DÉL-ALFÖLDI NEUROBIOLOGIAI TUDÁSKÖZPONT

DNT DÉL-ALFÖLDI NEUROBIOLÓGIAI TUDÁSKÖZPONT

TERÁPIÁS CÉLÚ IDEGRENDSZERI KUTATÁSOK A MOLEKULÁTÓL AZ INTEGRÁLT IDEGRENDSZERI MÛKÖDÉSIG

DÉL-ALFÖLDI NEUROBIOLOGIAI TUDÁSKÖZPONT

VEZETÕI ÖSSZEFOGLALÓ A Dél-Alföldi Neurobiológiai Tudásközpont (DNT) egységes centrumként mûködik a kutatás és fejlesztés területén. Céljaink változatlanok: a neurológia betegségek új, hatékony és jól tolerálható diagnosztikai, illetve kezelési módszereinek, gyógyszerjelölt vegyületeinek felfedezése és fejlesztése. A szegedi régió kiemelkedõ tudományos eredményeit felhasználva sokat ígérõ kutatási és fejlesztési programot valósítunk meg. A DNT részt vesz a leggyakrabban elõforduló neurodegenerációs betegségek új gyógyszereinek kifejlesztésében. A gyógyszerkutatás valamennyi fázisában részt veszünk, a felfedezéstõl a preklinikai, klinikai kísérletekig. Az egyes munkacsoportok nagyon szorosan együttmûködnek egymással, valamint más kutatócsoportokkal a világ valamennyi részébõl. A DNT harmadik évének legfontosabb eredménye a 2006 májusában az Egyetem Campusának központjában megnyílt “Kutatóközpont és Inkubátorház” (KIH) mûködésének teljes beindulása. A központ inkubátor szerepének megfelelõen támogatja az induló spin-off cégek betelepülését (JSW Hungary, LipidArt Kft., Vitadel Kft., Provit Kft.) és együttmûködését az egyes kutatócsoportokkal, a kis (Rytmion Kft.) és nagy vállalatokkal (General Electrics, Kromat (Agilent) Kft., Csertex Kft.). A Kutatóközpont és Inkubátorház épületében a következõ kutató-fejlesztõ egységek mûködnek: Számítógép Központ (”High Performance Computer”, HPC), NMR Laboratórium (500 és 600 MHz-es készülékekkel), a DNS-OligonukleotidRNS Laboratórium, Peptid- és Fehérje-Laboratórium, Neuroproteomikai Kutatóhely, Elektrofiziológiai Laboratórium, Sejt- és Szövettenyésztõ Laboratórium, Fluoreszcens Mikroszkópiai Kutatóhely, Állatház és Tanulási-Magatartási laboratóriumok. A felsorolt kutatóhelyek, laboratóriumok között szoros együttmûködés alakult ki a tervezett kutatásifejlesztési feladatok teljesítésére. A DNT végsõ célja a Kutatóközpont erõteljes fejlesztése és a fenntartható fejlõdés. Ebben az évben 2 új hasznosító (spin-off) vállalatot alapítottunk és 1 kisvállalkozás (LipidArt Kft.) csatlakozott a DNT-hez. Folytattuk a gyümölcsözõ együttmûködést hazai (Bay Zoltán Intézet) és multinacionális vállalatokkal (Eli Lilly Bécs, NUMICO Wageningen, JSW Research Graz). FP-7 közös pályázaton indultunk a Párizs-Évry “Genopol” K+F Centrummal. Összeállítottunk egy dinamikus termék- és szolgáltatás listát, amelyet a DNT képviselõi Lyonban mutattak be a Biosquare Kiállításon (2007. március. 12-14). A DNT további feladata, hogy megoldást találjon a neurodegeneratív betegségek korai felismerésére, diagnosztizálására. Folytatódott a jó együttmûködés az EGIS és a DNT között: az EGIS a Központ épületében több kutatólaboratóriumot mûködtet. A DNT kutatási-fejlesztési munkáiban 330 munkatárs vesz részt, többek között 6 akadémikus, 33 MTA doktora, 79 PhD vagy ezzel egyenértékû kutató, 45 doktorandusz és 62 egyetemi hallgató. A DNT 2007-ben összesen 104 dolgozót foglalkoztat, ami 60 új álláshely létesítését jelenti a délalföldi régióban. Hazai szabadalom 3 A DNT kutatási-fejlesztési munkái elõsegítik az Külföldi szabadalom 3 innovációt, az egyetemi hallgatók és a doktoranduszok Elõadás 143 képzését. A DNT kutatási-fejlesztési eredményeibõl 3 új magyar szabadalmi bejelentés készült. SCI publikáció 87

Könyvrészlet Könyv PhD MTA doktora Új alapítású spin-off cég Összesített impakt faktor

6 1 7 2

Prof. Gyula Telegdy, MD. DSc akadémikus, projekt vezetõ

246,009

1

TARTALOMJEGYZÉK

Vezetõi összefoglaló . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Tartalomjegyzék . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Küldetésnyilatkozat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 A DNT tagjai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 A DNT szervezeti felépítése . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Átfogó célok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Partnerek bemutatása. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 DNT kutatóközpont és inkubátorház . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Kutatási programok bemutatása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1. Alprogram . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2. Alprogram . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 3. Alprogram . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 4 Alprogram . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 5. Alprogram . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 Meghatározó személyek listája . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 Oktatási és képzési program. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 Technológia transzfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 Együttmûködés az ipari partnerekkel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 Fenntartható fejlõdés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 Médiamegjelenések . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 Publikációk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 Összefoglaló a 2007-es gazdálkodásról . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 Nagyobb beruházások listája . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 Teljesítményindikátorok. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 Monitoring értékelési rendszer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 Rövidítések . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 Elérhetõségek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

2

KÜLDETÉSNYILATKOZAT A Dél-Alföldi Neurobiológiai Tudásközpont (DNT) stratégiai célja, hogy magját adja egy, a dél-alföldi régió központtal kiépülõ élettudományi klaszternek. A DNT 9-10 éves távon a területen jelentõs magyarországi kutatóhelyekkel, gyógyszergyártókkal és csatlakozó, valamint spin-off KKV-kkel összefogásban egymást kiegészítõ funkciót vállalva nemzetközi jelentõségre tesz szert a neurobiológia kutatás-fejlesztésben (K+F), és jelentõs mértékû befektetési aktivitást vonz a dél-alföldi régióba. Alapító tagok

A Konzorciumba belépett új tagok

LipidArt Kft. A Konzorcium által alapított társaságok

3

SZERVEZET ÉS MENEDZSMENT 2007. október 31-én a DNT IT szavazati joggal rendelkezõ tagjai: ELNÖK: Prof. Telegdy Gyula akadémikus, egyetemi tanár DNT tudományos vezetõje • DNT 2-es altéma vezetõ SZTE ÁOK Kórélettani Intézete IT TAGOK: Prof. Penke Botond akadémikus, egyetemi tanár DNT koordinátor, DNT 1-es altéma vezetõ SZTE ÁOK Orvosi Vegytani Intézete Prof. Dékány Imre akadémikus, tanszékvezetõ egyetemi tanár Szegedi Tudományegyetem vezetõsége képviseletében SZTE tudományos rektorhelyettese Prof. Vigh László akadémikus MTA Szegedi Biológiai Központ képviseletében MTA SZBK Biokémiai Intézete Prof. Vécsei László akadémikus, tanszékvezetõ egyetemi tanár DNT 3-as altéma vezetõ SZTE ÁOK Neurológiai Klinika

IRÁNYÍTÓ TANÁCS

OPERATÍV SZINT

I. DÖNTÉSI SZINT II. DÖNTÉSI SZINT

Prof. Janka Zoltán tanszékvezetõ egyetemi tanár DNT 4-es altéma vezetõ SZTE ÁOK Pszichiátriai Klinika Dr. Janáky Tamás DNT 4-es altémavezetõ-helyettes SZTE ÁOK Orvosi Vegytani Intézete Prof. Tóth Gábor tanszékvezetõ egyetemi tanár DNT 5-ös altéma vezetõ SZTE ÁOK Orvosi Vegytani Intézete Dr. Lévay György kutatási osztályvezetõ EGIS NyRt. képviseletében Keresztes Péter ügyvezetõ igazgató Kromat Kft. Papp Csaba DNT menedzserigazgató

DNT KOORDINÁTOR

DNT MENEDZSERIGAZGATÓ

1. ALPROGRAM 2. ALPROGRAM 3. ALPROGRAM 4. ALPROGRAM 5. ALPROGRAM

4

DNT ELNÖK

KÖZPONTI ADMINISZTRÁCIÓ

1. 2. 3. 4. 5. 6.

ÁTFOGÓ CÉLOK: A DNT multidiszciplináris megközelítésû és nagy szakmai diverzitással jellemzett K+F tevékenységét a terápiás célú neurobiológiai alkalmazott kutatások terén erõsen fókuszált, alkalmazható eredménnyel kecsegtetõ, az ipari partnerek érdekkörébe esõ területen kívánja folytatni. Cél, hogy a régióban a DNT által koordinált konzorciumi tagok részvételével egy neurobiológiai K+F övezet alakuljon ki, amely közös stratégiai célok mentén végzi hosszú távon jelentõs, részben önfenntartó, piacorientált munkáját. Kiemelt célunk a szellemi áttörésekre képes kutatók kinevelése, megtartása. Minden szempontból vonzó, itthoni fejlõdésre alkalmas környezetet kívánunk teremteni a jövõ zálogát jelentõ tehetséges tudósnemzedék számára. Karrierlehetõséget kívánunk biztosítani a külföldrõl visszatérni szándékozó tudósaink számára. Célunk, hogy a projekteket végrehajtó világszínvonalú tudományos potenciálhoz méltó infrastrukturális háttér jöjjön létre a modern funkcionális genomika, proteomika és a terápiás célú orvosi/kémiai fejlesztések területén. Célunk, hogy a kutatók szemléletét a létrehozott szellemi termékek hasznosítása irányában fejlesszük, megfelelõ közgazdasági alapismeretekkel lássuk el õket ahhoz, hogy azok hasznosulhassanak, jól elõkészített spin-off vállalkozások jöhessenek létre, a konzorcium kutatásaira - fejlesztéseire alapozva. Célunk, hogy mind a felsõoktatásban, mind a posztgraduális képzésben neurobiológiai tudásbázisunk hasznosuljon, az elért eredményeinket a dél-alföldi régió és az ország a lehetõségekhez mérten minél hamarabb megismerhesse.

PARTNEREK: Konzorciumunk központi költségvetésbõl gazdálkodó tagjai: 1. Szegedi Tudományegyetem (SZTE) Az SZTE keretei között 37 munkacsoport vesz részt a kutató-fejlesztõ munkában. Ebbõl 19 az Általános Orvostudományi Karon, 9 a Természettudományi Karon, 6 a Gyógyszerésztudományi Karon, egy munkacsoport pedig a Tanárképzõ Fõiskolai Karon végzi munkáját. 2. Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Központ (MTA - SZBK) Az Európai Unió Kiválósági Központja (Center of Excellence) címet viselõ kutatóközpontban 13 munkacsoport kapcsolódott be a konzorcium kutató-fejlesztõ munkájába. 3. Magyar Tudományos Akadémia Támogatott Kutatóhelyek (MTA-TKI) Szorosan kapcsolódó neurobiológiai kutatások terén Az MTA-TKI két munkacsoporttal képviselteti magát munkánkban. Ipari partnerek

4. EGIS Gyógyszergyár NyRt. Az EGIS NyRt. a hazai gyógyszergyártás egyik jelentõs képviselõje. A DNT konzorcium keretein belül a gyár az elkészült többfunkciós épületünkhöz kutatólaboratóriumok kialakításával is hozzájárult. 5. SOLVO Biotechnológia ZRt. A Solvo Biotechnológai ZRt. az ABC transzportfehérjékkel kapcsolatos in vitro gyógyszerkutatási módszerek, diagnosztikai eljárások és terápiás hatású vegyületek kutatás-fejlesztésével és forgalmazásával foglalkozó vállalkozás. A céget 2005-ben Magyar Innovációs Nagydíjjal jutalmazták. 6. Diagnosztikum ZRt. A cég profilja megalakulásától kezdve orvosi laboratóriumi diagnosztikumok gyártása, beszerzése, forgalmazása, valamint az ezekhez kapcsolódó eszközök, mûszerek forgalmazása és szervize. A Word Economic Forum (Svájc) 1997-ben beválasztotta a Global Growth Companies (GGC) közé, mint a Közép- és Kelet-Európa kiemelkedõ teljesítményt nyújtó vállalatainak egyikét. 7. Kromat Mûszerforgalmazó Kft. A Hewlett Packard vállalatból leváló Agilent Technologies nevében a teljes kémiai analitikai üzletágat a Kromat Kft. vette át Magyarországon. A cég kereskedelmi tevékenységét jól kiegészíti a hatékony proteomikai alap- és alkalmazott kutatások támogatása, élõ kapcsolatépítés a kutatóbázisokkal.

5

8. Creative Labor Szolgáltató Kft. A vállalat több éves tapasztalattal rendelkezik a molekuláris biológia területén. Klónozási technikák, real-time és hagyományos PCR-es alkalmazások kidolgozása, fehérje expresszió bakteriális és eukarióta rendszerben, fehérje- és DNS analitikai módszerek gyakorlati alkalmazása szerepel eszköztárában. 9. Rytmion Kutató és Fejlesztõ Kft. A cég elsõsorban a szív elektrofiziológia és aritmia gyógyszereinek kutatása területén tevékenykedik, szoros együttmûködésben a Szegedi Tudományegyetem Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézetével. Tevékenysége a különbözõ gyógyszerjelölt molekulák kardiovaszkuláris hatásainak GLP körülmények közötti vizsgálata. 10. Kation Európa Bt. A vállalkozás az extracelluláris elektrofiziológia és mikroiontoforézis tárgyköréhez kapcsolódó üveg mikroelektródák, elektronikai eszközök és software-ek fejlesztésével, gyártásával és eladásával foglalkozik. Cégünk részt vesz az élvonalbeli neurobiológiai kutatásokban is, kiválóan felszerelt elektrofiziológiai laboratóriumot tart fent az SZTE Általános Orvosi Kar Orvosi Vegytani Intézetében. 11. QualiCont In Vitro Diagnosztikai Kht. A Kht. tevékenysége a hazai in vitro diagnosztikai laboratóriumok szakszerû külsõ minõségellenõrzésének biztosítása, az ehhez kapcsolódó kutatás-fejlesztési, informatikai, képzési-, továbbképzési és nemzetközi együttmûködési feladatok végrehajtása. 2001 év óta ISO 9001 minõségtanúsítással mûködik. 12. Dél-Alföldi Bio-Innovációs Centrum Kht. (DABIC) Genomikai Központja A Kht. tagjai a Szegedi Egyetem, a Bay Zoltán Intézet, a Gabonakutató Intézet, a Csongrád megyei és Szeged városi önkormányzata és számos olyan kis- és középvállalat, amely a genomikai kutatásokban érintett. A központ mûködésének egyik fõ célja olyan projektek irányítása és szervezése, mely több társintézet együttes munkáját igényli. Másik fõ célja egy bioinformatikai rendszer megteremtése. Csatlakozott ipari partnerek 13. JSW Hungary Kft. A társaság 2006. augusztusában csatlakozott a DNT programhoz. A cég gyógyszerjelölt molekulák kutatási szerzõdésen alapuló analitikai, biokémiai és molekuláris biológiai tesztelését, valamint azok in vitro szövettenyészeten és in vivo transzgenikus egérmodelleken történõ preklinikai kipróbálását végzi, szorosan kapcsolódva a DNT program 3. és 5. alprogramjához tartozó csoportok kutatásaihoz. Ezen túlmenõen kedvezményesen látja el a konzorcium minden egyes tagját az Alzheimer- és a Parkinson- kór transzgenikus állatmodelljeivel. 14. Musgenex Kft. Dr. Oláh Zoltán, 2006 januárjában MusGenex Kft névvel, az MTA SZBK Biokémiai Intézetének támogatásával és Dr. Sántha Miklós állatorvos bevonásával, egy új spin-off céget hozott létre. A cég tevékenységébe többek között beletartozik transzgenikus riporter állatmodellek tervezése, létrehozása és forgalmazása. Elsõsorban tudományos kutatással foglalkozó intézményeknek szállítunk, beleértve egyetemeket és gyógyszergyárakat, Európában vagy a világ bármely más kontinensén. 15. LipidArt Kft. A 2007 júniusában megalakult LipidArt Kft célja új típusú gyógyszerek felfedezése innovatív gyógyszerfejlesztési platform segítségével mely a membránok mikrodomén szerkezetének finomhangolása és a stresszválasz szelektív modulációja közötti kapcsolaton alapszik. A LipidArt elsosorban a globálisan egyre növekvõ jelentõségû neurodegeneratív betegségekre koncentrál. Konzorciumi alapítású társaságok 16. Provit Kft. A vállalat a Szegedi Tudományegyetem második hasznosító (spin-off) cége. Fõ profiljai: 1, funkcionális élelmiszer komponensek kutatása és alkalmazása, elsõsorban a tokoferolok neuroprotektív hatását kihasználva; 2, fehérjekémiai, proteomikai kutatások: az egyes betegségek kialakulásánál kulcsszerepet játszó célfehérjék azonosítása és kijelölése a racionális gyógyszertervezés céljára. 17. Vitadel Kft. A vállalat a Szegedi Tudományegyetem elsõ hasznosító (spin-off) cége. Fõ profiljai: 1, funkcionális élelmiszer komponensek kutatása és alkalmazása, elsõsorban a tokoferolok neuroprotektív hatását kihasználva; 2, fehérjekémiai, proteomikai kutatások: az egyes betegségek kialakulásánál kulcsszerepet játszó célfehérjék azonosítása és kijelölése a racionális gyógyszertervezés céljaira.

6

DNT KUTATÓKÖZPONT ÉS INKUBÁTORHÁZ A 2006. június 15-én megnyitott DNT központ 253 millió Ft-os (mintegy 1 millió eurós) beruházásával eddig a legnagyobb a DNT történetében. A Központ 1300 m2 labor-és irodaterületet foglal el. A beruházás legnagyobb részét a DNT projektbõl fedeztük, de más forrásokat is igénybevettünk. (5,08 millió Ft-ot a KF-IIF/2005 pályázatból az épület informatikai és kommunikációs hálózatának kiépítésére; a main-frame komputerek valamint a 600 MHz-es NMR készülék beszerzésére). A Központban a következõ laboratóriumok kaptak helyek: 1) Számítóközpont és Molekulamodellezési Laboratórium Két main-frame számítógép (értékük: 57 millió Ft, ~ 220.000 €); van elhelyezve a laboratóriumban, klaszterben kapcsolva. A központ fõ feladata a molekula-szimuláció és számítógépes molekula (gyógyszer) tervezés, valamint az NMR mérések adatainak feldolgozása. Ebben a laboratóriumban van az épület informatikai és telekommunikációs központja is. 2) NMR Centrum Az országban egyedülálló teljesítményre képes laboratórium egy 500 és egy 600 MHz-es Bruker gyártmányú NMR-készülékkel van felszerelve. Ezek összértéke kb. 250 millió Ft és más forrásból szereztük be õket, bár a laboratórium berendezését a DNT is támogatta 40 millió Ft-tal. A Centrum fõ feladata a fehérjék szerkezetének és kis molekulákkal (pl. gyógyszermolekulák) lejátszódó kölcsönhatásainak tanulmányozása. Az NMR Laboratórium a közeljövõben megszervezendõ „Strukturális Biológiai Központ” fontos alkotórésze. 3) DNS-Oligonukleotid Laboratórium A munkahely fõ feladata oligonukleotidok, antiszensz oligonukleotidok és peptid nucleinsavak (PNS) szintézise további biológiai vizsgálatok céljából. 4) RNS-Interferencia Laboratórium Magyarországon ez az egyetlen laboratórium, ahol molekulatervezés után kis interferáló RNS-et állítanak elõ. Az RNS interferencia a gyógyszertervezés és fejlesztés legmodernebb módszere (Kémiai Nobel-díj, 2006) 5) Peptid és Fehérjelaboratórium A munkahely feladata peptidek szintézise, a peptidek és fehérjék aggregációjának, a neurotoxikus peptid/fehérje szupramolekuláris szerkezeteknek, inklúziós testeknek a tanulmányozása. 6) Neuroproteomikai Kutatóhely Hazánkban ez is egy egyedülálló munkákra és teljesítményre képes laboratórium, képes kiszolgálni az egész ország neurobiológiai proteomikai igényét. A kutatóhely feladatai: fehérjék izolálása, 2D gélelektroforézissel vagy nano-HPLC-vel történõ elválasztása, a fehérjék azonosítása a tömegspektrometriás peptidszekvenálás és adatbázisok segítségével. A kutatómunkát egy modern tömegspektrométer segíti, amely a legmodernebb szoftverrel van felszerelve. (A DNT 46 millió Ft-tal támogatta a csúcsteljesítményû mûszer beszerzését). A kutatóhely fõ feladata azoknak a célfehérjéknek az azonosítása és validálása, amelyek a neurodegenerációs folyamatokban kulcsszerepet játszanak. 7) Elektrofiziológiai Laboratórium A munkahely fõ feladata a gyógyszerjelölt vegyületek központi idegrendszerre gyakorolt hatásának tanulmányozása in vivo elektrofiziológiai állatmodelleken. 8) Sejt-és Szövettenyésztõ Laboratórium A laboratórium fõ feladata olyan in vitro kísérletek véghezvitele sejt- és szövetkultúrákon (pl. organotipikus kultúrák), amelyekkel a neurodegeneratív betegségek sejt- és szövetkultúra modelljein tanulmányozható a gyógyszerjelölt vegyületek hatása.

7

9) Fluoreszcens Mikroszkópiai Kutatóhely 2+ Sejt- és szövetkultúrákban specifikus fluoreszcens festéssel tanulmányozzuk a Ca beáramlást a sejtekbe, a Zn2+ -ionok felszabadulását és a membránpotenciál változásokat a gyógyszerjelölt vegyületek hatására. Egy fluoro-plate-reader hasonló alapelven gyors és kvantitatív méréseket tesz lehetõvé. 10) Állatház A központban egymás mellett két állatház található: egy a patkányok és egy az egerek részére, minden felszerelés és berendezés eléri a GLP szintet. 11) Tanulási - Magatartási Laboratóriumok Ezeken a munkahelyeken azt tanulmányozzuk, hogy a gyógyszerjelölt vegyületek milyen hatást gyakorolnak a patkányok és (ritkábban végrehajtott kísérletekben) az egerek tanulására és viselkedésére. A következõ kísérleteket használjuk: nyílt porond (open field) teszt; passzív- és aktív elhárító magatartás; emelt plusz labirintus (maze); Morris vízlabirintus; tárgyfelismerés; forgórudas teszt és keresztlabirintus. A fenti laboratóriumok mellett két másik kutatócsoport is helyet kapott a Centrumban: az Alzheimer-kór Kutatócsoport és az Enterális Idegrendszeri Csoport. Az EGIS gyógyszergyár több laboratóriumot támogat a Centrumban. A DNT központi irodái szintén a Centrum épületében kaptak helyet. A DNT-t alkotó kisvállalatok (JSW Hungary, Rytmion, Vitadel Kft., Provit Kft.) mellett más cégek (General Electrics, Csertex Kft., ISH Kft.) is laboratóriumot és/vagy irodát kaptak a Központ épületében. Egy 40 m2-es szemináriumkönyvtár helyiséget alakítottunk ki szemináriumok, elõadások, munkamegbeszélések és üzleti tárgyalások céljára. 2 Jelenleg 72 m szabad, még nem beépített területünk van, melyet 2008 év elején tervezünk beépíteni. A DNT-tag kisvállalatok nem fizetnek bérleti díjat, csak rezsiköltséget a laboratóriumok és irodák bérletéért, a többi partner bérleti díjat és rezsiköltséget is fizet. Így a Centrum támogatni tudja az induló spin-off vállalkozásokat (inkubátor funkció). A Centrum épülete a közeljövõben megvalósításra kerülõ „Szegedi Egészségügyi Központ” területének északi részén helyezkedik el, így a tervek megvalósítása során a Centrum kutatói fizikailag is szoros kapcsolatot tudnak fenntartani és kiváló együttmûködést kiépíteni az Egészségügyi Központtal, illetve annak K+F+I részével, az Inkubátorház projekttel. A Centrum kiváló tudományos és laboratóriumi hátteret ad a gyógyszerkutatás és fejlesztés szinte valamennyi fázisának, a felfedezéstõl a preklinikai és klinikai kísérletekig. A Centrumban jelenleg 35 szenior, posztdoktori és doktori ösztöndíjas kutató dolgozik.

8

KUTATÁSI PROGRAMOK BESZÁMOLÓI 2006. november 1 - 2007. október 31. A DNT a neurodegenerációs betegségek (elsõsorban az Alzheimer- és Parkinson-kór), valamint a szorongásos betegségek és a depresszió kialakulásának mechanizmusát és gyógyszeres kezelési lehetõségeit kutatja. A DNT a projekt lezárása (2008. december) után is folytatni kívánja a kutató-fejlesztõ munkát, az UMFT GOP 1.1.2 pályázat keretében. Bár az alprogramok munkája szorosan kapcsolódik egymáshoz és sokszálú kooperációs hálózat alakultki, szervezési okok miatt a munkacsoportok munkáját 13 témacsoportra, klaszterre osztottuk fel. Ez a szervezés jól bevált, így a szakmai beszámolót is a 13 témacsoport szerint tagoltuk.

2004-2008 2004-2008 KÖZÖTTI KÖZÖTTI KUTATÁSOK KUTATÁSOK

KÖ ZP O

K GE

Anxietás

ENDSZERI B EGR ET EG I ID T N

SÉ

Huntingtonkór

Schizofrénia

Alzheimer-kór

K GE

Parkinsonkór

Depresszió

ENDSZERI B EGR ET EG I ID T N

SÉ

KÖ ZP O

Alzheimer-kór

2008 UTÁNI TERVEINK

Parkinsonkór

Depresszió

Huntingtonkór

Anxietás

1. ALPROGRAM: Kóros fehérje-aggregációval járó betegségek (Alzheimer-kór, Parkinson-kór) terápiájának kutatása. Projektvezetõ: Dr. Penke Botond 1. Klaszter: Az Alzheimer-kór új gyógyszerei. Projektvezetõ: Dr. Penke Botond Munkacsoport-vezetõk: Dr. Bogár Ferenc, Dr. Dékány Imre, Dr. Kiss Tamás, Dr. Laczkó Ilona, Dr. Martinek Tamás, Dr. Kálmán János, Dr. Datki Zsolt, Dr. Toldi József, Dr. Budai Dénes, Borbély Emõke Célok és rövid áttekintés (1.1-1.6 részfeladat) 1. Peptidek és peptidomimetikumok tervezése és szintézise a â-amiloidok és az á-szinuklein neurotoxikus hatásának kivédésére. 2. â-amiloid aggregációk, valamint az aggregációra ható potenciális gyógyszerjelölt peptidomimetikumok vizsgálata fizikaikémiai, spektroszkópiai és elektronmikroszkópos módszerekkel. 3. Az Alzheimer- és Parkinson-kór potenciális peptidomimetikum gyógyszereinek tesztelése humán trombocita modellen és in vitro sejttenyészeteken. 4. Az Alzheimer- és Parkinson-kór potenciális gyógyszereinek vizsgálata in vitro és in vivo elektrofiziológiai módszerekkel. 5. Az Alzheimer-kór potenciális gyógyszereinek tesztelése patkány magatartási és tanulási kísérletekkel. Potenciális gyógyszermolekulák tesztelése az Alzheimer-kór transzgenikus egérmodelljein. Elvégzett tevékenység: 1. Peptidek és peptidomimetikumok tervezése a â-amiloid és az á-szinuklein neurotoxikus hatásának kivédésére. 23 új vegyület elõállítása. Peptid és peptidomimetikum BSB vegyületek számítógépes tervezése.

