kecambah. Duplex PCR menggunakan primer TuMV dan primer nad5 dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan TuMV dan RNA total jaringan tanaman. Kata kunci : RNA, TuMV, caisin, benih, deteksi, RT-PCR
5
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2009 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
6
EVALUASI TIGA METODE PREPARASI RNA TOTAL UNTUK DETEKSI Turnip mosaic virus PADA BENIH Brassica sp. DENGAN REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION
JATI ADIPUTRA
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Entomologi/Fitopatologi
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
7
Penguji luar komisi pada ujian tesis : Dr. Ir. Eliza S. Rusli, M.Si.
8
9
PRAKATA
Bismillahi rohmaani rohiim. Alhamdulillahi robbil’alamin. Segala puji dan syukur kepada Allah SWT atas limpahan rahmat dan hidayah-Nya kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan penulisan tesis yang berjudul “Evaluasi tiga metode preparasi RNA total untuk deteksi TuMV pada benih Brassica sp. dengan reverse transcription polymerase chain reaction”. Salawat dan salam tercurah kepada Rasullulah SAW, keluarga, para sahabat, dan para pengikutnya. Penulis menyampaikan rasa terima kasih yang tidak terhingga kepada Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat, MSc. dan Dr. Ir. Tri Asmira Damayanti M.Agr. atas bimbingan, kesabaran, pengkayaan wawasan, saran, kritik dan dukungan moril yang sangat besar peranannya dalam penyelesaian penulisan tesis ini. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Ir. Syukur Iwantoro, MS, MBA. atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti program magister di IPB, serta Dr. Ir. Catur Putra Budiman MSc. atas dukungannya terhadap penulis selama mengikuti Sekolah Pasca Sarjana ini. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Dr. Ir. Eliza S. Rusli, M.Si yang bersedia menjadi Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis. Rasa hormat yang setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada kedua orang tua tercinta, ayahanda Parali Setiadi, ibunda Sri Lestari dan kakak-kakakku tercinta mas Dodit (Alm.), mas Bimo, mas Danar, mas Kikit, dan mas Neri yang telah mencurahkan kasih sayang, doa dan bimbingan. Ucapan terima kasih yang tidak terhingga juga penulis ucapkan kepada istri terkasih Primadani Kuliahsari atas kesabaran, kasih sayang dan dukungannya. Ucapan terima kasih disampaikan pula pada Mertua Bapak Heri Purnomo dan Ibu Puji Ken Rahayu, dan adik-adik ipar tersayang, adik Krisna dan adik Heni atas doa, dorongan semangat dan bantuan moril selama ini. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada rekan-rekan di Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian R. Yudiarto, Rumenda Ginting, Nurjanah, Dwi Sugipriatini, Titi Sumarti, Yani Dawi, Derhani LG, Rahmawati, Ummu Salamah R, Andi Prasetiawan, Dwi Subekti, dan Isti Wulandari atas persahabatan dan kerjasamanya. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada mbak Tuti dari laboratorium Virologi IPB atas bantuannya selama penelitian. Akhir kata penulis haturkan terima kasih kepada semua pihak dan semoga hasil penelitian ini bermanfaat untuk kepentingan umat manusia dan ilmu pengetahuan.
Bogor, 14 Februari 2009 Jati Adiputra
10 RIWAYAT HIDUP Jati Adiputra, SSi. Dilahirkan di Purworejo tanggal 5 Agustus 1976, sebagai anak keenam dari enam bersaudara, pasangan Bapak Parali Setiadi dan Ibu Sri Lestari. Penulis menikah dengan Primadani Kuliahsari pada tahun 2007. Penulis menempuh pendidikan di SMU Charitas, Jakarta, lulus pada tahun 1994. Penulis melanjutkan ke pendidikan tinggi di Universitas Nasional Jakarta, Fakultas Biologi pada tahun 1994 -2001. Pada Tahun 2005 penulis diterima sebagai Tenaga Pengendali Organisme Pengganggu Tumbuhan di Badan Karantina Pertanian. Sejak tahun tersebut penulis bekerja sebagai Tenaga Pengendali Organisme Pengganggu Tumbuhan di Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian, Jakarta. Pada tahun 2007 penulis berkesempatan melanjutkan pendidikan ke Program Magister Sains pada Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor, Program Studi Entomologi dan Fitopatologi. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh dari Badan Karantina Pertanian Departemen Pertanian.
