Isomerisasi Linoleat dalam Minyak Jarak Hasil Dehidrasi Menjadi Linoleat Terkonjugasi dan Pemisahannya dengan Kromatografi Kolom Fasa Diam Silika Gel yang Diimpregnasi Perak Nitrat Marham Sitorus1,2), Sanusi Ibrahim3), Hazli Nurdin3) dan Djaswir Darwis3) 1) Program S3 Ilmu Kimia PPs UNAND Kampus Limau Manis Padang 2) Jurusan Kimia FMIPA UNIMED Jl. William Iskandar Medan 3) Jurusan Kimia FMIPA UNAND Kampus Limau Manis Padang e-mail:
[email protected] Diterima 6 September 2010, diterima untuk dipublikasikan 23 Maret 2011 Abstrak Minyak jarak hasil dehidrasi (DCO = Dehydrated Castor Oil) mengandung dua komponen utama yaitu linoleat dan asam linoleat terkonjugasi (CLA = conjugated linoleic acid) dalam bentuk trigliserida. Penelitian ini bertujuan menentukan metode isomerisasi yang sesuai untuk mengisomerisasi asam linoleat dalam DCO menjadi CLA. Metode isomerisasi harus kemoselektif untuk mencegah reaksi penyabunan dan transesterifikasi. Metode isomerisasi yang dilakukan adalah : dengan KOH 2 M pelarut n-butanol, KOH 1%(w/v) tanpa pelarut dan pengaruh microwave dengan inisiator Iodium. Selanjutnya dilakukan pemisahan CLA dengan kromatografi kolom silika gel yang diimpregnasi perak nitrat. Pemisahan didasarkan pada perbedaan sifat reversibel ikatan koordinasi antara ion perak dengan ikatan rangkap komponen yang dipisahkan. Sifat reversibel ikatan koordinasi sebanding dengan jumlah ikatan rangkap dan jumlah isomer dengan geometri trans. Elusi dilakukan secara bergradien dengan variasi perbandingan pelarut heksan : aseton adalah: 97,5 : 2,5; 95 : 5; 90 : 10; 80 : 20; 70 : 30 dan 60 : 40 (v/v) dengan masing – masing fraksi ditampung sebanyak 8 x 5 mL. Sampel tiap fraksi dianalisis dengan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan pendeteksi noda menggunakan lampu UV. Hasil isomerisasi dan pemisahan dianalisis dengan GC, FTIR, UV dan GC-MS yang dibandingkan dengan data standar. Metode isomerisasi paling sesuai adalah dengan pengaruh microwave dengan inisiator Iodium dengan kenaikan kadar CLA sebesar 1,97%. Pemisahan paling optimal adalah dengan perbandingan pelarut heksan : aseton = 95 : 5 (v/v). Komposisi hasil pemisahan adalah: 0,91% (9c–2c) linoleat; 43,59% (9c/t–12t/c) linoleat; 18,58% (9c/t–1t/c) CLA; 3,46% (9t–11t) linoleat; 19,19%(9t– 1t) CLA dan 0,86% risinoleat. Perbandingan CLA : linoleat yang dihasilkan adalah 0,77 : 1 atau 70,32 % dibanding standar dengan perbandingan 1,45 : 1. Kata kunci: Isomerisasi, Linoleat, CLA, Dan silika gel yang diimpregnasi AgNO3 Abstract The main component of dehydrated castor oil (DCO) is linoleic and conjugated linoleic acid (CLA) as triglyseride forms. This research aim is to find out suitable method for linoleic isomerization of DCO into CLA. Isomerization method must be made chemoselective in order to prevent safonification and transesterification. Isomerization method with 2M NaOH in n-butanol, 1% KOH (w/v) without solvent and irradiated by microwave with iodine as an initiator were tested respectively. CLA was seperated by using column chromatography that AgNO3 impregnated silica gel as a stationary phase. Seperation was based on the differences of coordination bond strenght between the double bond and silver ion. It’s the more unsaturation and trans isomer the more srongly the molecule is retained. Gradient elution was carried out by various ratio of hexane and acetone (v/v) e. g : 97.5 : 2.5, 95 : 5, 90 : 10, 80 : 20, 70 : 30 and 60: 40 with 8 x 5 mL. Each of fraction was analyzed by using TLC and the spot detection was made by UV lamp. The results was analyzed by using GC, FTIR, UV and GC – MS and It’s compared with the standard data. The best isomerization was conducted by microwave irradiated using iodine as an initiator with a conversion factor of 1.97 %. Seperation of CLA could be made by column chromatography that AgNO3 impregnated silica gel as a stationary phase. The best result was conducted by eluting with 95: 5 (v/v) of hexaneacetone. The compositions of seperated were: 0,91% (9c–2c) linoleic, 43.59% (9c/t–12t/c) linoleic, 18.58% (9c/t– 1t/c)CLA, 3.46% (9t–11t) linoleic, 19.19%(9t– 1t) CLA and 0.86% ricinoleic. The ratio of CLA : linoleic prepared was 0.77 : 1 or 70, 32 % compared to the standar with the proportions of 1.45:1. Keywords: Isomerization, linoleic acid, CLA, And AgNO3 impregnated silica gel bawah pengaruh gelombang mikro (microwave) (Babby, 1997 dan Zucco, 1997). Katalis basa cocok untuk mengisomerisasi ikatan rangkap pada senyawa fenil propanoid yang mengandung gugus fenol (Peterson et al., 1993), namun tidak cocokuntuk