9

2 â-amiloid aggregációk, valamint az agggregációra ható potenciális gyógyszerjelölt peptidomimetikumok vizsgálata: a) spektroszkópiai vizsgálatok: fémionok hatása az aggregációra b) az 1. részfeladatban elõállított új vegyületek dezaggregáló hatásának gyors screenelése c) a képzõdött fibrillumok elektronmikroszkópos vizsgálata d) gyógyszerjelölt molekulák konformációs preferenciáinak mérése, kölcsönhatásuk vizsgálata â-amiloid oligomerekkel: a lehetséges specifikus kötõdési hely(ek) megállapítása oldatfázisban e ) â-amiloid aggregációra ható gyógyszerjelölt peptidomimetikumok hatásának vizsgálata CD-spektroszkópiával. 3. Az Alzheimer- és Parkinson-kór potenciális peptidomimetikum gyógyszereinek tesztelése in vitro sejttenyészeteken. Neuroprotektív szabad-gyökfogó vegyületek biológiai tesztelése in vitro. 4. Az Alzheimer- és Parkinson-kór potenciális gyógyszereinek vizsgálata in vitro és in vivo elektrofiziológiai módszerekkel. In vitro mérések: az újabb peptid és petidomimetikum vegyületek elektrofiziológiai vizsgálata normál patkány motoros kérgében a â1-42 amiloid által kifejtett neuromodulációban. In vivo mérések: glutamát-receptorokon ható modulátoro neuroprotektív hatásának vizsgálata (gyógyszerjelölt molekulák). 5 . Az Alzheimer-kór potenciális gyógyszereinek tesztelése patkány magatartási és tanulási kísérletekkel: 7 kísérletsorozat új vegyületekkel: Morris-féle vízilabirintus (referenciamemória), Y-labirintus (munkamemória) open field (anxietás, lokomóció), hisztológiai vizsgálatok. Potenciális gyógyszermolekulák tesztelése az Alzheimer-kór transzgenikus egérmodelljein. Eredmények 1. Peptidek és peptidomimetikumok tervezése és szintézise a â-amiloidok és az á-szinuklein neurotoxikus hatásának kivédésére. Az NMR laboratórium 1H-NMR kötésteszt segítségével kimutatta, hogy több, az in vivo tesztekben hatásosnak bizonyult molekula kötõdik a fibrilláris Aâ peptidhez. A kötõdés mechanizmusának jobb megértése céljából egy olyan szálmodellt készítettünk, ami a teljes Aâ1-42 szekvenciát tartalmazza, és lehetõvé teszi ezen molekulák lehetséges kötõhelyeinek vizsgálatát. A modell felépítéséhez az Aâ szál 17-42 aminosavakat tartalmazó részének Lührs és mts. által publikált NMR szerkezetét használtuk, kiegészítve az N-terminális szakasszal (béta szerkezetet feltételezve) és felépítettünk egy Aâ oktamert. A kapott struktúrával 4ns-os explicit vizes dinamikai szimulációt végeztünk. Megállapítottuk, hogy az N terminális rész béta szerkezete a dinamika során stabil maradt, bár jelentõs mozgásokat végzett. A futás utolsó szerkezetét választottuk a kötõdés vizsgálatokhoz. Megvizsgáltuk, hogy néhány potenciális Alzheimer gyógyszerjelölt molekula hogyan kötõdik a fibrillum modell N-terminális szakaszához (1-10) és a 16-22 tartományhoz. Megfigyeltük, hogy a gyógyszerjelölt vegyületek az N-teminális végen erõs, fõként a ligand fõlánca által alkotott H-kötésekkel kötõdnek a protofibrillumhoz. A legtöbb molekula esetében ez oda vezet, hogy a ligand apoláros oldalláncai „befedik” az Aâ poláros oldalláncait. Így a komplex apoláros felülete nagyobb lesz, mint az Aâoktameré volt, a poláros pedig lényegében változatlan marad. Az apoláris felszín növelése meggyorsítja az Aâ-peptid aggregációt. A gyógyszerjelölt vegyületek tehát nem szerkezetrombolók, hanem éppen ellenkezõleg: elõsegítik az aggregáció révén a nemtoxikus szuperstruktúrák képzõdését. Két vegyületcsaládban számos új peptidomimetikum szintézisére került sor. (Komolyabb szabadalmi védelemre csak akkor lehet számítani, ha a gyógyszerfejlesztésre kiválasztott 2-3 új vegyületnek szinte valamennyi, kémiailag rokon vegyületét is leõállítjuk és levédjük). A következõ szintézisekre került sor: 1. A Leu-Pro-Tyr-Phe-Asp-amid vezérvegyület (lead) család: 15 új vegyület elõállítása A biológiai screening (MTT-teszt) eredményébõl kiderült, hogy a gyógyszerjelölt vegyületek nagyon érzékenyek a szerkezeti változtatásokra. A peptidomimetikumok az N-terminális helyen szinte semmi változást nem viselnek el a biológiai hatás elvesztése nélkül. A Pro viszonylag jól cserélhetõ prolin-analógokkal, a Tyr helyén ugyancsak sokféle szerkezeti változtatás bizonyult jónak. A molekula C -terminusa ugyancsak nehezen tûri a változtatást, eddig mindössze 2 szerkezet bizonyult jónak. A szerkezeti változtatásokkal sikerült két enzimrezisztens, gyomorból felszívódó, a vér-agy gáton átjutó peptidomimetikumot (P59 és P79) találni, ezeket a vegyületeket választottuk ki további gyógyszerfejlesztéshez. 2, A Glu-Pro-Ala-Pro-Ala vezérvegyület családja: 8 új vegyület. Egyetlen kivétellel minden anyag aktív volt az MTT-teszten! Az ún. retro-inverz peptidek D-aminosavakból épülnek fel és enzimrezisztensek, gyógyszerfejlesztésre ezeket választottuk ki. A kötésvizsgálatok szerint ennek a vegyületcsaládnak a peptidjei és petidomimetikumai nem kötõdnek jól az Aâ és NAC aggregátumokon, mégis védenek a fenti anyagok neurotoxikus hatása ellen. Hatásmechanizmusuk vizsgálatát elkezdtük. Aâ-aggregációfok standardizálás. Óriási problémát okoz a szakirodalom értékelésében, valamint saját biológiai kísérleteinkben, ha nem tudjuk milyen aggregációs fokú Aâ peptiddel végeztük az in vitro és in vivo kísérleteket. Ezért kidolgoztunk egy olyan módszert, amellyel jól megismételhetõ módon mindig azonos aggregációs fokú Aâ peptideket kapunk. A módszernél egy olyan Aâ 1-42 analógból (izopeptidbõl) indulunk ki, amelyben a Gly25-Ser26 kötés nem peptid-, hanem észterkötés! A Ser26-izo Aâ 1-42 konformációja hélixes, monomer formában létezik, csak neutrális pH fölött O› N acilvándorlással alakul ki az Aâ 1-42 peptidszerkezet, amely gyors konformációváltozással â-réteggé alakul. Idõben elõrehaladva 20 °C-on a következõ konformációs és aggregációs állapotokat találjuk: 0-24 óra : monomer; konformációváltozás, kevés oligomer 24-48 óra : oligomer keverék 72 óra után: protofibrillumok 4 nap után: fibrillumok, érett fibrillumok megjelenése Az aggregációs fokot részben dinamikus fényszóródás mérésével (QLS), részben TEM segítségével bizonyítottuk. Ennek

10

alapján lehetõvé vált, hogy külön-külön tanulmányozzuk a fenti Aâ aggregációs formák neurotoxicitását, ill. a gyógyszerjelölt vegyületek hatását az Aâ-aggregátumok által beindított, neurodegenerációhoz vezetõ folyamatokra. A standardizálás után elvégzett kísérletek egyértelmûen bizonyították, hogy a gyógyszerjelölt vegyületeink (P29, P59, P79) egyaránt kivédik az Aâ 142 oligomerek, protofibrillumok és fibrillumok toxikus hatásait. 2, â-amiloid és á-szinuklein (NAC) aggregációk, valamint az aggregációra ható potenciális gyógyszerjelölt peptidomimetikumok vizsgálata fizikai-kémiai, spektroszkópiai és elektronmikroszkópos módszerekkel. Fémionok hatása az aggregációra. Mivel a kétértékû kationok (elsõsorban a cink) nagymértékben befolyásolják az Aâ-peptidek aggregációját és toxicitását, a következõ vizsgálatokat végeztük el: 1. A Zn2+ és a Mg2+ ion hatása az Aâ 1-42 aggregációjára 2+ 2. A Zn ion aggregáció-moduláló hatásának befolyásolása: a. kereskedelmi forgalomban lévõ cink-kelátorral (TPEN) 2+ b. Zn -keláláson alapuló hatásmechanizmusú szabdalmaztatott gyógyszerrel (Perindropil®) 3. Az Aâ 1-28 peptid aggregációjának vizsgálata, a Zn2+ ion hatása az aggregációra 4. A cink-ion (Zn2+) és az N1, N2-bis-(piridin-2-ilmetil)-etán-1,2-diamin (ENDIP) reakciójának követése titrációs izoterm mikrokalorimetria segítségével A peptidek aggregációját elõször a fény szórásintenzitás változásával követtük. Tapasztalataink szerint minden esetben a 2+ 2+ jelenlévõ fémion (Mg vagy Zn ) hatására az Aâ-peptid aggregációja pillanatszerûen felgyorsult, mely a szórásintenzitás ugrásszerû növekedését okozta. Specifikus Zn-kelátor (TPEN) jelenlétében az Aâ aggregáció felgyorsulása nem észlelhetõ. A kelátor megköti a cinket, így nincs jelen szabad fémion, az aggregáció nem változik. Érdekes, hogy az ACE- inhibitorként ismert, gyenge Zn-kelátor Perindropil® vérnyomáscsökkentõ gyógyszer viszonylag nagy (100µM) koncentrációban sem befolyásolja 2+ a Zn ionok hatását az Aâ aggregációra, minden bizonnyal gyenge Zn-kötési tulajdonsága miatt. 2+ Zn és ENDIP reakcióját titrációs izoterm mikrokalorimetria segítségével is követtük. Az eredményeink azt mutatták, hogy a cink-ionok kelálása endoterm folyamat, a reakció hõ elnyelésével jár. A kelátor mennyiségének csökkenésével közel lineárisan nõ a szükséges hõ mennyisége, amint viszont a rendszerben elfogy a szabad állapotú kelátor, a szükséges hõ mennyisége drasztikusan lecsökken, ami egyben a reakció teljes lejátszódását is indikálja. A számítások alapján a Zn-ENDIP kelát kialakulása ÄHképz = -1,30 kJ/mol endoterm hõváltozással jár. Aâ42 idõfüggõ aggregációjának és gátlásának tanulmányozása CD spektroszkópiával. - Befejeztük az Aâ(1-42) aggregáció gátlásának tanulmányozását gyógyszerjelölt kisméretû peptidek jelenlétében és megállapítottuk, hogy a gyógyszerjelölt anyagok növelik a â-szerkezet mennyiségét és az Aâ 1-42 további aggregációját idézik elõ. - Elkezdtük a normál (egyenes szálú) és a Ser27 aminosavnál megtört, ún. izoAâ(1-42) másodlagos térszerkezetének és 2+ aggregációjának tanulmányozását Zn jelenlétében. A spektroszkópiai méréseket semleges (pH 7.4) és savas pH-n (pH2.0) 2+ végezzük a Zn /peptide mólarány (rM) függvényében. Elõzetes CD vizsgálataink szerint a Zn2+ (rM=10-nél) a normál amiloid aggregációját idézte elõ 10% trifluoretanol/víz oldatban. Mivel az aggregátumokban a rendezetlen konformerek mennyisége növekedett a â–sheet rovására, feltételezhetõ, hogy a Zn2+ ilyen koncentrációban szétrombolja a â–sheet konformációt és fibrilláris aggregátum › nem fibrilláris aggregátum átrendezõdést eredményez. Gyógyszerjelölt vegyületek kötõdése fibrilláris Aâ 1-42 peptiden. Célul tûztük ki az Aâ1-42 és az amiloid fibrillumok mérgezõ hatását kivédõ tetra-, illetve pentapeptidek kölcsönhatásának vizsgálatát NMR spektroszkópia segítségével. A korábbiakban kidolgoztuk a fibrilláris Aâ[1-42] – ligandum kötõdési tesztjét, és megállapítottuk, hogy az RIIGLa, LPYFDa, LPFFD és az FRHDSa szekvenciáknál a jelintenzitás 9-26% körüli értékkel csökkent, ami szignifikáns mértékû kötõdésre utal és összhangban áll az in vitro és in vivo neuroprotektív hatással. Az elmúlt idõszakban felismertük, hogy a ligandumok kötõdése fiziológiás foszfát pufferben idõfüggést mutat. A további kísérleteket LPFFD molekulán végeztük el. A kötõdés monitorozása kimutatta, hogy a ligandum kötõdésének erõssége és a felkötõdött ligandum mennyisége idõben csökken. LPFFD jelenlétében dezaggregálódott Aâ-hoz tartozó jeleket a spektrumban nem találtunk. Ezek az eredmények kizárják az LPFFD â-réteg romboló hatását a vizsgált idõintervallumban. Az NMR vizsgálatokkal párhuzamosan diffúz fényszórási és TEM méréseket végeztünk. A fényszórási mérések egyértelmûen mutatják, hogy tiszta fibrilláris Aâ esetén lassú ülepedés van, míg a ligandum hatására a részecskeméret-növekedés indul meg a mintacsõ teljes hosszában, és az ülepedés meggyorsul, melynek dinamikája jól egyezik az NMR mérések eredményeivel. Következtetésünk, hogy az amiloid fibrillumok aggregációját, flokkulációját a hozzáadott ligandumok okozzák és a folyamat során gyengén kötõdõ ligandumok leszorulnak. PBS-ben a gyenge kötõdés nem lehetséges. A gyógyszerjelölt petidek hatásmechanizmusukat tekintve semmiképpen nem nevezhetõk â-szerkezetrombolóknak, hanem éppen ellenkezõleg: gyorsítják az aggregációt és a nemtoxikus szuperaggregátumok kialakulását. Az összes alkalmazott fizikai-kémiaimérés és mûszeres vizsgálat végeredménye egyértelmû: az eddig â-szerkezetrombolónak (BSB) tekintett pentapeptidek nem akadályozzák meg az Aâ1-42 aggregációját (vagyis nem BSB hatásúak), viszont megkötõdnek az Aâ fibrillumokon és neuroprotektív hatásúak, mert megakadályozzák az Aâ-fehérje kölcsönhatásokat. 3, Az Alzheimer- és Parkinson-kór potenciális peptidomimetikum gyógyszereinek tesztelése in vitro sejttenyészeteken. Kidolgoztunk egy gyors, ex vivo módszert a korai Alzheimer-kór cink ionokkal kapcsolatos élettani folyamatainak detektálására. A módszer lényege a következõ: a hippokampális cink ürítés mértéke jellemzi a glutamáterg neuronok preszinaptikus aktivitását. Ha ez az élettani folyamat változik, a változás markerként jelzi az idegsejtek állapotát és aktivitását. Kutatásaink

11

során azt tapasztaltuk, hogy bizonyos regisztrált vérnyomáscsökkentõ ACE-inhibitor cink kelátorok (Captopril, Perindopril) a cinkionok redisztribúcióját okozzák. In vitro és ex vivo eredményeink a Captopril és a Perindopril védõ hatását mutatták ki neurodegeneráció tesztekben. Elsõ lépésként bebizonyítottuk, hogy az in vitro sejttenyésztési rendszerünkben a Captopril védõ hatású az exogén eredetû cinkkel szemben. Második lépésként megnéztük, hogy az aromatáz gátló Formestane-nal indukált ösztrogén hiányos patkányokban a cink homeosztázis, glutamáterg preszinaptikus cink ürítési képesség hogyan változik a Captopril alkalmazása után. Az eredmény azt mutatja, hogy a kezelést követõen a neuronok cink-ürítési képessége normalizálódik, a kontrollhoz közelítõ normál értéket mutat. E mérés alatt összehasonlítottuk a hippokampusz és a neokortex szabad (vízzel kioldható) relatív cinktartalmát is ugyancsak ösztrogén hiányos nõstény patkányokban. Azt találtuk, hogy itt is a Perindopril normalizálta a jobboldali hippocampusz cink mennyiségét. Az aszimmetrikus cink-koncentráció irodalmilag ismert jelenség, amely a cinkürítéskor nem jelentkezett, de a beoldható cink mennyiségében igen. Az elõzetes mérések alapján azt találtuk, hogy a cink kelátorok a hippokampális cink-homeosztázis zavarait kivédik; korai Alzheimer-kórban védõ hatásuk lehet a hippokampális alapú memória károsodásával szemben. Ez egy teljesen újszerû, független hatásmechanizmus, közvetlen hatással a glutamáterg alapú memória központokra, eltérõen a vérnyomásszabályozásra kifejtett hatásuktól. Újabb méréseink eredményeként sikerült bizonyítani, hogy az idõs nõstény patkányokban a cinkürítés mértéke lényegesen nagyobb, mint az ugyanolyan korú hímekben. Az irodalomban már bizonyított, hogy az Aâ 2+ peptidek a Zn ionokat megkötik, így aggregációjuk felgyorsul. Mindez az Alzheimer-kór korai fázisára jellemzõ folyamat, ezért az 1 éves, vagy annál idõsebb nõstény patkányok Zn2+ diszhomeosztázisa jó kísérleti modellként szolgálhat az Alzheimer-kór korai fázisának tanulmányozására. 4, Az Alzheimer- és Parkinson-kór potenciális gyógyszereinek vizsgálata (elektrofiziológia). In vitro elektrofiziológia hippocampus szeleteken. In vitro elektrofiziológiai kísérleteinkben az újonnan szintetizált izo-amyloid Aâ1-42 hatását tanulmányoztuk a hippocampális -5 szinaptikus plaszticitásra. A peptidet 10 M-os koncentrációban oldottuk fel ACSF-ben, melyet rögtön lefagyasztottuk folyékony nitrogénben (<2 perc). Az oldatokat csak közvetlenül szelet felszínére történõ lokális applikáció elõtt olvasztottuk fel, melynek semmilyen detektálható hatása nem volt a Schaffer kollaterálisok orthodrom ingerlésére kapott mezõpotenciálok amplitúdóira a hippocampus CA1 régiójában. Ezután a szeletek mindkét csoportjában 20 percig regisztráltuk a szinaptikus alapaktivitást alacsony frekvenciás ingerléssel (0.05 Hz, 0.3 ms jelszélesség, 20-50 µA amplitúdó), majd LTP-t indukáltunk nagyfrekvenciás ingerléssel (100 Hz, 500 db, a teszt pulzus 100%-án). A mezõpotenciálok amplitúdóinak változása kontroll szeletek esetén 143.87 %-os (±0.62, N=6), míg az izo-amiloiddal kezelt szeletek esetén 132.63%-os (±0.35, N=7) volt a követés 1 órája alatt. A statisztikai analízis (Mann-Whitney teszt) alapján számos idõpillanatban a különbség a két csoport között szignifikáns volt, döntõen azonban az LTP követés 2. felében (p<0.05). A tapasztalt jelenség hátterében legnagyobb valószínûséggel az oligomer állapotú Aâ a poszt-szinaptikus AMPA receptorokra kifejtett hatása áll (Shemer, Eur J Neurosci, 2006 23(8):2035). In vivo elektrofiziológia altatott patkányon Patkány hippocampus neuronokban, egysejt-elvezetéssel tanulmányoztuk a gyógyszerjelölt vegyületek hatását, altatás közben bejuttatva az Aâ aggregátumok, illetve a védõanyag oldatát multibarrel elektródon át mikroiontoforézissel a vizsgált neuron környezetébe. Egy másik kísérletsorozatban a gyógyszerjelölt vegyületeket nem iontoforézissel adtuk be, hanem gyomorszondán át kapták a kísérleti állatok. Bebizonyítottuk, hogy a P59 és a P79 vegyületek mind közvetlenül az idegsejtre juttatva, mind gyomorszondán át adva az állatnak, hatásosan kivédik az Aâ 1-42 oligomerek és protofibrillumok/fibrillumok toxikus hatását a neuronokon. Az elõzõ pontban (1.) elõállított és jól jellemzett standardizált Aâ 1-42 különbözõ formákat alkalmazva bebizonyítottuk, hogy az oligomerek, ill. Aâ- fibrillumok a hippocampus CA 1 neuronjainak AMPA receptorain különbözõ hatást fejtenek ki. Az Aâ 1-42 oligomerek növelték a receptorok AMPA által kiváltott tüzelési aktivitását, ezzel szemben az Aâ fibrillumok csökkentették, sõt csaknem teljesen megszüntették azt. Ezek a vizsgálatok arra utalnak, hogy az Aâ- oligomerek, illetve fibrillumok más szignalizációs utakat indítanak be a neuronon. 5, Az Alzheimer-kór potenciális gyógyszereinek tesztelése patkány magatartási és tanulási kísérletekkel. AD modell patkányokon Az Alzheimer-kór patogenezisében központi szerepet játszik az â-amyloid peptid kóros felhalmozódása az idegsejtekben. Ez a peptid aggregálódásra hajlamos, ennek során szolubilis, kisebb fragmensekbõl álló peptidszálak egymáshoz tapadnak és oldhatatlan aggregátumot hoznak létre. A különbözõ aggregációs állapotú oldékony formák (különösen az oligomer és fibrilláris â-amyloid(1-42)) toxikusak az idegsejtekre, és azok pusztulását okozzák. A lerakódásokban leggazdagabb területek a memóriafunciókért felelõs hippocamus formáció és az entorhinális kéreg (EC), így a neurotoxikus peptid felhalmozódása, fokozottan ezen areák funkciókiesésével jár együtt. A laboratóriumunkban kidolgozott állatmodell segítségével olyan gyógyszerjelölt vegyületeket teszteltünk, melyek in vitro mérések szerint, aggregátum inhibitorokként mûködnek. Azt vizsgáltuk, hogy ezek a vegyületek in vivo körülmények között kivédik-e a â-amyloid(1-42) EC-be injektálásával kiváltott memóriaromlást. Szintetikus â-amyloid(1-42) oldatot (0,375mg/ml) (â-amyloid-kezelt csoport), vagy fiziológiás sóoldatot (kontrol csoport), pentapeptid védõanyagokat: LPYFD és RIIGL,gyógyszerjelölt vegyületet (P59), valamint pozitív kontrollnak pentaglicint injektáltunk felnõtt hím Wistar patkányok entorhinális kérgébe bilaterálisan. A magatartástesztek három héttel a mûtétet követõen kezdõdtek. A rövid távú memóriát Y-labirintusban, a hosszú távú memóriát tárgyfelismerési teszttel, a térbeli memóriát pedig Morris-féle vízilabirintusban vizsgáltuk. A magatartásteszteket követõen szövettani festéseket, valamint

12

fehérjeexpressziót követõ Western Blott vizsgálatokat végeztünk. Eddigi eredményeink igazolták a modell mûködõképességét, ugyanis a kontroll és az â-amyloid-kezelt állatok teljesítménye között szignifikáns különbséget mutattunk ki mind a Morris-féle vízilabirintusban, mind a tárgyfelismerés tesztben. A pentapeptidek( LPYFD, RIIGL) esetében nem tudtunk védõhatást igazolni. A pentaglicinnel kezelt állatok teljesítményébõl látható, hogy a speciális aminosav oldalláncokkal nem rendelkezõ pentapeptid hatására nem mutatható ki teljesítményváltozás a kezelést követõen. Újabb kísérleteink során négy állatcsoportot vizsgáltunk; oligomer Aâ1-42-vel, a gyógyszerjelölt vegyülettel (P59), a védõanyaggal és Aâ1-42-vel (1:5 mólarányban), valamint fiziológiás sóoldattal injektált állatok viselkedési és tanulási paramétereit teszteltük. Vizsgálataink alapján a térbeli memóriát felmérõ Morris-labirintusnál találtunk szignifikáns különbségeket, a probe és a reverz úszásoknál, valamint a tárgyfelismerési tesztnél voltak eltérések az állatcsoportok között. A kívülrõl bejuttatott amyloid károsítja a hosszútávú és a térbeli memóriát, míg a spontán alternálás (Y-teszt) eredményei azt sugallják, hogy a munkamemóriában az Aâ nem okoz deficitet. A nyílt porond tesztben sem találtunk különbséget az állatok viselkedési paraméterei között. Valószínûleg az amyloid hatása specifikus, csak a memóriafolyamatokat érinti. A P59 neuroprotektív hatású volt. Szövettani vizsgálatainkból kitûnik, hogy az LPYFD-vel kezelt állatok esetén a hiperativált gliák száma nem haladja meg a kontrolloknál tapasztalt mértéket, ugyanakkor az â-amlyoiddal és LPYFD-vel is kezelt, valamint a kizárólag â-amyoid-kezelt állatokat összehasonlítva is közel azonos mértékû hiperreaktivitást tapasztalunk. Ezek az elõzetes eredmények alátámasztják a magatartási vizsgálatok során is megfigyelt hasonlóságot az â-amlyoid-kezelt és a mellette védõanyagot kapott csoportok memóriafunkcióiban. A reaktív asztrociták és a plakkszerû struktúrák megjelenése igen kifejezett volt az amiloiddal kezelt állatokon. Transzgenikus modell: a P59 és P79 gyógyszerjelölt anyagok tesztelése most fut. Az eredmények összefoglalása, további lépések Magyarországon kb. 100.000, a világon 10 milliós nagyságrendû az Alzheimer-kórban szenvedõk száma. A betegségnek jelenleg nincs kielégítõ gyógykezelése. Egy Alzheimer-kór elleni gyógyszernek óriási forgalma lenne, de már egy lezárt preklinikai dosszié is nagyon értékes. Újabb 23 vegyület elõállításával lezártuk a szabadalmazandó vegyületek körét. Bebizonyítottuk, hogy a P59 és P79 felszívódik, átmegy a vér-agy gáton és kivédi az Aâ toxikus hatását. Kiderítettük a fenti vegyületek hatásmechanizmusát. 2008-ban lezárjuk az állatkísérleteket és értékesítjük a szabadalmat. 2. Klaszter: Neuroprotektív szabad-gyökfogó vegyületek tervezése, szintézise, biológiai tesztelése. Kísérleti vér-agy gát modell kidolgozása. Projektvezetõ: Dr. Zarándi Márta Munkacsoport-vezetõk: Dr. Farkas Eszter, Dr. Deli Mária Célok és rövid áttekintés (1.7 részfeladat) Neuroprotektív szabad-gyökfogó vegyületek tervezése, szintézise, biológiai tesztelése. Kísérleti vér-agy gát modell kidolgozása. Elvégzett tevékenység: Neuroprotektív szabad-gyökfogó vegyületek tervezése, szintézise, biológiai tesztelése: 1. á- és ã-tocopherol antioxidáns hatásának in vitro vizsgálata 2. a vegyületek in vitro tesztelése sejttenyészeten, szabad gyök képzõdés és megkötés kimutatása 3. agyi hiperfúziós modellben, határozzuk meg a várt neuroprotekció mértékét 4. vér-agy gát funkciók vizsgálata: efflux pumpa mûködés, permeabilitás változások, junkcionális fehérjék expressziójának és lokalizációjának változásai. Eredmények 1, Tocopherol származékok és tesztelésük . Elõzõ kísérleteink szerint az á-tocopherol a patkányokban csak óriási dózisban (100 mg/kg ip beadással) okozott mérhetõ neuroprotektív hatást. A szakirodalom az utóbbi években számos negatív eredményrõl számol be az á-tocopherollal kapcsolatban: az enyhe kognitív hanyatlásban nem találtak hatást (Petersen R.C. The New England J. Med. 352:2379, 2005), az Alzheimer-kórban nagy beteganyag statisztikai elemzése is hatástalannak mutatta az á-tocopherolt (Foley D.J. JAMA287:3261, 2002). Néhány szakirodalom a nagy dózisú, (30 IU/nap felett) á-tocopherol káros, oxidáló hatásáról számol be, ami nem meglepõ a vegyület standard redoxpotenciáljának ismeretében. Az á-tocopherol nagy dózisai oxidálják a lipideket („átocopherol mediated peroxidation”). 400 IU/nap dózisban adott á-tocopherol már a kardiovaszkuláris betegségek kockázatát növeli. Minden eddigi kísérlet eredménye arra utal, hogy az á-tocopherol nem mint szabadgyökfogó vegyület, hanem mint génexpressziót és szignáltranszdukciót szabályozó anyag játszik fontos élettani szerepet. Szabályozza pl. a protein kináz C enzimet, ezáltal egy sorozat biokémiai reakciót és a sejtproliferációt. á-Tocopherol jelenlétében számos olyan gén aktivitása csökken, amelyek az akut gyulladás kialakulásáért felelõsek. Az á-tocopherol gyenge felszívódási készsége és a vér-agy gáton történõ átjutás nehézsége szintén hozzájárultak ahhoz, hogy a nagy centrumokban placebo kontrollal végzett vizsgálatok az Alzheimer-kór elleni védelem szempontjából negatív eredménnyel zárultak. Saját laboratóriumi kísérleteink azt bizonyítják, hogy az á-tocopherol számos veszélyes és reakcióképes oxidálószerrel nehezen lép reakcióba és szabad gyökfogó tulajdonsága gyenge. Ezzel szemben azt találtuk, hogy a ã -tocopherol (dezmetil-átocopherol) sokkal jobb antioxidáns, könnyen reagál a reaktív nitrogénoxidokkal (RNOS) és 5-nitro-ã tocopherollá alakul át. A ã-