11 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ...........................................................................................
x
DAFTAR GAMBAR .....................................................................................
xi
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................
xii
PENDAHULUAN .........................................................................................
1
Latar Belakang ............................................................................................... Tujuan ............................................................................................................
1 3
TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................
4
Karakteristik Turnip mosaic virus .................................................................. Morfologi dan biologi .......................................................................... Kisaran inang, gejala dan daerah sebar ................................................ Karakteristik caisin (Brassica rappa L cv. group caisin) ............................. Deteksi Virus Tanaman menggunakan RT-PCR ...........................................
4 4 6 7 8
BAHAN DAN METODE ..............................................................................
11
Waktu dan Tempat Penelitian ....................................................................... Bahan Penelitian ........................................................................................... Metode Penelitian ......................................................................................... Penyiapan Bahan ................................................................................. Benih ............................................................................................ Kecambah ..................................................................................... Ekstraksi RNA Total ............................................................................ Metode Willey .............................................................................. Metode Randles ............................................................................ RNeasy plant mini kit (Qiagen, Germany) .................................. Kuantifikasi Hasil Ekstraksi RNA......................................................... Sintesis cDNA........................................................................................ Polymerase chain reaction..................................................................... Visualisasi Hasil Amplifikasi ................................................................
11 11 11 11 11 11 12 12 12 12 13 13 14 15
HASIL DAN PEMBAHASAN.......................................................................
16
Hasil................................................................................................................. Kondisi Perkecambahan Benih ............................................................ Kuantitas dan Kemurnian RNA Hasil Ekstraksi .................................. Duplex RT-PCR Menggunakan Kontrol Internal ................................ Deteksi TuMV pada Benih Caisin secara RT-PCR............................... Pembahasan......................................................................................................
16 16 16 18 20 21
SIMPULAN DAN SARAN.............................................................................
26
Simpulan................................................................................................ 26 Saran....................................................................................................... 26 DAFTAR PUSTAKA .....................................................................................
27
12
DAFTAR TABEL
Halaman
1 2 3
Konsentrasi (µg/ml) dan kemurnian RNA total caisin diukur menggunakan spektrofotometer..................................................
17
Konsentrasi (µg/ml) dan kemurnian RNA total benih millet diukur menggunakan spektrofotometer .....................................
18
Rekapitulasi hasil menggunakan tiga
21
deteksi metode
TuMV pada benih caisin ekstraksi yang berbeda........
13
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Diagram genom TuMV.................................................................
4
2
Posisi primer TuMV 8573F dan TuMV 9385R pada bagian gen NIb dan gen selubung protein (CP) ............................................
14
Skema lokasi primer kontrol internal dalam gen nad5 pada mitokondria .................................................................................
15
4
Pertumbuhan kecambah caisin ....................................................
16
5
Visualisasi hasil deteksi TuMV pada benih caisin menggunakan tiga metode ekstraksi RNA yang berbeda ..........
19
Hasil amplifikasi kontrol internal menggunakan primer nad5F dan nad5R pada kecambah millet berumur 3 hari dengan tiga metode ekstraksi RNA ................................................................
20
3
6
14
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
2
Data kemurnian dan konsentrasi (µg/ml) masing-masing metode ektraksi RNA pada stadia perkembangan benih caisin yang berbeda ..............................................................................
31
Data kemurnian dan konsentrasi (µg/ml) masing-masing metode ektraksi RNA pada stadia perkembangan benih millet yang berbeda ..............................................................................
32