1. Pendahuluan Reaksi isomerisasi terhadap ikatan rangkap umumnya dikatalisis oleh basa kuat seperti KOH atau NaOH dalam metanol. Selain dengan basa kuat isomerisasi juga dapat berlangsung dengan baik di 1
2
JURNAL MATEMATIKA DAN SAINS, APRIL 2011, VOL. 16 NOMOR 1
mengisomerisasi linoleat, karena akan menyebabkan reaksi penyabunan dan transesterifikasi (Bernas et al., 2003 dan Villenueve et al., 2005). Secara spesifik isomerisasi linoleat yang telah dilakukan antara lain adalah fotoisomerisasi linoleat dalam minyak kedelai, namun konversinya sangat rendah yaitu maksimal 0,5 % (Gangidi dan Proctor, 2004). Isomerisasi linoleat dengan katalis Wilkinson suatu kompleks rutenium juga dapat berlangsung baik namun permasalahannya adalah sulit mendapatkan katalis tersebut dan berharga sangat mahal serta tidak tersedia sebagai stok, karena baru disintesis bila akan digunakan (Villenueve et al., 2005). Penelitian ini bertujuan menentukan metode yang cocok untuk mengisomerisasi linoleat dalam minyak jarak hasil dehidrasi (DCO = dehidrated castor oil) menjadi linoleat terkonjugasi (CLA = conjugated linoleic acid). Bahan DCO yang digunakan adalah hasil dehidrasi risinoleat minyak jarak dengan katalis P2O5 dengan komponen utama campuran linoleat dan CLA (Sitorus et al., 2009). Senyawa CLA lebih bermanfaat dibanding dengan linoleat karena bioaktivitasnya yang lebih luas (Villenueve et al., 2005), sehingga isomarisasi linoleat dalam DCO menjadi CLA akan menaikkan nilai ekonomi DCO secara khusus dan minyak jarak secara umum. Dalam penelitian ini dikaji tiga cara untuk mengisomerisasi linoleat dalam DCO menjadi CLA yaitu dengan: 1. KOH dalam n-butanol, 2. KOH tanpa pelarut dan 3. pengaruh gelombang mikro (microwave) dengan inisiator Iodium. Isomerisasi dengan cara 1 dan 2 adalah merupakan modifikasi isomerisasi menggunakan katalis KOH atau NaOH dalam metanol yang bertujuan untuk meminimalisasi reaksi penyabunan dan transesterifikasi, karena nbutanol yang lebih non polar dibanding metanol tidak membentuk alkoksida dengan KOH. Selanjutnya isomerisasi dengan cara 3 didasarkan pada fotoisomerisasi linoleat dalam minyak kedelai (Gangidi dan Proctor, 2004), karena gelombang mikro adalah merupakan suatu foton atau cahaya. Energi gelombang mikro lebih besar dibanding cahaya maka akan lebih efektif untuk isomerisasi. Isomerisasi safrol dan egnenol dengan gelombang mikro menjadi isosafrol dan isoeugenol (Babby, 1997 dan Zucco, 1997) juga merupakan pedoman mengaplikasikan cara ini untuk isomerisasi linoleat. Selanjutnya tahapan penting dalam suatu sintesa adalah pemurnian atau pemisahan senyawa target. Pemisahan komponen lemak atau minyak konsumsi (edible oil) hasil isolasi tidak lazim dilakukan, karena pada umumnya semua komponennya dapat dikonsumsi. Senyawa CLA yang dihasilkan dalam penelitian ini adalah hasil sintesa dari minyak jarak yang tidak dikonsumsi (non edible oil), sehingga perlu dilakukan pemisahan senyawa target, khususnya dari komponen yang tidak dikonsumsi. Berbeberapa hasil penelitian melaporkan bahwa CLA dapat terpisah dengan baik
bila dianalisis dengan GC dan GC – MS dengan kolom kapiler baik fasa normal maupun fasa terbalik (Dobson, 1998, Sehat et al., 1998, Cristie et al., 2000, dan Ozgul, 2005). Pemisahan juga cukup baik bila CLA dianalisis dengan Ag+ HPLC dengan fasa normal atau fasa terbalik dengan merangkai minimal tiga kolom (Yuruwesz dan Morehouse, 2001, Adolft et al., 2002, Vereshhchagin dan Pchelkin, 2003 dan Cristie et al., 2007). Alat GC dan GC – MS adalah untuk analisis melalui cara derivatisasi, sehingga tidak dapat digunakan untuk mendapatkan senyawa CLA dalam bentuk trigliserida. Alat HPLC adalah preparatif namun hanya dalam skala relatif kecil dan harga peralatannya relatif mahal. Pemisahan CLA juga dapat dilakukan dengan teknik fraksinasi solven, namun pelarut dan disain reaktornya juga relatif mahal (Uehara et al,. 