13

tocopherol szintje a vérplazmában a rákbetegségek és a kardiovaszkuláris betegségek rizikójának jó biomarkere, egyben a prosztatarák megelõzésének legjobban bevált vegyülete (Wagner K.H. et al Ann. Nutr. Metab. 48:169, 2004). Az E-vitamin másik izoformája, az á-tocotrienol sejtkultúrában (striatális primer kultúra) a legjobbnak bizonyult neuroprotektív anyag, már nanomólos koncentrációban hatásos. Saját kísérleteink és a szakirodalom alapján egyértelmûvé vált, hogy neuroprotektív anyagként az á-tocopherol nem használható. Ennek egyszerû kémiai oka van: a gyûrûrendszer 5. helyén lévõ metilcsoport megakadályozza a szabad gyökökkel történõ gyors reakciót. Neuroprotekcióra, így az Alzheimer-kór prevencióra elsõsorban az 5-dezmetil forma, a ã-tokoferol és a tokotrienolok alkalmasak. Eddig ezek magas ára határt szabott a kísérleteknek, de az újonnan alapított LipidArt spin-off cégen keresztül sikerült olcsó, természetes ã-tocopherolhoz jutni. Ciklodextrinek segítségével a ã-tocopherol és a tocotrienolok felszívódása megjavult és az elõkísérletek szerint a vér-agy gáton történõ átjutás is növekszik. Az olcsó és természetes forrásból izolált ã-tocopherollal most kezdjük el az in vivo kísérleteket egy optimális diéta kialakítására, patkány modellen. 2, Agyi endotélsejtek interakciójának vizsgálata pathológiás fehérjeaggregátumokkal, peptidekkel: efflux transzporter aktivitás. Kísérleteinkben az amyloid típusú peptidek agyi endotélsejtekre gyakorolt közvetlen hatását vizsgáljuk. Megállapítottuk, hogy a â-amyloid peptidek, és a prion fehérje (Prp) 106-126 peptidszakasza toxikus hatást fejt ki agyi endotélsejtekre, károsodik az endotélsejtek barrier funkcióközti szoros zárókapcsolatok mûködése és az agyi endotélsejtek TJ struktúrája. A 2007-es évben a munkatervnek megfelelõen kísérleteinket az efflux transzporterek vizsgálatára összpontosítottuk. A vér-agy gát egyik legfontosabb tulajdonsága, hogy megteremti a központi idegrendszer homeosztázisát. Ebben fontos szerepet játszanak az efflux transzporterek, amelyek megakadályozzák a toxikus xenobiotikumok bejutását az idegrendszerbe, illetve segítik a káros metabolitok eltávolítását. A vér-agy gát két fontos efflux transzportere a P-glikoprotein (Pgp)és a multidrog rezisztencia fehérje1 (MRP-1). Az efflux pumpa mûködést a Pgp ligand rodamin 123 sejten belüli akkumulációjával mértük. Primer agyi endotélsejt tenyészetekben inkubálás után a rodamin szintje alacsony, amit a Pgp inhibitor cyclosporin A jelentõsen megemelt. A sejtek kezelése oldhatatlan fehérjeaggregátumot létrehozó PrP106-126 peptiddel koncentráció-függõ módon megnövelte a sejten belüli rodamin szintet, ami azt jelenti, hogy a peptid hatására az endotélsejtek efflux transzporter mûködése károsodott. Ezt a károsító hatást pentosan ki tudta védeni, míg önmagában a Pgp aktivitást nem befolyásolta. RT-PCR technikával igazoltuk, hogy a PrP106-126 peptid a Pgp mRNS expresszióját is szignifikánsan csökkentette. Az MRP-1 pumpa számos xenobiotikum, gyógyszerhatóanyag mellett glutation-konjugált vegyületek efflux transzportjáért felelõs. Aktivitását a glutation-konjugált bimane sejten belüli és sejtbõl kipumpált mennyiségének arányával határoztuk meg. Az ismert inhibitor, az indomethacin jelentõsen gátolta az MRP-1 pumpa mûködését. A PrP106-126 peptid az MRP-1 efflux aktivitását is szignifikánsan csökkentette, amit pentosan kezeléssel gátolni tudtunk. Pentosan kezelés önmagában jelentõsen fokozni tudta az MRP-1 efflux pumpa aktivitást, ami a vér-agy gát funkciókra kifejtett kedvezõ hatásának újabb bizonyítéka. Amyloid típusú peptid a vér-agy gát efflux pumpáinak mûködését gátolta, amit a korábbi kísérleteink során protektívnek bizonyult pentosan, egy erõsen szulfatált poliszacharid ki tudott védeni. A pentosan, mint vér-agy gát protektív hatóanyag klinikai fontosságú lehet neurodegeneratív megbetegedésekben. Eredmények összefoglalása, további lépések Farmakológiailag nagyon jelentõs lenne olyan tokoferol származékok vagy kompozitok elõállítása, amelyek átjutnak a vér-agy gáton és neuroprotektív hatásúak. Erre komoly kereslet van és azonnal eladható funkcionális élelmiszerként lenne forgalmazható. A ã -tokoferolt és tokotrienolokat, ill. komplexeiket próbáljuk 2008-ban funkcionális élelmiszerré fejleszteni. 3. Klaszter: Az Alzheimer-kór gyógyszerjelölt vegyületeinek in vivo vizsgálata és toxikológiája. Projektvezetõ: Dr. Falkay György Munkacsoport-vezetõk: Dr. Nagymajtényi László, Dr. Benedek György, Dr. Erõs István Célok és rövid áttekintés (1.8 részfeladat) Az Alzheimer- és Parkinson-kór gyógyszerjelölt vegyületeinek in vivo vizsgálata és toxikológiája. Elvégzett tevékenység: Az Alzheimer- és Parkinson-kór gyógyszerjelölt vegyületeinek in vivo vizsgálata és toxikológiája: 1. hatóanyagok transzportjának elõsegítése a vér-agy gáton keresztül 2. toxikológiai paraméterek megállapítása 3. gyógyszerjelölt vegyületek (LPYFD, P59) szervmegoszlása, bejutása az agyba 4. a kijelölt gyógyszerjelölt vegyületek (2 molekula) biztonságfarmakológiai vizsgálata. Eredmények 1, Hatóanyagok transzportja a központi idegrendszerbe. Az á-tokoferol és a ã-tokoferol protektív hatását vizsgálatuk az Alzheimer-kór kialakulásával kapcsolatban. Célul tûztük ki megfelelõ hordozórendszer kifejlesztését, mely egyaránt biztosítja a lipofil karakterû E-vitamin oldékonyságát, valamint elõsegíti a hatóanyag vér-agy gáton keresztül történõ transzportját. Az intranazális bevitel mellett ezért a fenti követelményeknek megfelelõ nem-ionos tenzidekbõl felépülõ vezikuláris gyógyszerhordozók (nioszómás rendszerek) formulálását és vizsgálatát is megkezdtük. Elõkísérleteink során nátrium-fluoreszceint alkalmaztunk modellanyagként. A tesztvegyületet három vivõanyagban dolgoztuk fel. Az elsõ rendszer foszfát puffer (pH=7,4), második és a harmadik Span60-at és koleszterint 1:1 mólarányban tartalmazó

14

nioszómás rendszer volt. A harmadik összetétel azonban glükóz alapú emulgenst is tartalmazott, mely várakozások szerint az agyi kapillárisok endotélsejtjein található glükóztranszporter rendszerhez (GLUT1) kapcsolódva receptor mediált endocitózis révén fokozza a vezikulumba bezárt hatóanyag központi idegrendszerbe irányuló transzportját. Vizsgálatainkhoz 10 hetes Wistar patkányokat (n=36) használtunk. A beadás minden vivõanyag esetén 5ml/ttkg dózisban történt az éteres narkózissal elaltatott patkányok farokvénájába. Az állatokat 3, 10, 30 perccel a beadást követõen éteres túlaltatással elpusztítottuk, agyukat eltávolítottuk. Az agyakból 6 régiót különítettünk el további vizsgálatok céljából, ezek a szaglógumó, az agykéreg, a hippokampusz, a köztiagy, a híd és a kisagy voltak. 3 perccel a beadás után a legmagasabb agyi szinteket a targetált nioszómák esetén mértük, míg 10 perccel a kezelés után a nem targetált nioszómás rendszer alkalmazásakor kaptuk a legjobb eredményt. A 30 perces adatokat tekintve viszont a pufferben oldott tesztanyag alkalmazásakor némileg magasabb értékeket kaptunk. Az eredmények talán azzal magyarázhatóak, hogy az alkalmazott glükóz alapú emulgens hidrofil fejcsoportját különbözõ hosszúságú glükózmolekulákból felépülõ lánc alkotja, melynek monoglikozid frakciójának részaránya nem volt elegendõ a GLUT1 transzporteren történõ transzport kellõen hatékony fokozásához. Továbbiakban tervezzük tisztán alkil-monoglikozidot tartalmazó emulgens kipróbálását. 3

2, A [ H]LPYFD és a P59 gyógyszerjelölt vegyület központi idegrendszerbe történõ bejutásának in vivo vizsgálata patkányban. Korábbi vizsgálataink során megállapítottuk, hogy a tríciált LPYFD intravénás bevitelét követõen radioaktivitás detektálható az agyban, tehát a [3H]LPYFD vagy radioaktív metabolitja(i) bejutnak a központi idegrendszerbe. A pályázat jelenlegi szakaszában célul tûztük ki annak eldöntését, hogy a központi idegrendszerben észlelt radioaktivitásért az intakt [3H]LPYFD vagy annak metabolitjai a felelõsek. A hím patkányokat (SPRD, tömeg: 200 g) 200, illetve 500 ml tríciált LPYFD peptiddel kezeltük intravénásan, illetve intraperitoneálisan majd két óra elteltével az állatok agyát eltávolítottuk. A folyékony nitrogénben lefagyasztott agyakból 25% és 75%-os acetonitriles (ACN) extraktumot készítettünk, melyeket HPLC analízisnek vetettünk alá (UV- és radiokromatográfiás detektor). A [3H]LPYFD biotranszformációját in vitro körülmények között is megvizsgáltuk (agyi membránpreparátum, ACN-es extrakció, HPLC). Megállapítottuk, hogy 2 órával a kezelés után az intakt peptid csekély mennyiségben, a tríciumot hordozó metabolitjai viszont nagyobb mennyiségben mutathatók ki az agyban. 3 A [ H]LPYFD metabolizmusa bizonyos mértékben in vitro körülmények között agyi membránpreparátumban is végbemegy, de az intakt peptid minden frakcióban kimutatható és a keletkezõ metabolitok száma is kevesebb, mint az az in vivo kezelést követõen tapasztalható. Ez arra utalhat, hogy az agyban nem várható intenzív metabolizmus. Az in vivo és in vitro vizsgálatokból levonható az a következtetés, miszerint a LPYFD metabolizmusa jelentõs a periférián. A P59 gyógyszerjelölt vegyület triciált alakjával szintén elvégeztük a fenti kísérleteket. Ez az anyag peptidomimetikum és rezisztens a proteolitikus enzimekkel szemben. Intravénás bevitele után sem bomlik, az agyban még a beadás után 2 órával is jól kimutatható, viszont a vizelettel elég gyorsan kiürül. 3, Új állatmodell amiotroph lateral sclerosisra; toxikológiai és biztonságfarmakológiai vizsgálatok Újabb in vivo modellek kifejlesztésén is dolgozunk, melyek alkalmasak lehetnek az amyotrophikus lateral sclerosis (ALS) szimulálására patkányban, ez az irány azért fontos, mert néhány adat arra utal, hogy az Alzheimer betegség és az ALS patomechanizmusában vannak hasonlóságok. Eddigi vizsgálataink szerint a 25-35 amyloid peptid intrathecalis adagolása esetén jelentõs arányban bénultak az állatok, míg az 1-42 peptid hatástalan volt. A jövõben tervezzük a kipróbálását azon anyagoknak ezen modellben, melyek hatékonyak voltak Alzheimeres állatmodellekben. A P29 gyógyszerjelölt vegyület megismételt toxikológiai vizsgálata azt mutatta, hogy a vegyület egészen 100 mg/kg határig nem toxikus (egér). A P59 toxikológiai vizsgálata (28 napos kísérlet) elkezdõdött. Jelenleg fut mindkét vegyület biztonságfarmakológiai vizsgálata is. Eredmények összefoglalása, további lépések A fenti vizsgálatok pozitív eredménye esetén ezen a szinten lezárható a preklinikai vizsgálatsorozat és egy eladható termék jön létre, amely Alzheimer-kór ellenes gyógyszer kifejlesztése esetén nagy értéket képvisel. Szükségesnek látszik egy új, kevésbé vízoldható és lassabban kiürülõ gyógyszerjelölt vegyület tervezése a P59 szerkezet alapján. 2. ALPROGRAM: Szorongásos betegségek és kóros neuroendokrin folyamatok (tanulás- és memóriazavarok, stressz, szenvedélybetegségek) gyógyszeres kezelése. Az alprogram két területen kapcsolódik a gyógyszerkutatáshoz és -fejlesztéshez: a szorongásos betegségek és a depresszió (4. klaszter), illetve a szenvedélybetegségek kezelésére alkalmas új vegyületek kutatásával (5. klaszter). Külön kutatásifejlesztési irányt képvisel az enterális idegrendszer, a „brain-gut axis” vizsgálata (7. klaszter). 4. Klaszter: Anxiolitikumok kutatása; AMPA-receptorok modulációja Projektvezetõ: Dr. Telegdy Gyula Munkacsoport-vezetõk: Dr. Telegdy Gyula, Dr. Lévay György Célok és rövid áttekintés (2.1-2.3 részfealadat)

15

1, Szorongást és stresszhatást befolyásoló, anxiolitikus hatású peptidek és peptidomimetikumok tervezése, szintézise és biológiai vizsgálata. 2, Az AMPA/Kainát receptorokat moduláló potenciális gyógyszerek szintézise, in vitro és in vivo tesztelése és Az AMPA receptor moduláló gyógyszerek hatásmechanizmusának vizsgálata. Elvégzett tevékenység: Új vegyületek tesztelése állatkísérletekben. Tanulás és memória funkciók aktív és passzív elhárításos tanulási tesztekben. A vegyületek és analógjainak hatása az anxietás-anxiolysis folyamataira az ún. „elevated plus maze” rendszerben. Glutamát receptorokat moduláló potenciális gyógyszerek szintézise. 70 új, még korábban le nem írt molekula szintézise, valamint farmakológiai vizsgálata. Az NMDA receptor moduláló gyógyszerek hatásmechanizmusának vizsgálata: - a gyógyszerjelölt anyagok hatására történõ neurotranszmitter-felszabadulás meghatározása in vitro szuperfúziós technikával - a modulátorok által befolyásolt fehérjék proteomikai vizsgálata. Az NMDA receptor moduláló gyógyszerek hatásmechanizmusának vizsgálata, in vitro és in vivo tesztelése. A kiemelkedõ in vivo hatékonyságú vegyületek elõzetes gyógyszerbiztonsági, toxikológiai, mutagenitási (Ames teszt) és egyéb biztonság farmakológiai vizsgálatok. Eredmények Anxiolitikum és antidepresszáns hatású peptidek Kimutattuk, hogy az urocortinok (1,2,3) antidepressziós tesztben különbözõ módon hatnak. Az urocortin 1-nek nincs antidepressziós hatása, míg az urocortin 2 kismértékû, az urocortin 3 jelentõs antidepressziós hatással rendelkezik. Az urocortin 3 fragmentumainak antidepresziós hatását vizsgáltuk a hatáscentrum megállapitására. Kiderült, hogy a biológiai hatás a C-terminális 3-4 aminosavból álló fragmentumhoz kötött. A fragmentumból analógok készültek (Tóth Gábor - Orvosi Vegytani Intézet) és az analógok közül többnek kimutattuk az antidepressiós hatását. Az ezzel kapcsolatos szabadalmi eljárás elkezdõdöttt és a Szegedi Tudományegyetem hozzájárulása után a szabadalmi bejegyzés elindítható. Kimutattuk, hogy az urocortin 3 antidepressziós hatásában adrenergiás és serotonergiás mechanizmusok is résztvesznek. In vitro superfuziós rendszerben kimutattuk, hogy a CRF és az urocortin 1 fokozta a GABA release-t amygdala szeletek elektromos ingerlésére, amely hatás CRF1 antagonistával, antalarminnal, felfüggeszthetõ volt. A CRF 2 antagonista, astressin 2B, hatástalan volt. Urocortin 2 és urocortin 3 hatástalannak bizonyult az amygdala GABA releasére eletromos ingerlést követõen. Részletesen vizsgáltuk a neuromedin S hatását a hypophysis-mellékvesekéreg rendszer mûködésére, a különbözõ magatartási rekciókra és autonom folyamatokra. A neuropeptid S fokozta a mellékvesekéreg aktivitását dózis-hatás összefüggésben, amely hatás gátolható volt CRF 1 antagonistával. Fokozta az állatok mosakodási reakcióját, amely haloperidollal (dopamin antagonistával) és CRF 1 antagonistával gátolható volt. In vitro rendszerben a Neuromedin S fokozta a dopamin release-t amygdala szeletekbõl, azonban nem volt hatása a lokomócióra. NMDA-receptor moduláló vegyületek Ahogyan ezt már az elõzõ beszámolóban jeleztük, a glutamát receptor modulátorok projekt keretében kisebb módosítás történt. Az eddig vizsgált AMPA receptor modulátorok további vizsgálatait kellõen hatékony fejlesztésre alkalmas jelölt molekula hiányában leállítottuk. A továbbiakban a receptor család másik fontos tagjának, az NMDA receptor modulátorainak, nevezetesen a glicin kötõhelyen modulátor szerepet játszó, a glicin szintet szabályozó glicintranszporter-1 (GlyT-1) gátló hatású vegyületek vizsgálatait végezzük. A GlyT-1 inhibitorok az NMDA receptor komplex mûködésének módosításával hatékony terápiás eszközök lehetnek a depresszió és a schizophrenia gyógyításában. Az elmúlt idõszakban a project keretében az elõbbiekben említett GlyT-1 inhibitorok vizsgálatait, illetve a részletes farmakológiai karakterizáláshoz szükséges új modellek beállítását végeztük. Az eddigiekben alkalmazott „spreading depression” és „patch clamp” modelleket fokozatosan felváltják a glicin transzporter aktivitás mérésére szolgáló rendszerek (glicin release mérése, mikrodialízis), ezt követõen pedig azok az új módszerek, amelyek a különbözõ központi idegrendszeri stimulánsok (PCP-fenciklidin, MK-801, amphetamin, stb.) által kiváltott speciális viselkedésformák (hipermotilitás, sztereotipia) gátlásán alapulnak. Az új módszerek beállítása és validálása a referens vegyületek felhasználásával megtörtént. Az elmúlt évben több vegyületcsaládban összesen kb. 70 db új vegyület szintézise történt meg. A vegyületek biológiai hatékonyságát a projektben elfogadott screen rend szerint vizsgáljuk. Az átmeneti idõszakban a fentieknek megfelelõen a következõ vizsgálatokat végeztük el: · Spreading depression mérése izolált csirke retinán: a teszten 35 vegyületet vizsgáltunk meg. · Patch clamp vizsgálatok izolált cerebelláris szemcsesejteken: 10 vegyület vizsgálatát végeztük el, az NMDA receptor funkciót jelentõs mértékbe egyik vizsgált vegyület sem változtatta. · Glicin felszabadulás mérése agyszeletbõl: 10 vegyület mérését végeztük el. · Glicin és glutamátszintek mérése mikrodialízis technikával éber patkányban: a módszer beállításon kívül 2 vegyület mérését végeztük el. · PCP és MK-801 hipermotilitás gátlására a referensek mellett 15 vegyületet vizsgáltunk meg, jelentõsebb hatást 2 vegyület esetében találtunk, ezeket további in vivo módszerekkel is meg fogjuk vizsgálni. · Egyéb magatartás-farmakológiai vizsgálatot 2 vegyülettel végeztünk. Eredmények összefoglalása, további lépések Az urocortin-3 jelentõs antidepresszáns hatással rendelkezik, megtaláltuk a hatásért felelõs aktív centrumot. Nagy gyakorlati jelentõsége van a szorongást és stresszhatást befolyásoló peptideknek és mimetikumoknak, ezek mint vezérvegyületek (lead)

16

szerepelnek a további gyógyszerfejlesztésekben. A vegyületekre szabadalmat kérünk. Az NMDA receptor moduláló vegyületek a pánikbetegségek gyógyszerjelölt molekulái. 5. Klaszter: Opioid agonisták és antagonisták Projektvezetõ: Dr. Borsodi Anna Munkacsoport-vezetõk: Dr. Benyhe Sándor, Dr. Tóth Géza, Dr. Szûcs Mária, Dr. Szabó Gyula Célok és rövid áttekintés (2.4-2.5 részfeladat) 1. Új opioid és nociceptiv receptor szelektív agonista és antagonista peptidek szintézise, radiojelölése, biokémiai vizsgálata. 2. Opioid peptidek komplex magatartás vizsgálata. javaslat egy nem addiktív új opioid típusú analgetikum vagy gyógyszerkombináció összeállítására. Elvégzett tevékenység: â-aminosavakat tartalmazó peptidek tervezése és szintézise. Radioaktív opioid ligandum termékké fejlesztése. Az elõzõ évben kiválasztott és tríciált opioid antagonista származék további részletes hatástani jellemzése natív szövetekben, sejttenyészetekben. A radiopeptidek in vitro stabilitási vizsgálatai. A lead nociceptiv analógok és antagonisták vizsgálata krónikus adminisztráció esetén. Opioid peptidek komplex magatartás vizsgálata: Patkányok alapvetõ magatartási reakcióinak (explorációs, tájékozódási, mozgáskoordinációs magatartás) vizsgálata. Eredmények 1, Opioid agonista és antagonista vegyületek szintézise, radiojelölése, biokémiai vizsgálata. Néhány biológiailag jelentõs endomorfin származékunkból in vivo vizsgálatokra (analgézia tesztek) új szintézisekkel 100 mg-os tételben állítottunk elõ peptideket. Glicinnel meghosszabbított endomorfin-1 és endomorfin-2 származékokat mint biológiai prekurzorokat terveztünk és szintetizáltunk és biokémiailag és farmakológiailag jellemeztünk. Új endomorphin analógokat szintetizáltunk Aba-Gly és spiro-Aba-Gly dipeptidek felhasználásával. A Tyr-spiro-R-Ala-Gly-Phe-NH2-ról NMR és molekula modellezési módszerekkel bizonyitottuk a â-kanyar szerkezetet a peptidláncban, és ez az analóg radioreceptor kötési vizsgálatok alapján megtartotta a potent és mu opioid szelektivitását. Radioaktívan jelzett Dmt-endomorfin-2 anyagunk kereskedelmi termék lett. Radioaktív jelölési technikáink segítettek új megbízások megszerzésében hazánkban és a világ más részeiben is (ESTEVE, IVAX). Tríciált anyagjaink 2007-ben eljutottak Franciaországba, Ausztriába, Angliába, az USA-ba, Lengyelországba és Olaszországba. Az új opioid antagonista peptid analóg [3H]H-Dmt-Tic-(2S,3R)âMePhe-Phe-OH szintézise és katalitikus tríciálása a jódozott prekurzor peptidbõl sikeresen megvalósult. A tisztított radiojelzett peptid specifikus aktivitása 2.15 TBq/mmol (58 Ci/mmol). Ezen vegyület újdonságnak számít mivel egy szerkezetileg módosított tirozin csoport (2',6'-dimetiltirozin, Dmt1) helyettesíti az egyes helyzetben lévõ tirozint az N-terminálison, valamint egy â-metil szubsztituált fenilalanin (âMePhe3) csoport található a hármas helyzetben. Mivel a âMePhe csoport különbözõ diasztereomer konfigurációt ad és ezáltal módosíthatja a biológiai aktivitást, mindkét lehetséges jelöletlen threo diasztereomer analógot (2S,3R és 2R,3S) megvizsgáltuk és bevontuk a kísérletekbe. Ezen analógok affinitását és szelektivitását (-opioid illetve -opioid receptor) radioligand kötési kísérletekben elemeztük. A különbözõ agonista illetve antagonista karakterüket, funkcionális [35S]GTPS kötési kísérletekben vizsgáltuk, kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtvonalakon melyek szelektíven és stabilan expresszálnak ä- vagy ì-opioid receptorokat. Egyensúlyi kísérletekben, a radiojelzett peptid származék [3H]H-Dmt-Tic-(2S,3R)âMePhe-Phe-OH kötõdése patkány agyimembrán homogenátumokban telíthetõ volt, és a Scathard szerinti transzformáció egy-kötõhelyes kötõdést mutatott 0.3 nM-os Kd és 127 fmol/mg fehérje Bmax értékekkel. Heterológ kompetíciós kísérletekben a [3H]H-Dmt-Tic-(2S,3R)âMePhePhe-OH kötõdésének gátlása különbözõ receptor-típus specifikus opioid jelöletlen ligandokkal a következõ kompetíciós kötési mintázatot adta: ä>ì>ê, utalva a ä-opioid kötõhelyek szelektív jelölésére. A funkcionális kísérletekben, mindkét (2S,3R) és (2R,3S) peptid parciális agonista hatást mutatott; önmagukban csak kismértékben aktiválták a szabályozó G-fehérjéket a CHOsejtvonalakon, de mindkét sztereoizomer kompetitív módon gátolta az agonistával stimulált [35S]GTPS kötést a rekombináns receptorokat expresszáló rendszerben. ä-CHO sejteken a (2S,3R) izomer mutatott nagyobb ä-antagonista hatást. Több új endomorfin származék, köztük a béta-metil szubsztituált ciklohexil-alanin oldalláncot tartalmazó analógok széles körû biokémiai hatásvizsgálatát végeztük el. Jellemeztük a prolin-oldalláncán (Pro2) tríciált Dmt1-endomorfin II radioligandot. Farmakológiai kísérletekben mutattuk ki a Xenopus laevis trópusi és laboratóriumi békafaj természetes opioid peptidjének, a xendorfin-1-nek in vivo antinociceptív hatásait kétéltûekben. Biokémiai és funkcionális tesztekben jellemeztünk két, a TIPP delta-opioid receptor szelektív antagonista tetrapeptidek ('Schiller-peptidek') családjába sorolt, új, diasztereomer analógot, illetve egyikük radiojelzett változatát: [3H]H-Dmt-Tic-(2S,3R)âMePhe-Phe-OH. Megállapítottuk, hogy a nagy affinitású opioid ligandok egyidejûleg hordozzák a ì-agonista és ä-antagonista hatást. Biokémiailag jellemeztük a szintetikus endomorfin peptidomimetikumokat (Aba-Gly és spiro-Aba-Gly származékok). A konformációsan gátolt szerkezetek egyike, a Tyr-spiro-RAba-Gly-Phe-NH2 tetrapeptid a természetes endomorfinokhoz közelítõ affinitást és szelektivitást mutatott (hatásmegõrzés), másodlagos szerkezetében a â-turn konformáció dominál. 2, Opioid peptidek komplex magatartás vizsgálata. Nem addiktív új opioid típusú analgetikum kifejlesztése. Kis dependenciakapacitású, kevés mellékhatással rendelkezõ opioid analgetikum kifejlesztése, ún. 'lead' molekulák kiválasztása céljából szerkezet-hatás vizsgálatokat végeztünk a ì-receptor endogén ligandjainak tekintett endomorfin-1 és endomorfin-2 konformációsan gátolt 8 új származékával. Vizsgálatainkat kiterjesztettük a morfin kezelés beszüntetése utáni molekuláris változások mérésére. Megállapítottuk, hogy ha ez spontán történik, akkor a sejtfelszíni -opioid receptorok száma 37

17

%-kal, míg naltrexon-precipitált elvonáskor 66%-kal nõ. Az elvonás fázisában a receptorok jelátviteli sajátságaiban nem észleltünk szignifikáns változásokat. A megvonási tünetek kialakulásában az intracelluláris -opioid receptorok nem játszanak fontos szerepet, szemben a morfin dependencia állapotával. A ì-opioid receptorok endogén ligandja, az endomorfin 16 új, aliciklusos â-aminosavat tartalmazó konformációsan gátolt származékával végzett korábbi szerkezet-hatás vizsgálataink alapján, a tolerancia vizsgálatainkhoz lead molekulának a Tyr(1S,2R)ACHC-Phe-Phe-NH2 ligandot választottuk. Az új peptidet intracerebroventrikulárisan injektáltuk patkányokba. Megállapítottuk, hogy a peptid ismételt adásakor (20 ìg, b.i.d., 10 nap) analgetikus tolerancia jön létre. Ez nem jár együtt a receptorok internalizációjával/down-regulációjával, viszont az intracelluláris -opioid receptor szám 46%-kal up-regulálódik. A krónikus peptid kezelés nem váltott ki receptor deszenzitizációt. Elvégeztük egy új, konformációsan gátolt, peptidomimetikum radioantagonista, a [3H]TYR-TIC-(2S,3R)-â-MEPHE-PHE-OH részletes kötési és funkcionális sajátságainak vizsgálatát. Az új ligand az alapvegyületnél négyszer potensebb ä-antagonista patkány agyban illetve rekombináns receptorokat expresszáló sejtvonalban. Amerikai együttmûködésben kimutattuk, hogy az új ligand intrathekális adása után mért tail-flick analgézia tesztben ún. ä1-opioid receptor szelektív antagonistaként viselkedik, mely összhangban van vadtípusú és transzgenikus agyi mmembránokban kapott funkcionális méréseinkkel. A radioligand kedvezõ tulajdonságai (magas affinitás, stabilitás, ä1-specifitás) miatt kiváló eszköz lehet szerkezeti és topográfiai vizsgálatokhoz. Kimutattuk, hogy a kannabinoid CB1 és a GABAB receptorok funkcionális interakcióba lépnek patkány hippocampusban és egy olyan új egységet hoznak létre, amelynek jelátviteli és ligandkötõ sajátságai eltérnek az egyedi receptorokétól. Hipotézisünk szerint receptor hetero-oligomerizációja állhat a háttérben. Eredmények összefoglalása, további lépések A szenvedélybetegségek (kábítószer- és alkoholfüggõség) leküzdésének elsõ lépését jelentik azok a vizsgálatok, melyek a különbözõ agonista és antagonista peptidek és mimetikumok pontos hatásmechanizmusának megértését teszik lehetõvé. Errõl a pontról indulhat egy racionális gyógyszertervezés. 6. Klaszter: Az enterális idegrendszer, a „brain-gut axis” vizsgálata Projektvezetõ: Dr. Lonovics János Munkacsoportvezetõ: Dr. Izbéki Ferenc Célok és rövid áttekintés (2.6 részfeladat) Új terápiás eljárások kidolgozása a „brain-gut axis” károsodása következtében kialakuló betegségek kezelésére. Elvégzett tevékenység: A szerin proteázok szerepe irritábilis bélbetegségben (IBS). Az IBS és a viscerális hiperszenzitivitás gyógyszeres befolyásolásával kapcsolatos vizsgálatok. Gliasejt-károsodás az enterális idegrendszerben (ENS) diabeteszes betegeknél. Eredmények Irritábilis bélbetegségben (IBS) a stressz vastagbél permeabilitás fokozódást és viscerális hiperszenzitivitást okoz. Kimutattuk, hogy a hasmenéssel járó IBS betegekben a széklet szerin-proteáz aktivitás emelkedett és a székletszám korrelál a proteáz emelkedettség mértékével. További vizsgálataink célja természetben elõforduló proteáz inhibitorok (szója, burgonya) szerepének vizsgálata az IBS kezelésésben. A stressz és a fekélybetegség kapcsolatában teszteltük a gasztrin lehetséges szerepét gasztrin knock-out (GKO) és vad típusú (WT) egerekben két, jelenleg a fekélybetegség kezelésében használt gyógyszer, omeprazol és ranitidine alkalmazásával. A GKO-egerek savszekréciója 65%-kal csökkent. A WT-egérben omeprazollal a gasztrin savtermelést fokozó hatása teljesen gátolható volt. Ranitidinel csak a kisdózisú gasztrin-stimulált savszekreció volt blokkolható, a nagydózisú gasztrin hatását csak részben tudtuk gátolni. A GKO-egerekben sem gasztrinnal sem hisztaminnal nem lehetett a savszekréciót serkenteni. Ezen kisérletek alapján kidolgoztuk humán endoszkópos mintából gyomormirigyek tenyésztését és ezek gyógyszeres befolyásolásának módszerét. További gyógyszeralkalmazási kutatási célunk a gasztrin és acetilcholin által kiváltott savszekréció jellemzése. Cukorbetegségnél fellépõ gyomor-bélrendszeri károsodásokban a bél-idegrendszer (ENS) neuronális és glia sejtjei egyaránt szerepet játszhatnak, amelyek a betegek hatékony kezelését is gátolják. A cukorbetegekben gyakori hasmenés tanulmányozásásval kapcsolatban patkányokban kimutattuk az ENS nitrerg elemeinek jelentõs pusztulását a vékonybél disztális szakaszán és a vastagbélben. Ezt a károsodást korai inzulinkezeléssel megelõztünk és a béltranzit-idõ is normalizálódott. Eddig nem vizsgált terület a glia károsodásának szerepe a cukorbetegek kóros ENS mûködésében. Eredményeink szerint a rövid idõtartamú cukorbetegségben nem alakul ki jelentõs glia károsodás, viszont a tartós diabétesz jelentõs glia károsodást is okoz, mely fokális és/vagy segmentalis. A munka további folytatásának célja a károsodás jellegének vizsgálata és a korai inzulinkezelés szerepének tisztázása a gliasejt-károsodás megelõzésében. Eredményeink két gyakori, jelentõs népegészségügyi problémát képezõ stresszhez kötõdõ betegségben merõben új terápiás megközelítések közvetett kidolgozását teszik lehetõvé. Cukorbetegségben eredményeink aláhúzzák a korai kezelés fontosságát kóros bélmûködés kezelésében, továbbá új utakat nyithatnak meg a nitrerg elemek specifikus farmakológiai befolyásolásában. Eredmények összefoglalása, további lépések A krónikus alkoholizmus, a diabetes és a stressz egyaránt károsítja az enterális idegrendszert, ezért hatásuk jelentõs

18

népegészségügyi problémát jelent. Ennek farmakológiai befolyásolása a betegek százezreinek életét könnyítené meg. 3. ALPROGRAM: Neurodegeneratív kórképek patomechanizmusa: neuroprotelktív hatású farmakonok fejlesztése. Az alprogramban a kutatók a neurodegeneratív és cerebrovasculáris betegségek kialakulásának pontosabb mechanizmusát vizsgálják. A K+F munkák 4 témacsoportban folynak. 7. Klaszter: Kinurénsav származékok mint gyógyszerek. Neuroprotekció a reduktív stressz befolyásolásával Projektvezetõ: Dr. Vécsei László Munkacsoport-vezetõk: Dr. Fülöp Ferenc, Dr. Toldi József, Dr. Boros Mihály Célok és rövid áttekintés (3.2 részfeladat) Neurodegeneráció és neuroprotekció: védõanyagok és mechanizmusok kutatása, új típusú neuroprotektív szerek elõállítása és vizsgálata. Elvégzett tevékenység: Neurodegeneráció és neuroprotekció: védõanyagok és mechanizmusok kutatása. Új típusú neuroprotektív szerek elõállítása és vizsgálata: - A farmakológiai vizsgálatok eredményei alapján folytatódtak a potenciális farmakonok szintézise. - A szintetizált molekulák tesztelése neurodegeneratív modellekben, ischemiás és PTZ tesztben. - Az újabb analógok tesztelése, az ischemiás modelleken túlmenõen, PTZ kiváltotta görcs modelleken is (elektrofiziológia, hisztológia, magatartási vizsgálatok). Eredmények Az a célunk, hogy olyan kinurenin-származékot találjunk, amely elsõként kísérletes modellekben kedvezõen befolyásolja a neurodegeneratív kórképek lefolyását, gátolja a migrén modellben a morfológiai lesiokat, illetve kedvezõ perifériás hatása legyen a gyulladásos gastrointestinális modellekben. Eddigi eredményeinket részben szabadalomban, részben az itt feltûntetett publikációkban foglaltuk össze. Az elõzõ munkaszakaszokban szintetizált kinurénsavszármazékok esetében a vegyületek nem oldódtak vízben, ezért jelen munkaszakaszban vízoldékony kinurénsavszármazékok szintézisét terveztük és valósítottuk meg. A kinurénsav molekulába többlépéses szintézissel tercier nitrogén atomot tartalmazó oldalláncot építettünk be. Az így nyert kinurénsav-amidok hidroklorid-sói jó vízoldékonyságuak lettek. A kidolgozott szintézisút alkalmazásával elõször két új kinurénsav származékot (SzR/72 és SzR/73) küldtünk farmakológiai vizsgálatra 100 mg-os mennyiségben. A vegyületek kiváló farmakológiai eredményei, valamint az SzR/72 vér-agy gáton való átjutásának következményeképpen további 5, az oldallánc hosszában és elágazásában különbözõ analóg (SzR/78, SzR/79, SzR/80, SzR/81 és SzR/82) szintézisét végeztük el. Az SzR/72-bõl további 7, illetve 10 g-ot, az SzR/73-ból 2 g, az SzR/79, SzR/80, SzR/81 és SzR/82-bõl pedig további 150-150 mg-ot szintetizáltunk. Ezzel párhuzamosan, referenciavegyületként 5 g 4-klórkinurenint, valamint L-kinureninszulfátot állítottunk elõ és küldtünk el farmakológiai vizsgálatra. Elekrofiziológia. Az elõzõ munkaszakasz jelentéseiben részletesen beszámoltunk arról, hogy számos kinurénsav származék neuroprotektív hatását kipróbáltuk az elmúlt évek során ex vivo, in vitro elektrofiziológiai, hisztológiai és magatartásvizsgáló módszerekkel. Az ex vivo elektrofiziológiai és a magatartási kísérletek ezekkel az anyagokkal lezárultak; a kipróbált származékok közül az SZR-72-es kódjelû bizonyult hatékonynak. Eredményeink szerint, abban az esetben, ha az SZR-72 kellõ koncentrációban van jelen a központi idegrendszerben, hatékonyan csökkentette a hippocampalis válaszok amplitúdóját, de nem volt képes a PTZ indukálta epileptiform aktivitás kialakulását megakadályozni. (Más munkacsoport kevésbé drasztikus modelljében szignifikánsan az SZR-72 protektívnek bizonyult). Az analitikai vizsgálataink szerint az SZR-72 perifériás (i.v.) beadás után nemsokára megjelenik a cerebrospinális folyadékban, vagyis valamilyen mértékben átjut a vér-agy gáton. In vitro kísérletekben, (ahol az SZR-72 barrier nélkül hozzáfér az NMDA receptorokhoz) hatékonyan csökkenti a hippocampalis kiváltott válaszok amplitúdóját. Most folyó, még nem lezárult vizsgálataink arra utalnak, hogy in vitro körülmények között az SZR-72 képes a PTZ kiváltotta epileptiform aktivitást is kivédeni. (In vitro vizsgálatokban a kinurenin tökéletesen képes a PTZ indukálta epileptiform tevékenységet kivédeni). Ez azért fontos, mert elméletileg megalapozza, illetve magyarázza az SZR-72 hatásmechanizmusát). A korábbi évek tudományos munkái (saját és mások publikációi) egyértelmûen azt mutatták, hogy a kinurénsav (KYNA) egy olyan NMDA receptor antagonista, amely a receptor glicin-alloszterikus kötõhelyen keresztül hatékonyan védi a neuront a hiperexcitációtól. Ez a receptorblokkoló hatás a mikromólos koncentrációtartományban érvényesül. Ezzel szemben, néhány száz nanomólos tartományban a KYNA serkentõleg hat a neuronális aktivitásra, maximális hatása 250 nM-nál észlelhetõ. Emlõsök esetében, a fiziológiás koncentrációtartomány éppen ez alatt van, de bizonyos kóros körülmények között ez megemelkedhet. Mindez elméletileg lehetõvé teszi, hogy a KYNA neuromodulátor szerepet töltsön be a központi idegrendszerben. Felmerült a kérdés, hogy a központi idegrendszerben ígéretes neuroprotektív sajátságú szerek, közöttük a KYNA, befolyásolhatják-e az enterális idegrendszer (ENS) mûködését is. A glutamát neurotranszmisszió jelensége az enterális idegrendszer (ENS) mûködésében már ismert, de részleteiben tisztázásra váró terület. Tevékenységünket a glutamát receptor antagonista kinurénsav (KYNA), és annak véragy-gát

19

permeábilis, szintetikus analógjainak perifériás gasztrointesztinális (GI) hatásainak meghatározására fókuszáltuk: a vastagbél obstrukció által indukált hipermotilitási zavar kísérletes modelljében, illetve a vastagbélgyulladás nekrózissal járó krónikus modelljében (m. Crohn). Ezekben a modellekben megvizsgáltuk a gyulladáscsökkentõ és redox-regulátor foszfatidilkolin kezelés hatását is. 1. Akut vastagbél obstrukció kísérletes modelljében kimutattuk, hogy a GI motilitás növekedéssel párhuzamosan a szabadgyök termelõ xanthin-oxidoreduktáz (XOR) aktivitás is emelkedik mucosában, szignifikáns leukocita akkumuláció mellett (MPO aktivitás). A KYNA kezelés hatékonyan gátolta az obstrukció által facilitált motilitás fokozódást, a XOR aktivitást, és a gyulladásos markerek változását. A KYNA terápia emellett fokozta a colon simaizom tónusát és csökkentette a nitrogén monoxid (NO) produkciót is. In vitro, sejtmentes közegben végzett vizsgálataink igazolták, hogy a KYNA közvetlenül gátolja a XOR enzimaktivitást. 2. Az enterális idegrendszer-neuroprotekció további vizsgálatát, a vér-agy gáton átjutó, farmakológiailag módosított KYNA analógok (SZR 72,-73,-761,-79,-80,-81,-82,-83 kódjelû anyagok) perifériás ENS effektusainak (GI motilitás facilitáció/inhibició) tisztázásával folytattuk, a vastagbél gyulladás krónikus modelljében patkányokon. Kimutattuk, hogy a colitis következménye a fokozott serosa mikroperfúzióval, szöveti XOR, MPO aktivitások emelkedésével és a vastagbél motilitási indexének szignifikáns növekedésével jellemezhetõ gyulladásos válasz. A KYNA és az SZR72 kezelés csökkentette a serosa kapillárisaiban a vörösvértestek áramlási sebességét, a motilitás, valamint XOR és MPO aktivitások fokozódását, a colon tónusának fokozása mellett. A szintetikus KYNA-analóg SZR72 hatása tartósabbnak bizonyult a KYNA hatásához képest. Jelenleg is folyó vizsgálataink szerint a szintetikus KYNA analógok közül az SZR73,-761,-79,-80 hatástalan a periférián, míg az SZR 81,-82 jelentõs motilitás gátlást okoz. 3. A hipoxiás szövetkárosodás in vivo modelljeiben igazoltuk, hogy a foszfatidilkolin elõkezelés szignifikánsan kivédi a szöveti károsodást és mérsékli a helyi, következményes gyulladásos reakciót. Igazoltuk, hogy a folyamat a megváltozott neuronális nitrogén monoxid (NO) szintézissel áll összefüggésben. Eredmények összefoglalása, további lépések A kinurénsav eddig az egyetlen természetes neuroprotektív anyag, amelyik a központi idegrendszerben képzõdik. Nagyon nagy gyakorlati jelentõsége van egy olyan új vegyületnek, amelyik szerkezetében közel áll a kinurénsavhoz és a neurodegeneratív betegségek lehetséges gyógyszer, megelõzõ szere. Ehhez növelni kell a kinurénsavhoz képest az új vegyület neuroprotektív hatását. Új vegyületeinket szabadalmaztattuk. 8. Klaszter: Szelektív stresszfehérje-indukáló gyógyszerhatású vegyületek. Projektvezetõ: Dr. Vígh László Munkacsoportvezetõ: Dr. Sántha Miklós Célok és rövid áttekintés (3.1 és 3.3 részfeladat) 1. Szelektív stresszfehérje indukción alapuló neuroprotektív gyógyszercsalád kifejlesztése. 2. Neurodegeneráció és neuroprotekció modellezése in vivo transzgenikus egerekben. Elvégzett tevékenység: Screening az ipari partnerek és a konzorciumi tagok által biztosított neuroprotektív stresszfehérje indukcióra képes aktív molekulákkal. A neuroprotektív celluláris mechanizmusok elemzése. A tömegspektrometriára épülõ lipidomika és membránbiokémia alkalmazása és fejlesztése. Az amyloid precursor protein (APP) mRNS fokozott termelése biglycan transzgenikus egerek agyában. A human apolipoprotein B-100 túltermelése súlyos neurodegenerációt indukál transzgenikus egerekben. Eredmények 1. A screening technika kifejlesztése: 1. Szelektív, a különféle stresszfehérje családok eltérõ indukcióját elõidézni képes nem toxikus neuroprotektív vegyületek kiválasztása: screenmódszer kidolgozása molekulák tesztelésére. Az elõzõ évben sikeresen elõállított hsp70 promoter-YFP, valamint a hsp25 promoter-EGFP riporter konstrukciókkal stabilan transzfektált SH-SY5Y humán neuroblasztóma sejtvonalak felhasználásával megkezdtük az ipari partnerek által rendelkezésünkre bocsátott, feltételezett neuroprotekciós potenciállal bíró gyógyszerjelöltek részletes analízisét. A szûrés elsõ periódusában sikerült stressz fehérje indukciós hatással rendelkezõ vegyületeket szelektálnunk. 2. A hatásmechanizmus és a támadáspont vizsgálatához felhasználni kívánt innovatív módszerek fejlesztése. Az elõzõ idõszakban, a zavaró hátteret jelentõsen csökkentõ teljes visszaverõdésen alapuló TIRF mikroszkópiai üzemmóddal felszerelt mûszerünk és az általunk kifejlesztett automatikus képanalizáló szoftver segítségével megkezdtük az elõzõleg azonosított gyógyszerjelöltek hatásmechanizmusának vizsgálatát. A sejtmembránok mikroheterogén szervezõdésére a molekulák, illetve stressz által gyakorolt hatások követése révén összefüggéseket fedeztünk fel a membránok raft szerkezetének változása és a gyógyszerjelöltek stressz válasz módosító hatása között. Magasabb szintû preklinikai tesztrendszer: az elõszelektált gyógyszer jelöltek neuroprotektív hatásainak vizsgálatára C. elegans poliglutamin patogenezis progressziójának követésével. Átalánosan elfogadott, hogy a kiterjedt ismétlõdõ poliglutamin szekvenciát tartalmazó fehérjék hibás foldingja, illetve aggregációja szerepet játszik a Huntington-kór illetve egyéb neurodegeneratív betegségek patogenezisében. A molekuláris chaperonok képesek „feloldani ” a poli-Q aggregátumokat, ezáltal csökkentve ezek toxicitását. Az elõzõ pontban megvalósított szûrõmódszer segítségével kiválasztott molekulák neuroprotektív hatásának tanulmányozására egy nemzetközilg elfogadott neurodegenerációs modellt, egy erõs promóterrel meghajtott GFP fúziós poli-

20

Q-t expresszáló C. elegans vonalat használtunk. A paralizált nematódák arányát precízen mérõ motilitás teszt segítségével a két legígéretesebb HSP koindukáló molekulát teszteltük. Az egyik közülük rendkívül hatásos neuroprotektív szernek bizonyult kísérleti rendszerünkben, megerõsítve ezzel a chaperon indukción alapuló neuroprotekciós drogfejlesztési stratégiánk alalpelveit. 3. A legkorszerûbb tömespektrometriára épülõ lipidomika (GC-MS, ESI-MS) és membránbiokémia alkalmazása és fejlesztése.Megkezdtük a pályázat kereti között a Regensburgi Egyetemmel közösen kifejlesztett nagy áteresztõ képességû lipidomikai módszer hazai implementációját. A módszer segítségével azonosítottunk egy olyan mutáns sejtvonalat, melyben a dezmoszterol felszaporodott. Ez a sejtvonal kiváló lehetõséget nyújt az Alzheimer-kórban megfigyelt hasonló változások modellezésére. Az új mutáns teljes karakterizálása folyamatban van. Továbbá egy speciális SCAN-SIM technika bevezetésével GC-MS készülékünk érzékenységét mintegy tízszeresére növeltük és ezzel lehetõvé vált nyomokban elõforduló lipid metabolitok elemzése. Megkezdtük a fentiekben ismertetett C. elegans modell patofiziológiás lipid változásainak karakterizálását. 4. Az amyloid precursor protein (APP) mRNS fokozott termelése biglycan transzgenikus egerek agyában. Az Alzheimer–kór az APP fehérje hibás hasitása következtében létrejövõ â-amyloid felhalmozódásának és plakkok formájában történõ lerakódásának a következménye. Az atheroszklerózis kiváltója az atherogén LDL-hez kötött apolipoprotein B (apoB) fehérjének az érfalak intima rétegében történõ retenciója és felhalmozódása. A biglycan ez a kis, leucinban gazdag fehérjék családjába tartozó fehérje valószinûleg részt vesz ebben a folyamatban. 2007-ben a biglycan és az apoB fehérjék egyedi, illetve együttes túltermelését tanulmányoztuk transzgenikus egerekben szemikvantitativ PCR segitségével. Megállapitottuk, hogy a biglycan transzgenikus egerek agyában a kortikális APP695 (122%) és APP770 (157%) mRNS-ek szintje szignifikánsan megemelkedett a kontrol alomtársakhoz képest, viszont a kettõs transzgenikus egerekben (apoB+/-x biglycan+/-) nem történt változás. Ezek az eredmények az elsõ kisérletes bizonyitékai annak, hogy a biglycan megváltoztathatja az agyban az APP mRNS hasitását és ezáltal résztvehet az Alzheimer-kór és egyéb vaszkuláris demenciák pathogenezisében. 5. A human apolipoprotein B-100 túltermelése súlyos neurodegenerációt indukál transzgenikus egerekben. Korábbi tanulmányok összefüggést mutattak ki a szérum emelkedett apolipoprotein B-100 (apoB) szintje és az Alzheimer-kór elõfordulása között. Annak érdekében, hogy feltárjuk az apoB-100 neurodegenerációban betöltött szerepét, apoB-100 fehérjét túltermelõ transzgenikus egerek szérum lipoprotein-szintjét, cerebrális fehérje-profilját, amyloid-plakk képzõdését, a neuronális apoptózis mértékét és az agy morfológiáját tanulmányoztuk. Azt találtuk, hogy a transzgenikus egerekben a szérum trigliceridek szintje szignifikáns megemelkedett, a koleszterol szint viszont nem változott. Az ellenanyag-mikroarray kisérlet számos citoszkeletális, neurális és mitogén aktivált protein-kináz fokozott termelõdését mutatta, ami az apoptótikus folyamatok aktivációjára utalt. A hisztokémiai vizsgálatok amiloid plakkok képzõdését és az idegsejtek kiterjedt pusztulását mutatták ki. A biokémiai elváltozások az agy morfológiailag is kimutatható károsodásához vezettek; a harmadik és negyedik agykamra erõteljes kitágulása volt megfigyelhetõ.. A bemutatott eredmények alapján arra következtettünk, hogy a humán apoB-100 fehérje túltermelése apoptózist és súlyos neurodegenerációt okoz transzgenikus egerek agyában. Eredmények összefoglalása, további lépések Óriási tudományos és gyakorlati jelentõségû a nagy áteresztõképességû lipidomika hazai alkalmazása és fejlesztése, valamint egy új típusú szelektív stresszfehérje-indukáló neuroprotektív hatású gyógyszerjelölt vegyület fejlesztése. Megalapítottuk a LipidArt Kft.-t (spin-off vállalat), az eredmények hasznosítására jelenleg a Bayer Gyógyszergyárral (Leverkusen) tárgyalunk. 9. Klaszter: A neurodegeneráció és neuroprotekció alapjai. Projektvezetõ: Dr. Párducz Árpád Munkacsoport-vezetõk: Dr. Jancsó Gábor, Dr. Bari Ferenc, Dr. Tamás Gábor, Dr. Szente Magdolna Célok és rövid áttekintés (3.2, 3.6 és 3.8 részfeladat) 1. Neurodegeneráció és neuroprotekció: védõanyagok és mechanizmusok kutatása, új típusú neuroprotektív szerek elõállítása és vizsgálata. 2. Potenciálisan neuroprotektív hatású vegyületek agyi vérkeringésre gyakorolt hatása és gyógyszerbiztonsági vizsgálata. 3. Marker gének és fehérjék azonosítása a humán és a patkány agykéreg lassú gátló sejtjeiben. Elvégzett tevékenység: A neuronális gangliozid szintézis farmakológiai befolyásolása. Akut- és késõi idegrendszeri változások követésére alkalmas modellek beállítása és jellemzése. Az ígéretes DHEA származékok hatásának összehasonítása különbözõ modelleken. Potenciálisan neuroprotektív hatású vegyületek agyi vérkeringésre gyakorolt hatása és gyógyszerbiztonsági vizsgálata: Az agyi vérkeringésre gyakorolt hatás vizsgálata újszülött malacon (vazodilatáció és vazokonstrikció mérése, dózishatásgörbe felvétele, az adatok statisztikai elemzése). A neurogliaform sejtek specifikusan végrehajtandó túlmûködéséhez vagy alulmûködéséhez olyan molekuláris vagy élettanifarmakológiai markert kerestünk, ami a neurogliaform sejteket kizárólagosan jelöli és más agykérgi sejtekben nem található. Az emberi agykéreg interneuronjainak csoportosítása, elektromos szinapszisok.