2006). Pemisahan secara kromatografi kolom dengan fasa diam silikagel dan alumina tidak cocok, karena komponen CLA mempunyai sifat fisika dan kimia yang berdekatan, padahal kedua sifat ini adalah dasar pemisahan dengan kromatografi kolom (Cristie et al., 2007). Berdasarkan paparan di atas, maka pemisahan CLA hasil isomerisasi pada penelitian ini dilakukan dengan kromatografi kolom yang dimodifikasi yaitu dengan mengimpregnasi fasa diam silika gel dengan perak nitrat. Pemisahan didasarkan pada fenomena terjadinya ikatan koordinasi yang dapat balik (revesibel) antara ikatan rangkap komponen yang akan dipisahkan dengan ion perak melalui kompleks EDA (electron donor acceptor). Kekuatan reversibilitas ikatan rangkap dengan ion perak sebanding dengan jumlah ikatan rangkap dan isomer dengan geometri trans, sehingga waktu elusi tiap komponen akan berbeda (Neff et al., 1999, Damyonova, 2006, dan Cristie et al., 2007). Metode elusi dilakukan secara bergradien dengan campuran pelarut heksana dan aseton yang didasarkan pada pemisahan GLA (gamma linoleic acid) dari EPO (evening primrose oil) dan berbagai biji – bijian (Guel – Guero et al., 1999 dan Rincon et al., 2009). Pemisahan dipandu dengan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan deteksi noda menggunakan lampu ultra violet (UV). Penetapan hasil terbaik dilakukan berdasarkan data analisis dengan GC dan identifikasi dengan alat FTIR,UV dan CC - MS yang dibandingkan data standar. 2. Metodologi 2.1 Bahan dan Peralatan Bahan kimia yang digunakan dengan kualifikasi pa adalah: minyak jarak hasil dehidrasi (DCO) dari penelitian terdahulu (Sitorus et al, 2009), KOH, n-butanol, Iodium, etanol, silka gel 60G, AgNO3, heksana, aseton, plat KLT, akuades dan Na2SO4 anhidrus. Peralatan yang digunakan adalah: peralatan gelas, botol sampel (vial), timbangan digital AND GR 2000, evaporator Heidolph VV 2000, alat refluks, hot plate yang dilengkapi dengan pengatur suhu dan magnetig styrer, pompa vacuum KRISBOW
Sitorus, dkk., Isomerisasi Linoleat dalam Minyak Jarak Hasil Dehidrasi Menjadi Linoleat Terkonjugasi .............. 3 yang dilengkapi dengan manometer U, tabung berisi serbuk magnesium dan tabung berisi silika gel pink, tabung gas Nitrogen yang dilengkapi dengan regulator, alat GC HP 5890, Spektrofotometer FTIR SHIMADZU, UV SIMADZU, alat GC-MS SIMADZU QP2010S, kolom kromatografi panjang 30 cm dengan diameter 2,5 cm, lampu UV SPECTROLINE, oven pengering MEMMERT dan oven microwave TEKNOWELL.
noda menggunakan lampu UV untuk melihat kemiripan pola noda dengan standar. Hasil terbaik ditentukan berdasarkan analisis GC sampel yang dibuat data KLTnya. Identifikasi hasil pemisahan terbaik dianalisis denga alat, FTIR, UV dan GC – MS yang dibandingkan dengan data standar.
2.2 Isomeisasi Linoleat Dalam DCO Menjadi CLA
Minyak jarak hasil dehidrasi (DCO = dehydrated castor oil) yang digunakan adalah hasil dehidrasi risinoleat minyak jarak dengan P2O5 (Sitorus et al., 2009). Komponen utama DCO adalah linoleat dan asam linoleat terkonjugasi (CLA = conjugated linoleic acid). Tujuan penelitian ini adalah mengisomerisasi linoleat menjadi CLA yang mempunyai bioaktivitas lebih luas, sehingga bernilai ekonomi lebih tinggi (Vellenueve et al., 2005). Linoleat mempunyai dua ikatan rangkap terisolasi yaitu pada C9 dan C12, sehingga diisomerisasi akan terbentuk dua jenis produk yang ikatan rangkapnya terkonjugasi yaitu C9 - C11 melalui pergeseran ikatan rangkap dari C12 ke C11 dan C10 – C12 melalui pergeseran ikatan rangkap dari C9 ke C10. Katalis basa KOH atau NaOH dalam metanol yang umum digunakan untuk isomerisasi tidak dapat diaplikasikan terhadap linoleat karena akan terjadi penyabunan dan transesterifikasi (Bernas et al., 2003 dan Villenueve et al., 2005). Isomerisasi KOH dengan pelarut n-butanol dan tanpa pelarut dimaksudkan untuk mencegah kedua reaksi tersebut. Penyabunan dan transesterifikasi tidak terjadi karena KOH tidak membentuk alkoksida dengan nbutoksida. Fungsi KOH adalah mengaktifkan hidrogen pada C10 untuk selanjutnya menggeser posisi ikatan rangkap dari C9 ke C10 membentuk CLA C10 - C12 atau dari C12 ke C11 membentuk CLA C9 – C11. Aliran gas nitrogen melalui serbuk Mg adalah untuk mencegah terjadinya oksidasi ikatan rangkap pada lemak, sedangkan pengurangan tekanan melalui tabung silika gel pink adalah membuatreaktor bebas air. Penambahan Iodium 0,1% (w/v) pada isomerisasi dengan pengaruh microwave adalah sebagai inisiator karena reaksi isomerisasi adalah melalui mekanisme radikal bebas jenis reaksi perisiklik tipe sigmatropik melalui pergeseran hidrogen [1,3] (Babby, 1997 dan Zucco, 1997). Hasil isomerisasi ketiga cara tersebut dianalisis dengan GC untuk menentukan metode yang paling cocok yaitu berdasarkan besarnya peningkatan kadar CLA yaitu dengan dengan peningkatan kadar CLA tertinggi. Analisis dilakukan dengan alat GC SIMADZU QP2010S (Rastek Rxi5MS 30 m ID 0,25 mm,gas pembawa He, suhu kolom : 90 – 290oC, suhu awal 3 menit 10oC/menit, detektor FID, suhu detektor 250oC, suhu injektor 300oC, total flow: 80 mL/menit dan split 153 Kpa ). Kromatogram CLA standar, DCO sebelum isomerisasi dan hasil isomerisasi dengan ketiga metode yang dilakukan adalah pada Gambar 1 berikut ini.