21

Eredmények 1, A neuroszteroidok neuroprotektív hatásának tanulmányozására új kísérletes modellt állítottunk be. A központi idegrendszerben fellépõ gyulladások elõfordulnak mind sérülések, mind neurodegeneratív megbetegedések következményeként. A gyulladásos reakciókban kulcsszerepet játszanak az immunrendszer központi idegrendszerre jellemzõ tagjai, a mikrogliasejtek, melyek az itt található sejtek 5-20%-át teszik ki. Ezek a sejtek nem pusztán a nekrotikus sejttörmelék eltakarításában játszanak szerepet, hanem aktívan részt vesznek a gyulladásos állapot elõidézésében, így felelõsek a neuronok pusztulásáért is. Idegi sérülést követõen a nyugalmi állapotban lévõ mikrogliasejtek aktiválódnak, morfológiai és funkcionális változásokon mennek keresztül és ilyen körülmények között megnövekszik az immunválasszal és a gyulladással kapcsolatos molekulák expressziója. Ezek az ún. aktivált mikroglia sejtek citokineket, chemokineket és szabad gyököket termelnek. A citokinek egy csoportja antiinflammatórikus hatású (pl. TGF-â, IL-4, IL-10), míg mások (TNF-á, IL-1 â) proinflammatórikus tulajdonságúak. Ez az oka annak, hogy a sérülést követõ mikroglia aktiváció kétélû fegyver, mert a citokin expresszió jellegétõl függõen gátolhatja a gyulladásos folyamatokat, azaz neuroprotektív hatású lehet, de kedvezõtlen esetben további neuronális károsodást idézhet elõ. A kérdés gyakorlati jelentõsége miatt rendkívül lényeges azon molekuláris mechanizmusok tisztázása, melyek a mikroglia aktiválódásában szerepet játszhatnak. A jelenlegi munkaszakaszban elvégzett kísérleteinkben az általunk korábban kidolgozott ún. target deprivációs modell alkalmazásával tanulmányoztuk az idegi sérülést követõ mikroglia válaszokat. Kísérleteinkben az extraocularis izmokat beidegzõ III. agyideg axonjainak károsodását követõen a III. agyideg centrális magjában, a nucleus oculomotoriusban immunhisztokémiai módszerekkel követtük egyes mikroglia markerek expressziójának idõbeli változásait. Eredményeink szerint a sérülést követõen 3 hónapos Balb/c egerekben már az elsõ napon kimutatható mikroglia aktiváció az érintett oldali n. oculomotorius magban, ez maximumát a 4. napon éri el. Nem találtunk szignifikáns különbséget a hím és ovariektomizált nõstények reakciója között. Kimutattuk, hogy 17â-ösztradiol-al történõ kezelés szignifikáns módon csökkenti a sérülésre adott mikroglia választ és eddigi adataink szerint ez a hormonhatás nem érinti egyformán a hím és nõstény álatokat. A jelenleg is folyamatban lévõ kísérleteinkben a protektív hatásban megfigyelt dimorfizmus hátterét és a DHEA hatását vizsgáljuk. 2, A gangliozidok szerepe a neuroprotekcióban és a neurodegenerációban Kísérleteink elsõsorban a membrán raftok integráns alkotóelemét képezõ gangliozidok szerepének további tisztázását célozták az elsõdleges nociceptív érzõ ganglionsejtek aktiválásában és a nociceptor neuronokat érintõ potenciális degeneratív folyamatok mechanizmusában. Vizsgálati modellként felnõtt patkány spinális ganglionsejt-tenyészeteket alkalmaztunk. Kísérleteinket érzõ ganglionsejt-tenyészeteken, specifikus citokémiai, immunhisztokémiai és morfometriai módszereket alkalmazva végeztük. Megállapítottuk, hogy spinális ganglionsejt-tenyészetben a gangliozidok szintézisében kulcsszerepet játszó ceramid-szintáz bénitását és a gangliozidok deplécióját követõen jelentõsen csökken a TRPV1 receptor aktiválhatósága és a neuronok TRPV1 immunreaktivitása. Eredményeink arra utalnak, hogy a neuronális gangliozid szintézis farmakológiai befolyásolása új lehetõségeket kínál az érzõ neuronokat érintõ potenciális neurotoxikus léziók gátlása és a nociceptor funkció, illetve a fájdalom befolyásolása tekintetében. A nociceptor primer afferens neuronok funkcionális aktiválódását in vivo kísérletekben is vizsgáltuk experimentális diabeteses neuropathia kialakulását követõen. 3, Az agyi vérkeringésre ható, potenciálisan neuroprotektív szerek vizsgálata a) A szekretorikus foszfolipáz A2 (PLA2) enzim szerepe az újszülöttkori agyi vérkeringésben A PLA2 a membrán foszfolipidekrõl leggyakrabban arachidonsavat hasít le, melybõl a ciklooxigenáz (COX) úton az agyi vérkeringés szabályozásában alapvetõ fontosságú prosztanoidok képzõdnek. Eddig nem vizsgálták a PLA2 izoenzimek, pl. a szolubilis PLA2 (sPLA2) szerepét az az újszülöttkori agyi prosztanoid termelésben, mely fontos faktora lehet az iszkémia/reperfúziót (I/R) követõ agykárosodásnak is. Megvizsgáltuk az sPLA2 gátló PX-18 hatását 1) az agyi és a szisztémás vérkeringésre; 2) COX-függõ agyi értágulatra; 3) az I/R által kiváltott agyi érkárosodásra. Altatott újszülött malacokban (n=44) regisztráltuk a keringési paramétereket, zárt koponyaablak és intravitális mikroszkópia módszerével mértük a piális arteriolák átmérõjét. A globális agyi a koponyaûri -4 nyomás fokozásával hoztuk létre. A piális arteriolák funkcióját a hypercapnia (10% CO2), PACAP38 (10-6M), NMDA (10 M), és -6 bradykinin (10 M) által kiváltott vazodilatációval jellemeztük. -4 Az agyfelszínen alkalmazott PX-18 csak 10 M koncentrációban okozott értágulatot (16±5%,mean±sem). Az iv. adott PX-18 (6 mg/kg) átmenetileg jelentõsen csökkentette az artériás középnyomást és tágította a arteriolákat (32±1%). A topikális PX-18 (10-6 5M) a COX-függõ vazodilatátorok közül a PACAP38 (10 M) hatását csökkenti (67±11% vs 24±6%), a hypercapniával kiváltott vazodilatációt nem befolyásolja. Az iv PX-18 a COX-függõ érreakciókat nem változtatja meg. Az I/R jelentõsen csökkentette a piális arteriolák válaszkészségét mind az endotél függõ (hypercapnia: 44±4% vs 25±7%, bradykinin 10-6M: 65±7% vs 38±6%), mind az endotél független vazodilatátorokkal szemben (NMDA 10-4M: 57±5% vs 19±7/). A PX-18 iv. infúzió (6 mg/kg/20 perc) kivédi az I/R agyi érfunkció károsító hatását. A sPLA2 1) hozzájárul a bazális értónus kialakulásához, 2) szerepet játszhat a COX-függõ agyi érreakciókban és 3) jelentõsen hozzájárul az I/R agyi érkárosító hatásához. b) A PACAP és a vazoaktív intesztinális polipeptid (VIP) kölcsöhatása az újszülöttkori agyi vérkeringésben. A VIP és a potenciális PACAP antagonista vegyületek kölcsönhatását vizsgáltuk, hiszen hatásuk feltételezhetõen azonos, vagy hasonló receptorokon érvényesül. A VIP az agyi erekben koncentráció-függõ értágulatot hoz létre. A két PACAP antagonista (PACAP6-38 és-6-27) részlegesen gátolja a VIP vazodilatátor hatását. Miután azt találtuk, hogy a PACAP által kiváltott agyi vazodilatáció indometacin szenzitív és szelektív COX-1 blokkolókkal igen, de COX-2 blokkolóval nem antagonizálható ezen vizsgálatainkat kiterjesztettük a VIP-re is. Eredményeink szerint a VIP hatását csak részben védi ki az indometacin elõkezelés. További kísérleteinkben azt találtuk, hogy a VIP-erg agyi vazodilatáció független az NO termeléstõl.

22

4, Marker gének és fehérjék azonosítása a humán és a patkány agykéreg lassú gátló sejtjeiben. Elsõ kísérletsorozatunkban az idegi információfeldolgozás elemi lépéseivel foglalkoztunk. A posztszinaptikus funkció szabályozásában a kálcium eloszlása a dendritek különféle kompartmentjeiben kulcsfontosságú. A kálcium térszelektív eloszlása biztosítja ugyanis a szinapszisok és a szinaptikus plaszticitás szelektív szabályzását. Több mechanizmus ismert a kálcium idegsejtekbõl történõ eltávolítására, de a dendritikus kálcium-kompartmentalizációban az eltávolító mechanizmusok szerepe nem ismert. Elõször alkalmaztunk nagyfelbontású immuncitokémiát kétfoton mikroszkópiával kombinációban a kálciumeltávolítás viszgálatára. Kísérleteinkben egy Na+/Ca2+ kicserélõ (NCX1) molekula hatását vizsgáltuk CA1 piramissejtekben. Az NCX1 sûrûség hétszer akkora volt a dendrittörzseken, mint a dendrittüskéken. Ezen eredményeket alátámasztva kétfoton képalkotással azt találtuk, hogy a szinaptikusan aktivált kálciumválaszok NCX blokkolás alatt elsõsorban a dendrittörzseken változtak meg. Az NCX molekulák dendrittörzsekre lokalizált hatása eddig ismeretlen módon szabályozza a dendrittörzsek és a dendrittüskék közti kálciumdinamikát. Mivel az NCX eloszlás nem függött a szómától való távolságtól, ezért a serkentõ bemenetektõl független szabályozást tesz lehetõvé. Az NCX eloszlás e tekintetben jelentõsen különbözik a korábban talált AMPA receptor és hiperpolarizáció aktivált csatorna eloszlástól, ahol a távolság és bemenetfüggõ szabályozás fontos szerepet játszik. Második kísérletsorozatunkban a neurogliaform sejtek hatásmechanizmusát vizsgáltuk. A szinaptikus receptorokon keresztül kialakuló fázikus és az extraszinaptikus receptorokot mûködésbe hozó tonikus gátlás jelenti a GABAA receptor közvetített gátlás két fõ formáját az agykéregben. Korábbi eredmények szerint létezik egy átmeneti forma tonikus és a fázikus gátlás között, de ennek az úgynevezett lassú GABAA hatásnak az eredete nem ismert. Kimutattuk, hogy a lassú GABAA válaszokat egy speciális interneuron típus, a neurogliaform sejt alakítja ki. A neurogliaform sejtek egyetlen akciós potenciálja elegendõ a lassú GABAA válaszok kialakítására, amelyek a következõ igen szokatlan tulajdonságokkal rendelkeznek: rendkívül lassú kinetika, regulálhatóság GABA transzporterekkel, alacsony GABA koncentráció és a transzmitter diffúziója a szinaptikus résen kívülre. Az eredmények a GABAerg kommukáció egyedi formáját tárják fel, amelyre egy különleges preszinaptikus sejttípus specializálódott. Harmadik kísérletsorozatunkban az emberi agykéreg interneuronjainak csoportosításához, tipizálásához járultunk hozzá. Kísérleteinkben humán agykérgi szeleteket használtunk kombinált elektrofiziológiai-morfológiai vizsgálatokra. A neurogenezis során fontos szerepet játszó ilyen COUP-TF2 fehérjérõl bebizonyítottuk, hogy a felnõtt interneuronokban is jelen van, mégpedig szelektíven csak kolecisztokinint, kalretinint, vagy reelint is expresszáló interneuronokban. Parvalbumin, kalbindin, illetve szomatoszatin tartalmú interneuronok, valamint piramis sejtek sosem tartalmazzák a COUP-TF2 fehérjét. Kimutattuk továbbá, hogy ezen sejtek meglehetõsen nagyszelektivitással innerválnak vagy piramissejt tüskéket, vagy más interneuronok sejttestjé,t illetve dendritjeit. Ilyen nagymértékû specializáció más fajok interneuronjaira nem volt jellemzõ. Kimutattunk továbbá más fajok közti különbséget is ennek a markernek a segítségével: a patkány neurogliaform sejtekkel ellentétben a humán neurogliaform sejtek nem tartalmaznak COUP-TF2 fehérjét. Negyedik kísérletsorozatunkban az emberi agykéreg azonosított sejtjei közti szinapszisok mûködését vizsgáltuk, amire ezidáig nem volt példa az irodalomban. Direkt módszerekkel bizonyítottuk, hogy az emberi agykéregben is mûködnek elektromos szinapszisok: kimutattuk, hogy az emberi neurogliaform sejtek egymással homológ, más interneuron típusokkal pedig heterológ elektromos szinapszisokat alakítanak ki. Kimutattuk továbbá, hogy az emberi neurogliaform sejtek, a patkányban leírtakhoz hasonlóan a posztszinaptikus sejteknem lassú, GABAA és GABAB receptorokon át mûködõ gátlást alakítanak ki. Eredmények összefoglalása, további lépések A neurodegeneráció ellenes potenciális gyógyszerek racionális tervezésében feltétlenül szükséges a neuroprotekció alapjainak megismerése, erre az alapkutatásra kiemelkedõen sikeres gyógyszerkutatás és fejlesztés épülhet. 2008-ban az ösztradiol neuroprotektív hatásmechanizmusának felderítésére koncentrálunk. Folytatjuk az emberi agykéreg elektromos szinapszisainak vizsgálatát. 10. Klaszter: Oxidatív stressz ellenes anyagok. Projektvezetõ: Dr. Ferdinándy Péter Célok és rövid áttekintés (3.4 részfeladat) Az oxidatív stressz kutatása: peroxinitrit ellenes vegyületek tesztelése és génterápiás módszerek alkalmazása a a neuroprotekcióban. Elvégzett tevékenység: A peroxinitrit molekuláris target-jeinek keresése és aktiválódásának vizsgálata, gátlásainak lehetõségei, screen módszerek kidolgozása, különös tekintettel a matrix metalloproteázokra. Eredmények A kutatócsoport az oxidatív stressz és stressz adaptáció biokémiai hátterének vizsgálatában a matrix metalloproteinázok oxidatív aktiválódását vizsgálta, illetve az NO és szuperoxid reakciójából keletkezõ peroxinitrit markereinek, és a peroxinitrit scavengerek screen módszereinek kidolgozását végezte. A következõ konkrét eredményeink születtek: · A szenzoros neuronok szerepét az oxidatív és nitrozatív stresszre kifejett hatását vizsgáltuk a szívben, melynek kapcsán számos új megfigyelést tettünk. Megállapítottuk, hogy a szívben lévõ kapszaicin-érzékeny szenzoros neuronok fiziológiás mûködése a az alap peroxinitrit képzõdést fenntartja, és ezáltal a szarkoplazmás retikulum CaATP-ase S-nitrozilációján

23

keresztül szabályozza a szívizom relaxációját. A megfigyelésnek igen nagy jelentõsége lehet a számos betegséghez kapcsolódó szenzoros neuropátia kezelésében. · Az MTA SZBK Sántha Miklós kutatócsoportja által kidolgozott neurodegenratív állatmodell, az Apoâ100 transzgén állatok karakterizálását végeztük. Az Apoâ100 transzgén súlyos neurodegenerációt vált ki egerekben. Az állatok kardiovaszkuláris karakterizálásáról egy közlemény jelent meg, míg a neurodegenerációval kapcsolatos közlemény jelenleg elbírálás alatt áll. · A mátrix metalloproteináz gátlók gyógyszerfejlesztési lehetõségeirõl ipari partnerünkkel együtt egy összefoglaló közleményt jelentettünk meg. Eredmények összefoglalása, további lépések Az oxidatív stressz számos más hatása mellett a neurodegeneráció kialakulásában is részt vesz, ezt az Alzheimer-kórban központi szerepet játszó â-amiloid aggregátumok is kiváltják. Nagy gyakorlati jelentõsége lenne egy olyan gyógyszerjelölt vegyületnek, amely megakadályozza az oxidatív stressz kialakulását és neuroprotektív hatású. Vizsgálni fogjuk az ã-tokoferol hatását neurodegeneratív állatmodellen. Együttmûködés A kutatócsoport eredményeit a gyakorlatban a Pharma Hungary 2000 Kft., spin-off alkalmazza (www.pharmahungary.com) 11. Klaszter: Õssejtkutatás. Projektvezetõ: Dr. Gulya Károly Célok és rövid áttekintés (3.7 részfeladat) Szöveti regeneráció: csontvelõ eredetû õssejtek autológ reintegrációja a patkány retinába és különbözõ agykérgi területekre. Elvégzett tevékenység: Az in vitro kezelt, az ektodermiális fejlõdési irányba elindított sejtek autológ idegi transzplantációja az agy különbözõ területein. A reintegrálódott sejtek fenotípusának vizsgálata morfológiai, immuncitokémiai és molekuláris biológiai módszerekkel. Eredmények Célunk egy olyan in vitro rendszer vagy in vivo állatmodell kifejlesztése és tesztelése, amelyben felnõtt patkányok in vitro kezelt õssejtjeit autológ transzplantáció révén terápiás célból juttatjuk az in vitro fenntartott szövetszeletekre, illetve injektáljuk a központi idegrendszer ép vagy kísérletesen károsított részeibe. Kísérleteink elsõ részében megvizsgáltuk, hogy a különbözö neurotrófokkal kezelt csontvelöi eredetü sejtek megfelelö lefagyasztási technikával hosszú idön át eltarthatók-e és igény szerint feléleszthetök-e. Eredményeink szerint két olyan protokoll is van, amellyel az össejtszármazékok 10-15%-a 1 hónappal a lefagyasztás után feléleszthetö. Ez az arány más, lefagyasztott sejtek felélesztésénél mérhetõ arányhoz viszonyítva jónak mondható (primer hippocampális neuronkultúrában kb. 30%, fibroblaszt-kultúrában kb. 50%). Kísérleteink másik részében a különbözõ neurotrófokkal ex vivo kezelt õssejtszármazékokat mechanikailag károsított patkány retinákba injektáltuk vissza. A neuroektoderma felé differenciálódó sejtek a retina minden rétegébe integrálódtak. Bár a legtöbb sejt a mélyebb rétegekben volt megfigyelhetõ, számos sejt volt meg ganglionsejtek rétegében és a sugártestben is. Folyamatban vannak olyan kísérletek is, amelyekben a calmodulin gének expresszióját vizsgáljuk a különbözõ neurotrófok hatására kialakult neuroszférákban. Megállapítottuk, hogy az ex vivo kezelt neuroszféra sejtek a károsított idegszövetbe reintegrálódnak. Az EGF vagy az NGF kezelés nagyszámú õssejtszármazék célszövetbe való települését eredményezi, s e sejtek egy részére a korai posztnatális neuronok fenotípusa a jellemzõ (Tuc-4 fenotípus). Állatkísérleteink egy részében az Alzheimer-kórban is érintett nucleus basalis magnocellularis roncsolását végeztük el, s megállapítottuk, hogy a roncsolt szövetbe számos, in vitro kezelt össejtszármazék reintegrálódik. E sejtek egy része Tuc4-pozitív, jelezve, hogy e sejtek szintén a neuronális fejlödési útra léptek. A Karolinska Intézettel együttmûködésben vizsgáljuk az Alzheimer kóros és öregkori normál agyak jellegzetességeit a teljes agy vagy agyii hemiszfériumok immunohisztoblotjai alapján. A NeuN, a HLA és a GFAP antigének ezzel a módszerrel történõ vizsgálatával áttekintõ képet kapunk a neuronok, a mikroglia és az asztrociták teljes agyban megfigyelhetõ eloszlásáról. Eredmények összefoglalása, további lépések Nagy gyakorlati jelentõségû egy olyan állatmodell kifejlesztése és tesztelése, amelyben felnõtt patkányok in vitro kezelt õssejtjeit autológ transzplantáció révén terápiás célból juttatunk vissza a központi idegrendszer ép vagy kísérletes módon károsított részeibe (retina, hippocampus, nucleus basalis magnocellularis stb.). 4. ALPROGRAM 12. Klaszter:Neuroproteomikai centrum létrehozása, Pszichiátriai betegségek funcionális genomikája, proteomikája, célfehérjék kijelölése Projektvezetõk: Dr. Janka Zoltán, Dr. Janáky Tamás Munkacsoport-vezetõk: Dr. Medzihradszky Katalin, Dr. Puskás László, Dr. Juhász Gábor, Dr. Palkovits Miklós, Dr. Telegdy Gyula, Dr. Kovács Kornél Az alprogram egységes egészként mûködik, így egyetlen klaszterbe soroltuk be. A neuroprotemikai centrum virtuális laboratóriumként mûködik Szegeden (2 munkahely) illetve Budapesten (1 kutatócsoport).

24

Célok és rövid áttekintés (4.1-4.7 részfeladat) 1. Neuroproteomikai Centrum kialakítása, mûködtetése 2. Membrán mikrodomén és szignálrendszer fehérjék vizsgálata pszichiátriai betegségek állatmodelljeiben 3. Raft-proteinek és szignálfehérjék változása „pszichiátriai betegség” állatmodellben 4. Pszichiátriai betegségek állatmodelljeiben végzett funkcionális genomikai és proteomikai vizsgálatok 5. Humán agyminták funkcionális genomikai és proteomikai vizsgálata 6. Állatmodellekben kijelölt molekulák szignálrendszer aktivációs hatásainak kimutatása 7. Állatokban kijelölt, szignálrendszeren is ható molekulák keresése emberben Elvégzett tevékenység: Poszt-transzlációs módosítások vizsgálati módszereinek beállítása. Neuroproteomikai mérések. Proteomikai tanfolyam szervezése. Plus maze teszten átesett egerek proteomikai vizsgálata: normál egerek két agyi régiójának (frontális+prefrontális cortex, amygdala és entorhinális cortex) proteomikai feltérképezése 2D elektroforézis és tömegspektrometria segítségével. Depressziós állatmodellben talált célfehérjék validálása, az eredmények bioinformatikai elemzése. Szorongásos állatmodellben talált célfehérjék validálása, az eredmények bioinformatikai elemzése. Normál és depressziós agyminták különbözõ 2 agyrégiójának összehasonlító proteomikai feltérképezése 2D elektroforézissel, eltérõ expressziójú fehérjék tömegspektrometriás azonosítása. Depressziós, öngyilkos személyek 2 különbözõ agyrégiójának proteomikai feltérképezése 2D elektroforézissel. Állatok szelektálása depressziós állatmodellben célfehérjék aktivitásának vizsgálatához. A szorongásos és depressziós állatmodellekben kijelölt potenciális célmolekulák azonosítása. Eredmények A NeuroProteomikai Laboratórium kialakításával és mûködtetésével kapcsolatban a WATERS Co. „Protein Expression System” rendszerével (melynek beszerzése részben RET finanszírozásában történt) sok problémánk volt. Tekintettel a rendszer hosszú üzemképtelen idõszakaira, sikerült a garanciát 6 hónappal meghosszabbítani. A rendkivül sokoldalú kiértékelõ szoftver (ProteinLynx Global Server) teljes körû megismerése a rendszeres szoftver-upgrade miatt állandó tanulást igényel. A Centrum bioinformatikai hátterét egy 4 magos processzorú adatbázis-szerver beüzemelésével, a távoli munkahelyek biztonságos használatának megoldásával, valamint a mágnesszalagos adatarchiválás beállításával fejlesztettük. A gyorsabb adatbázis-szerver beállításával az egy-egy állatkisérlet mintáinak proteomikai vizsgálatakor összegyûjtött hatalmas adatmennyiség (pl. 24 állat agymintáinak analízisekor 144 GB) feldolgozása vált gyorsabbá és könnyebbé. A tömegspektrométerek folyamatos mûködtetése érdekében megoldottuk, hogy az interneten keresztül bármely engedélyezett számítógéprõl folyamatosan nyomon követhessük a készülékek pillanatnyi állapotát, s akár otthonról hétvégén is be tudunk avakozni a rendszerek mûködésébe. A mérési adatok késõbbi ismételt feldolgozhatósága érdekében megoldottuk a biztonságos adatarchiválást. Az óriási mennyiségû LC-MS mérési adat (100 GB-ok) tárolását mágnesszalagos egység üzembehelyezésével végezzük. A Centrum elválasztástechnikai repertoárjának bõvítésére bevezettük a makropórusos fordított fázisú (mRP) kromatográfiát, amely elsõ lépése egy többdimenziós fehérjeelválasztásnak, melynek során a rendkivül bonyolult összetételû agyszövet fehérjéit akarjuk további vizsgálatokhoz frakciókra bontani. Hasonló feladatot lát el az Agilent Off-gel elektroforézis készüléke (ami jelenleg is laboratóriumunkban van kipróbáláson), de az más tulajdonságok alapján (izoelektromos pont) választja szét a fehérjéket, ill. a peptideket. Mivel kedvezõ tapasztalatokat szereztünk a készülékkel kapcsolatosan, valószínûleg megvásárolunk egy ilyen berendezést. Egér, ill. humán agyminták fehérjeprofiljának vizsgálatához az elmúlt két évben beállítottuk a fluoreszcens festékeket alkalmazó 2 dimenziós differenciál gélelektroforézist (2D-DIGE). Ez a módszer kis mennyiségû mintából (5-50 ìg fehérje) képes megbízható kvantitatív fehérjetérkép összehasonlításokat végezni. Azoknak a fehérjéknek az azonosítására, amelyek állatkisérletek egyes csoportjaiban eltérõen expresszálódtak (2D-DIGE által megtalált különbségek), nagyobb mennyiségû agymintákból (6-800 ìg) újabb „preparatív” 2D gélelektroforéziseket végeztünk. Az ezen gélekbõl végzett fehérjeazonosítások során azt tapasztaltuk, hogy a 2 dimenziós elektroforézis (24x24cm) nagy felbontóképessége ellenére egy-egy gélfoltban gyakran több fehérje jelenlétét lehet kimutatni. Ez nem is csoda, hisz egy-egy agymintában akár néhány tízezer fehérje is lehet, míg a gélen „csak” 2-3 ezer foltot lehet detektálni. Az ezekben a foltokban lévõ fehérjék arányát az eddig alkalmazott technikákkal nem lehetett megállapítani (csak a folt intenzitásának növekedését észleltük, de nem tudtuk megmondani, hogy melyik fehérje okozta azt). A „Protein Expression System” alkalmazásával sikerült egy olyan módszert kidolgoznunk, melynek segítségével meghatározható az egy gélfoltban található fehérjék relatív mennyisége. Módszerünk továbbfejlesztésével a jövõben abszolút mennyiségi meghatározásokat kívánunk végezni. A 2D-DIGE rendkívül nagy teljesítõképességû módszer a fehérjeexpresszió meghatározására, azonban drága, idõigényes, és megvannak az gélelektroforézis elvébõl származó hátrányai: csak korlátozott módon képes a membránfehérjék és a bázikus fehérjék elválasztására. Ezen hátrányok kiküszöbölésére ¦ a kvantitatív fehérjeazonosítás szempontjait messzemenõen figyelembevéve ¦ ugyancsak a „Protein Expression System” használatával kidolgoztunk egy olyan agyi fehérjeösszetételmeghatározási módszert (one-pot method), melynek segítégével jelenleg 300-500 fehérjét tudunk mind minõségileg, mind mennyiségileg azonosítani. Ez a módszer gyorsabb, mint a korábban említett 2D-DIGE, de csak az nagyobb mennyiségben jelenlévõ fehérjéket tudja analizálni. Úgy gondoljuk, hogy a két módszer kiegészíti egymást. Mind a tavalyi patkányagy szinaptoszó-ma-preparátumok 1D, mind az újabb patkányagyak 2D gélelektro-foretikus elválasztásaiból származó mintákból történõ fehérjeazonosításkor gyakran találkoztunk olyan fehérjékkel, amelyek nem a molekulatömegüknek megfelelõ helyen, hanem magasabb tömegeknél jelentkeztek. Megállapítottuk, hogy azok különbözõ molekulatömegû fehérjék, melyek egy

25

sávba, ill. foltba futnak gyakran egy biológiai folyamatban (pl. citrátkör, reduktív karboxilát ciklus, ATP szintézis, oxidatív foszforiláció) összetartozó fehérjék (komplexek).

1.ábra Fehérjék kvalitatív és kvantitatív meghatározása proteomikai módszerekkel A különbözõ poszt-transzlációs módosítá-sok teszik mûködõképessé a fehérjéket. Foglalkoztunk a legfontosabb poszttranszlációs módosítások – foszforiláció, glikoziláció- analízisének beállításával és optimalizálásával, amely a projekt folyamán késõbb a célmolekulák jellemzésénél hasznosítható lesz.

2. ábra Szinaptoszóma preparátumban azonosított fehérjék (piros csillaggal jelzett) a citrátkörben, ill. reduktív karboxilát ciklusban

A tudományos társadalmat régóta foglalkoztató kérdés, hogy a magasabbrendû állatok és nõvények esetében mekkora változatosságot okoz a proteomikai vizsgálatokban a genetikai változatosság, tehát szükségszerû-e azonos vagy közel azonos genetikai hátterû egyedeket vizsgálnunk. A kérdés eldöntése érdekében két egér csoport lett kiválasztva: (1) azonos szülõktõl egyszerre született hím NMRI egerek csoportja és (2) különbözõ szülõktõl, de közel azonos idõben született hím NMRI egerek csoportja. Mindkét csoport 6-6 egyedbõl állt és a teljes agy fehérjekivonatuk lett analizálva 2D-SDS-PAGE segítségével. Egyegy mintából kb. 500 µg fehérjét analizáltunk, ami kb. 500 fehérje mennyiségi összehasonlí-tását tette lehetõvé. A két csoport között nem találtunk szignifikáns különbséget, így elmondható, hogy a proteomikai vizsgálatok céljára nem szükséges azonos, vagy közel azonos, beltenyésztett állatok felhasználása, legalábbis az 500 leggyakoribb fehérje esetében. Állatkísérleteinkben a szorongás egyik állatmodeljéül az EGIS gyógyszergyár Nyrt. 35 generáción keresztül beltenyészett (BL6 és NMRI törzsek keresztezésével kialakított) szorongó egértörzsét (3 hónapos hím egerek) használtuk, melyek különbözõ magatartási tesztekben („elevated plus maze”, „open field activity”, valamint „light-dark test”) mind szorongó állatnak bizonyultak. Másik állatmodel az „elevated plus maze” tesztben válogatott azonos korú, 200-250 g súlyú hím Wistar patkányok voltak. A válogatás alapjául a kereszt nyitott részében eltöltött idõt vettük.