Isomerisasi dilakukan terhadap 25 mL (24,0075 g) DCO dengan tiga cara yaitu: [1]. 50 mL KOH 2 M dalam n-butanol, [2]. KOH (1 % w/v) terhadap DCO, dan [3]. pengaruh gelombang mikro (microwave). Cara [1] dan [2] direfluks pada suhu titik didih sekitar 200oC selama 2 jam sambil diaduk dengan magnetig styrer dengan aliran gas Nitrogen dan tekanan 50 – 70 mmHg menggunakan pompa vacuum melalui silka gel pink. Isomerisasi dengan cara [3] dilakukan dengan memasukan DCO dan 0,1% (w/v) inisiator Iodium dalam gelas kimia Pirex. Selanjutnya diletakkan pada pengaruh microwave dengan selama 30 menit. Setiap hasil isomerisasi diekstrak dengan heksana dan dikeringkan dengan Na2SO4 anhidrus kemudian dianalis dengan GC dalam bentuk metil ester asam lemak. Cara isomerisasi terbaik ditentukan berdasarkan analisis data GC dan identifikasi hasil terbaik dilakukan dengan FTIR dan GC - MS yang dibandingkan dengan data standar. 2.3 Pemurnian CLA dengan Kromatografi Kolom Terimpregnasi Perak Nitrat Sebanyak 20g silika gel 60G ditambahkan ke dalam 50 mL etanol untuk membentuk bubur silika gel. Di tempat lain dibuat 1 g AgNO3 dalam 50 mL etanol dan diaduk dengan pengaduk magnet. Selanjutnya larutan perak nitrat dicampurkan dengan bubur silika gel dan diaduk sekitar 10 menit. Etanol diuapkan dengan rotary evavorator vacuum (50oC) dan silika gel terimpregnasi diperoleh dengan pemanasan dalam oven pada suhu 105oC selama 2 jam. Kolom disiapkan dengan melarutkan silika gel terimpregnasi perak nitrat dengan pelarut n-heksana hingga menjadi bubur. Selanjutnya bubur dimasukkan kedalam kolom dengan diameter 2,5 cm dan tinggi 30 cm hingga kolom bebas gelembung udara. Kolom dibiarkan selama satu malam dengan pelarut sekitar 2 cm di atas fasa diam dengan menutup keran bagian bawah dan bagian atas untuk menghindari kekeringan. Sebanyak 2,5 mL sampel yang akan dipisahkan dimasukkan kedalam kolom dan dilakukan elusi bergradien dengan pelarut heksana dan aseton. Kepolaran pelarut dinaikkan dengan menambah jumlah aseton dengan variasi perbandingan heksana : aseton adalah: 97,5 : 2,5; 95 : 5; 90 : 10; 80 : 20; 70 : 30 dan 60 : 40 (v/v) dengan masing masing fraksi ditampung sebanyak 8 x 5 mL. Sampling tiap fraksi di KLT dengan pengungkapan
3. Hasil dan Pembahasan 3.1 Isomerisasi Linoleat Dalam DCO Menjadi CLA
4
JURNAL MATEMATIKA DAN SAINS, APRIL 2011, VOL. 16 NOMOR 1
6
5
8 7 12
34
9 10
Gambar 1a. Kromatogram linoleat terkonjugasi (CLA = conjugated linoleic acid) standar 7
6
12
9
8 1113 10 1
2
34
14
Gambar 1b. Kromatogram minyak jarak hasil dehidrasi (DCO = dehydrated castor oil) sebelum dehidrasi
Sitorus, dkk., Isomerisasi Linoleat dalam Minyak Jarak Hasil Dehidrasi Menjadi Linoleat Terkonjugasi .............. 5 1 (pelarut)
2 3
45
Gambar 1c. Kromatogram hasil isomerisasi linoleat dalam DCO menjadi CLA dengan NaOH dalam n-butanol
7
6
12
9
8 1
11 13 2
345
10
14
Gambar 1d. Kromatogram hasil isomerisasi linoleat dalam DCO menjadi CLA dengan pengaruh microwave inisiator Iodium
6
JURNAL MATEMATIKA DAN SAINS, APRIL 2011, VOL. 16 NOMOR 1
1 (pelarut)
7
6
12
9 8 2 5
34
10 11
13
Gambar 1e. Kromatogram hasil isomerisasi linoleat dalam DCO menjadi CLA dengan NaOH tanpa pelarut Hasil analisis terhadap kromatorgram pada Gambar 1 yang dibandingkan dengan data standar maka diidentifikasi 7 komponen penyusun yaitu : 1. linoleat (9c-12c), 2. linoleat (9c/t-12t/c), 3. stearat, 4. CLA (9c/t11t/c), 5. linoleat (9t-11t), 6. CLA (9t-11t) dan 7. sisa risinoleat dengan komposisi seperti pada Tabel 1. Tabel 1. Komposisi standar CLA, DCO sebelum isomerisasi, hasil isomerisasi dengan KOH dalam n-butanol, isomerisasi dengan KOH tanpa pelarut dan isimerisasi pengaruh mirowave dengan inisiator Iodium Komponena Standar CLA
Linoleat (9c – 12c) Linoleat (9c/t -11t/c) Stearat (C18:0) CLA (9c/t – 11t/c) 5.Linoleat (9t – 11t) CLA (9t – 11t) Risinoleat
0,72 [3/10,037] 39,38 [5/10,556] ta 43,41 [6/10,658] 5,21 [7/10,794] 8,90 [8/10,926] ta
DCO Sebelum isomerisasi 12,41 [6/10,032] 39,00 [7/10,108] 4,53 [8/10,031] 12,08 [9/10,51] 3,36 [11/10,776] 19,93 [12/10,925] 0,55 [14/11,962]
Kadar (%)b Isomerisasi dengan KOH dalam n-butanol td 45,84 [2/10,633] td 10,80 [3/11,494] 34,10 [4/11,496] 9,25 [5/11,576] td
Isomerisasi pengaruh microwave inisiator Iodium
Isomerisasi KOH-tanpa pelarut
12,13 [6/9,872] 41,41 [7/9,943] 5,15 [8/10,145] 11,72 [9/10,348] 1,96 [11/10,615] 22,7 [12/10,769] 0,47 [14/11,814]
12,98 [6/10,044] 39,47 [7/10,109] 5,49 [8/10,314]] 11,26 [9/10,522] 2,87 [1/876] 16,19 [12/10,939] 0,41 [13/11,982]
a. penomoran dalam kurung ( ) adalah posisi ikatan rangkap, c adalah cis dan t adalah trans b. relatif terhadap luas puncak yang dikoreksi terhadap pelarut dengan bilangan dalam kurung [ / ] adalah no puncak/waktu retensi dalam menit ta : tidak ada dan td : tidak terdeteksi
Sitorus, dkk., Isomerisasi Linoleat dalam Minyak Jarak Hasil Dehidrasi Menjadi Linoleat Terkonjugasi .............. 7
Senyawa CLA tidak terdapat dalam keadaan murni namun selalu tercampur dengan linoleat. Linoleat dan CLA adalah isomer yang hanya dibedakan ikatan rangkap, sehingga mempunyai sifat fisik yang mirip. Isomer CLA (C10 – C12) tidak dihasilkan pada isomerisasi, sama seperti standar yang secara alami juga jarang diproduksi namun dominan menghasilkan CLA (C9 – C11) (Muller dan Delahoy, 2009). Kadar total linoleat dan total CLA berdasarkan Tabel 1 adalah: [1]. sebelum isomerisasi total linoleat adalah 54,77 % dan total CLA adalah 32,01 % [2]. isomerisasi dengan KOH dalam nbutanol total linoleat adalah 79,94% dan total CLA adalah 20,06% (terjadi penurunan CLA sebesar 11,95%), [3]. isomerisasi pengaruh microwave inisiator Iodium total linoleat adalah 55,49% dan total CLA adalah 33,98% (terjadi kenaikan CLA sebesar 1,97%), dan [4]. isomerisasi dengan KOH tanpa pelarut total linoleat adalah 55,32% dan total CLA adalah 27,45% (terjadi penurunan CLA sebesar 4,56%). Data ini mengindikasikan bahwa dari ketiga cara tersebut yang paling cocok untuk mengisomerisasi linoleat menjadi CLA adalah dengan pengaruh microwave dengan inisiator Iodium. Isomerisasi dengan pengaruh microwave juga lebih baik dibandingkan dengan cara fotoisomerisasi dengan peningkatan kadar CLA maksimum 0,5 % (Gangidi dan Proctor, 2004). Reaksi isomerisasi pengaruh microwave adalah jenis reaksi perisiklik dengan mekanisme radikal bebas melalui pergeseran sigmatropik (sigmatropic rearragement) hidrogen [1,3]. Atom yang berpindah adalah radikal hidrogen dari suatu atom karbon dari posisi satu ke atom karbon posisi tiga. Fungsi microwave adalah sebagai sumber energi untuk merobah Iodium sebagai inisiator radikal bebas yang selanjutnya akan menarik radikal hidrogen dari posisi 1 untuk dipindahkan ke posisi 3 (Baby, 1997 dan Zucco, 1997). Isomer CLA (C9 – C11) lebih stabil dibanding (C10 – C12) karena posisinya lebih simetri. Hal inilah diperkirakan yang menyebabkan produk yang terbentuk hanya isomer CLA (C9 – C11). Hasil isomerisasi linoleat dengan KOH dalam n–butanol dan KOH tanpa pelarut tidak meningkatkan kadar CLA yang mengindikasihan bahwa KOH tidak cocok diaplikasikan untuk isomerisasi walapun telah dilakukan modifikasi yaitu mengganti metanol dengan pelarut n-butanol yang lebih non polar dan tanpa menggunakan pelarut. 3.2 Pemisahan CLA Hasil Isomerisasi dengan Kromatografi Kolom Fasa Diam Silikagel yang Diimpregnasi dengan Perak Nitrat Komponen lemak konsumsi tidak lazim dipisahkan, karena pada umumnya semua komponennya adalah esensial. Senyawa CLA yang dihasilkan dalam penelitian ini adalah hasil sintesis dari risinoleat minyak jarak (castor oi)l, maka perlu dilakukan pemurnian. Tujuan dari pemurnian adalah