26

Korábbi eredményeink alapján kisérleteinkhez a következõ munkamenetet alakítottuk ki:

A proteomikai és genomikai vizsgálatokhoz a szorongó egértörzsbõl 12 különbözõ agyterület mikrodisszekciója történt. A kontroll és az anxious csoport egyaránt 12-12 állat volt. A mikrodisszekciós agyterületek reprezentálják valamennyi feltételezett, a szorongással kapcsolatba hozható agyterületet. A mintavétel sztereomikroszkóp alatt, fagyasztott metszetekbõl történt. Az Eppendorf csöveket felhasználásig -70 oC-on tároltuk. Agymetszetek száma: 672 (28 / agy). Mintaszám: 288 Eppendorf csõ. A csövek mindegyike 4 db, 0,5-0,8 mm-es mikrodisszekciós tûvel kivett mintát tartalmaz. A válogatott, szorongó patkány agyminták proteomikai vizsgálatához 22 fagyasztott patkányagy 4 területérõl (amygdala, cortex, enthorinális kéreg, nucleus caudatus) mikrodisszekcióval 88 micropunch mintát, míg a genomikai vizsgálatokhoz 21 állatból 84 mikropunch mintát gyüjtöttünk. A fenti kisérletekkel parallel, mintavétel történt humán agyakból. Agyszám: 9 kontroll (myocardialis infarktusban elhunyt, neurodegenerációs vagy pszichiátriai betegségben nem szenvedõ egyénektõl) és 9 depressziós, öngyilkosságban elhunyt egyén agyából. A vizsgálatra kivett agyterületek száma: 11, melyek magukba foglalják a depressziós betegség által leginkább érintett agyterületet. A mikrodisszekció fagyasztott agymetszeteken, 0,8-5,0 mm-es belméretû mikrodisszekciós tûvel történt. A mintákat Eppendorf csövekben gyûjtöttük, és -70°C-on tároltuk. Mintaszám: 132 Eppendorf csõ, melyek mindegyikében 4-8 szövetminta volt. A válogatott szorongó és normál patkányok mikrodisszekcióval izolált agyrészleteinek körültekintõ egyesítésével 7 szorongó és 5 nem szorongó csoportot alakítottunk ki. Az egyes minták kb. 4-500 µg fehérjét tartalmaztak. 12 Amygdala, ill. 12 prefrontális kéreg mintát izoelektromos fókuszálást követõen 24x24 cm SDS-poliakrilamid elektroforézissel analizáltunk. Sypro-Ruby festést követõen az egyes géleken átlagosan 450 foltot lehetett detektálni. A különbözõ állatcsoportokból származó géleket a PD-Quest szoftver segítségével mennyiségileg összehasonlítottuk. Sem a prefrontális agykérgi minták, sem az amygdala minták összehasonlításakor nem találtunk szignifikáns különbséget a szorongó és nem szorongó patkányok mintáinak között. Az elmúlt év során az egérmintákból 554 proteomikai fehérjeazonosítást végeztünk. Ezen fehérjék mindegyike a kontrolltól eltérõ expressziót mutatott a 2D-differenciál elektroforetikus elválasztásokban. A fehérjéket tripszines emésztést követõen LC_MS/MS technikával analizáltuk, majd adatbázisokban történõ kereséssel azonosítottuk.A szorongó egértörzs egyedeinek teljes agyából készített fehérjeprofil 155 foltban (összesen 62 fehérje) különbözik a normál kontrollétól. A megváltozott expressziójú fehérjék értékelése és értelmezése alapján feltártuk, hogy az anxietás megváltoztatja a szinaptikus régió fehérjevázát és több fontos elemét. Ez igazolta a pályázatban felvázolt koncepciót miszerint a pszichiátriai betegségekben nem a receptorok, hanem molekuláris környezetük változik. Az azonosított fehérjék kb. 40%-ról már ismert, hogy szerepet játszik a a szorongásos kórképekben (ez a tény validálja a mi munkánkat is), a többi szerepe eddig nem volt ismert. Kiderült, hogy jelentõs változások vannak a redox rendszerben és a glukóz metabolizmusban is. 4 fehérjét további kutatás céljára az EGIS kiemelt és nem enged közölni. A többi változást tartalmazó kézirat jóváhagyásra az EGIS-nél van. A szorongó egerek prefrontális cortexének fehérjeprofilja 55 fehérjében, míg az amygdala fehérjeösszetétele 22 foltban tér el a kontroll állatokétól 2D differenciálelektroforézissel vizsgálva. A teljes agyban kapott eredmények és a struktúránként kapott eredmények között az átfedés nem túl nagy, de a kontrollok nem voltak azonosak, így ez nem jelent sokat a további munka szempontjából.

27

4. ábra Prefrontális cortexben azonosított – „legnagyobb egybefüggõ hálózat” (18 változó protein, melybõl 10 protein-t kékkel jelöltünk) 1.Táblázat. Néhány eltérõ expressziójú fehérje szorongó egérben

A depresszió a pubertást követõ hormonális átrendezõdés után jelentkezik leggyakrabban. Ismert továbbá, hogy nõkben a depresszió elõfordulási gyakorisága nagyobb, mint férfiakban, melynek egyik lehetséges magyarázata a hormonális különbségekben keresendõ. Az ösztrogén szint és a pszichiátriai betegségek kapcsolatának vizsgálata során ovariektomizált egereket kezeltünk 17â-ösztradiollal, majd a néhány agyterületbõl (szomatoszenzoros kéreg, mediális szeptum, substantia innominata, striatum) mikrodisszekcióval kivágott szövetek fehérjeösszetételét vizsgáltuk 2D-differenciálelektroforézissel. A kontrollhoz viszonyítva 103 foltnak változott az intenzitása, melybõl 52 fehérjét azonosítottunk. Az eredmények alapján igazolódott, hogy ösztrogénkezelés hatására a redox rendszerben, a metabolizmusban és a szinaptikus régió fehérjeösszetételében is hasonló változások következtek be, mint amit anxietásban találtunk. Ez az eredmény alátámasztja a pszichiátriai kórképek hormonális modulációjának molekuláris hátterét. Elkészült egy kézirat és egy PhD disszertáció a témából. Az, hogy anxietásban és depresszióban citokinek koncentrációja többszörösére növekszik, felveti a kapcsolatot a gyulladás és az anxietás között. LPS (lipopoliszacharid) hatásra kialakuló gyulladásban vizsgáltuk az agyi proteom változásait WAGRij patkányokban. Az LPS okozta rohamszám növekedéssel párhuzamosan megváltozott az agyi motor-proteinek, a clathrine

28

rendszer és a redox rendszer is. A prefrontális kéregben 18, a thalamusban 20 fehérje expresszióváltozását észleltük. Az eredmények értékelési fázisban vannak. Tematikusan az eredmények a depresszió, anxietás és citokin változások témakörbe tartozó új adatokat szolgáltatnak. A citokinek és a pszichiátriai betegségek kapcsolatának jelenleg igen gyorsan fejlõdõ irányzataiba csatlakoztathatók.

3.ábra Az oxidatív stresszben, ill. a szinaptikus dokkolásban érintett fehérjék hálózata, (feketével jelölve a megváltozott expressziójú proteinek)

Humán proteomikai vizsgálatok. A vállalásnak megfelelõen elkészült emberi agyminták DIGE elemzésére alkalmas géleinek futtatása kontroll és depressziós öngyilkosok kérgi szövetmintáinak összevetésével. Az eredmények azonosítása és értékelése a beszámolás utáni periódusra nyúlik el. Funkcionális genomikai vizsgálatokat az EGIS szorongó egértörzsén végeztünk. A kapott, mikrodisszekcióval kimetszett hippocampus, és prefrontális kéreg minták (70 db) 3 csoportra oszthatók; „bátor” „szorongó”, és „szorongó”+kezelt. A kezelés az EGIS Gyógyszergyár Nyrt. egyik anxiolitikumával történt. A mintákból RNS-t izoláltunk, majd reverz transzkripcióval az RNS-t cDNS-é írtuk át. Az átírt cDNS-hez ezután „kifogó” szekvenciát ligáltunk, majd az ily módon kezelt mintát 30 000 gén specifikus oligonukleotid szekvenciát tartalmazó csipre vittük fel. Ezek a csipek az egér teljes kódoló genomját lefedik, így alkalmas teljes genomi génexpressziós szûrésekre. A kísérlet során a hippocampus-ból származó mintát összesen nyolc két színnel jelzett mintával hibridizáltuk (Cy3, és Cy5) „color-flip” elrendezésben. A hibridizáció Ventana automatikus hibridizációs robotban történt kontrollált és az elõzõekben optimalizált körülmények között. A csipek konfokális lézerszkenneres leolvasása után az eredmények kiértékelését speciális DNS-chip kiértékelõ szoftverrel (GenPix 5.0) dolgoztuk fel. Ennek során 85 gén mûködésében alulmûködést, 27 gén esetében pedig túlmûködést tapasztaltunk. A csiprõl több gént választottunk ki a QRT-PCR-es visszaellenõrzésre, melybõl 5 gén esetében alulmûködést, 3 gén esetében pedig túlmûködést tapasztaltunk. Ezekben az esetekben TaqMan és SybrGreen protokollokat használtunk. A többi (10) gén esetében nem tapasztaltunk szignifikáns változást. A különbség az eltérõ protokollok és az univerzális Roche Taqman próbák bizonytalanságából adódik. A szorongó és normál egér 2D fehérjegélelektroforézissel eltérõ expressziójúnak mutatkozó fehérjéinek azonosítása után meghatároztuk, hogy a kapott fehérjék génszinten milyen változást mutatnak. Összesen 48 génre terveztünk gén specifikus primereket, melyekbõl 15 gén tervezése hippocampusra, ill. 33 gén prefrontális kéregre történt. Ezek közül 4 gén repressziót, 17 gén pedig overexpressziót mutatott. Az overexpressziót mutató gének közül 8 egyezést mutatott a fehérje expressziós eredményekkel. A repressziót mutató gének közül 3 egyezést mutatott a fehérje expressziós eredményekkel. A fehérje és génexpressziós változások különbsége az eltérõ agyrégióban történõ differenciált expresszióból és az eltérõ szintû szabályozásokból (fehérje, RNS lebomlás, stabilitás ..stb) adódhat. A válogatott szorongó patkány kísérlet során az elõzõekben ismertetett eljárást és protokollokat alkalmaztunk. Az amygdala, és prefrontális kéreg agyi régió vizsgálata során 6-6 csipet (3 kontroll, 3 szorongó) alkalmaztunk. A kísérleti rendszerben nagyon fontos volt, hogy igazoljuk, hogy a kapott minták (fõként az amygdala) elegendõ szövetet biztosítanak RNS preparálás és a további génexpressziós vizsgálatok számára. Az RNS tisztítást oszlopkromatográfiás eljárással végeztük, Dnáz kezelés mellett. A szöveteket RNALaterben tároltuk a szöveti homogenizációig és a feltáró pufferhez merkaptoetanolt adtunk az esetleges Rnáz inaktivációjához. Minden minta esetében sikerült 1-3 ug teljes RNS-t kapni, amely a Genisphere cég által forgalmazott jelamplifikáción alapuló, kétlépcsõs fluoreszcens jelöléshez elegendõnek bizonyult. A csip kísérlet során az amygdala agyi régióban 245 gén represszióját tapasztaltuk, illetve 211 gén overexpressziót mutatott. A prefrontális kéreg esetében az eredmények 77 gén represszióját, és 54 gén overexpresszióját mutatták. Az amygdala agyi régió esetében 21 gént ellenõriztünk vissza QRT-PCR-el, a prefrontális kéreg esetében pedig 53 gént vizsgáltunk meg. Az eredmények kiértékelései jelenleg is folynak. Irodalmi adatok szerint a major depresszióban szenvedõ betegek gyakorlati játékszituációkban suboptimális döntési stratégiát mutatnak. Ugyanakkor nincs adat arra vonatkozóan, hogy ezen betegek esetében a személyiségi faktor és a genetikai variációk befolyásolják-e a döntéshozatalt. Pszichiátriai vizsgálatainkba 124 unipoláris depresszióban szenvedõ beteget vontunk be. A betegek a Iowa Gambling Teszt

29

ABCD és az EFGH feladatát, Temperamentum és a Character Inventory Tesztet töltötték ki, valamint a szerotonin transzporter promoter (5-HTTLRP) régiójában található polimorfizmus került vizsgálatra és a Temperamentum kérdõívre adott válaszok lettek kiértékelve. Megállapítást nyert, hogy a ll (hosszú) genotipussal rendelkezõ betegek magasabb pontszámot értek el és optimálisabb döntéshozatali startégiát használtak az ABCD feladatban, mint azok, akik ss (rövid) genotípust mutattak. Nagyobb kitartás volt társítható a jobb teljesítéssel az ABCD feladatban. Ugyanakkor a kifejezettebb sérelem elkerülõ magatartás (harm-avoidance) rosszabb teljesítéssel társult az EFGH feladatban. Az eredmények alapján elmondható, hogy mind a személyiségi faktor, mind a betegek genotípusa befolyásolja a major depresszióban szenvedõ betegek döntéshozatali stratégiáját. A NeuroProteomikai Centrum dolgozói, együttmûködésben más egyetemek kutatóival megalapítottuk a Magyar Proteomikai Társaságot, s túl vagyunk a társaság két vándorgyûlésének lebonyolításán is. Az MTA SzBK Proteomikai Csoportja szervezésében 2007-ben is megrendeztük a Proteomikai Tanfolyamot. A két korábbi, hasonló tematikájú tanfolyam után az idei már haladó szinten volt meghirdetve, s fõ témája a bioinformatika volt. A visszajelzések alapján tanfolyamunk az idén is rendkivül sikeres volt. A proteomikai eredmények hálózatépítéssel egybekötött értékelése visszaigazolta munkánk azon alapgondolatát, hogy a pszichiátriai betegségekben tapasztalt receptor heterogenitás nem a genetikai heterogenitásra, hanem a receptorok molekuláris környezetében történõ változásokra vezethetõ vissza. Ez az eredmény a vártnál sokkal átütõbben igazolta vissza a kutatási irány jogosságát. Eredményeink alapján a proteomika kutatásban betöltött szerepérõl a következõ megállapítások körvonalazódnak: • A proteomika fõ célja a kutatási hipotézisek adatalapú elõállítása. • A proteomika az eredmény elõállításának elsõ lépései között van. • Feladata az interpretációs bioinformatikai protein-hálózatépítés alapú hipotézis készletek elõállítása. • A bioinformatikai munka annyit ér, amennyit kísérletileg validálni lehet belõle. • Nagy probléma az irodalom megbízhatatlansága, a szemantikai keresõ motorok gyengeségei, a tapasztalatlanság a modellezésben, a túlzó elvárások. • Az új kutatási irányok kijelölésében a proteomikai eredmények megbízhatóbb kiindulópontot adnak,mint az eddigi szakirodalom. Eredmények összefoglalása, további lépések A pánikbetegségek és a depresszió hatékony gyógyszereinek racionális tervezéséhez szükségünk van a betegségek kialakulásában kulcsszerepet játszó fehérjék mint farmakológiai célpontok azonosítására és validálására. Az állatkísérletekben talált, kulcsfontosságú 4 fehérjét megvizsgáljuk humán agymintákban is. 5. ALPROGRAM 13. Klaszter: Neurobiológiai betegségek diagnosztikája Projektvezetõ: Dr. Tóth Gábor Munkacsoport-vezetõk: Dr. Pávics László, Dr. Fülöp Ferenc, Dr. Welker Ervin, Dr. Dux László, Dr. Puskás László, Dr. Dombi György Célok és rövid áttekintés (5.1-5.6 részfeladat) 1. *Tc és 18F-jelzett peptidek tervezése és szintézise az Aâ-plakkok központi idegrendszerbeli kimutatására 2. Trodat alapú *Tc jelzett diagnosztikumok fejlesztése 3. A prion fehérje átalakulás mechanizmusának megismerése és a prion betegség diagnózisa 4. Neuromuszkuláris betegségek diagnosztikája 5. Pszichiátriai betegségek génexpresszión alapuló diagnosztikája 6. Sclerosis Multiplex (SM) négy pathológiailag jól definiált altípusának liquorminták alapján történõ tanulmányozása Elvégzett tevékenység: 1. Peptid szerkezetek tervezése és szintézise 99mTc és 18F izotóp jelzés céljára (Alzheimer-kór diagnosztika) 2. Trodat alapú *Tc jelzett diagnosztikumok fejlesztés: analóg vegyületek elõállítása 3. IgY antitestek elõállítása és prion fehérje (normális és abnormális PrP) kötõdésvizsgálata 4. A denervált és reinnervált izom regenerációs hatékonyságának jellemzése. A miosztatin szerepe az androgénfüggõ izomtömeg változásokban 5. Pszichiátriai kórképben szenvedõ betegektõl vérminta gyûjtése. Az egér és a humán DNS-chip kísérletekbõl kapott génexpressziós eredmények fehérvérsejtekben történõ ellenõrzése. 6. SM adatbázis értékelés, a minta statisztikai méretre növelése. Diagnosztikus eredmények, spektrális régiók kiválasztása Eredmények 1. Peptid molekulák jelölése 99mTc izotóppal Ebben a munkaszakaszban az LPYFD pentapeptid amid két új származékát állítottuk elõ. Az elsõ a csak kurkumint tartalmazó hexapeptid, a második egy új hisztidin származékot tartalmazott kelátorként. A két új molekula szerkezete az alábbi ábrákon látható:

30

Ebben a kutatási szakaszban egy a vér/agy-gáton való átjutás szempontjából optimált szerkezetû peptid (peptid-C: CURC-LysLeu-Pro-Tyr-Phe-Asp-NH2) pozitron emittáló izotóppal való ismert pozícióban való jelölési módszerének kifejlesztését tûztük ki célul. A 18F-jelzést úgynevezett kétfunkciós „hídligandon” keresztül valósítjuk meg a peptid általunk kiválasztott alkalmas funkciós csoportját kiválasztva. A választott peptid egyik végén kurkuminnal konjugált, amely a teljes szerkezet lipofil jellegét növeli, ugyanakkor lizin-oldalláncon tartalmaz egy primer amino-csoportot, amely alkalmas 18F-ral való radioaktív nyomjelzés szempontjából. A para-[18F]fluorobenzoesav (4) volt egy olyan alkalmas összekötõkapocs - „hídligand” -, amely egyik oldalról tartalmazza a radioaktív izotópot, másrészt viszont megfelelõen aktivált karboxil-csoportján keresztül enyhe reakciókörülmények között kapcsolódhat a peptid-C lizin primer amino-termináljához. A para-[18F]fluorobenzoesav (4) szintézisét, ciklotronban elõállított 18F-fluorid-ionból kiindulva SN2 mechanizmusú nukleofil szubsztitúcióval végeztük.

6. ábra: A p.[18F] fluorbenzolsav szintézise A (peptid-C) enyhe reakciókörülmények között, szelektíven történõ acilezéséhez a lizin primer amino-csoportján szükséges volt (4) vegyületet aktiválni. Ehhez a szabad benzoesav származékból N-szukcinimidil-4-[18F]fluorobenzoátot állítottunk elõ. A radioaktív jelölés teljes hozama az eddigi eredmények alapján 10 % körüli a kiindulási fluor-18 aktivitására vonatkoztatva. A peptid-C e radioaktív prekurzorral való konjugálása a következõ kísérleti lépés. 2. Diagnosztikumok fejlesztése idegrendszeri betegségek korai felismerésére A pályázati munka harmadik évében a korábban elõállított ditiol-amin-amid típusú izotópfogó ligandum felhasználásával közvetlen elõanyagát (1) kaptuk a 2 tropánvázas TRODAT-1 analóg vegyületnek (1. ábra). Több irodalmi módszert próbáltunk ki a tiol csoportok benzil védõcsoportjának eltávolítására, ezek közül a trifluoro-ecetsav jelenlétében higany-acetáttal történõ reakció tûnt a legígéretesebbnek, azonban minden esetben csak az utolsó köztitermék bomlását tapasztaltuk.

7. ábra 3. A prion fehérje átalakulás mechanizmusának megismerése és a prion betegség diagnózisa Elõzmények: Poliklonális antitesteket állítunk elõ a PrP fehérje rövid, 7-8 aminosavból álló peptidjeivel immunizálva csirkéket. Az antitesteket mikrotiterpléten, két különbözõ módon teszteltük. a. A prion fehérjét immobilizáltuk és a poliklonális antitesteknek a fehérjéhez való kötödését vizsgáltuk. b. Második módszerként szendvics esszét állítottunk be, amikor is az antitesteket, amelyeket az elõbb ismertetett módon választottunk ki, immobilizáltuk a mikrotiterplaten és egy másik anti PrP antitesttel határoztuk meg a kifogott prion fehérje mennyiségét. Mindegyik peptid esetében azokat az antitesteket választottuk ki, amelyek nagyobb affinitást mutatták a rekombináns fehérjék iránt.

31

A kiválasztott antitesteket egészséges és TSE-ében szenvedõ hörcsögökbõl nyert agy-homogenizátum segítségével a prion fehérje mindkét formáján teszteltük. Az IgY antitestek felismerték a prion fehérjét mind a normál, mind a fertõzött agyhomogenátumokban. Mindemellett a detektált szignál nagyságából a fertõzött agyminták esetében arra a következtetésre jutottunk, hogy az antitestek az abnormális formát csökkent mértékben, vagy egyáltalán nem ismerik fel. Ennek az eredménynek a megerõsítése nagyon fontos mind a fehérje abnormális formájú szerkezetének megismerése (mind a négy antitest a fehérje C-terminális része ellen irányul), mind hatékony diagnosztikai módszer kifejlesztése szempontjából. Ennek az eredménynek a megerõsítését tervezzük úgy, hogy a normális PrP-t proteázos emésztéssel a detektálás elõtt eltávolítjuk a mintákból. Mindehhez elõször is az IgY antitestekbõl állítottunk elõ megint elegendõ mennyiségben a további kísérletekhez a korábban ismertetett módon. Egészséges állatokból nyert agy-homogenátumokon optimalizáltuk a proteázos emésztés körülményeit olyan módon, hogy a mintából a fehérje normális konformációjú formáját teljesen elemésszük. Egészséges és TSE-ében szenvedõ hörcsögökbõl nyert agy-homogenizátumokon vizsgáltuk a négy antitest és egy kontrol antitest PrP-kötödését, miután a mintákat proteináz K emésztésnek vetettük alá. Kísérleteink megerõsítették, hogy bár az IgY antitestek a normális PrP formát felismerték, az abnormális PrP formát nem. Mindemellett a kontrol antitest felismerte mindkét formát ugyanazokon a preparátumokon, megerõsítve korábbi feltételezésünket. 4, Diagnosztikumok fejlesztése idegrendszeri betegségek korai felismerésére - Neuromuszkuláris betegségek diagnosztikája. A denervált/reinnervált izom regenerációs hatékonyságának jellemzése Korábban leírtuk a denervált, majd reinnervált patkányizom regenerációjának morfológiai károsodását, a motoros véglemezek abnormalitásait, valamint a miozin nehéz láncok (MHC) izoformáinak immunhisztokémiai analízise alapján a reinnervált soleus drámai lassú-gyors rosttípus-váltását. Legújabb vizsgálataink szerint a regenerációt követõen a gyors rostoknak nemcsak a száma nõtt meg, hanem a lassú rostoknál hatékonyabban is regenerálódtak, tehát a regenerált/reinnervált soleus nem tudta fenntartani az eredeti rosttípus-mintázatot. Megvizsgáltuk továbbá az MHC expressziót RT PCR segítségével, és azt találtuk, hogy a reinnervált/regenerált izomban bekövetkezõ rosttípus-váltás a transzkripció szintjén regulálódik. Az extracelluláris matrix szerepével kapcsolatban korábban kimutattuk a matrilin-2 aktiválódását a regeneráció kezdeti stádiumában és a motoros véglemezek újraszervezõdésében. In vitro sejtkultúrákon végzett kísérleteink alapján a mioblasztok ténylegesen termelik a matrilint, és ennek szabályozásában a Prx1 transzkripciós faktor is szerepet játszhat. Jelenleg matrilinmutáns egérben vizsgáljuk, hogy a regeneráció és a motoros véglemezek kialakulása károsodik-e.Másik kísérletsorozatunkban megvizsgáltuk, hogy a miosztatinnak van-e szerepe az androgén-függõ izomtömeg-változásokban. A két reguláló molekula közötti kapcsolat tanulmányozására a patkányok androgén-dependens levator ani (LA) izmát alkalmaztuk, amely a hímekben a pubertás során bekövetkezõ tesztoszteron-szint emelkedés miatt fiziológiás hipertrófián esik át. Fiatal hímek pubertás elõtti kasztrációja megakadályozza az izom növekedését, míg felnõtt hímek esetében a tesztoszteron megvonása (kasztráció) izomsorvadást indukál. Tesztoszteron kezeléssel mindkét folyamat megfordítható. Eredményeink szerint az androgének szignifikánsan csökkentik a miosztatin protein szintjét mindkét állatcsoport LA izmában, míg az mRNS szint hasonló csökkenése csak a felnõtt állatokban volt megfigyelhetõ. Továbbá leírtuk a miosztatin fehérjét sejtmagi homogenizátumban, amely jelezheti transzkripciós faktorként való funkcióját. Bizonyítottuk, hogy az androgének gátolják a miosztatin kifejezõdését, ami kulcsfontosságú lehet az LA izom tömegének regulációjában. Jelenleg vizsgáljuk, hogy az androgének ezen hatása az androgén-receptor útvonalon, vagy más faktorok befolyásolásán keresztül valósul-e meg. 5, Pszichiátria betegségek génexpresszión alapuló diagnosztikája A pályázat ezen szakaszában olyan módszert validáltuk, amely alkalmas teljes vérbõl fehérvérsejteket izolálni, majd abból akár hónapokkal késõbb is RNS-t kivonni úgy, hogy közben az RNS degradációja nem következik be. Ennek a módszernek a jelentõssége, hogy esetleges limfociták génexpressziós mintázatán alapuló diagnosztikai kit kifejlesztésénél nagy elõny, hogy a vér mintavétele és annak analízise különbözõ helyen történhet. A vér mintavétel klinikákon történik, majd onnan egy központi laboratóriumba szállítják, ahol a génexpressziós vizsgálatot végzik. 10 normál emberbõl izoláltunk leukocita-extraktumot, és olyan körülmények között dolgoztunk fel, amely egy klinikai-laboratóriumi mintavétel-feldolgozás körülményeit imitálta. A protokoll alapján megfelelõ mennyiségû RNS-t sikerült izolálnunk, amelyeket cDNS-sé átírva olyan templáthoz jutottunk, amelyen kvantitatív valós-idejû PCR-ben (QRT-PCR) teszteltünk. Több olyan génnek a kifejezõdését tudtuk igazolni, amelyek elõzetes eredményeink alapján szkizofréniára jellemzõ markerek lehetnek (dopamin receptor, káliumcsatorna gének). Emellett különbözõ normalizációs gének kifejezõdését is megvizsgáltuk. Ez rendkivül fontos az egyedi minták minõségi ellenõrzésénél is. A protokollokat TaqMan univerzális próbákkal hajtottuk végre. Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy az általunk optimalizált módszer alkalmas vérbõl centrifugálás nélkül leukocitákat izolálni, majd abból jó minõségû RNS-t preparálni génexpressziós analízisekhez. A Transmentix Kft-vel megállapodtunk, hogy az általuk tervezett szkizofrénia betegek génexpressziós mintázat meghatározásában részt vállalunk közös szabadalom vagy alkalmazás fejében. A munkaszakasz során összesen 60 különbözõ (kifejezetten szkizofrén, de mániás depressziós, major depressziós és személyiségzavaros is) beteg és 20 kontroll, egészséges mintájának az elõzetes feldolgozását hajtottuk végre. Kimutattuk, hogy a dopanireceptorgének kifejezõdése sokszor a kimutathatóság határán van, és nagyon nagy egyedi szórásokat ad, így késõbb ezek nem alkalmasak diagnosztikai markerekként való alkalmazásra. Több, a humán DNS-chip kísérletekbõl kapott gén kifejezõdését is megvizsgáltuk, és találtunk olyan géneket, amelyek a betegek mintái több, mint felében eltérõ kifejezõdést mutattak. Jelenleg klaszteranalízist és a klinikai kórképekkel történõ statisztikai egyeztetés történik, valamint azoknak a géneknek a kiszûrése, amelyek a legkisebb fals pozitív és fals negatív eredményt adják.

32

6, Sclerosis Multiplex (SM) négy pathológiailag jól definiált altípusának liquorminták alapján történõ tanulmányozása Az elmúlt idõszakban a cerebrospinális liquor ex vivo NMR spektroszkópiás mérésének feltételeit határoztuk meg. Kidolgoztuk az NMR csõbe juttatásának steril módozatát és bomlásmentes tárolási feltételeit. A liquor mérések kulcstényezõje az oldószerelnyomásos méréstechnika, mivel az víz jelének elnyomása mellett az alapvonalat nem torzíthatjuk. Kimértük, hogy a víz jel elnyomását hatékonyan, a WATERGATE pulzusszekvencia és elõszaturáció kombinálásával lehet megvalósítani. A tesztmérések során megállapítottuk, hogy a liquor ex vivo NMR mérése sikeresen megvalósítható. A spektrumban megtalálhatók a glükóz mint fõkomponens jelei, lipidek és más metabolitok mellett kis koncentrációban aromás funkciós csoporttal rendelkezõ anyagok. Ez utóbbiakról gyanítható, hogy neurotranszmitterekrõl van szó. A Neurológiai Klinika liquorbankjából kvázi-véletlen szelekcióval multiplex sclerosis diagnózissal rendelkezõ (SM+) és kontroll (SM–) mintákat választottunk. Összesen 8 SM+ és ugyanannyi SM– mintát mértünk meg. Az SM+ minták között további alcsoportok voltak: primer progresszív, szekunder progresszív, relapsing-remitting. A mérések elõzetes kiértékelése azt mutatja, hogy ígéretes lehet az aromás régió elemzése. Sajnos, nagymértékû a jelek ingadozása, és ez nem korreláltatható egyértelmûen minden esetben a kóros állapottal. Úgy véljük, hogy a primer progresszív betegeknél megfigyelt jelszegény aromás régió lehet indikatív. Ezért a méréseket további, a primer progresszív esetekre homogenizált mintákkal folytatjuk. A Neurológiai Klinika liquorbankjából 8 primer progresszív beteg és velük korban és nemben összevethetõ kontrol mintáját a fent leírt módszerekkel sikeresen megmértük. A foszfor metabolizmus esetleges különbségeinek fekderítésére elkezdtük a fenti minták 31P NMR spektrumait is megmérni. A spektrumok jelenleg matematikai-statisztikai kiértékelés alatt állnak. Eredmények összefoglalása, további lépések Óriási gyakorlati jelentõsége lenne az Alzheimer-kór olcsó, megbízható és korai diagnózisának, hogy a betegség gyógyszeres kezelése idõben elkezdõdjön. Maga a diagnosztikum is jó piacot ígér, ugyanez érvényes a prion betegség és a neuromuszkuláris betegségek megbízható diagnosztikumaira. A betegségek gyakorisága miatt nagyon fontos a pszichiátriai betegségek génexpresszión alapuló diagnosztikája. A sclerosis multiplex négy altípusának elkülönítése a likvorminták alapján olyan egyedi gyógyszerelést tenne lehetõvé, amelyre eddig még nem volt példa.

33

MEGHATÁROZÓ MUNKATÁRSAK LISTÁJA

34

Meghatározó személy

Konzorciumi tag

Prof. Dr. Benedek, György Borbély, Emõke Prof. Dr. Boros, Mihály Dr. Datki, Zsolt László Prof. Dr. Dékány, Imre Prof. Dux, László Prof. Dr. Erõs, István Prof. Dr. Falkay, György Dr. Farkas, Eszter Dr. Farkas, Tamás Prof. Dr. Ferdinándy, Péter Prof. Dr. Fülöp, Ferenc Dr. Fülöp, Lívia Prof. Dr. Gulya, Károly Dr. Horváth, Gyöngyi Hunya, Ákos Gábor Dr. Izbéki, Ferenc Dr. Janáky, Tamás Prof. Dr. Janka, Zoltán Dr. Kálmán, János Kardos, József Prof. Dr. Kiss, Tamás Prof. Dr. Kovács, Kornél Prof. Dr. Lonovics, János Dr. Martinek, Tamás Dr. Pákáski, Magdolna Prof. Dr. Penke Botond Prof. Dr. Szabó, Gyula Széll Zoltán Dr. Tamás, Gábor Prof. Dr. Telegdy, Gyula Prof. Dr. Toldi, József Dr. Deli, Mária Dr. Medzihradszky-Fölkl, Katalin Dr. Tóth, Géza Prof. Dr. Vígh, László Dr. Bogár, Ferenc Dr. Juhász, Gábor Prof. Dr. Palkovits, Miklós Krajcsi, Péter Glavinas, Hristos Dukai, Márta Péterffy, Ferencné Kiss, Orsolya Nyilas, Anita Csorba, Attila Szeliné Szomor, Judit Körmöndiné Buzás, Krisztina Tubak, Vilmos Dr. Tóth-Molnár, Edit Miklósné Bódi, Edina Molnár, Imréné Tisza, Andrásné Prokes Jóvér, Anikó Dr. Sárkány, Erika

SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE SZTE MTA SZBK MTA SZBK MTA SZBK MTA SZBK MTA TKI MTA TKI MTA TKI Solvo Solvo Solvo Diagnosticum Diagnosticum Diagnosticum Kromat Kromat Kromat Creative Labor Kft. Rytmion Rytmion Rytmion Kation Európa Bt. Kation Európa Bt. QualiCont Kht.

Feladatok 1-es alprogram, 3-as klaszter 1-es alprogram, 1-es klaszter 3-as alprogram, 7-es klaszter 1-es alprogram, 1-es klaszter 1-es alprogram, 1-es klaszter 5-ös alprogram, 13-as klaszter 1-es alprogram, 3-as klaszter 1-es alprogram, 3-as klaszter 1-es alprogram, 2-es klaszter 1-es alprogram, 1-es klaszter 3-as alprogram, 10-es klaszter 3-as alprogram, 7-es klaszter 1-es alprogram, 1-es klaszter 3-as alprogram, 11-es klaszter 1-es alprogram, 3-as klaszter 1-es alprogram, 1-es klaszter 2-es alprogram, 6-os klaszter 4-es alprogram, 12-es klaszter 4-es alprogram, 12-es klaszter 4-es alprogram, 12-es klaszter DNT központi adminisztráció 1-es alprogram, 1-es klaszter 4-es alprogram, 12-es klaszter 2-es alprogram, 6-os klaszter 1-es alprogram, 1-es klaszter 4-es alprogram, 12-es klaszter 1-es alprogram, 1-es klaszter 2-es alprogram, 5-ös klaszter DNT központi adminisztráció 3-as alprogram, 9-es klaszter 2-es alprogram, 4-es klaszter 3-as alprogrma, 7-es klaszter 1-es alprogram, 2-es klaszter 2-es alprogram, 5-ös klaszter 2-es alprogram, 5-ös klaszter 3-as alprogram, 8-as klaszter 1-es alprogram, 1-es klaszter 4-es alprogram, 12-es klaszter 4-es alprogram, 12-es klaszter 3-as alprogram, 9-es klaszter 3-as alprogram, 9-es klaszter 3-as alprogram, 9-es klaszter 5-ös alprogram, 13-as klaszter 5-ös alprogram, 13-as klaszter 5-ös alprogram, 13-as klaszter 4-es alprogram, 12-es klaszter 4-es alprogram, 12-es klaszter 4-es alprogram, 12-es klaszter 1-es alprogram, 1-es klaszter 3-as alprogram, 7-es klaszter 3-as alprogram, 7-es klaszter 3-as alprogram, 7-es klaszter 1-es alprogram, 1-es klaszter 1-es alprogram, 1-es klaszter 5-ös alprogram, 13-as klaszter Összesen Teljes munkaidõre átszámított kutatói létszám:

Ráfordított nap 56 225 115 50 11 100 56 14 169 141 28 10 141 84 150 23 90 11 23 225 23 40 2 90 5 100 23 225 23 100 84 56 12 90 56 56 40 23 11 26 68 88 112 112 225 225 225 12 125 200 125 225 225 84 5061 22,5

OKTATÁSI KURZUS 2006.12.01.-2007.11.30.

Proteomikai tanfolyam Az éves rendszerességgel megtartott tanfolyam Janáky Tamás és Medzihradszky Katalin vezetésével idén 2007. szeptember 24-26. között zajlott. Négy elõadásban mutattuk be a proteomikai módszereket. Az Alzheimer-kór és sejtélettani alapjai speciálkollégium Penke Botond, Toldi József, Kálmán János, Datki Zsolt vezetésével 2007-2008 tanév során heti 2 órában megvalósuló speciálkollégium (AOK-K99022, 2 kreditpont). Az egyetemi hallgatókat és doktoranduszokat célzó oktatás 250-300 hallgató rendszeres részvételével zajlik. Speciálkollégiumok egyetemi hallgatók és dokotoranduszok részére 1. Nyomjelzéstechnika - Dr. Tóth Géza 20072 2. Neuronális és gliális plaszticitás - Dr. Párducz Árpád 2007 3. Molekuláris Sejtbiológia - Dr. Párducz Árpád 2007 4. Neuroanatómia - Dr. Jancsó Gábor 2007 5. Molekuláris Neurobiológia - Dr. Gulya Károly 2007 6. Molekuláris Medicina - Dr. Gulya Károly 2007 7. DNS-chipek alkalmazása és bioinformatikai elemzése (bioinformatikai kurzus) - Dr. Puskás László 2007 8. Chiptechnológia a klinikumban: technológia és alkalmazás - Dr. Puskás László 2007 9. NMR Spektroszkópia - Dr. Dombi György 10. L. Pasteur és Szent-Györgyi Albert élete és munkássága - Dr. Penke Botond és Dr. Datki Zsolt 2007 Hazai oktatási kurzusok 1. Preklinikai és klinikai kutatások menedzsmentje üzleti és piaci szempontból Dr. Budai Dénes, Kation Bt., 2007. október20., MBSZ Biotechnológiai menedzser képzés. 2. Protein Identification by Mass Spectrometry, az MTA nemzetközi tréningje, 2007. március 3. QualiCont Fórum _ QualiCont Kht., 2007. február 8, Budapest PhD képzések Benyhe Sándor: Engin Bojnik PhD hallgató témavezetése Borsodi Anna: Ioja Enikõ, Páldyova Eszter PhD hallgatók témavezetése Szûcs Mária: Birkás Erika, Resat Cinar PhD hallgatók témavezetése, Tóth Géza: Szemenyei Erzsébet, Keresztes Attila PhD hallgatók témavezetése TDK dolgozatok, versenyek Boros Mihály: Fazekas Borbála, Fülöp Miklós ÁOK V: Glutamát receptor gátlás hatása kísérletes colitis modellben (témavezetõk: Varga Gabriella biológus, Dr. Kaszaki József egyetemi docens); SZTE ÁOK TDK Konferencia, Szeged, 2007. február 08-10. III. díj. Váradi Rita VI. ÁOK: A foszfatidil-etanolamin gyulladáscsökkentõ hatása kísérletes pleuritisben. Szeged, 2007. Témavezetõk: Dr. Erõs Gábor, Varga Gabriella - TDK dolgozat TDK dolgozat: Fazekas Borbála, Fülöp Miklós, V. ÁOK: A glutamát receptor gátlás hatása kísérletes vastagbélgyulladásban. Szeged, 2007. Témavezetõk: Dr. Kaszaki József egyetemi adjunktus, Varga Gabriella biológus. Lonovics János: Schnúr A, Farkas K. A parietális sejtek proton pumpa aktivitásának regulációja izolált egér gyomor mirigyekben. TDK elõadás, Szeged, 2007 Szûcs Mária: Kékesi Orsolya, Kerekes Márta TDK-s hallgatók témavezetése

Szakdolgozatok Érces Dániel: Kinurénsav neuroprotektív hatása kísérletes akut vastagbél elzáródásban. Szeged 2007. Témavezetõ: Dr. Kaszaki József egyetemi docens. Rácz András: A hízósejtek szerepe kísérletes akut vastagbél elzáródásban. Szeged 2007. Témavezetõ: Dr. Kaszaki József egyetemi docens. Váradi Rita: A foszfatidil-etanolamin preventív hatása a patkány mesenterialis ischaemia-reperfúzió következményeire. Szeged 2007. Témavezetõk: Varga Gabriella biológus, Dr. Kaszaki József egyetemi docens. Lõvei Péter: A táplálék foszfatidilkolin tartalmának preventív hatása a mesenteriális ischaemia-reperfúzió következményeire. Szeged 2007. Témavezetõ: Dr. Kaszaki József egyetemi docens. Dr. Rácz Gábor: The expression of muscle specific genes in mechanical ventillation and regeneration 2007. Témavezetõ: Dux László.

35

TECHNOLÓGIA TRANSZFER, A KUTATÁSI EREDMÉNYEK HASZNOSÍTÁSA Új spin-off cégek alapítása · Az MTA Szegedi Biológiai Központ (MTA SZBK) részvételével alakult meg a LipidArt Kft. · Biotargeting Kft. hét magánszemély alapításában (2 fõ SzBK Biokémia Int., 5 fõ SzTE Gyógyszerhatástani Intézet). Ügyvezetõ: Dr. Borsodi Anna Szabadalmak: Három hazai szabadalmi bejelentés készült: 1. Kation Bt: Lineáris mikropozicionáló sztereotaxiás készülékhez (1. alprogram) 2. SZTE Orvosi Vegytani és SZTE Gyógyszerkémiai Intézet: Új peptidek és peptidomimetikumok az amyloidózisal járó neurodegenerációs folyamatok leállítására (1. alprogram) 3. SZTE Kórélettani Inzézet Prof. Telegdy Gyula: Izatin és származékai gyógyszerként történõ alkalmazása Két külföldi szabadalmi PCT bejelentés is történt: 1. SZTE Kórélettani Inzézet Prof. Telegdy Gyula: Urocortinok anxiolytikus és antidepressziós hatása (2. alprogram) 2. SZTE Neurológiai Klinika Prof. Vécsei László: Kinurénsav és származékai alkalmazása a gyomor-bél traktus hipermotilitással és gyulladással járó állapotainak és köszvénynek kezelésére (3. alprogram) Megadott hazai szabadalmak: 1.SZTE Kórélettani Inzézet Prof. Telegdy Gyula: Izatin és származékai gyógyszerként történõ alkalmazása 2. SZTE Neurológiai Klinika Prof. Vécsei László: Kinurénsav és származékai alkalmazása a gyomor-bél traktus hipermotilitással és gyulladással járó állapotainak és köszvénynek kezelésére (3. alprogram) Termékek: • Felnõtt patkány csontvelõi sejtjeinek és az azokból kialakított õssejtszármazékok lefagyasztott populációinak kereskedelmi forgalmazásra történõ elõállítása. (SZTE Molekuláris Medicina Intézet, Gulya Károly (3-as alprogram) • Extracelluláris wolfram elektródák és sterotaxiás célú digitális mikropozícionáló eszköz (Kation Bt., 1-es alprogram) • 1 új kettõs transzgenikus egérvonal (apoB-100 x biglycan) (JSW Hungary Kft., 3-as alprogram) • Oligomer Aâ peptid ( SZTE ÁOK Penke Botond, 1-es alprogram) • Radioaktívan jelzett Dmt-endomorfin-2 (MTA SZBK Tóth Géza, 2-es alprogram) • Acpc(2)-endomorfin2 (MTA SZBK Tóth Géza, 2-es alprogram) Új források bevonása: A SZOTE Kht. pályázatából vásárolt nagyteljesítményû HPC (High Performance Computing) számítógéprendszer a DNT Kutatóközpont és Inkubátorházban áll rendelkezésére a DNT kutatócsoportjainak. Az SZTE Gyógyszerésztudományi Kar új, 600 MHz-es NMR készüléke egy 500 MHz-es másik NMR készülékkel együtt a DNT kutatóközpontban lett elhelyezve és a kutatók rendelkezésére áll. 2007. márciusában a Lyonban megrendezett Biosquare kiállításon a DNT képviseltette magát, s mind lehetséges befektetõkkel, mind potenciális kooperációs partnerekkel tárgyaltunk. Együttmûködési megállapodást készítettünk elõ egy technológia tarnszfer vállalkozással (Laser Consult Kft.) a keletkezett szabadalmak hatékonyabb piacra jutását elõsegítendõ.

36

EGYÜTTMÛKÖDÉS AZ IPARI PARTNEREKKEL EGIS Gyógyszergyár NyRt. A vállalat kulcsszerepet játszik a második alprogram kutatási-fejlesztési munkáiban. A DNT Kutatóközpont és Inkubátorházban a következõ laboratóriumok mûködnek az EGIS támogatásával: DNS- és Oligonukleotid Laboratórium, RNS-Interferencia Laboratórium, Számítóközpont és a Peptid-Protein Laboratórium Kromat Kft. A vállalat a 4. alprogram munkáiban kulcsszerepet tölt be. A Kromat Kft. segítségével indult be a Neuroproteomikai Laboratórium mûködése és a vállalat részt vesz a Provit Kft. spin-off cég alapításában is. JSW Hungary Kft. A JSW Hungary Kft. 2006. augusztusában csatlakozott a DNT programhoz. A cég gyógyszerjelölt molekulák kutatási szerzõdésen alapuló analitikai, biokémiai és molekuláris biológiai tesztelését, valamint azok in vitro szövettenyészeten és in vivo transzgenikus egérmodelleken történõ preklinikai tesztelését végzi, szorosan kapcsolódva a DNT program 3. és 5. alprogramjához tartozó csoportok kutatásaihoz. Ezen túlmenõen kedvezményesen látja el a konzorcium minden egyes tagját az Alzheimer- és a Parkinson- kór transzgenikus állatmodelljeivel. Musgenex Kft. A társaság több új, a konzorcium profiljában is szereplõ, különbözõ neurodegenerációs betegségek megelõzésére és gyógyítására alkalmas gyógyszerhatóanyag felfedezésével, a vezérmolekulák gyógyszerré, gyógyhatású készítménnyé fejlesztésével járulhat hozzá a projekt megvalósításához; eddig már két amerikai/világszabadalom felfedezésében és sikeres megvalósításában vett részt. A Musgenex rendelkezik az állatkísérletekhez és kísérleti állatok tartásához szükséges engedélyekkel, továbbá új neurodegenerációs betegségeket modellezõ transzgenikus egerek kifejlesztésével járulhat hozzá a konzorcium feladatainak sikeres teljesítéséhez Vitadel Kft. A DNT saját alapítású cége, melynek elsõdleges feladata a konzorciumi partnerek által nyújtott szolgáltatások kiközvetítése, kapcsolatépítés. A projekt befejeztével az elõbbieken túlmenõen az egyetemi konzorciumi partner részére kíván projektmenedzsmenti szolgáltatásokat végezni. LipidArt Kft. Az MTA SZBK, az SZTE magánszemélyei és egy technológia transzfer társaság alapításával létrejött cég a konzorcium számára térítésmentesen biztosítja a kísérletek elvégzéséhez szükséges gamma-tocopherolt. Fenntartható fejlõdés A DNT egyik pályázatban is megfogalmazott célja, hogy a pályázati idõszak leteltével olyan szervezet alakuljon ki, amely képes saját bevételeibõl és egyéb forrásokból költségeinek jelentõs részét fedezni. A kapcsolatok komplex rendszerét kidolgozva feladati szintek szerint a következõ bevételi forrásokra számítunk. Nemzetközi kapcsolatrendszer A Szegedi Tudományegyetem részt vesz a magyar, cseh, szlovák, horvát, román, ukrán egyetemek és a Cedars Sinai Medical Health Care részvételével alakított konzorciumban. A DNT által alapított Vitadel spin-off cég mint ernyõcég a konzorciumi szerzõdés keretein belül olyan nemzetközi kapcsolatokkal rendelkezõ társasághoz tud kapcsolódni, mely a szabadalmi jogok értékesítésében jelentõs potenciállal és nagy tapasztalattal rendelkezik. A DNT felvette a kapcsolatot a NUMICO multinacionális vállalattal egy funkcionális élelmiszer eladása és az Eli Lilly bécsi irodájával egy potenciális gyógyszer továbbfejlesztése céljából. Hazai kapcsolatrendszer A DNT már idén bekapcsolódik az Új Magyarország Fejlesztési Terv Gazdasági Operatív Program (ÚMFT GOP) „Egyetemi tudásközpontok megerõsítése” nevû pályázatba. Az egyetem másik két nagyprojektjének menedzsmentjével egyzetetve (DEAK, KN RET) a pályázathoz összeállítottuk az alapítandó gazdasági társaság üzleti tervét, és elõzetes felmérést végeztünk a biztosítandó önerõt illetõen. Tárgyaltunk a DNT konzorciumi partnerein kívül más lehetséges társaságokkal is (TEVA, Chinoin, Richter, Csertex Kft). Regionális kapcsolatrendszer A DNT integrálódni kíván a szegedi és a dél-alföldi technológiai egészségügyi koncepcióba is a Szeged Pólus Kht-n, illetve a Szegedi Egészségügyi Központon keresztül. Képviseltetjük magunkat a pólusváros koncepción belül létrehozandó inkubátorközpont munkacsoportoban. Helyi kapcsolatrendszer Az egyetemen belül a három nagyprojekt az ÚMFT GOP pályázatában együtt indul, figyelembe véve természetesen a jelenleg futó RET és KKK pályázatok eltérõ lejárati idejét. A DNT továbbvihetõ kutatási témáit 2008. december 1 után a fenti pályázati forrás felhasználásával fejlesztjük tovább.

37

MÉDIAMEGJELENÉSEK 2007-ben Nyomtatott média Délmagyarország: 2007.02.13 ; 9.o. „Ellenszer lelki nyavalyákra” Szegedi Egyetem: 2007.03.26 ; 5.o. „Szabadalmak – illúziók nélkül” Szegedi Egyetem: 2007.03.12 ; 7.o. „Itthon Boldogulni- Beszélgetés Klivényi Péterrel” Szegedi Egyetem: 2007.02.19 ; Címlap, 3.o. „Kétéves a Neurobiológiai Tudásközpont” Elektronikus média MTV regionális híradó Szeged: 2006.10.19 MTV regionális híradó Szeged: 2007.02.14. ; 14:54 Index.hu: 2007.02.14. „Új lázcsillapító készül Szegeden” Duna Televítió: 2007. 07. 11. Alzheimer-kórral foglalkozó mûsor Konferencia 2007.10.18. Szeged SZAB székház. Somogyi u. 7. Konferencia a DNT 2007 évi eredményeirõl.

1. Alprogram

PUBLIKÁCIÓK

1. Peter-Szabo M, Kekesi G, Nagy E, Sziver E, Benedek G, Horvath G.: Quantitative characterization of a repeated acute joint inflammation model in rats. Clin. Exp.Pharmacol. Physiol 34:520-526, 2007 IF: 1.780 2. Horvath G., Kekesi G., Tuboly G., Benedek G.: Antinociceptive interactions of triple and quadruple combinations of endogenous ligands at the spinal level. Brain Res. 1155:42-48., 2007. IF: 2.341 3. Horvath G., Kekesi G., Nagy E., Benedek G.: The role of TRPV1 receptors in the antinociceptive effect of anandamide at spinal level. Pain, In press 2007. IF: 4.836 4. Sipos E, Kurunczi A, Kasza A, Horvath J, Felszeghy K, Laroche S, Toldi J, Parducz A, Penke B., Penke Z.: Beta-amyloid pathology in the entorhinal cortex of rats induces memory deficits: implications for Alzheimer's disease. Neuroscience. 147:28-36., 2007 IF: 3.427 5. Veszelka S, Pásztói M, Farkas AE, Krizbai I, Dung NTK, Niwa, M, Ábrahám CS, Deli MA. Pentosan polysulfate protects brain endothelial cells against bacterial lipopolysaccharide-induced damages. Neurochem. Int., 50: 219-228, 2007 IF: 3.211 6. Nakagawa S, Deli MA, Nakao S, Honda M, Hayashi K, Nakaoke R, Niwa M. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cell. Mol. Neurobiol, 27: 687-694, 2007 IF: 2.219 7. Csete M, Sipos A, Koházi-Kis A, Szalai A, Szekeres G, Matesz A, Csákó T, Osvay K, Bor Z, Penke B., Deli MA, Veszelka S, Marti O.: Comparative study of sub-micrometer polymeric dot-arrays, linear and crossed gratings generated by UV laser based two-beam interference as surfaces for AFM and SPR based biosensing. Appl. Surf. Science in press, epub 2007 Aug. 14 IF: 1.436 8. Gáspár, R., Gál, A., Gálik, M., Ducza, E., Minorics, R., Kolarovszki-Sipiczki, Z., Klukovits, A., Falkay, G.: Different roles of a2-adrenoceptor subtypes in non-pregnant and late-pregnant uterine contractility in vitro in the rat. Neurochem. Int. 51:311-318, 2007 IF: 3,159 9. Hajdú, Zs., Hohmann, J., Forgo, P., Martinek, T., Dervarics, M., Zupkó, I., Falkay, G., Cossuta, D., Máthé, I.: Diterpenoids and flavonoids from the fruits of Vitex agnus-castus and antioxidant activity of the fruit and their constituents. Phytother. Res. 21:391-394, 2007 IF: 1,144 10.Kolarovszki-Sipiczki, Z., Gáspár, R., Ducza, E., Páldy, E., Benyhe, S., Borsodi, A., Falkay, G.: Effect of a2-adrenoceptor subtype selective inverse agonists on non-pregnant and late-pregnant cervical resistance in vitro in the rat. Clin. Exp. Pharm. Phys. 34:42-47, 2007 IF: 1,780 11. Jójárt, B., Márki, Á.: Possible dynamic anchor points in a benzoxazine derivative - humanoxytocin receptor system – a molecular docking and dynamics calculation. J. Mol. Model 73:41-48, 2007 IF: 1,384 12.Jójárt, B., Márki, Á.: Receptor-based QSAR studies of non-peptide human oxytocin receptor antagonist. J. Mol. Graph. Model. 25:711-720, 2007 IF: 2,371