untuk memisahkan komponen – komponen yang tidak esensial khususnya sisa risinoleat. Sifat fisik CLA dengan komponen yang dipisahkan sangat berdekatan maka pemurnian dengan kromatografi kolom fasa diam silika gel atau alumina tidak dapat diaplikasikan. Metode yang digunakan adalah kromatografi kolom fasa diam silikagel yang diimpregnasi dengan perak nitrat. Ion perak (Ag+) dapat membentuk ikatan koordinasi yang reversibel dengan ikatan rangkap pada komponen yang akan dipisahkan melalui kompleks EDA = electron donor acceptor yang kekuatan ikatannya sebanding dengan kenaikan jumlah ikatan rangkap dan jumlah isomer trans(Damyanova, 2010). Elusi bergradien dilkukan dengan menaikan jumlah aseton untuk meningkatkan kepolaran. Perbandingan eluen heksana dan aseton yang digunakan adalah : 97,5 : 2,5; 95 : 5; 90 : 10; 80 : 20; 70 : 30, dan 60 : 40 (v/v). Fraksi tiap perbandingan pelarut ditampung sebanyak 8 x 5 mL dan dianalisis dengan KLT dengan pengungkapan noda menggunakan lampu UV. Analisis KLT adalah untuk melihat kesamaan pola noda dengan standar, bukan untuk melihat pemisahan noda karena fasa diam adalah silika gel. Sampel tiap fraksi perbandingan pelarut yang pola KLTnya sama dianalisis dengan GC untuk menentukan kadar sisa risinoleat dan kadar total linoleat dan CLA dengan komposisi seperti Tabel 2. Tabel 2. Komposisi sisa risinoleat dan total linoleat dan CLA hasil pemurnian dengan kromatografi kolom silikagel yang diimpregnasi dengan perak nitrat Perbandingan eluen heksana : aseton (v/v)a CLA hasil
Kadar (%)b Risinoleat Linoleat dan CLA 0,47 89,37
isomerisasi
0,34
89,82
95 : 5
1,33
25,88
90 : 10
5,08
9,22
80 : 20
78,89
6,77
70 : 30
8,6
14,30
60 : 40 a. perbandingan heksana : aseton (97,5 : 2,5) tidak dibuat data GC karena tidak memunculkan noda pada KLT b. relatif terhadap luasan puncak Berdasarkan data pada Tabel 2 maka pemisahan CLA terbaik adalah dengan perbandingan eluen heksan : aseton adalah 95: 5 (v/v) dengan sisa risinoleat terendah yaitu 0,34 % dan kadar linoleat
8
JURNAL MATEMATIKA DAN SAINS, APRIL 2011, VOL. 16 NOMOR 1
dan CLA tertinggi yaitu sebesar 89,82%. Pada perbandingan eluen selanjutnya maka kadar risinoleat makin naik dan kadar total linoleat dan CLA makin turun hingga perbandingan heksana : aseton 70 : 30 (v/v). Pada fraksi perbandingan eluen 60 : 40, kadar risinoleat sudah kembali turun dan kadar linoleat naik yang mengindikasikan bahwa elusi sampel sudah hampir selesai. Dari hasil ini disimpulkan bahwa kromatografi kolom dengan fasa diam silikagel yang diimpregnasi perak nitrat dapat digunakan untuk memurnikan CLA hasil sintesis. Hasil yang
diperoleh diharapkan akan lebih optimal dengan penyempurnaan teknik pemurnian dengan variasi campuran eluen polar yang lain seperti asetonitril dan metilen klorida (Cristie et al., 2007) dan penyempurnaan metode impregnasi perak nitrat terhadap fasa diam silikagel(Guel-Guero et al., 1999 dan Rincon et al., 2009). Komposisi CLA hasil pemisahan terbaik yaitu dengan perbandingan eluen heksana : aseton 95 : 5 (v/v) dianalisis dengan GC – MS yang dibandingkan dengan standar dengan kromatogram pada Gambar 2. 3
[a]
[b]
Gambar 2. Kromatogram GS – MS [a]. standar CLA dan [b]. CLA hasil pemurnian dengan perbandingan eluen heksana : aseton 95 : 5 (v/v) Standar CLA tidak ada dalam keadaan murni dan selalu tercampur dengan isomer linoleat. Komposisi CLA hasil pemisahan terbaik (Gambar
2b) yang dibandingkan dengan komposisi standar (Gambar 2a), berdasarkan interpretasi tiap puncak MS adalah pada Tabel 3 berikut.