38

13. Rákos G, Kis Z, Nagy D, Lür G, Farkas T, Hortobágyi T, Vécsei L., Toldi J. Evans Blue fluorescence permits the rapid visualization of non-intact cells in the perilesional rim of cold-injured rat brain. Acta Neurobiol Exp (Wars). 67:149-54., 2007 IF: 1.207 14. Vincze G., Almos P., Boda K., Döme P., Bódi N., Szlávik G., Mglóczki E., Pákáski M. , Janka Z., Kálmán J. : Risk factors of cognitive decline in residental care in Hungary. Int. J.Geriatr. Psychiatry Published online 11 Jun 2007 IF: 1.948 15. Hartai Z., Juhász A., Rimanóczy A., Janáky T., Donkó T., Dux L., Penke B., Tóth G., Janka Z., Kálmán J.: Decreased serum and red blood cell kynurenic acid levels in Alzheimer's disease. Neurochem Int. 50: 308-313., 2007 IF: 3,261 16. Zana M. , Janka Z. , Kálmán J. :Oxidative stress: A bridge between Down's syndrome and Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging 28: 648-676., 2007 IF: 5,312 17. Oláh,Z., Jósvay K., Pecze L., Letoha T., Babai N., Budai D., Ötvös F., Szalma S., Vizler Cs. Anti-calmodulins and tricyclic adjuvants in pain therapy block the TRPV1 channel. PLoS ONE 2(6): e545. doi:10.1371/journal.pone.0000545 (Accepted May 24, 2007.) 18. Szegedi V., Juhász,G., Vass G., Fülöp L., Soós K., Budai D., Penke B.: Aâ1-42 oligomers and fibrils show differential effects on AMPA receptor function of CA1 neurons in vivo. Eur. J. Neurosci. 2007, (Submitted). IF: 3,709 19. Likó I., Mák M., Klement É., Hunyadi-Gulyás É., Pázmány T., Medzihradszky-Fölkl. K., Urbányi Z.: Evidence for an extended interacting surface between â-amyloid and serum amyloid P component. Neurosci. Lett. 412: 51-55., 2007 IF: 1.898 20. Farkas, E., Luiten, P.G.M., Bari, F.: Permanent, bilateral common carotid artery occlusion in the rat: a model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases. Brain Res. Rev., 54:162-180., 2007 IF: 6.721 21. Annaházi, A., Mracskó, É., Süle, Z., Karg, E., Penke, B., Bari, F., Farkas, E.: Pre-treatment and post-treatment with -tocopherol attenuates hippocampal neuronal damage in experimental cerebral hypoperfusion. Eur. J. Pharmacol., 571:120-128., 2007 IF: 2.522 22.Datki Z.L., Hunya Á., Penke B.: A novel and simple fluorescence method for the measurement of presynaptic vesicular zinc release in acute hippocampal slices with a fluorescence plate reader. Brain Res Bull. 74:183-7. 2007. IF: 2,609 23. Zarandi M., Soos K., Fulop L., Bozso Z., Datki Z., Toth GK., Penke B.: Synthesis of Abeta [1-42] and its derivates with improved efficiency. J Pept Sci. 2007. Feb; 3 (2):194-9. IF: 1,803 24. Walter S., Letiembre M., Liu Y., Heine H., Penke B., Hao W., Bode B., Manietta N., Walter J., Schulz-Schaffer W., Fassbender K.: Role of the Toll-like receptor 4 in Neuro-inflammation in Alzheimer's disease. Cell Physiol Biochem 20: 947-956., 2007 IF: 3,558 25. Hunya Á., Földi I., Szegedi V., Soós K., Zarándi M., Szabó A., Zádori P., Penke B., Datki Z.: Differences between normal and alpha-synuclein overexpressing SH-SY5Y neuroblastoma cells after A â(1-42) and NAC treatment. Brain Res Bull., 2007 IF: 1,721 26.Penke B., Farkas E., Bari F., Zarándi M., Janáky T.: Possible therapeutic use of tocopherols in cardiovascular and neurodegenerative diseases. Proceeding of 5th Joint Meeting on Med. Chem. (Medimond S.r.l.)., 2007, Portoroz 27.Laczkó I., Vass E., Soós K., Fülöp L., Zarándi M., Penke B.,: Aggregation of Aâ(1-42) in the presence of short petides: conformational studies. J. Pept. Sci. 2007, accepted for publication IF:1,803 Könyv, könyvfejezet Deli MA.: Blood-brain barrier models. In: Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology, Neural Membranes and Transport, Vol. 11, Lajtha A (Ed.), Springer, pp. 29-56, 2007 (IF: -) Penke B., Tóth G., Váradi Gy.,: Peptide hormones and enzyme inhibitors. In: Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 36. Davis J. (Ed) Royal Society Press 2007

39

2. Alprogram 28.Tóth, G., Ioja, E., Tömböly, Cs., Péter, A., Chung, N.N., Schiller, P.W., Benyhe, S., Borsodi, A., Tourwé, D.: Beta-methyl substitution on Cha residue in Dmt-Tic-Cha-Phe peptides provides highly potent delta agonists. J. Med. Chem. 50: 328-333., 2007 IF: 4,926 29.Stevens, C.W., Tóth, G., Borsodi, A., Benyhe, S.: Xendorphin B1, a novel opioid-like peptide determined from a Xenopus laevis brain cDNA library, produces opioid antinociception after spinal administration in amphibians. Brain Res. Bull. 71: 628-632., 2007 IF: 2,481 30.Ioja, E., Tourwé, D., Kertész, I., Tóth, G., Borsodi, A., Benyhe, S.: Novel diastereomeric opioid tetrapeptides exhibit differing pharmacological activity profiles. Brain Res. Bull. 74:, 119-129., 2007 IF: 2,481 31. Tömböly, C., Ballet, S., Feytens, D., Kövér, K.E., Borics, A., Al-Khrasani, M., Fürst, S., Tóth, G., Benyhe, S., Tourwé, D.: Endomorphin-2 with a â-turn backbone constraint retains the potent ì opioid receptor agonist properties. J. Med. Chem. in press 2007 IF: 4,926 32. Páldyová, E., Bereczki, E., Sántha, M., Wenger, T., Borsodi, A., Benyhe, S.: Noladin ether, a putative endocannabinoid, inhibits ì-opioid receptor activation via Cb2 cannabinoid receptors. Neurochemistry International, in press 2007 IF: 2,994 33. Páldyová, E., Bereczki, E., Sántha, M., Wenger, T., Borsodi, A., Benyhe, S.: Altered gene expression and functional activity of opioid receptors in the cerebellum of CB1 cannabis receptor knockout mice after acute treatments with cannabinoids. Acta Biologica Hungarica, in press 2007 IF: 0, 636 34. Rocha, L., M. Cuellar-Herrera, M. Velasco, F. Velasco, A. Velasco, F. Jiménez, S. Orozco-Suarez Borsodi A.: Opioid receptor binding in parahippocampus of patients with temporal lobe epilepsy: Its association with antiepileptic effects of subacute electrical stimulation. Seisure 16:645-652., 2007 IF: 1,573 35. Fekete Z.A., Hoffmann E.A., Kortvelyesi T., Penke B.: Harmonic vibrational frequency scaling factors for the new NDDO Hamiltonians: RM1 and PM6 Mol. Phys. in press. 2007 IF: 1.690 36. C. Kozmutza, Bartha F., Udvardi L., Varga I.: Ionized Atoms and Dimers Study of the effect of metal ions on hydroxyl-containing molecules. Int J Quantum Chem, 107:2730 – 2740., 2007 IF: 1.182 37.Róka R, Rosztóczy A, Leveque M, Izbéki F, Nagy F, Molnár T, Lonovics J, Garcia-Villar R, Fioramonti J, Wittmann T, Bueno L.: A pilot study of fecal serine-protease activity: a pathophysiologic factor in diarrheapredominant irritable bowel syndrome. Clin Gastroenterol Hepatol. 5:550-555. 2007 38.Izbéki F, Wittmann T, Linke N, Bódi N, Fekete É, Bagyánszki M.: Immediate insulin treatment prevents accelerated gut motility and reduction of nitrergic neurons in ileum and colon of streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes Res Clin Pract (submitted) IF: 1,837 39.Schnúr A, Hegyi P, Venglovecz V, Rakonczay Z, Ignáth I, Takács T, Lonovics J., Varró A, Varró A, Dockray G.: Functional characterization of the H+/K+ ATPase in wild type and gastrin knock-out mice. Z. Gastroenterol 45:443, 2007 IF: 1,293 40.Pagliocca A, Hegyi P., Venglovecz V., Rackstraw SA, Wang TC, Dimaline R, Varro, Dockray G. Identification of ezrin as a target of gastrin in immature gastric parietal cells. J Physiol (London), 2007, (submitted) IF: 4,407 41.Linke N., Izbéki F., Bagyánszki M., Bódi N., Rosztóczy A., Fekete É., Lonovics J., Wittmann T.: Early insulin treatment prevents the loss of nitrergic neurons in the ileum and colon and restores altered gut motility in streptozotocin-induced diabetic rats. Z. Gastroenterologie; 45:, 2007 IF: 1,293 42. Bagosi Z., Jászberényi M., Bujdosó E., Szabó G., Telegdy G.: The effects of endomorphins and diprotin A on striatal dopamine release induced by electrical stimulation—An in vitro superfusion study in rats. Neurochemistry Int. 49:665-668., 2006 IF: 3,159 43. Bagosi Z., Jászberényi M., Szabó G., Telegdy G.: The effects of CRF and the urocortins on [3H]GABA release from the rat amygdala—An in vitro superfusion study Brain Research Bulletin, In Press, (2007), doi:10.1016/j.brainresbull.2007.07.003, IF: 1,684 44. Birkas E.; Kertesz I., Toth,G., Bakota L., Gulya K., Szucs M.: Synthesis and pharmacological characterization of a novel, highly potent, peptidomimetic delta-opioid radioantagonist, [H]Tyr-Tic-(2S,3R)-â-MePhe-Phe-OH. Neuropeptides., Accepted for publication IF: 2,789

40

45. Csányi G., Leprán I., Flesch T., Telegdy G., Szabó G., Mezei Zs.: Lack of endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF) up-regulation in endothelia dysfunction in aorta in diabetic rats. Pharmacological Report 59:447-455., 2007 IF.: 0.764 46. Jászberényi M., Bagosi Z., Thurzó, Földes,I., Telegdy G.: Endocrine and behavioral effects of Neuromedin S. Hormones and Behavior. Accepted for publication. IF.:3.649 47. Tanaka M., Telegdy G.: Antidepressant-like effects of the CRH family peptides urocortin 1, urocortin 2 and urocortin 3 in a modified forced swimming test in mice. Brain Res. Bull, Accepted for publication. IF:.2.609 1 48. Szemenyei E., Tóth G.: Tritium Labelling and Degradation of 2',6'-Dmt -endomorphin-2. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals 2007, in press IF: 0.746 49. Aguila B., Coulbault L., Boulouard M., Léveillé F., Davis A., Tóth G., Borsodi A., Balboni G., Salvadori S., Jauzac P., Allouche S.: In vitro and in vivo pharmacological profile of UFP-512, a novel selective ä-opioid receptor agonist: Functional and trafficking studies correlate with the lack of tolerance. British Journal of Pharmacology 2007, in press IF: 3.825 50.Hársing, G.L., Jurányi, Z., Gacsályi, I., Tapolcsányi, P., Czompa, A., Mátyus, P.: Glycine transporter type-1 and its inbhibitors. Current Med.Chem. 13: 1017-1044., 2006 IF: 4.904 51.Sziray, N., Leveleki, Cs., Lévay, G. Markó, B., Hársing G.L Jr., Mikics, É., Barsy, B., Haller, J.: Mechanism, underlying the long term behavioral effects of traumatic experience in rats: the role of serotonin/noradrenalin balance and NMDA receptors. Brain Res.Bull.71:376-385., 2007 IF: 1.684 52.Gigler, G., Móricz, K., Ágoston, M., Simó, A., Albert, M., Benedek, A., Kapus, G., Kertész, Sz., Vegh, M. Barkóczy, J., Markó, B., Szabó, G., Matucz, É., Gacsályi, I., Lévay, G., Hársing, G.L., Szénási, G.: Neuroprotective and anticonvulsant effects of EGIS-8332, a non-competitive AMPA receptor antagonist, in a range of animal models. British J. Pharmacol. 152: 151-160., 2007 IF: 3.825 3. Alprogram 53.Institóris, Á., Farkas, E., Berczi, S., Süle, Z., Bari, F .: Effects of cyclooxygenase (COX) inhibition on memory impairment and hippocampal damage in the early period of cerebral hypoperfusion in rats. Eur. J. Pharmacol., 2007 in press. IF: 2.522 54.Lenti, L., Domoki, F., Kis, D., Hegyi, O., Toth, G.K., Busija, D.W., Bari F.: Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide induces pial arteriolarvasodilation through cyclooxygenase-dependent and independent mechanisms in newborn pigs. Brain Res.1165:81-8., 2007 IF: 2.341 55.Kaszaki J, Palásthy Z, Érczes D, Rácz A, Torday C, Varga G, Vécsei L, Boros M.: Kynurenic acid inhibits intestinal hypermotility and xanthine oxidase activity during experimental colon obstruction in dogs. Neurogastroenterology and Motility 2007 in print. IF: 3,338 56. Gera L., Varga R., Török L., Kaszaki J., SzabóA., NagyK., Boros M.: Beneficial effects of phosphatidylcholine during hindlimb reperfusion. J Surg Res 139: 45-50, 2007. IF: 2,038 57.Csont T, Bereczki E, Bencsik P, Fodor G, Gorbe A, Zvara A, Csonka C, Puskas LG, Santha M, Ferdinandy P.: Hypercholesterolemia increases myocardial oxidative and nitrosative stress thereby leading to cardiac dysfunction in apoB-100 transgenic mice. Cardiovasc Res 76:100-109., 2007 IF: 5.8 58. Bencsik P, Kupai K, Giricz Z, Görbe A, Huliák I, Fürst S, Dux L, Csont T, Jancsó G, Ferdinandy P. Cardiac capsaicin-sensitive sensory nerves regulate myocardial relaxation via S-nitrosylation of SERCA: role of peroxynitrite. Br J Pharmacol 2007 in press IF: 3.8 59. Orojan I, Bakota L, Gulya K.: Trans-synaptic regulation of calmodulin gene expression after experimentally induced orofacial inflammation and subsequent corticosteroid treatment in the principal sensory and motor trigeminal nuclei of the rat. Neurochem Int. 2007 in press. IF: 3.159 60. Dux M, Rosta J, Pintér S, Sántha P, Jancsó G.: Loss of capsaicin-induced meningeal neurogenic sensory vasodilatation in diabetic rats. Neuroscience. 2007 Sep 12; [Epub ahead of print] IF: 3,6

41

61. Dux M., Rosta J., Jancsó G.: Dysfunction of meningeal capsaicin-sensitive afferent nerves in a rat model of diabetic neuropathic pain. European J.Pain, 11, (Supplement 1): 168, 2007 IF:3,333 62. Jancsó G., Sántha P., Oszlács O., Nyári T.: Perineural capsaicin and resiniferatoxin induce selective regional analgesia and phenotypic switch of primary sensory neurons expressing TRPV1 European J. Pain, 11, (Supplement 1): 170, 2007 IF:3,333 63. Szigeti C., Körtvély E., Sántha P., Nyári T., Gulya K., Jancsó G.: Effects of traumatic and selective chemical lesions of peripheral nerves on TRPV1 receptor expression: Implications for vanilloid-induced analgesia European J. Pain, 11, (Supplement 1): 176, 2007 IF:3,333 64. Csakvari E, Hoyk Z, Garcia-Ovejero D, Garcia-Segura LM, Parducz A: Fluctuation of synapse density in the arcuate nucleus during the estrous cycle. Neuroscience. 144:1288-1292., 2007 IF: 3,601 65. Hajszan T., MacLusky NJ, Johansen JA, Jordan CL, Leranth C.: Effects of androgens and estradiol on spine synapse formation in the prefrontal cortex of normal and testicular feminization mutant male rats. Endocrinology. 148:1963-1967., 2007 IF: 5,313 66. Leranth C, Hajszan T.: Extrinsic afferent systems to the dentate gyrus. Prog Brain Res, 163: 63-84., 2007 IF: 2.872 67. Hajszan T, Milner TA, Leranth C.: Sex steroids and the dentate gyrus. Prog Brain Res, 163: 399-415., 2007 IF: 2.872 68. Bjelik, A., Pákáski;M., Bereczki E., Gonda, S., Juhász A., Rimanóczy Á., Zana M., Boda K., Janka Z., Sántha M., Kálmán J.: APP mRNA splicing is upregulated in the brain of biglycan transgenic mice. Neurochem. Int. 50:1-4., 2007 IF:3.20 69. Lorincz, A., Rozsa, B., Katona, G., Vizi, E. S., Tamás, G.: Differential distribution of NCX1 contributes to spine-dendrite compartmentalization in CA1 pyramidal cells. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 1033-8., 2007 IF: 10,231 70. Szabadics, J., Tamás, G., & Soltesz, I.: Origin and mechanism of slow GABAA inhibition in the neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 14831-6., 2007 IF: 10,231 71. Rákos G., Kis Z., Nagy D., Lür G., Farkas T., Hortobágyi T., Vécsei L., Toldi J. : Evans Blue fluorescence permits the rapid visualization of non-intact cells in the perilesional rim of coldinjured rat brain. Acta Neurobiol Exp 67: 149-154., 2007 IF: 1,207 72. Gigler, G., Szénási, G., Simó, A., Lévay, Gy., Hársing, L.G., Sas, K., Vécsei, L., Toldi, J.: Neuroprotective effect of L-kynurenine sulfate administered before focal cerebral ischemia in mice and global cerebral ischemia in gerbils. Eur. J. Pharmacol. 564:116-122, 2007. IF: 2,522 73. Knyihár, E., Toldi, J., Krisztin-Péva, B., Chadaide, Z., Németh, H., Fenyõ, R., Vécsei, L.: Prevention of electrical stimulation-induced increase of c-fos immunoreaction in the caudal trigeminal nucleus by kynurenine combined with probenecid. Neurosci. Lett. 418:122-126, 2007. IF: 2,092 74. Knyihár, E., Toldi, J., Mihály, A., Krisztin-Péva, Z., Chadaide, Z., Németh, H., Fenyõ, R., Vécsei, L.: Kynurenine in combination with probenecid mitigates the stimulation-induced c-fos immunoreactivity of the rat caudal trigeminal nucleus in an experimental migraine model. J. Neural. Transm. 114:417-421, 2007. IF: 2,938 75 Rajda, C., Bergquist, J., Vécsei, L.: Kynurenines, redox disturbances and neurodegeneration in multiple sclersosis. J. Neural. Transm. in press, 2007 IF: 2,544 76. Sas, K., Robotka, H., Toldi, J., Vécsei, L.: Mitochondria, metabolic disturbances, oxidative stress and the kynurenine system, with focus on neurodegenerative disorders. J. Neurol. Sci 257:221-239, 2007 IF: 2,412 77. Nagy E, Balogi Z, Gombos I, Akerfelt M, Bjorkbom A, Balogh G, Torok Z, Maslyanko A, Fiszer-Kierzkowska A, Lisowska K, Slotte PJ, Sistonen L, Horvath I, Vigh L.: Hyperfluidizationcoupled membrane microdomain reorganization is linked to activation of the heat shock response in a murine melanoma cell line. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 7945-7950., 2007 IF:10,231 78.Vigh L, Torok Z, Balogh G., Glatz A., Piotto S., Horvath I.: Membrane-regulated stress response: a theoretical and practical approach. Adv Exp Med Biol. 594:114-31., 2007 IF:0,646

42

79.Vigh, L., Horváth, L., Maresca, B., Harwood, J. L.: Can the stress protein response be controlled by “membrane-lipid therapy”? Trends Biochem Sci. 32:357-63., 2007 IF: 13,863 80. Nakamoto, H. & Vigh, L.: Small heat shock proteins and their clients Cel. Mol. Life Sci. 64:294-306., 2007 IF:4,65581.Vigh L, Nakamoto H, Landry J, Gomez-Munoz A, Harwood JL, Horvath I.: Membrane Regulation of the Stress Response from Prokaryotic Models to Mammalian Cells. Ann N Y Acad Sci. [Epub ahead of print] 2007 IF:1,93 Könyv, könyvfejezet: Jancsó G., Katona M, Horváth V, Sántha P, Nagy J.: Sensory nerves as modulators of cutaneous inflammatory reactions in health and disease. In: Neurogenic Inflammation, ed Berczi I, Elsevier, 2007, in press Dux M., Messlinger K: Neurogenic vascular responses in the dura mater and their relevance for the pathophysiology of headaches In: Neurogenic Inflammation, ed, Berczi I, Elsevier, 2007, in press Kiss, Cs., Vécsei, L.: Kynurenine in the brain: preclinical and clinical studies, therapeutic considerations. (invited paper). In: Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology 3rd Edition (Ed: Lajtha, A) Kluwer, New York, 2007 in press 4. Alprogram 82. Must A., Juhász A., Rimanóczy Á., Szabó Z., Kéri Sz., Janka Z.: Major depressive disorder, serotonin transporter, and personality trats: Why patients use suboptimal decision making strategies? J. Affective Disorders, 2007 Mar 21:(Epub ahead of print) IF: 3.138 83.Puskas LG., Kitajka K.: Nutrigenomic approaches to study the effects of n-3 PUFA diet in the central nervous system. Nutr Health.;18:227-32., 2006 84.Verdier Y., Földi I., Sergeant N., Fülöp L., Penke Zs., Janáky T., Szücs M., Penke B.: Characterization of the interaction between Amyloid beta 1-42 and glyceraldehyde phosphodehydrogenase J. Peptide Sci, accepted for publication, 2007 IF: 1,801 5. Alprogram 85.Mendler L, Baka Zs, Kovács-Simon A, Dux L.: Androgens negatively regulate myostatin expression in an androgen-dependent skeletal muscle. B.Biophys Res Comm 361: 237-242., 2007 IF. 2.855 86.Mendler L, Pintér S, Kiricsi M, Baka Zs, Dux L.: The regeneration of reinnervated rat soleus muscle is accompanied by fiber transitions toward a faster phenotype. J Histochem Cytochem. Kézirat elfogadva 2007 IF: 2.45 87.Welker, E., Hathaway, L., Xu, G., Narayan, M., Pradeep, L., Shin, H., Scheraga. H. A. Oxidative folding and N-terminal cyclization of onconase Biochemistry, 46: 5485-5493., 2007. IF.: 3.0 Könyv, könyvfejezet: Dr. Bán É. és Dr. Konkoly-Thege M.: „QualiCont bakteriológiai körkísérletek értékelése –kenetek vizsgálati mintákból és hemokultúrákból” Kiadó neve: QualiCont Kht., nyomda: Tisza Press Nyomda, 2007. szeptember utolsó hetében jelent meg.

43

ÖSSZEFOGLALÓ A 2007-ES GAZDÁLKODÁSRÓL Ada tok e Ft-ba n Sze ge di Tudom á nye gye te m NKTH támogatás Önerõ

2005

2006

2007

2005

2006

2007

Krom a t Kft 280 990 0

369 907 0

272 463 0

NKTH támogatás Önerõ

6 500 54 704

14 500 5 204

14 500 5 704

MTA - Sze ge di Biológia i Kuta tóközpont NKTH támogatás 42 893 Önerõ 0

60 562 0

77 500 0

Cre a tív La bor Kft. NKTH támogatás Önerõ

1 000 1 000

3 000 3 000

2 000 2 000

MTA - Tá m oga tott Kuta tóhe lye k Iroda NKTH támogatás 15 942 Önerõ 0

24 363 0

12 429 0

NKTH támogatás Önerõ

2 000 2 000

3 000 3 000

3 500 3 500

EGIS Gyógysze rgyá r NyRt. NKTH támogatás Önerõ

0 49 000

0 53 000

0 59 000

NKTH támogatás Önerõ

1 500 1 500

2 294 2 294

2 512 2 512

NKTH támogatás Önerõ

2 160 2 000

4 000 4 000

7 590 7 000

NKTH támogatás Önerõ

1 000 2 000

2 000 2 000

2 000 2 000

Dia gnosticum ZRt. NKTH támogatás Önerõ

4 000 4 000

8 000 8 000

6 000 6 000

NKTH támogatás Önerõ

1 000 1 000

2 000 2 000

1 667 1 667

Rytmion Kft.

Ka tion Bt.

SOLVO ZRt.

Qua liCont Kht.

DABIC Kht.

Alté m á k k ö lts é g ve té s e 2 0 0 7 -b e n

3 a s a lté ma 19% 2 e s a lté ma 22%

4 e s a lté ma 16%

5 ö s a lté ma 9% Me n e d z s me n t kö lts é g e k +r e z s i 12%

1 e s a lté ma 22%

1 e s a lté ma

2 e s a lté ma

3 a s a lté ma

4 e s a lté ma

5 ö s a lté ma

Me n e d z s me n t kö lts é g e k, Re z s i

Nagyobb mûszerberuházások listája 2007-ben:

44

Gyártó

Megnevezés

Bruttó érték

AuroScience Kft S-Biotech Kft AuroScience Kft nikon Campden Instruments Pan Lab Si WIP Kft Ugo Basile Colombus Instruments AuroScience Kft Spektrum 3D Kft Simkon Külker Kft.

Többcsatornás elektrofiziológiai készülék Liofilizáló Mikroszkóp fejlesztés Szorongásmérõ gép Magatartásvizsgáló készülék (2 db) Vérgázmérõ készülék Magatartásvizsgáló készülék Hangingerlõ (responder) Mikroszkóp, fejlesztés Precíziós mérleg HPLC

15 480 000 Ft 4 000 000 Ft 4 000 000 Ft 3 500 000 Ft 3 480 000 Ft 2 418 000 Ft 2 400 000 Ft 1 775 000 Ft 1 548 000 Ft 1 028 000 Ft 2 700 000 Ft

TELJESÍTMÉNYINDIKÁTOROK Terv 3 1 0 4 4 4 1

Termék: Beküldött hazai szabadalom: Beküldött nemzetközi szabadalom PCT: Új szolgáltatás: Új technológia: Alkalmazás: Prototípus:

Tény 6 3 2 8 10 12 1

MONITORING ÉRTÉKELÉSI RENDSZER Munkacsoportok értékelési rendszere Háromhavonta minden munkacsoport beszámol az operatív vezetõknek az elvégzett munkáról. Nem megfelelõ beszámoló esetén a DNT vezetése jogosult elõször utófinanszírozottá tenni a csoportot, újabb nem teljesítés esetén pedig kizárhatja a munkacsoportot. Altémák értékelési rendszere Minden altémavezetõ félévente beszámol az altémához tartozó munkacsoportok munkájáról. Az értékeléshez a következõ szempontrendszert alkalmazzuk: 1. Tudományos eredmények: A kutatócsoport annyi pontot kap, amennyi a DNT kutatási/fejlesztési témáiból írt cikkek impakt faktora. Kongresszusi elõadásokat, összefoglalókat nem számítjuk be. 2. Benyújtott szabadalmak: Minden egyes benyújtott szabadalomért 20 pontot kap a munkacsoport 3. Spin-off cégek alapítása: A kockázatvállalást jutalmazva minden spin-off cégbe való belépésért, amelyet a munkacsoport vagy valamelyik tagja alapít, 30 pont jár. 4. Részvétel EU-6 vagy EU-7 keretprogramban: Minden egyes sikeres EU-network pályázatért 30 pont jár. Ha a nyertes pályázat benyújtója és koordinátora a DNT adott munkacsoportja, akkor ezt 40 ponttal jutalmazzuk. A kapott pontszám alapján dönt az IT a projekt erdményességérõl és mérlegeli a támogatás folyamatosságát. RÖVIDÍTÉSEK: ABC „ATP-Binding Casette" transzportfehérjék AL50 „Abszolut Letális 50%" dózis ÁOK Általános Orvostudományi Kar DABIC Dél-Alföldi Bio-Innovációs Centrum Kht. DNT Délalföldi Neurobiológiai Tudásközpont GGC Global Growth Companies GLP Good Laboratory Practice GOP Gazdaságfejlesztési Operatív Program GYTK Gyógyszerésztudományi Kar IT Igazgató Tanács JGYTFK Juhász Gyula Tanárképzõ Fõiskolai Kar K+F Kutatás és Fejlesztés KKV Kis- és Középnagy Vállalat

MBSZ Magyar Biotechnológiai Szövetség MTA Magyar Tudományos Akadémia MTA-SZBK Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Központ MTA-TKI Magyar Tudományos Akadémia Támogatott Kutatóhelyek Iroda NKTH Nemzeti Kutatási és Technológiai Hivatal NO Nitrogén monoxid PCR Polinucleotid Chain Reaction SZBK Szegedi Biológiai Központ SZTE Szegedi Tudományegyetem TTK Természettudományi Kar ÚMFT Új Magyarország Fejlesztési Terv

DÉL-ALFÖLDI NEUROBIOLÓGIAI TUDÁSKÖZPONT 6725 Szeged, Szikra u. 2. Tel.: +3662/546-827 · Fax: +36-62/546-826 E-mail: [email protected] · Web: www.dnt.u-szeged.hu Design: Csécsei Károly