Sitorus, dkk., Isomerisasi Linoleat dalam Minyak Jarak Hasil Dehidrasi Menjadi Linoleat Terkonjugasi .............. 9 Tabel 3. Komposisi CLA hasil pemisahan dengan perbadingan eluen heksana : aseton = 95: 5(v/v) dan Standar CLA Standar CLA No puncak 1
tr menit 24,731
Kadar (%)a 1,23
2
25,199
31,55
3
25,270
42,80
4
25,483
8,04
5
25,594
16,30
Komponen (9c-12c) linoleat (9c/t-12t/c) linoleat (9c/t-11t/c) CLA (9t-12t) linoleat (9t-11t) CLA
CLA hasil pemisahan perbandingan eluen heksana : aseton = 95 : 5 (v/v) No tr/menit Kadar Komponen puncak (%) 3 24,583 0,91 (9c-12c) linoleat 4 24,781 43,59 (9c/t-12t/c) linoleat 6 25,083 18,58 (9c/t-11t/c) CLA 7 25,949 4,36 (9t-12t) linoleat 8 25,644 19,19 (9t-11t) CLA 12 27,037 0,86 Risinoleatb
a. kadar relatif terhadap luasan puncak b. risinoleat sisa dari isomerisasi linoleat dengan microwave inisiator Iodium
[a] C=C-C=C
Overtone C=O
C=O
C=C-C=C
[b] Ovetone C=O C=O
Gambar 3. Spektra FTIR CLA standar [a], dan spektra FTIR hasil pemisahan dengan perbandingan eluen heksana : aseton 95 : 5 (v/v)
10
JURNAL MATEMATIKA DAN SAINS, APRIL 2011, VOL. 16 NOMOR 1
Berdasarkan hasil perhitungan dari Tabel 1 maka untuk standar perbandingan kadar total CLA : linoleat adalah 1,45 : 1 (CLA = 59,18%), sedangkan untuk hasil pemisahan (Tabel 3) adalah 0,77 : 1 (CLA = 41,62%) maka hasil pemisahan adalah 70,32% dibandingkan dengan standar. Selanjutnya CLA hasil pemisahan direkam spektra FTIR untuk memverifikasi kesamaan pola pita serapan gugus fungsional dengan standar yang spektranya pada Gambar 3. Secara spesifik persamaan spektra adalah serapan alkena terkonjugasi (C=C-C=C) yaitu dengan munculnya serapan ganda yaitu 1851,07 cm-1 dan 1612,49 cm-1 untuk standar (Gambar 3a) dan 1658,78 cm-1 dan 1558 cm-1 untuk hasil pemisahan (Gambar 3b). Pita serapan 3464,15 cm-1 (Gambar 3a) dan 3448,72 cm-1 (Gambar 3b) masing – masing adalah penguatan (overtone) dari serapan gugus karbonil (C=O). Hasil verifikasi menunjukkan kesamaan pola spektra FTIR yang mengindikasikan bahwa keduanya mengandung senyawa sama yaitu CLA. Data pendukung lain untuk verifikasi kesamaan gugus fungsional antara standar dan hasil pemisahan adalah perekaman spektra UV dengan spektra pada Gambar 4. Ikatan rangkap terkonjugasi (C=C – C = C) adalah suatu gugus kromofor yang menyerap cahaya UV dengan panjang gelombang yang menyebabkan serapan maksimum (λmaks) adalah 233 nm untuk standar (Gambar 4a) dan 231 nm untuk hasil pemisahan (Gambar 4b). Harga λmaks yang relatif sama ini juga mengindikasikan bahwa keduanya mengandung komponen yang sama yaitu CLA. (λmaks)
[a]
(λmaks)
[b]
Gambar 4. Spektra UV standar CLA [a] dan hasil pemisahan dengan perbandingan eluen heksana : aseton 95 : 5 (v/v) [b]
4. Kesimpulan Metode isomerisasi linoleat dalam DCO menjadi CLA paling sesuai adalah dengan pengaruh microwave dengan Iodium sebagai inisiator dengan konversi sebesar 1,97 %. Pemisahan CLA hasil sintesis dapat dilakukan dengan kromatografi kolom dengan silika gel yang diimpregnasi perak nitrat sebagai fasa diam. Pemisahan terbaik adalah dengan perbandingan eluen heksan : aseton 95 : 5 (v/v). Komposisi hasil pemisahan adalah: 0,91% (9c – 12c) linoleat, 43,59% (9c/t – 12t/c) linoleat, 18,58% (9c/t – 11t/c) CLA, 3,46% (9t – 11t) linoleat, 19,19% (9t – 11t) CLA dan 0,86% sisa risinoleat. Perbandingan CLA : linoleat yang dihasilkan adalah 0,77 : 1 atau 70,32 % dibanding standar CLA dengan perbandingan 1,45 : 1. 5. Ucapan Terima Kasih Terimakasih disampaikan kepada BBPS DIKTI sebagai sponsor untuk studi S3 Ilmu Kimia di PPs UNAND Padang dan DP2M DIKTI yang membantu dana penelitian untuk Disertasi melalui Hibah Doktor Tahun 2010. Terima kasih juga disampaikan pada Bapak Drs. Manius Sianipar Kepala Laboratorium Sinar Oleo Chemical Indonesia (SOCI) Medan yang membantu analisis GC dan DR. Tutik Dwi Wahyuningsih, M.Si Kepala Laboratorium Kimia Organik FMIPA UGM yang membantu fasilitas analisis dengan spektroskopi FTIR , UV dan alat GC – MS. Daftar Pustaka Adolf, R. O, A. Menzel, and V. D. Taran, 2002, Analysis of Conjugated Linolec Acid Enriched Triacylglycerol Mixture by Isocratic Silver – Ion High Performance Liquid Chromatography, J. Chrom. A, 953, 293 – 297. Baby, C., 1997, Microwave Isomerization of Safrol And Eugenol, Synth. Com., 27:24, 4335 – 4340. Bernas, A., N. Kumar, P. Maki-Arvela, N. V. Kulko’va, B. Holmbom, T. Salmi, and D. Y. Murzin, 2003, Isomerization of Linoleic Acid over Supported Metal Catalyst, Appl. Catal., 245, 257-275. Cristie, W. W, G. Dopson, and R. O. Adlof, 2007, A Practical Guide to The Isolation, Analysis and Identification of Conjugated Linoleic Acid, Lipids, 42,1073 – 1025. Damyanova, B. N, 2010, Silver Ion Chromatografi And Lipids, http//lipidlibrary.aocs.org/ Silver/bnd_rev/index1.htm, 1, 1 – 7. David, W. L, A. A. Wierzbicki, and C. J. Field, 1999, Preparation of Conjugated Linoleic Acid from Safflower Oil, JAOCS, 75, 137 – 142. Dobson, G, 1998, Identification of Conjugated Linoleic Acid by GC-MS of 4-methyl 1,2,4
Sitorus, dkk., Isomerisasi Linoleat dalam Minyak Jarak Hasil Dehidrasi Menjadi Linoleat Terkonjugasi .............. 11 – triazoline -3,5 – Dione Adducts, JAOCS, 75, 137 – 142. Gangidi, R. R. and A. Proctor, 2004, Photochemical Production of Conjugated Linoleic Acid From Soybean Oil, Lipids, 36:6, 577 - 585. Guil Gurero, J. L, P. C. Madrid, and E. El – Hassan, 2000, γ - Linoleic Acid Purification from Seed Oil Sources by Argentonated Silicagel Chromatograpy Colomn , J. Chrom. A, 694, 381 – 389. Hidekata, U, T. Suganuma, S. Negishi, S. Ueno, and K. Sato, 2006, A Novel Method for Solvent Fractination of Two CLA Isomers, JAOCS, 83, 261 -268. Muller. J, and J. E. Delahoy, 2009, CLA Implications for Animal Production and Human Health: www.das.psu.edu/temdairy, 04, 1-4. Neff, W. E, R. O. Adlof, and M. El-Agaimy, 1999, Silver Ion High – Performance Chromatography of The Triacylglycerols of Crepis alpina Seed Oil, JAOCS, 71:8, 853 – 860. Ozgul, Y. S, 2005, Determination of Conjugated Linoleic Acid Conten of Selected Oil Seeds Grown in Turkey, JAOCS, 82, 893 – 898. Peterson, H. P, J. H. Bryan, and T. A. Keevel, 1993, A Kinetics Study of The Izomerisation of Eugenol, J. Chem. Edu., 70:4, A96 – A98. Rincon, M. A. C, I. R. Garcia, and J. L. Guil-Guerro, 2009, Purification of GLA – Triglycerides from Evening Primrose Oil by Gravimetric
Colomn Chromatography, JAOCS, 86, 605 – 609. Sehat, N, J. K. G. Kramer, M. M. Mossoba, M. P. Yurawecz, J. A. G. Roach, K. Eulitz, K. M. Morehouse, and Y. Ku, 1998, Identification of Conjugated Linoleic Acid Isomers in Cheese by Gas Chromatography , Silver Ion High Performance Liquid Chromatography and Mass Spectral Reconstructed Ion Profiles Camparison of Chromatographic Elution Sequences, Lipids, 33, 963 - 971. Sitorus, M, S. Ibrahim, H. Nurdin, and D. Darwis 2009, Transformation of Ricinoleic of Castor Oil into Linoleic (Omega – 6) and Conjugated Linoleic Acid, Indo. J. Chem., 9:2, 278 – 284. Villeneuve, P, R. Lago, N. Barouh, and B. Barea, 2005, Production of Conjugated Linoleic Acid Isomers by Dehydration and Isomerization of Castor Bean Oil, JAOCS, 82, 261 – 270. Vereshchagin, A. G, and V. P. Pchelkin, 2003, Thin – Layer Chromatography of Coordination Ag+ - Complexes of Plant Diacylglycerols, Russian J. Biorg. Chem., 29:1, 73 – 79. Yuruwecz, M. P, K. M. Morehouse, 2001, Silver-Ion HPLC of Conjugated Linoleic Acid Isomers, Eur. J. Lipid Sci. Tech., 103, 609 -613. Zucco, C, 1997, Isomerization of Safrol and Eugenol Under Microwave Irradiation, Synth. Com., 27:24, 335 – 4340.
